Artykuł metodologiczny

Izolacja, rozmnażanie i identyfikacja gatunków bakterii o właściwościach metabolizowania węglowodorów z siedlisk wodnych

DOI:

10.3791/63101

⸱

7 grudnia 2021

 , 
1Department of Life Sciences, School of Natural Sciences, Shiv Nadar University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiamy proces izolacji, rozmnażania i charakteryzowania bakterii rozkładających węglowodory z siedlisk wodnych. W protokole opisano izolację bakterii, identyfikację metodą 16S rRNA oraz badanie ich potencjału degradacji węglowodorów. Ten artykuł pomoże naukowcom w scharakteryzowaniu różnorodności biologicznej drobnoustrojów w próbkach środowiskowych, a w szczególności w badaniach przesiewowych pod kątem drobnoustrojów o potencjale bioremediacji.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zanieczyszczenia węglowodorowe są odporne na degradację, a ich akumulacja w środowisku jest toksyczna dla wszystkich form życia. Bakterie kodują liczne enzymy katalityczne i są naturalnie zdolne do metabolizowania węglowodorów. Naukowcy wykorzystują różnorodność biologiczną w ekosystemach wodnych do izolowania bakterii o potencjale biodegradacji i bioremediacji. Takie izolaty ze środowiska zapewniają bogaty zestaw szlaków metabolicznych i enzymów, które można dalej wykorzystać do zwiększenia skali procesu degradacji na skalę przemysłową. W tym artykule nakreśliliśmy ogólny proces izolacji, rozmnażania i identyfikacji gatunków bakterii z siedlisk wodnych oraz badamy ich zdolność do wykorzystania węglowodorów jako jedynego źródła węgla in vitro przy użyciu prostych technik. Niniejszy protokół opisuje izolację różnych gatunków bakterii i ich późniejszą identyfikację za pomocą analizy 16S rRNA. W protokole przedstawiono również etapy charakterystyki potencjału degradacji węglowodorów izolatów bakteryjnych. Protokół ten będzie przydatny dla naukowców próbujących wyizolować gatunki bakterii z siedlisk środowiskowych do ich zastosowań biotechnologicznych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Węglowodory (HC) są szeroko stosowane zarówno jako paliwa, jak i w zastosowaniach chemicznych. Węglowodory aromatyczne, takie jak benzen, toluen i ksylen, są szeroko stosowane jako rozpuszczalniki1. Alkeny, takie jak etylen i propylen, służą jako prekursory w syntezie odpowiednio polimerów polietylenu i polipropylenu. Polimeryzacja innego węglowodoru, styrenu, tworzy polistyren. Działania antropogeniczne wprowadzają węglowodory do środowiska podczas ich produkcji i transportu. Zanieczyszczenie gleby i wody węglowodorami stanowi poważne zagrożenie dla środowiska i zdrowia ludzkiego. Mikroorganizmy odgrywają ważną rolę w utrzymaniu ekosystemu, regulując cykle biogeochemiczne i wykorzystując szeroką gamę substratów, w tym zanieczyszczenia i ksenobiotyki, przekształcając je w węgiel i źródło energii. Ten proces detoksykacji zanieczyszczeń środowiska przez mikroorganizmy jest znany jako bioremediacja3,4,5,6,7.

Mikroorganizmy zdolne do rozkładu węglowodorów znajdują się w siedliskach wodnych i glebowych8,9,10. Zidentyfikowano wiele bakterii o potencjale degradacji alkanów i aromatycznych HC, takich jak Pseudomonas, Acinetobacter, Rhodococcus, Marinobacter i Oleibacter11. Rozwój zaawansowanych technologicznie podejść niezależnych od kultur pomógł odkryć nowe społeczności mikrobiologiczne rozkładające HC12. Materiał genomowy wyizolowany bezpośrednio z próbek źródłowych jest amplifikowany i sekwencjonowany za pomocą metod o wysokiej przepustowości, takich jak sekwencjonowanie nowej generacji (NGS), po którym następuje analiza, eliminując potrzebę hodowli mikroorganizmów. Metody NGS, takie jak analiza metagenomu, są drogie i mają wady związane z procesem amplifikacji13. Techniki uprawy, takie jak selektywna hodowla wzbogacająca14, które mają na celu izolację mikroorganizmów rozkładających węglowodory, są nadal użyteczne, ponieważ pozwalają naukowcom badać i manipulować szlakami metabolicznymi w izolatach bakteryjnych.

Izolacja genomowego DNA i późniejsze sekwencjonowanie materiału genomowego ujawnia cenne informacje o każdym organizmie. Sekwencjonowanie całego genomu pomaga w identyfikacji genów kodujących oporność na antybiotyki, potencjalnych celów leków, czynników wirulencji, transporterów, enzymów metabolizujących ksenobiotyki itp15,16,17. Udowodniono, że sekwencjonowanie genu kodującego 16SrRNA jest solidną techniką identyfikacji filogenezy bakteryjnej. Zachowanie sekwencji i funkcji genu na przestrzeni lat sprawia, że jest to niezawodne narzędzie do identyfikacji nieznanych bakterii i porównywania izolatu z najbliższymi gatunkami. Ponadto długość tego genu jest optymalna dla analizy bioinformatycznej18. Wszystkie te cechy, wraz z łatwością amplifikacji genów za pomocą uniwersalnych starterów i ulepszeniem technologii sekwencjonowania genów, sprawiają, że jest to złoty standard w identyfikacji drobnoustrojów.

Tutaj opisujemy procedurę odzyskiwania mikroorganizmów hodowlanych z potencjałem degradacji HC z próbek środowiskowych. Opisana poniżej metoda przedstawia pobieranie i identyfikację bakterii rozkładających HC i jest podzielona na pięć sekcji: (1) pobieranie bakterii z próbek wody, (2) izolacja czystych kultur, (3) badanie zdolności izolatów bakteryjnych do rozkładu HC, (4) izolacja genomowego DNA oraz (5) identyfikacja na podstawie sekwencjonowania genu 16S rRNA i analizy BLAST. Procedura ta może być dostosowana do izolowania bakterii do wielu różnych zastosowań biotechnologicznych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Pobieranie, przetwarzanie i analiza próbek

UWAGA: Tutaj prezentujemy protokół izolacji bakterii z siedlisk wodnych. Niektóre z izolatów mogą być chorobotwórcze, dlatego należy nosić rękawice i dezynfekować miejsce pracy przed i po użyciu.

  1. Zbierz 500 ml próbki wody w pięciu sterylnych szklanych butelkach z różnych miejsc zbiornika wodnego. Zmierz pH i temperaturę każdej próbki za pomocą odpowiednio pH-metru i termometru.
    UWAGA: Protokół nie jest specyficzny dla danego miejsca i można go łatwo dostosować do izolowania organizmów z zbiorników wodnych skażonych węglowodorami.
  2. Przefiltrować próbkę w partii 100 ml przez arkusze filtracyjne o wielkości porów 0,22 μm, w warunkach aseptycznych.
    UWAGA: Średnica bibuły filtracyjnej nie powinna przekraczać średnicy szalki Petriego. Na przykład bibuła filtracyjna o średnicy nieprzekraczającej 85 mm jest optymalna dla szalki Petriego o średnicy 100-120 mm.
  3. Trzymaj bibuły filtracyjne na różnych płytkach z pożywkami (PYE19, R2A20, M9, LB, NB, TSB, M6321 i M2G22). Różne rodzaje pożywek hodowlanych umożliwiają selekcję i wzbogacanie różnych mikroorganizmów. Składy różnych pożywek wzrostowych wymieniono w tabeli 1. Użyj jednego papieru na każdą płytkę z podłożem i odklej po 2 godzinach za pomocą sterylnych kleszczyków.
  4. Próbki wody niefiltrowanej (rozcieńczenie 10:6) należy rozcieńczyć seryjnie w sterylnej wodzie podwójnie destylowanej, dodając 100 μl pobranej próbki wody do 900 μl sterylnej wody. Powoduje to rozcieńczenie 1:10. Z tej próbki pobrać 100 μl i dodać 900 μl sterylnej wody, aby uzyskać rozcieńczenie 1:100. Powtarzać rozcieńczenie, aż wielkość zawijania rozcieńczenia wyniesie 1:1 000 000. Wymieszać pipetując. Ostateczna objętość każdego rozcieńczenia wynosi 1 ml.
  5. Rozprowadzić 100 μl rozcieńczonej próbki wody pojedynczo na wszystkich płytkach z podłożami wzrostowymi wymienionymi w kroku 3 w trzech egzemplarzach.
  6. Inkubować płytki w temperaturze 30 °C przez 24 do 48 godzin, w zależności od wzrostu kolonii.
    UWAGA: Większość izolatów środowiskowych rośnie w optymalnej temperaturze 30 °C. W przypadku izolowania próbek ze środowiska o ekstremalnych temperaturach, należy inkubować płytki w tej samej temperaturze, co temperatura w miejscu pobierania.
  7. Następnie zbierz kolonie za pomocą sterylnej wykałaczki lub końcówki pipety i wykonaj smugi kwadrantowe, aby uzyskać izolowane kolonie.
  8. Inkubuj płytki przez noc. Następnego dnia przesiewaj kolonie na podstawie ich cech morfologicznych, takich jak kolor, tekstura, kształt, rozmiar, margines, wysokość itp. Uzupełnij kolonie, aby uzyskać czyste kultury.
  9. Wykonaj barwienie metodą Grama każdej czystej kultury23 i przystąp do przygotowania surowca glicerolowego.
  10. Aby przygotować zapasy glicerolu, należy zaszczepić pojedynczą kolonię w 3 ml odpowiedniej pożywki wzrostowej i inkubować w temperaturze 30 °C. Z nocnej hodowli weź 700 μL i dodaj 300 μL 100% glicerolu (sterylizowanego w autoklawie) w cryovials24. Zamrozić fiolki w temperaturze -80 °C w celu długotrwałego przechowywania.

2. Degradacja węglowodorów

UWAGA: Poniższy przykład służy do przesiewania izolatów, które mogą rozkładać styren. Jest to niewielka modyfikacja metody zaadaptowanej w poprzednim raporcie25. Postępuj zgodnie z instrukcjami w warunkach aseptycznych.

  1. Ze świeżo udekorowanego talerza wybierz kolonię i zaszczep ją w 5 ml bulionu sojowego tryptycznego (TSB)/bulionu odżywczego (NB). Hodować kulturę przez noc w temperaturze 30 °C z wytrząsaniem przy 200 obr./min, aż absorpcja osiągnie ~2,
    UWAGA: Inne niż TSB/NB można wybrać dowolną pożywkę wzrostową, w której bakterie osiągają wysoką gęstość komórek.
  2. Następnego dnia zagnieździć komórki w temperaturze 2862 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant.
  3. Przepłukać granulki dwukrotnie 2 ml autoklawizowanego roztworu soli fizjologicznej (0,9% NaCl) i wirować w temperaturze 2862 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Sól fizjologiczna jest izotoniczna, dzięki czemu utrzymuje ciśnienie osmotyczne wewnątrz komórek bakteryjnych.
  4. Zawiesić osad w 2 ml ciekłego, bezwęglowego podłoża podstawowego (LCFBM). Zmierzyć absorbancję (OD600).
  5. Weź dwie sterylne kolby Erlenmeyera o pojemności 150 ml do kontroli i grupy doświadczalnej. Oznacz je jako A i B.
  6. W grupie nieinokulowanej/kontrolnej (kolba A) dodać 40 ml LCFBM i styrenu (5 mM).
  7. Do kolby B dodać 35 ml LCFBM i styrenu (dostosować końcowe stężenie styrenu do 5 mM). Dodać zawiesinę komórek z końcowym OD600 komórek ≈ 0,1 i uzupełnić pozostałą objętość za pomocą LCFBM do 40 ml. Inkubować kolby w temperaturze 30 °C z wytrząsaniem przy 200 obr./min przez 30 dni><. UWAGA: Nadmiar węglowodorów może być toksyczny dla drobnoustrojów, dlatego zacznij od niskiego stężenia i stopniowo je zwiększaj.
  8. Powtórzyć powyższe czynności dla każdego dodatkowego szczepu, który musi zostać oceniony pod kątem degradacji węglowodorów.
  9. Mierzyć średnicę zewnętrzną600 każdej kolby co 5 dni i wykreślać krzywą wzrostu. Wydłuż inkubację do 45 dni, jeśli bakterie mogą wykorzystywać styren. Wzrost OD600 wskazuje, że bakteria może metabolizować styren.

3. Badania przesiewowe degradacji katecholi przez izolaty bakteryjne

UWAGA: Degradacja węglowodorów aromatycznych, takich jak styren, benzen, ksylen, naftalen, fenole, itp., wytwarza katechole jako produkty pośrednie reakcji. Katechole są dalej metabolizowane przez bakterie za pomocą enzymów 1,2-dioksygenazy katecholowej i dioksygenazy katecholu 2,3-katecholu odpowiednio przez szlaki orto- i meta-rozszczepienia26. Enzymy te biorą również udział w degradacji innych węglowodorów, takich jak chlorobenzen27. Wspomniany poniżej protokół wykorzystuje lizat całych komórek do testu enzymatycznego katecholu 2, 3-dioksygenazy28. Ta sama metoda lizy może być stosowana do badania przesiewowego aktywności katecholu 1, 2-dioksygenazy. Jednak skład mieszaniny reakcyjnej będzie się różnił. Oba enzymy są z natury indukowane i mogą być indukowane przez dodanie fenolu do pożywki wzrostowej.

  1. Za pomocą sterylnej pętli zaszczepij kolonię bakteryjną ze świeżo prążkowanej płytki do pożywki z soli mineralnych (MSM) uzupełnionej 1-4 mM fenolu. Inkubować kulturę w temperaturze 30 °C i 200 obr./min. Zebrać kulturę w temperaturze 4 °C, gdy OD600 osiągnie wartość 1,4-1,6 (tj. w późnej fazie wykładniczej), wirując w temperaturze 4500 x g przez 20 minut.
  2. Przemyć osad komórkowy buforem fosforanowym (0,5 M, pH 7,5).
  3. Ponownie zawiesić komórki w wyżej wymienionym buforze fosforanowym i dostosować końcowy OD600 ≈ 1,0.
  4. Lizować komórki za pomocą pulsacyjnej sonikacji przez 1,5 minuty, przy czym czas trwania każdego impulsu wynosi 15 s. Po tym kroku zawiesina musi być czysta lub mniej mętna. Jeśli nie, zwiększ liczbę impulsów i sprawdź, czy zawieszenie jest czyste. Po każdym impulsie należy przechowywać próbkę na lodzie, aby uniknąć degradacji białka.
  5. Usunąć resztki komórek i nieuszkodzone komórki przez odwirowanie przy 9 000 x g przez 30 minut, utrzymując niską temperaturę (4 °C).
  6. Ostrożnie odpipetować klarowny supernatant. Ta frakcja zawiera surowy ekstrakt do oznaczania enzymów.
  7. Określ stężenie białka w surowym ekstrakcie metodą Bradforda lub Lowry'ego29,30.
  8. Aby określić aktywność 2,3-dioksygenazy katecholowej, należy zmierzyć tworzenie się końcowego produktu reakcji (semialdehydu 2-hydroksymukonowego) za pomocą spektrofotometru.
  9. Przygotować mieszaninę reakcyjną, dodając 20 μl katecholu (50 mM), 960 μl buforu fosforanowego (50 mM, pH 7,5) i 20 μl surowego ekstraktu.
  10. W celu kontroli ujemnej zastąpić surowy ekstrakt buforem fosforanowym i dostosować końcową objętość do 1 ml.
  11. Inkubować mieszaninę reakcyjną przez 30 minut. W ustalonych odstępach czasu mierzyć absorbancję przy 375 nm. Wzrost absorbancji wskazuje na powstawanie końcowego produktu reakcji, semialdehydu kwasu 2-hydroksymukonowego (2-HMS). Wykonaj eksperyment w trzech egzemplarzach.
    UWAGA: Catechol jest wrażliwy na światło i tlen. Mieszaninę reakcyjną należy przechowywać w ciemności i szczelnie zamykać probówki, aby zapobiec naturalnemu rozkładowi katecholu.

4. Izolacja genomowego DNA czystej kultury

UWAGA: To jest ogólny protokół izolacji genomowego DNA. Barwienie metodą Grama przeprowadzono na etapie pobierania, przetwarzania i analizy próbki. Ze względu na różnice w grubości ścianki komórkowej bakterii Gram-dodatnich i Gram-ujemnych, metoda lizy komórek jest odpowiednio modyfikowana. Podczas izolowania należy nosić rękawiczki i dezynfekować stół warsztatowy 70% etanolem, aby uniknąć degradacji DNA przez nukleazy. Niektóre z wymienionych poniżej chemikaliów mogą powodować poważne oparzenia skóry i należy zachować odpowiednią ostrożność podczas obchodzenia się z nimi.

  1. Izolacja genomowego DNA z bakterii Gram-ujemnych31.
    1. Wybierz pojedynczą kolonię i zaszczep ją w świeżej pożywce wzrostowej w sterylnych probówkach.
    2. Umieścić probówki w wytrząsarce inkubatora z prędkością 200 obr./min i pozostawić bakterie do wzrostu przez noc w temperaturze 30 °C.
    3. Następnego dnia zasyp 1,5 ml wyhodowanej przez noc kultury w temperaturze 12 400 x g przez 3 minuty.
    4. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 200 μl buforu do lizy (40 mM tris-octanu, pH 7,8, 20 mM octanu sodu, 1 mM EDTA, 1% SDS).
    5. Dodać 66 μl roztworu NaCl (5 M) i dobrze wymieszać.
    6. Otrzymaną mieszaninę osadzać w temperaturze 12 400 x g przez 10 minut (4 °C).
    7. Odpipetować klarowny sklarent sklarowany do probówki do mikrowirówki i dodać równą objętość chloroformu.
    8. Odwrócić roztwór kilkakrotnie mieszać, aż do uzyskania mlecznego roztworu.
    9. Wirować w temperaturze 12 400 x g przez 3 minuty i przenieść supernatant do czystej fiolki.
    10. Dodaj 1 ml lodowatego 100% etanolu; mieszaj przez odwrócenie, aż wytrącą się białe nici DNA.
    11. Odwirować wytrącone DNA w temperaturze 2 200 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant.
    12. Umyj osad DNA 1 ml 70% etanolu i pozostaw osad DNA do wyschnięcia na 5 minut w temperaturze pokojowej.
    13. Po wysuszeniu zawiesić osad w 100 μl 1x buforu Tris-EDTA(TE) i przechowywać DNA w temperaturze -20 °C.
    14. Zmierz stężenie (A260/280) za pomocą spektrofotometru i uruchom DNA na żelu agarozowym (1%), aby ocenić jakość DNA24.
  2. Izolacja genomowego DNA ze szczepu Gram-dodatniego32
    1. Wybierz pojedynczą kolonię i zaszczep ją w świeżej pożywce wzrostowej w sterylnych probówkach.
    2. Umieść probówki w wytrząsarce inkubatora z prędkością 200 obr./min i pozwól bakteriom rosnąć przez noc w odpowiedniej temperaturze wzrostu.
    3. Następnego dnia weź 1,5 ml wyhodowanej kultury i odwiruj przy 8 600 x g przez 5 minut.
    4. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w buforze TE.
    5. Wyreguluj OD600 = 1,0 za pomocą buforu TE i przenieś 740 μl zawiesiny komórek do czystej probówki do mikrofuge.
    6. Dodać 20 μl lizozymu (100 mg/ml bulionu) i dobrze wymieszać pipetując. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut (w suchej kąpieli).
    7. Dodaj 40 μl 10% SDS i dobrze wymieszaj.
    8. Dodać 8 μl proteinazy K (10 mg/ml). Dobrze wymieszać i inkubować w temperaturze 56 °C przez 1-3 godziny (w suchej kąpieli). Zawiesina powinna teraz stać się klarowna o zwiększonej lepkości, co oznacza efektywną lizę komórek.
      UWAGA: Zawiesinę można pozostawić na noc, jeśli komórki nie są prawidłowo zlizowane.
    9. Podgrzej mieszaninę CTAB/NaCl w temperaturze 65 °C (w suchej kąpieli) i dodaj 100 μl tej mieszaniny do zawiesiny komórek. Dobrze wymieszaj.
    10. Inkubować w temperaturze 65 °C przez 10 minut (w suchej kąpieli).
    11. Dodać 500 μl chloroformu: alkoholu izoamylowego (24:1) i dobrze wymieszać. Wirować w temperaturze 16 900 x g przez 10 minut w temperaturze 25 °C.
    12. Przenieść fazę wodną do świeżej probówki do mikrowirówki, unikając fazy organicznej (faza lepka na dole).
    13. Ostrożnie dodać 500 μl fenolu:chloroformu:alkoholu izoamylowego (25:24:1) i dobrze wymieszać. Wirować w temperaturze 16 900 x g przez 10 minut w temperaturze 25 °C.
    14. Pobrać fazę wodną do świeżej probówki do mikrowirówki. Dodać 500 μl chloroformu: alkoholu izoamylowego (24:1) i dobrze wymieszać.
    15. Przenieść fazę wodną i dodać 0,6 objętości izopropanolu (wstępnie schłodzonego w temperaturze -20 °C).
    16. Wytrącone nici DNA muszą być widoczne w formie nitkowatej. Inkubować w temperaturze -20 °C przez 2 godziny lub przez noc.
    17. Wirować przy 16 900 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C w celu osadzenia DNA.
    18. Ostrożnie zdekantować izopropanol i umyć granulat 1 ml zimnego 70% etanolu (wstępnie schłodzonego w temperaturze -20 °C) w celu usunięcia wszelkich zanieczyszczeń.
    19. Wirować przy 16 900 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant.
    20. Pozostaw granulat do wyschnięcia w temperaturze pokojowej przez 20 minut lub utrzymuj probówkę w temperaturze 37 °C. Upewnij się, że granulat nie jest przesuszony.
    21. Zawiesić w 100 μl 1x buforu TE i przechowywać DNA w temperaturze -20 °C.
      UWAGA: Jeśli osad zostanie nadmiernie przesuszony i trudno go ponownie zawiesić, należy inkubować probówkę do mikrowirówki z osadem DNA i wodą wolną od nukleaz w temperaturze 37 °C przez 15-20 minut i ponownie zawiesić przez pipetowanie.
    22. Zmierz stężenie (A260/280) za pomocą spektrofotometru po rozcieńczeniu 1:100 w buforze 1x TE i uruchom DNA na żelu agarozowym (1%), aby ocenić jakość DNA24.

5. Sekwencjonowanie 16S rRNA

UWAGA: Protokół opisany poniżej służy do amplifikacji i sekwencjonowania 16S rRNA do identyfikacji bakterii. Informacje pochodzące z sekwencji 16S rRNA są wykorzystywane do identyfikacji nieznanego organizmu i znalezienia pokrewieństwa między różnymi organizmami.

  1. Aby zidentyfikować szczepy, amplifikuj DNA wyizolowane z czystych kultur bakteryjnych metodą PCR z uniwersalnymi starterami ukierunkowanymi na sekwencję 16S rRNA dla bakterii: 27F (5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3') i 1492R (5'- TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3')33.
  2. Przygotuj mieszaninę PCR (25 μl reakcji) na lodzie z 18 μl wody autoklawowanej/wolnej od nukleaz, 2,5 μl 10x buforu, 0,5 μl starterów do przodu i do tyłu (zapas 100 μM), 2 μl mieszanki dNTPs (zapas 100 μM), 1 μl matrycy DNA (2-15 ng / μL) i 1 U polimerazy Taq.
  3. Do amplifikacji genu 16S rRNA należy zastosować następujące warunki cykliczne: początkowa denaturacja w temperaturze 94 °C przez 10 minut (końcowa denaturacja w temperaturze 94 °C przez 40 s, wyżarzanie startera w temperaturze 56 °C przez 1 minutę, przedłużenie w temperaturze 74 °C przez 2 minuty) x 30 cykli, końcowe przedłużenie w temperaturze 74 °C przez 10 minut.
  4. Po zakończeniu cyklu wymieszaj 5 μl próbki i 1 μl 5x barwnika ładującego DNA. Uruchom na 1% żelu agarozowym, aby sprawdzić amplifikację. Produkty PCR należy przechowywać przez krótki czas w temperaturze 4 °C lub zamrażać w temperaturze -20 °C do czasu dalszego użycia.
  5. W przypadku sekwencjonowania genu 16S rRNA należy przeprowadzić tę samą reakcję, jak wspomniano powyżej, dla większej objętości (100 μl).
  6. Oczyść amplikony do sekwencjonowania Sangera 24,34 za pomocą zestawu do oczyszczania produktu PCR lub wymieszaj całą próbkę z barwnikiem ładującym DNA i załaduj żel agarozowy, aby wykonać metodę ekstrakcji żelu.
  7. Po zakończeniu sekwencjonowania przekonwertuj plik wyników w formacie FASTA i sprawdź podobieństwo sekwencji za pomocą podstawowego narzędzia do wyszukiwania wyrównania lokalnego (BLAST) na NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)35.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Schemat przedstawiający całą procedurę izolacji i badania przesiewowego bakterii z siedlisk wodnych oraz ich późniejszej identyfikacji za pomocą analizy 16S rRNA jest przedstawiony w Rysunek 1. Próbki wody z terenów podmokłych w Ddri w Indiach zebrano w sterylnych szklanych butelkach i natychmiast przewieziono do laboratorium w celu przetworzenia. Próbki przepuszczono przez arkusze filtracyjne o wielkości porów 0,22 μm, a bibuły filtracyjne utrzymywano w kontakcie z różnymi ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Powszechnie wiadomo, że tylko około 1% bakterii na Ziemi może być łatwo hodowanych w laboratorium6. Nawet wśród bakterii hodowlanych wiele pozostaje niescharakteryzowanych. Udoskonalenia w metodach molekularnych nadały nowy wymiar analizie i ocenie społeczności bakteryjnych. Takie techniki mają jednak ograniczenia, ale nie sprawiają, że analizy kultur są zbędne. Techniki czystej hodowli w celu wyizolowania poszczególnych gatunków bakterii pozostają podstawowym mechanizmem charakterystyki właściwoś...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy dr Karthikowi Krishnanowi i członkom laboratorium RP za ich pomocne komentarze i sugestie. DS jest wspierany przez stypendium doktoranckie SNU i stypendium Earthwatch Institute India. Laboratorium RP jest wspierane przez grant CSIR-EMR oraz fundusze na rozpoczęcie działalności z Shiv Nadar University.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AgarozaSigma-AldrichA4718Elektroforeza żelowa
Chlorek amonu (NH4Cl)Sigma-AldrichA9434Składnik podłoża wzrostowego
Siarczan amonuSigma-AldrichA4418Składnik pożywki
Bacto-AgarMillipore1016141000Przygotowanie pożywki stałej
Chlorek wapnia (CaCl2)MERCKC4901-500GSkładnik pożywki wzrostowej
CatecholSigma-Aldrich135011Test degradacji węglowodorów
Bromek cetyltrimetyloamoniowy, CTABSigma-AldrichH6269Izolacja genomowego DNA
ChloroformHIMEDIAMB109Izolacja genomowego DNA
Fosforan disodowy (Na2HPO4)Sigma-AldrichS5136Składnik pożywki wzrostowej
EDTASigma-AldrichE9884składnik buforowy gDNA
Siarczan żelazawy, siedmiowodny (FeSO4.7H20)Sigma-Aldrich215422Składnik pożywki wzrostowej
Glukoza Sigma-AldrichG7021Pożywka wzrostowa
składnik GlicerolSigma-AldrichG5516Składnik pożywki wzrostowej; Zapasy glicerolu
IzopropanolHIMEDIAMB063Izolacja genomowego DNA
LB AgarDifco244520Pożywka
wzrostowa Luria-Bertani (LB)Difco244620Pożywka
wzrostowa Siarczan magnezu (MgSO4)MERCKM2643Składnik pożywki wzrostowej
Jednowodny siarczan manganu (II) (MnSO4. H20)Sigma-Aldrich221287Składnik podłoża wzrostowego
Bulion odżywczy (NB)Merck (Millipore)03856-500GPożywka wzrostowa
PeptonMerck91249-500GSkładnik podłoża wzrostowego
PhenolSigma-AldrichP1037Izolacja genomowego DNA
Fosforan potasu, dwuzasadowy (K2HPO4)Sigma-AldrichP3786Pożywka wzrostowa
składnik Fosforan potasu, monozasadowy (KH2PO4)Sigma-AldrichP9791Składnik pożywki wzrostowej
Proteinaza KThermoFisher ScientificAM2546Izolacja genomowego DNA
QIAquick Gel Zestaw do ekstrakcjiQIAGEN160016235DNA oczyszczanie
QIAquick PCR Zestaw do oczyszczaniaQIAGEN163038783Oczyszczanie DNA
R2A AgarMillipore1004160500Pożywka wzrostowa
SmartSpec Plus SpektrofotometrBIO-RAD4006221Pomiar absorbancji
Octan soduSigma-AldrichS2889Izolacja genomowego DNA
Chlorek sodu (NaCl)Sigma-AldrichS9888Składnik pożywki wzrostowej
Dodecylosiarczan sodu (SDS)Sigma-AldrichL3771Izolacja genomowego DNA
StyrenSigma-AldrichS4972Biodegradacja styrenu
Polimeraza DNA Taq NEBM0273X16s rRNA PCR
Tris-EDTA (TE)Sigma-Aldrich93283Zawieszenie genomowego DNA
Tryptyczny bulion sojowy (TSB)Merck22092-500GPożywka wzrostowa
Ekstrakt drożdżowySigma-AldrichY1625-1KGPożywka wzrostowa
Siarczan siedmiowodny (ZnSO4.7H20)Sigma-Aldrich221376Składnik podłoża wzrostowego
składnik

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sirotkin, A. V. Reproductive effects of oil-related environmental pollutants. Encyclopedia of Environmental Health. , 493-498 (2019).
  2. Li, C., Busquets, R., Campos, L. C. Assessment of microplastics in freshwater systems: A review. Science of The Total Environment. 707, 135578(2020).
  3. Siddiqa, A., Faisal, M. Microbial degradation of organic pollutants using indigenous bacterial strains. Handbook of Bioremediation. , 625-637 (2021).
  4. Hossain, F., et al. Bioremediation potential of hydrocarbon degrading bacteria: isolation, characterization, and assessment. Saudi Journal of Biological Sciences. , (2021).
  5. Wongbunmak, A., Khiawjan, S., Suphantharika, M., Pongtharangkul, T. BTEX biodegradation by Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum W1 and its proposed BTEX biodegradation pathways. Scientific Reports. 10 (1), 17408(2020).
  6. Bodor, A., et al. Challenges of unculturable bacteria: environmental perspectives. Reviews in Environmental Science and Bio/Technology. 19 (1), 1-22 (2020).
  7. Phale, P. S., Sharma, A., Gautam, K. Microbial degradation of xenobiotics like aromatic pollutants from the terrestrial environments. Pharmaceuticals and Personal Care Products: Waste Management and Treatment Technology. , 259-278 (2019).
  8. Brooijmans, R. J. W., Pastink, M. I., Siezen, R. J. Hydrocarbon-degrading bacteria: the oil-spill clean-up crew. Microbial Biotechnology. 2 (6), 587-594 (2009).
  9. Sorkhoh, N. A., Ghannoum, M. A., Ibrahim, A. S., Stretton, R. J., Radwan, S. S. Crude oil and hydrocarbon-degrading strains of Rhodococcus rhodochrous isolated from soil and marine environments in Kuwait. Environmental Pollution. 65 (1), 1-17 (1990).
  10. Chaillan, F., et al. Identification and biodegradation potential of tropical aerobic hydrocarbon-degrading microorganisms. Research in Microbiology. 155 (7), 587-595 (2004).
  11. Bôto, M. L., et al. Harnessing the potential of native microbial communities for bioremediation of oil spills in the Iberian Peninsula NW coast. Frontiers in Microbiology. 12, 879(2021).
  12. Wang, Y., et al. A culture-independent approach to unravel uncultured bacteria and functional genes in a complex microbial community. PloS One. 7 (10), 47530(2012).
  13. Jovel, J., et al. Characterization of the gut microbiome using 16S or shotgun metagenomics. Frontiers in Microbiology. 7, 459(2016).
  14. Spini, G., et al. Molecular and microbiological insights on the enrichment procedures for the isolation of petroleum degrading bacteria and fungi. Frontiers in Microbiology. 0, 2543(2018).
  15. Pightling, A. W., et al. Interpreting whole-genome sequence analyses of foodborne bacteria for regulatory applications and outbreak investigations. Frontiers in Microbiology. , 1482(2018).
  16. Salipante, S. J., et al. Application of whole-genome sequencing for bacterial strain typing in molecular epidemiology. Journal of Clinical Microbiology. 53 (4), 1072-1079 (2015).
  17. Lovley, D. R. Cleaning up with genomics: applying molecular biology to bioremediation. Nature Reviews Microbiology. 1 (1), 35-44 (2003).
  18. Janda, J. M., Abbott, S. L. 16S rRNA gene sequencing for bacterial identification in the diagnostic laboratory: pluses, perils, and pitfalls. Journal of Clinical Microbiology. 45 (9), 2761-2764 (2007).
  19. Poindexter, J. S. Biological properties and classification of the Caulobacter group. Bacteriological Reviews. 28 (3), 231-295 (1964).
  20. Reasoner, D. J., Geldreich, E. A new medium for the enumeration and subculture of bacteria from potable water. Applied and Environmental Microbiology. 49 (1), 1-7 (1985).
  21. Pardee, A. B. The genetic control and cytoplasmic expression of “Inducibility” in the synthesis of β-galactosidase by E. coli. Journal of Molecular Biology. 1 (2), 165-178 (1959).
  22. Ely, B. Genetics of Caulobacter crescentus. Methods in Enzymology. 204, 372-384 (1991).
  23. R, C. Gram staining. Current Protocols in Microbiology. , Appendix 3 (2005).
  24. Green, M. R., Hughes, H., Sambrook, J., MacCallum, P. Molecular cloning: a laboratory manual. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , 1890(2012).
  25. Chauhan, D., Agrawal, G., Deshmukh, S., Roy, S. S., Priyadarshini, R. Biofilm formation by Exiguobacterium sp. DR11 and DR14 alter polystyrene surface properties and initiate biodegradation. RSC Advances. 8 (66), 37590-37599 (2018).
  26. Takeo, M., Nishimura, M., Shirai, M., Takahashi, H., Negoro, S. Purification and characterization of catechol 2,3-Dioxygenase from the aniline degradation pathway of Acinetobacter sp. YAA and its mutant enzyme, which resists substrate inhibition. Bioscience, Biotechnology, Biochemistry. 71, 70079-70080 (2007).
  27. Nguyen, O. T., Ha, D. D. Degradation of chlorotoluenes and chlorobenzenes by the dual-species biofilm of Comamonas testosteroni strain KT5 and Bacillus subtilis strain DKT. Annals of Microbiology. 69 (3), 267-277 (2019).
  28. Hupert-Kocurek, K., Guzik, U., Wojcieszyńska, D. Characterization of catechol 2, 3-dioxygenase from Planococcus sp. strain S5 induced by high phenol concentration. Acta Biochimica Polonica. 59 (3), (2012).
  29. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
  30. Peterson, G. L., et al. A simplification of the protein assay method of Lowry et al. which is more generally applicable. Analytical Biochemistry. 83 (2), 346-356 (1977).
  31. Chen, W. P., Kuo, T. T. A simple and rapid method for the preparation of gram-negative bacterial genomic DNA. Nucleic Acids Research. 21 (9), 2260(1993).
  32. William, S., Feil, H., Copeland, A. Bacterial genomic DNA isolation using CTAB. Sigma. 50 (6876), (2012).
  33. Frank, J. A., et al. Critical evaluation of two primers commonly used for amplification of bacterial 16S rRNA genes. Applied and Environmental Microbiology. 74 (8), 2461-2470 (2008).
  34. Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (12), 5463-5467 (1977).
  35. Johnson, M., et al. NCBI BLAST: a better web interface. Nucleic Acids Research. 36, suppl 2 5-9 (2008).
  36. Harayama, S., Rekik, M. Bacterial aromatic ring-cleavage enzymes are classified into two different gene families. Journal of Biological Chemistry. 264 (26), 15328-15333 (1989).
  37. Li, X., et al. Efficiency of chemical versus mechanical disruption methods of DNA extraction for the identification of oral Gram-positive and Gram-negative bacteria. The Journal of International Medical Research. 48 (5), 300060520925594(2020).
  38. Coico, R. Gram staining. Current Protocols in Microbiology. , Appendix 3 (2005).
  39. Clarridge, J. E. III Impact of 16S rRNA gene sequence analysis for identification of bacteria on clinical microbiology and infectious diseases. Clinical Microbiology Reviews. 17 (4), 840(2004).
  40. Dereeper, A., et al. Phylogeny. fr: robust phylogenetic analysis for the non-specialist. Nucleic Acids Research. 36, suppl 2 465-469 (2008).
  41. Wadowsky, R. M., Wolford, R., McNamara, A. M., Yee, R. B. Effect of temperature, pH, and oxygen level on the multiplication of naturally occurring Legionella pneumophila in potable water. Applied and Environmental Microbiology. 49 (5), 1197-1205 (1985).
  42. du Toit, W. J., Pretorius, I. S., Lonvaud-Funel, A. The effect of sulphur dioxide and oxygen on the viability and culturability of a strain of Acetobacter pasteurianus and a strain of Brettanomyces bruxellensis isolated from wine. Journal of Applied Microbiology. 98 (4), 862-871 (2005).
  43. Johnson, J. S., et al. Evaluation of 16S rRNA gene sequencing for species and strain-level microbiome analysis. Nature Communications. 10 (1), 1-11 (2019).
  44. Kim, E., et al. Design of PCR assays to specifically detect and identify 37 Lactobacillus species in a single 96 well plate. BMC Microbiology. 20 (1), 1-14 (2020).
  45. Poretsky, R., Rodriguez-R, L. M., Luo, C., Tsementzi, D., Konstantinidis, K. T. Strengths and limitations of 16S rRNA gene amplicon sequencing in revealing temporal microbial community dynamics. PLoS ONE. 9 (4), (2014).
  46. Johnson, B. H., Hecht, M. H. Recombinant proteins can be isolated from E. coli cells by repeated cycles of freezing and thawing. Bio/Technology. 12 (12), 1357-1360 (1994).
  47. Rodríguez-Carmona, E., Cano-Garrido, O., Seras-Franzoso, J., Villaverde, A., García-Fruitós, E. Isolation of cell-free bacterial inclusion bodies. Microbial Cell Factories. 9 (1), 71(2010).
  48. Hoiczyk, E., Hansel, A. Cyanobacterial cell walls: News from an unusual prokaryotic envelope. Journal of Bacteriology. 182 (5), 1191(2000).
  49. Erstad, S. M., Sakuragi, Y. Easy and efficient permeabilization of cyanobacteria for in vivo enzyme assays using B-PER. Bio-Protocol. 8 (1), (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Bakterie degraduj ce w glowodoryizolacja bakteriipotencja bioremediacyjnyanaliza 16S rRNAbarwienie metod Gramatest degradacji katecholuelektroforeza w elu agarozowymamplifikacja PCRprofilowanie metaboliczne

Powiązane artykuły