Method Article

Generowanie samoorganizujących się organoidów ludzkiego serca pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych

DOI:

10.3791/63097

⸱

September 15th, 2021

 ,  ,  ,  , 
1Institute for Quantitative Health Science and Engineering, Division of Developmental and Stem Cell Biology, Michigan State University, 2Department of Biomedical Engineering, College of Engineering, Michigan State University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisujemy protokół do efektywnego tworzenia istotnych dla rozwoju organoidów ludzkiego serca (hHO) przy użyciu ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych poprzez samoorganizację. Protokół opiera się na sekwencyjnej aktywacji sygnałów rozwojowych i wytwarza wysoce złożone, funkcjonalnie istotne tkanki ludzkiego serca.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Możliwość badania rozwoju ludzkiego serca w zdrowiu i chorobie jest bardzo ograniczona przez możliwość modelowania złożoności ludzkiego serca in vitro. Opracowanie bardziej wydajnych platform podobnych do narządów, które mogą modelować złożone fenotypy in vivo, takie jak organoidy i narządy na chipie, zwiększy możliwości badania rozwoju i chorób ludzkiego serca. W artykule opisano protokół generowania wysoce złożonych organoidów ludzkiego serca (hHO) poprzez samoorganizację przy użyciu ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych i stopniową aktywację szlaku rozwojowego przy użyciu inhibitorów małocząsteczkowych. Ciała zarodkowe (EB) są generowane na 96-dołkowej płytce z okrągłodennymi, ultra niskimi dołkami przyłączeniowymi, co ułatwia hodowlę zawiesinową zindywidualizowanych konstruktów.

EBs przechodzą różnicowanie w hHO za pomocą trzyetapowej strategii modulacji sygnalizacji Wnt, która obejmuje początkową aktywację szlaku Wnt w celu wywołania losu mezodermy serca, drugi etap hamowania Wnt w celu stworzenia ostatecznych linii serca i trzeci etap aktywacji Wnt w celu indukcji tkanek narządu nasierdziowego. Etapy te, przeprowadzane w formacie 96-dołkowym, są bardzo wydajne, powtarzalne i wytwarzają duże ilości organoidów na serię. Analiza za pomocą obrazowania immunofluorescencyjnego od 3. do 11. dnia różnicowania ujawnia specyfikacje pierwszego i drugiego pola serca oraz wysoce złożone tkanki wewnątrz hHO w dniu 15, w tym tkankę mięśnia sercowego z regionami kardiomiocytów przedsionkowych i komorowych, a także komory wewnętrzne wyściełane tkanką wsierdzia. Organoidy wykazują również skomplikowaną sieć naczyniową w całej strukturze i zewnętrzną wyściółkę tkanki nasierdzia. Z funkcjonalnego punktu widzenia, hHO biją mocno i wykazują normalną aktywność wapnia, określoną za pomocą obrazowania Fluo-4 na żywo. Ogólnie rzecz biorąc, protokół ten stanowi solidną platformę do badań in vitro na tkankach serca przypominających narządy ludzkie.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wrodzone wady serca (CHD) są najczęstszym typem wad wrodzonych u ludzi i dotykają około 1% wszystkich żywych urodzeń1,2,3. W większości przypadków przyczyny choroby niedokrwiennej serca pozostają nieznane. Możliwość tworzenia modeli ludzkiego serca w laboratorium, które bardzo przypominają rozwijające się ludzkie serce, stanowi znaczący krok naprzód w bezpośrednim badaniu przyczyn leżących u podstaw choroby wieńcowej u ludzi, a nie w zastępczych modelach zwierzęcych.

Uosobieniem laboratoryjnych modeli tkanek są organoidy, trójwymiarowe konstrukcje komórkowe, które przypominają organ interesujący pod względem składu komórkowego i funkcji fizjologicznych. Organoidy często pochodzą z komórek macierzystych lub komórek progenitorowych i są z powodzeniem wykorzystywane do modelowania wielu narządów, takich jak brain4,5, kidney6,7, intestine8,9, lung10,11, wątroba12,13oraz pancreas14,15, żeby wymienić tylko kilka. Ostatnie badania wykazały możliwość stworzenia samoorganizujących się organoidów serca w celu badania rozwoju serca in vitro. Modele te obejmują wykorzystanie mysich embrionalnych komórek macierzystych (mESC) do modelowania wczesnego rozwoju serca16,17 aż do specyfikacji przedsionkowo-komorowej18 oraz ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) do generowania organoidów sercowo-endodermalnych z wieloma warstwami zarodkowymi19 i kardioidów komorowych20 o bardzo złożonym składzie komórkowym.

Ten artykuł przedstawia nowatorski 3-etapowy protokół modulacji WNT do generowania wysoce złożonych hHO w efektywny i ekonomiczny sposób. Organoidy są generowane na 96-dołkowych płytkach, co daje w rezultacie skalowalny, wysokowydajny system, który można łatwo zautomatyzować. Metoda ta polega na tworzeniu agregatów hPSC i wyzwalaniu etapów rozwojowych kardiogenezy, w tym tworzenia mezodermy i mezodermy serca, specyfikacji pierwszego i drugiego pola serca, tworzenia narządów przedsierdziowych i specyfikacji przedsionkowo-komorowej. Po 15 dniach różnicowania hHO zawierają wszystkie główne linie komórkowe znajdujące się w sercu, dobrze zdefiniowane komory wewnętrzne, komory przedsionkowe i komorowe oraz sieć naczyniową w całym organoidzie. Ten wysoce wyrafinowany i powtarzalny system organoidów serca jest podatny na badanie analiz strukturalnych, funkcjonalnych, molekularnych i transkryptomicznych w badaniach nad rozwojem i chorobami serca oraz farmakologicznymi badaniami przesiewowymi.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Hodowla i utrzymanie hPSC

UWAGA: Ludzkie indukowane PSC (hiPSC) lub ludzkie embrionalne komórki macierzyste (hESC) muszą być hodowane przez co najmniej 2 kolejne pasaże po rozmrożeniu, zanim zostaną użyte do wytworzenia EB do różnicowania lub dalszej krioprezerwacji. hPSC są hodowane w pożywce PSC (patrz Tabela Materiałów) na 6-dołkowych płytkach hodowlanych pokrytych błoną podstawną, macierzą zewnątrzkomórkową (BM-ECM). Wykonując zmiany pożywki na hPSC na płytkach 6-dołkowych, dodaj pożywkę bezpośrednio do wewnętrznej strony dołka, a nie bezpośrednio na komórki, aby zapobiec niepożądanemu oderwaniu komórek lub stresowi. Użytkownicy powinni uważać na podgrzewane podłoża PSC, które nie powinny być podgrzewane w temperaturze 37 °C; wszystkie media PSC użyte w tym protokole były termostabilne.

  1. Aby pokryć płytki dołkowe BM-ECM, rozmrozić jedną porcję BM-ECM (przechowywaną w temperaturze -20 °C zgodnie z instrukcjami producenta) na lodzie i wymieszać 0,5 mg BM-ECM z 12 ml zimnej modyfikowanej pożywki Eagle's (DMEM)/pożywki F12 (przechowywanej w temperaturze 4 °C) firmy Dulbecco. Rozprowadzić 2 ml mieszaniny DMEM/F12-BM-ECM na każdym dołku płytki 6-dołkowej i inkubować w temperaturze 37 °C przez co najmniej 2 godziny.
  2. Aby rozmrozić komórki, najpierw rozmrozić kriowialny hPSC w kulce lub łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 1-2 minuty, aż widoczna będzie tylko niewielka ilość lodu. Przenieść rozmrożone komórki do probówki wirówkowej i powoli dodawać 8-9 ml pożywki PSC uzupełnionej 2 μM inhibitora ROCK, tiazowiwiny (Thiaz) i wirować przy 300 × g przez 5 minut. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórek w pożywce PSC uzupełnionej 2 μM tiazu. Rozprowadzić komórki w pożywce hodowlanej do 1-2 dołków w zależności od stężenia komórek kriowialnych i hodowli w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 24 godziny przed zmianą pożywki PSC.
  3. Zmieniaj pożywkę na komórkach w odstępach 48 godzin. Wykonaj płukanie i wymianę pożywki za pomocą odpowiednio DMEM/F12 (1 ml / dołek) i pożywki PSC (2 ml / dołek).
    UWAGA: Mycie pomaga usunąć odpady komórkowe i zanieczyszczenia, podczas gdy świeże zmiany podłoża zapewniają komórkom odnowione źródło składników odżywczych.
  4. Przejść komórki po subkonfluencji (60-80% zlewającej się) poprzez zasysanie pożywki, a następnie przemycie każdej studzienki 1 ml 1x buforowanego fosforanem roztworu Dulbecco (bez wapnia, bez magnezu; DPBS). Odessać DPBS i dodać 1 ml odczynnika dysocjacyjnego dla hPSC (patrz Tabela Materiałów), a następnie po 10 sekundach zasysać całą warstwę odczynnika z wyjątkiem cienkiej.
  5. Inkubować przez 2-5 minut z cienką warstwą odczynnika dysocjacyjnego do hPSC, aż utworzą się przerwy między komórkami.
    UWAGA: Czas do zatrzymania dysocjacji jest zależny od linii komórkowej.
  6. Dodać 1 ml pożywki PSC uzupełnionej 2 μM Thiaz (pożywka PSC + Tiaz) do dołka i delikatnie postukać w płytkę, aby wywołać oderwanie komórek. Odpipetować odłączone komórki w pożywce 1-2 razy, aby rozbić wszelkie duże kolonie, i ponownie zawiesić komórki w pożywce PSC + Thiaz w stosunku 1:6 dołka (komórki z 1 dołka zawieszone w 12 ml pożywki hodowlanej). Ponownie nakryć komórki w studzienkach pokrytych BM-ECM.

2. Generacja 3D samoskładających się organoidów ludzkiego serca

  1. Tworzenie ciała zarodka (EB):
    UWAGA: Konieczne jest ograniczenie obserwowalnych komórek zróżnicowanych przed utworzeniem ciała zarodka. Dwa do trzech dołków 6-dołkowej płytki przy 60-80% zbiegu da wystarczającą ilość komórek na pojedynczą 96-dołkową płytkę organoidów. Wszystkie podłoża powinny być porcjowane i ogrzewane w kulce lub łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przed jakąkolwiek zmianą pożywki, aby zminimalizować szok temperaturowy dla EB lub organoidów (nie obejmuje to odczynników dysocjacji komórek). Zobacz Rysunek 1A,B.
    1. Dzień -2
      1. Aby wytworzyć EBs, w dniu -2 należy przemyć sub-konfluentne hPSC (60-80% zlewające się) DPBS przez co najmniej 10 sekund, aby zmyć wszelkie resztki komórek i odessać DPBS.
      2. Aby odłączyć komórki i uwolnić je do stanu pojedynczej komórki, dodaj 1 ml odczynnika do dysocjacji komórek w temperaturze pokojowej (patrz tabela materiałów) do każdej studzienki przez 3-6 minut. Delikatnie postukaj w płytkę ~5 razy co minutę, aby wywołać oderwanie podczas sprawdzania pod mikroskopem. Dodaj 1 ml pożywki PSC + Thiaz, aby zatrzymać reakcję.
      3. Aby zebrać komórki i rozbić wszelkie pozostałe agregaty, należy pipetować pożywkę w górę i w dół w studzience 2-3 razy, aby wytworzyć zawiesinę jednokomórkową. Przenieść zawiesinę jednokomórkową do probówki wirówkowej i wirować przez 5 minut w temperaturze 300 × g.
      4. Aby uzyskać pożądane stężenie komórek, należy wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 1 ml pożywki PSC + Thiaz. Policz komórki za pomocą licznika komórek lub hemocytometru i rozcieńcz komórki w pożywce PSC + Thiaz do stężenia 100 000 komórek/ml.
      5. Aby rozprowadzić komórki do tworzenia EB, użyj pipety wielokanałowej, aby dodać 100 μl (10 000 komórek) do każdego dołka 96-dołkowej płytki o bardzo niskim nasadce okrągłodennej. Odwirować płytkę w temperaturze 100 × g przez 3 minuty i inkubować przez 24 godziny w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
    2. Dzień -1
      1. Ostrożnie usunąć 50 μl pożywki z każdej studzienki i dodać 200 μl świeżej pożywki PSC podgrzanej do 37 °C, aby uzyskać końcową objętość 250 μl na studzienkę. Inkubować komórki przez 24 godziny w temperaturze 37 °C, 5% CO2,
        UWAGA: Ostrożnie usuń i dodaj pożywkę z boku studzienki, aby uniknąć naruszenia EB na dnie studzienki. Ze względu na delikatną naturę EB i kulturę zawiesiny, podczas zmiany pożywki konieczne jest pozostawienie niewielkiej objętości płynu w każdym dołku, aby uniknąć zakłócenia EB.
  2. Różnicowanie organoidów ludzkiego serca (hHO):
    UWAGA: Wszystkie media należy podgrzać w kulce lub łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przed jakąkolwiek zmianą mediów. Ostrożnie usunąć i dodać podłoże z boku studzienki, aby uniknąć zakłócenia rozwijających się organoidów na dnie studzienki. Przemywania nie są potrzebne między zmianami pożywki, aby zminimalizować mieszanie i umożliwić stopniowe usuwanie inhibitorów i czynników wzrostu. RPMI z 2% suplementem B-27 (Tabela materiałów) stosowano w całym protokole różnicowania. Suplement witaminy B-27 zawiera insulinę, chyba że jest to określone (insulina jest wolna od insuliny w dniach 0-5). Zobacz Rysunek 1C.
    1. Dzień 0
      1. Aby zainicjować różnicowanie w kierunku linii mezodermy, usuń 166 μl pożywki z każdej studzienki (~ 2/3 całkowitej objętości studzienki) i dodaj 166 μl RPMI 1640 zawierającego insulinowolny suplement B-27, 6 μM CHIR99021, 1,875 ng/ml białka morfogenetycznego kości 4 (BMP4) i 1,5 ng/ml aktywiny A dla końcowego stężenia studzienki 4 μM CHIR99021, 1,25 ng/ml BMP4 i 1 ng/ml aktywiny A. Inkubować przez 24 godziny w temperaturze 37 °C, 5% CO2.
    2. Dzień 1
      1. Usuń 166 μl pożywki z każdej studzienki i dodaj 166 μl świeżego RPMI 1640 z suplementem bezinsulinowym B-27. Inkubować przez 24 godziny w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
    3. Dzień 2
      1. Aby wywołać specyfikację mezodermy serca, należy usunąć 166 μl pożywki z każdej studzienki i dodać 166 μl RPMI 1640 zawierającego insulinoodporny suplement B-27 i 3 μM Wnt-C59 dla końcowego stężenia studzienki 2 μM Wnt-C59. Inkubować przez 48 godzin w temperaturze 37 °C, 5% CO2.
    4. Dzień 4
      1. Usuń 166 μl pożywki z każdej studzienki i dodaj 166 μl świeżego RPMI 1640 z suplementem bezinsulinowym B-27. Inkubować przez 48 godzin w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
    5. Dzień 6
      1. Usunąć 166 μl pożywki z każdej studzienki i dodać 166 μl RPMI 1640 z dodatkiem B-27. Inkubować przez 24 godziny w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
    6. Dzień 7
      1. Aby wywołać różnicowanie proepicardial, należy usunąć 166 μl pożywki z każdej studzienki i dodać 166 μl świeżego RPMI 1640 zawierającego suplement B-27 i 3 μM CHIR99021 dla końcowego stężenia studzienki 2 μM CHIR99021. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
      2. Usuń 166 μl pożywki z każdej studzienki i dodaj 166 μl świeżego RPMI 1640 zawierającego suplement B-27. Inkubować przez 48 godzin w temperaturze 37 °C, 5% CO2,
        UWAGA: Zaleca się szczególną ostrożność przy tej drugiej zmianie pożywki w dniu 7, ponieważ organoidy są bardziej podatne na ruch z powodu zmian pożywki.
      3. Od 7 dnia aż do pobrania lub przeniesienia do analiz lub doświadczeń, należy zmieniać pożywkę co 48 godzin, usuwając 166 μl pożywki z każdej studzienki i dodając 166 μl świeżego RPMI 1640 zawierającego suplement B-27.
        UWAGA: Organoidy są gotowe do analiz i eksperymentów w 15 dniu, chyba że interesujące są wcześniejsze stadia rozwojowe. Można je hodować po 15 dniu w celu długoterminowej hodowli lub eksperymentów dojrzewania.

3. Analiza organoidów

  1. Przenoszenie całych organoidów (żywych lub stałych)
    UWAGA: W przypadku transferu żywych organoidów należy upewnić się, że używane końcówki pipet są sterylne.
    1. Odetnij końcówkę końcówki pipety P200 na odległość 5-10 mm od otworu końcówki, co spowoduje uzyskanie szerokiego otworu o średnicy ~2-3 mm.
    2. Włóż końcówkę prosto do studzienki okrągłodennej zawierającej organoid, tak aby pipeta była całkowicie pionowa (prostopadła do płytki). Upewnij się, że tłok pipety jest już całkowicie dociśnięty przed włożeniem końcówki do medium.
    3. Powoli zwolnić tłok pipety, pobierając wystarczającą ilość podłoża (100-200 μl) do zebrania organoidu.
    4. Przenieść organoid w pożywce do miejsca docelowego (np. w celu utrwalenia, obrazowania na żywo, zapisu elektrofizjologii, hodowli nowej płytki).
  2. Organoidy mocujące
    UWAGA: Utrwalanie i barwienie organoidów można wykonać na 96-dołkowej płytce hodowlanej lub w probówkach do mikrowirówek. Z paraformaldehydem (PFA) należy obchodzić się wyłącznie pod wyciągiem.
    1. W celu utrwalenia w probówkach do mikrowirówek, żywe organoidy należy przenieść do oddzielnych probówek zawierających 1-8 organoidów w probówce.
      UWAGA: Nie należy przekraczać ilości 8 organoidów w probówce.
    2. Ostrożnie wyjąć i wyrzucić jak najwięcej pożywki z probówki, nie dotykając organoidów.
    3. Dodaj 4% PFA do każdej probówki lub studzienki (300-400 μl na probówkę mikrowirówki i 100-200 μl na dołek na 96-dołkowej płytce). Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30-45 min.
      UWAGA: Czas inkubacji powyżej 1 godziny może wymagać etapów pobierania antygenu i nie jest zalecany.
    4. Bezpiecznie wyrzucić PFA, nie naruszając organoidów. Wykonaj 3 prania z DPBS uzupełnionym 1,5 g/L glicyny (DPBS/Gly), używając tej samej objętości, która została użyta do 4% PFA, odczekując 5 minut między praniami. Usunąć DPBS/Gly i przystąpić do barwienia immunologicznego lub innych analiz lub dodać DPBS i przechowywać w temperaturze 4 °C do wykorzystania w przyszłości przez okres do 2 tygodni.
      UWAGA: Przechowywanie utrwalonych organoidów dłużej niż 2 tygodnie może spowodować degradację i zanieczyszczenie tkanek i nie jest zalecane.
  3. Barwienie immunofluorescencyjne w całości
    1. Dodać 100 μl roztworu blokującego/przepuszczalnego (10% normalnej surowicy osła + 0,5% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) + 0,5% Triton X-100 w 1x DPBS) do każdej studzienki lub probówki zawierającej utrwalone organoidy. Inkubować w temperaturze pokojowej przez noc na shakerze.
      UWAGA: Nie należy przekraczać ilości 8 organoidów w probówce.
    2. Ostrożnie usunąć i wyrzucić jak najwięcej roztworu blokującego, nie dotykając organoidów. Wykonaj 3 prania z DPBS, odczekując 5 min między praniami.
    3. Przygotować roztwór przeciwciał pierwszorzędowych (1% normalna surowica osła + 0,5% BSA + 0,5% Triton X-100 w 1x DPBS) z pożądanymi przeciwciałami pierwszorzędowymi w zalecanych stężeniach. Inkubować w temperaturze 4 °C przez 24 godziny na wytrząsarce.
    4. Ostrożnie usunąć i wyrzucić jak najwięcej roztworu przeciwciała, nie dotykając organoidów. Wykonaj 3 prania z DPBS, odczekując 5 min między praniami.
    5. Przygotować roztwór przeciwciał drugorzędowych (1% normalna surowica osła + 0,5% BSA + 0,5% Triton X-100 w 1x DPBS) z pożądanymi przeciwciałami drugorzędowymi w zalecanych stężeniach. Jeżeli przeciwciała są znakowane fluorescencyjnie, inkubować w temperaturze 4 °C w ciemności (np. przykryte folią aluminiową) przez 24 godziny na wytrząsarce.
    6. Ostrożnie usunąć i wyrzucić jak najwięcej roztworu przeciwciała, nie dotykając organoidów. Wykonaj 3 prania z DPBS, odczekując 5 min między praniami.
    7. Przygotować szkiełka z koralikami (o średnicy 90-300 μm) zamontowanymi w podłożu montażowym (patrz Tabela Materiałów) w pobliżu krawędzi szkiełka, w którym zostanie umieszczone szkiełko nakrywkowe z organoidami.
      UWAGA: Zaleca się, aby przed kontynuowaniem pozostawić medium montażowe wokół koralików do wyschnięcia; Zapobiegnie to przesuwaniu się koralików. Zobacz Rysunek 2.
    8. Przenieść wybarwione organoidy za pomocą wyciętej końcówki pipety na szkiełko, między kulkami, zachowując odstępy, aby uniknąć kontaktu między organoidami po umieszczeniu na szkiełku. Użyj rogu zwiniętej chusteczki laboratoryjnej, aby ostrożnie usunąć nadmiar płynu wokół organoidu.
    9. Przykryj organoidy podłożem do czyszczenia montażowego (roztwór oczyszczający fruktoza i glicerol to 60% (obj./obj.) glicerolu i 2,5 M fruktozy)37, używając 120-150 μl podłoża do czyszczenia montażowego na szkiełko.
      UWAGA: Zaleca się używanie naciętej końcówki pipety podczas pracy z medium montażowo-czyszczącym, ponieważ jest ono bardzo lepkie.
    10. Zawieś szkiełko nakrywkowe na szkiełko podstawowe z organoidami pokrytymi roztworem montażowo-czyszczącym i powoli dociśnij szkiełko nakrywkowe do szkiełka, upewniając się, że organoidy znajdują się między zamontowanymi koralikami.
    11. Uszczelnij obwód szkiełka nakrywkowego na szkiełku za pomocą lakieru do paznokci w warstwie nawierzchniowej. Pozostaw szkiełko do wyschnięcia w ciemności w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Przechowywać w temperaturze 4 °C w ciemności do długotrwałego przechowywania.
  4. Obrazowanie stanów przejściowych wapnia w żywych organoidach serca
    UWAGA: Zgodnie z instrukcjami producenta, Fluo4-AM rozpuszczono w dimetylosulfotlenku (DMSO) do końcowego stężenia roztworu podstawowego 0,5 mM. Fluo4-AM dodano bezpośrednio do dołka organoidowego w 96-dołkowej płytce.
    1. Wykonaj 2 płukania organoidów za pomocą pożywki RPMI 1640.
      1. Usunąć 166 μl zużytego podłoża ze studzienki.
      2. Dodać 166 μl podgrzanej pożywki RPMI 1640, usunąć 166 μl pożywki i dodać 166 μl świeżej pożywki RPMI 1640.
        UWAGA: Mycie odbywa się w celu usunięcia odpadów i resztek komórek. Dwie trzecie pożywki jest usuwane ze studzienek podczas płukania, aby uniknąć naruszenia organoidów na dnie studzienki przed testem funkcjonalnym.
    2. Dodaj pożywkę Fluo4-AM do organoidów.
      1. Dodaj Fluo4-AM rozpuszczony w DMSO do RPMI 1640 zawierającego suplement B-27, aby przygotować roztwór 1,5 μM.
      2. Usunąć 166 μl pożywki ze studzienki.
      3. Dodać 166 μL 1,5 μM Fluo4-AM do RPMI 1640 zawierającego suplement B-27, aby uzyskać końcowe stężenie studzienki 1 μM. Inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 30 min.
    3. Wykonaj 2 prania, jak w kroku 3.4.1.
    4. Dodać do studzienki 166 μl RPMI 1640 zawierającego suplement B-27.
    5. Za pomocą odciętej końcówki pipety P200 przenieś organoid na szalkę Petriego ze szklanym dnem (np. 8-dołkową komorową szklaną szklaną pokrywę z wysokowydajnym szkłem nakrywkowym #1,5) ze 100-200 μl podłoża.
      UWAGA: Patrz sekcja 3.1 dotycząca przenoszenia całych organoidów.
    6. Wyobraź sobie, że organoidy żyją pod mikroskopem z komorą o kontrolowanej temperaturze i CO2 w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
    7. Nagraj kilka filmów trwających 10-20 s w różnych miejscach organoidu, pokazując wzrost i spadek poziomu intensywności fluorescencji, gdy wapń wchodzi i wychodzi z komórek.
      UWAGA: W przypadku nagrań w wysokiej rozdzielczości zaleca się nagrywanie z prędkością 10 kl./s lub większą; Zalecane jest 50 kl./s.
    8. Analizuj filmy za pomocą oprogramowania do analizy obrazu (np. ImageJ), wybierając obszary zainteresowania i mierząc poziomy intensywności w czasie.
    9. Znormalizuj nagrania intensywności za pomocą ΔF/F0 w funkcji czasu w milisekundach i wykreśl.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby osiągnąć samoorganizujące się hHO in vitro, zmodyfikowaliśmy i połączyliśmy wcześniej opisane protokoły różnicowania dla jednowarstwowego różnicowania 2D kardiomiocytów21 i komórek nasierdziowych22 za pomocą modulatorów szlaku Wnt i dla organoidów przedsercowych 3D16 za pomocą czynników wzrostu BMP4 i Activin A. Korzystając z protokołu różnicowania EB i hHO na 96-dołkowej płytce opisanego tutaj i pokazanego w Rysunek ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ostatnie postępy w dziedzinie kardiomiocytów pochodzących z ludzkich komórek macierzystych i innych komórek pochodzenia sercowego zostały wykorzystane do modelowania rozwoju ludzkiego serca 22,24,25 i chorób 26,27,28 oraz jako narzędzia do badań przesiewowych terapii 29,30 i cz...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez National Heart, Lung, and Blood Institute of the National Institutes of Health pod numerami nagród K01HL135464 i R01HL151505 oraz przez American Heart Association pod numerem nagrody 19IPLOI34660342. Pragniemy podziękować MSU Advanced Microscopy Core i dr Williamowi Jacksonowi z Wydziału Farmakologii i Toksykologii MSU za dostęp do mikroskopów konfokalnych, IQ Microscopy Core i MSU Genomics Core za usługi sekwencjonowania. Pragniemy również podziękować wszystkim członkom Laboratorium Aguirre za ich cenne uwagi i rady.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Przeciwciała
Alexa Fluor 488 Osioł anty-myszInvitrogenA-212021:200
Alexa Fluor 488 Osioł anty- królikInvitrogenA-212061:200
Alexa Fluor 594 Osioł anty-myszInvitrogenA-212031:200
Alexa Fluor 594 Osioł anty- królikInvitrogenA-212071:200
Alexa Fluor 647 Osioł anty- kozaInvitrogenA328491:200
HAND1Abcamab196622Królik; 1:200
HAND2Abcamab200040Królik; 1:200
NFAT2Abcamab25916Królik; 1:100
PECAM1DSHBP2B1Królik; 1:50
TNNT2Abcamab8295Mysz; 1:200
THY1Abcamab133350Królik; 1:200
TJP1InvitrogenPA5-19090Koza; 1:250
VIMAbcamab11256Koza; 1:250
WT1Abcamab89901Królik; 1:200
Pożywki i odczynniki
AccutaseInnovative Cell TechnologiesNC9464543odczynnik do dysocjacji komórek
Activin AR& D Systems338AC010
B-27 Suplement (bez insuliny)GibcoA1895601bezinsulinowy suplement do hodowli komórkowych
B-27 SuplementGibco17504-044Suplement do hodowli komórkowych
BMP-4GibcoPHC9534
Albumina surowicy bydlęcejBioworld50253966
CHIR-99021Selleck442310
D-(-)-FruktozaMillipore SigmaF0127
DAPIThermo Scientific622481:1000
Dimethyl SulfoxideMillipore SigmaD2650
DMEM/F12Gibco10566016
Essential 8 Flex Medium KitGibcoA2858501pożywka z pluripotencjalnych komórek macierzystych (PSC) zawierająca 1% penicylina-streptomycyna
Fluo4-AMInvitrogenF14201
GlicerolMillipore SigmaG5516
GlicynaMilipore Sigma410225
Matrigel GFRCorningCB40230Macierz zewnątrzkomórkowa błony podstawnej (BM-ECM)
Normalna surowica osłaMillipore SigmaS30-100mL
ParaformaldehydMP BiomedicalsIC15014601Proszek rozpuszczony w buforze PBS – stosować w 4%
Roztwór buforowy fosforanowy
Bufor fosforanowy (10x)Gibco70011044
7315590 &mikro; m
ReLeSRStem Cell TechnologiesNC0729236odczynnik dysocjacyjny do hPSC
RPMI 1640Gibco11875093
TiazovivinMillipore SigmaSML1045
Triton X-100Millipore SigmaT8787
Trypan Blue SolutionGibco1525006
VECTASHIELD Vibrance Antifade Montaż podłożaVector LaboratoriesH170010
WNT-C59SelleckNC0710557
Inne
probówki do mikrowirówek 1,5 mlFisher Scientific02682002
15 ml Falcon Probówki FisherScientific1495970C
2 mL Fiolki kriogeniczneCorning13-700-500
50 ml zbiorników na odczynnikiFisherbrand13681502
6-dołkowe płytki do hodowli komórkowych z płaskim dnemCorning0720083
8 Dobrze komorowa pokrywa Szkło z wysokowydajnym szkłem nakrywkowym #1.5CellvisC8-1.5H-N 96-well
Clear Ultra Low Attachment MicroplatesCostar07201680
ImageJObraz NIH oprogramowanie do przetwarzania
KimwipesKimberly-Clark Professional06-666chusteczki laboratoryjne
Cover GlassVWR48393-24124 x 50 mm nr 1.5
Szkiełka mikroskopoweFisherbrand1255015
Moxi Cell CounterOrflo Technologies  MXZ001
Kaseta licznika komórek Moxi Z – Typ MOrflo  TechnologieMXC001
Pipety wielokanałoweFisherbrandFBE120030030-300 & mikro; L
Olympus cellVivoOlympusdo obrazowania kalektu, analiza za pomocą Imagej
Wirówka Sorvall Legend X1Mikser termiczny ThermoFisher Scientific75004261
ThermoFisher Scientific13-687-717
Top Coat Nail VarishSeche ViteMożna kupić w każdym supermarkecie
15140122 Gibco Gibco 10010049 Polybead Microspheres Polysciences, Inc. Micro

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hoffman, J. I. E., Kaplan, S. The incidence of congenital heart disease. Journal of the American College of Cardiology. 39 (12), 1890-1900 (2002).
  2. Wu, W., He, J., Shao, X. Incidence and mortality trend of congenital heart disease at the global, regional, and national level, 1990-2017. Medicine. 99 (23), 20593(2020).
  3. Fahed, A. C., Gelb, B. D., Seidman, J. G., Seidman, C. E. Genetics of congenital heart disease: the glass half empty. Circulation Research. 112 (4), 707-720 (2013).
  4. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
  5. Mansour, A. A., et al. An in vivo model of functional and vascularized human brain organoids. Nature Biotechnology. 36, 432-441 (2018).
  6. Homan, K. A., et al. Flow-enhanced vascularization and maturation of kidney organoids in vitro. Nature Methods. 16 (3), 255-262 (2019).
  7. Uchimura, K., Wu, H., Yoshimura, Y., Humphreys, B. D. Human pluripotent stem cell-derived kidney organoids with improved collecting duct maturation and injury modeling. Cell Reports. 33 (11), 108514(2020).
  8. Serra, D., et al. Self-organization and symmetry breaking in intestinal organoid development. Nature. 569, 66-72 (2019).
  9. Mithal, A., et al. Generation of mesenchyme free intestinal organoids from human induced pluripotent stem cells. Nature Communications. 11, 215(2020).
  10. Porotto, M., et al. Authentic modeling of human respiratory virus infection in human pluripotent stem cell-derived lung organoids. mBio. 10 (3), 00723(2019).
  11. Dye, B. R., et al. In vitro generation of human pluripotent stem cell derived lung organoids. Elife. 4, 05098(2015).
  12. Mun, S. J., et al. Generation of expandable human pluripotent stem cell-derived hepatocyte-like liver organoids. Journal of Hepatology. 71 (5), 970-985 (2019).
  13. Vyas, D., et al. Self-assembled liver organoids recapitulate hepatobiliary organogenesis in vitro. Hepatology. 67 (2), 750-761 (2018).
  14. Dossena, M., et al. Standardized GMP-compliant scalable production of human pancreas organoids. Stem Cell Research & Therapy. 11, 94(2020).
  15. Georgakopoulos, N., et al. Long-term expansion, genomic stability and in vivo safety of adult human pancreas organoids. BMC Developmental Biology. 20 (1), 4(2020).
  16. Andersen, P., et al. Precardiac organoids form two heart fields via Bmp/Wnt signaling. Nature Communications. 9, 3140(2018).
  17. Rossi, G., et al. Capturing cardiogenesis in gastruloids. Cell Stem Cell. 28 (2), 230-240 (2021).
  18. Lee, J., et al. In vitro generation of functional murine heart organoids via FGF4 and extracellular matrix. Nature Communications. 11 (1), 4283(2020).
  19. Drakhlis, L., et al. Human heart-forming organoids recapitulate early heart and foregut development. Nature Biotechnology. 39 (6), 737-746 (2021).
  20. Hofbauer, P., et al. Cardioids reveal self-organizing principles of human cardiogenesis. Cell. 184 (12), 3299-3317 (2021).
  21. Bao, X., et al. Directed differentiation and long-term maintenance of epicardial cells derived from human pluripotent stem cells under fully defined conditions. Nature Protocols. 12 (9), 1890-1900 (2017).
  22. Bao, X., et al. Long-term self-renewing human epicardial cells generated from pluripotent stem cells under defined xeno-free conditions. Nature Biomedical Engineering. 1, 0003(2016).
  23. Lewis-Israeli, Y., et al. Self-assembling human heart organoids for the modeling of cardiac development and congenital heart disease. Nature Communications. 12, 5142(2021).
  24. Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (27), 1848-1857 (2012).
  25. Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. Production of de novo cardiomyocytes: Human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming. Cell Stem Cell. 10 (1), 16-28 (2012).
  26. Hashem, S. I., et al. Impaired mitophagy facilitates mitochondrial damage in Danon disease. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 108, 86-94 (2017).
  27. Sun, N., et al. Patient-specific induced pluripotent stem cells as a model for familial dilated cardiomyopathy. Science Translational Medicine. 4 (130), (2012).
  28. Stroud, M. J., et al. Luma is not essential for murine cardiac development and function. Cardiovascular Research. 114 (3), 378-388 (2018).
  29. Liang, P., et al. Drug screening using a library of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes reveals disease-specific patterns of cardiotoxicity. Circulation. 127 (16), 1677-1691 (2013).
  30. Mills, R. J., et al. Functional screening in human cardiac organoids reveals a metabolic mechanism for cardiomyocyte cell cycle arrest. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (40), 8372-8381 (2017).
  31. Braam, S. R., et al. Prediction of drug-induced cardiotoxicity using human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cell Research. 4 (2), 107-116 (2010).
  32. Burridge, P. W., et al. Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes recapitulate the predilection of breast cancer patients to doxorubicin-induced cardiotoxicity. Nature Medicine. 22 (5), 547-556 (2016).
  33. Pinto, A. R., et al. Revisiting cardiac cellular composition. Circulation Research. 118 (3), 400-409 (2017).
  34. Bertero, A., et al. Dynamics of genome reorganization during human cardiogenesis reveal an RBM20-dependent splicing factory. Nature Communications. 10 (1), 1538(2019).
  35. Gilbert, S. F. Lateral plate mesoderm: Heart and Circulatory System. Developmental Biology. 6th edition. , Sinauer Associates. Sunderland (MA). 591-610 (2000).
  36. Richards, D. J., et al. Human cardiac organoids for the modelling of myocardial infarction and drug cardiotoxicity. Nature Biomedical Engineering. 4 (4), 446-462 (2020).
  37. Lewis-Israeli, Y. R., Wasserman, A. H. Heart Organoids and Engineered Heart Tissues: Novel Tools for Modeling Human Cardiac Biology and Disease. Biomolecules. 1277, (2021).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Human Heart OrganoidsPluripotent Stem CellsSelf Assembling OrganoidsWnt Signaling ModulationEmbryoid BodiesCardiac Mesoderm DifferentiationImmunofluorescence ImagingCalcium ImagingCardiomyocyte SpecificationVascular Network Formation

Related Articles