Artykuł metodologiczny

Przeszczep domózgowy i śledzenie bioluminescencji in vivo ludzkich nerwowych komórek progenitorowych w mózgu myszy

5.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63102

⸱

27 stycznia 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute for Regenerative Medicine, University of Zurich, 2Neuroscience Center Zurich, University of Zurich and ETH Zurich

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy intraparenchymalne przeszczepienie ludzkich nerwowych komórek progenitorowych transdukowanych podwójnym wektorem reporterowym wyrażającym lucyferazy-zielone białko fluorescencyjne (GFP) w mózgu myszy. Po przeszczepie sygnał lucyferazy jest wielokrotnie mierzony za pomocą bioluminescencji in vivo i przeszczepionych komórek wykazujących ekspresję GFP, identyfikowanych w sekcjach mózgu za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Streszczenie

Terapia komórkowa od dawna jest nowym paradygmatem leczenia w neurobiologii eksperymentalnej. Jednak badania nad przeszczepianiem komórek często opierają się na pomiarach punktu końcowego i dlatego mogą oceniać podłużne zmiany migracji komórek i przeżycia tylko w ograniczonym zakresie. Niniejszy artykuł przedstawia wiarygodny, minimalnie inwazyjny protokół przeszczepiania i podłużnego śledzenia nerwowych komórek progenitorowych (NPC) w mózgu dorosłej myszy. Przed przeszczepem komórki są transdukowane wektorem lentiwirusowym składającym się z bioluminescencyjnego (świetlik-lucyferaza) i fluorescencyjnego (zielone białko fluorescencyjne [GFP]) reportera. NPC są przeszczepiane do prawej półkuli kory mózgowej za pomocą stereotaktycznych zastrzyków w korę sensomotoryczną. Po przeszczepie przeszczepione komórki wykrywano przez nienaruszoną czaszkę przez okres do pięciu tygodni (w dniach 0, 3, 14, 21, 35) z limitem rozdzielczości 6000 komórek przy użyciu obrazowania bioluminescencyjnego in vivo. Następnie przeszczepione komórki są identyfikowane w histologicznych skrawkach mózgu i dalej charakteryzowane za pomocą immunofluorescencji. W ten sposób protokół ten stanowi cenne narzędzie do przeszczepiania, śledzenia, ilościowego określania i charakteryzowania komórek w mózgu myszy.

Wprowadzenie

Mózg ssaków ma ograniczone zdolności regeneracyjne po urazie lub chorobie, co wymaga innowacyjnych strategii wspomagających naprawę tkanek i funkcji. Strategie przedkliniczne koncentrują się na różnych aspektach regeneracji mózgu, w tym neuroprotekcji, neurogenezie, angiogenezie1,2, naprawa bariery krew-mózg3,4, lub terapia komórkowa5,6. Terapia komórkowa ma tę zaletę, że jest w stanie promować wiele z tych procesów pronaprawczych jednocześnie. W eksperymentach z przeszczepianiem komórek naprawa tkanek następowała poprzez (1) bezpośrednią wymianę komórek i (2) produkcję cytokin prowadzącą do angiogenezy i neurogenezy7. Ostatnie postępy w technologii komórek macierzystych jeszcze bardziej ułatwiły rozwój skalowalnych, dobrze scharakteryzowanych źródeł komórek nerwowych, które są obecnie w przygotowaniu do badań klinicznych (recenzowane w 7,8,9). Chociaż terapie komórkowe osiągnęły stadium kliniczne w przypadku kilku chorób neurologicznych (np. choroby Parkinsona10, stroke11 i uraz rdzenia kręgowego12), ich skuteczność była zmienna i potrzebne są dalsze badania przedkliniczne, aby zrozumieć mechanizmy interakcji przeszczep-gospodarz.

Jednym z głównych ograniczeń wielu badań przedklinicznych jest ciągłe śledzenie przeszczepionych komórek wewnątrz gospodarza. Często wykonywane są tylko pomiary punktu końcowego, z pominięciem dynamicznych procesów migracji i przetrwania w host6,13. Ograniczenia te skutkują słabą charakterystyką przeszczepionych komórek i wymagają dużej liczby zwierząt, aby zrozumieć zmiany podłużne. Aby przezwyciężyć te ograniczenia, w tym badaniu transdukujemy indukowane pluripotencjalne komórki progenitorowe pochodzące z nerwowych komórek macierzystych (iPSC) za pomocą dostępnego na rynku wektora lentiwirusowego z podwójnym reporterem składającego się z lucyferazy świetlika czerwonego i wzmocnionego białka zielonej fluorescencji (rFluc-eGFP). Komórki te są przeszczepiane za pomocą stereotaktycznego wstrzyknięcia intrapażowego, do mózgu myszy i są śledzone podłużnie za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego in vivo przez 5 tygodni. Po pobraniu tkanki mózgowej przeszczepione komórki wykazujące ekspresję GFP są identyfikowane i dalej charakteryzowane w histologicznych skrawkach mózgu. Metodę tę można płynnie dostosować do alternatywnych źródeł transdukcyjnych komórek i dróg przeszczepu do zastosowań in vivo w mózgu gryzoni. Ogólnie rzecz biorąc, procedura jest cenna dla uzyskania podłużnych informacji na temat przeżycia i migracji przeszczepu w mózgu myszy oraz ułatwia późniejszą charakterystykę histologiczną.

Protokół

UWAGA: Wszystkie eksperymenty na myszach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi rządowymi, instytucjonalnymi i ARRIVE oraz zostały zatwierdzone przez Kantonalne Biuro Weterynaryjne w Zurychu. Użyto dorosłych samców i samic nieotyłych myszy z cukrzycą SCID gamma (NSG) (10-14 tygodni, 25-35 g). Myszy trzymano w zwykłych klatkach typu II/III w grupach po co najmniej dwa zwierzęta na klatkę w pomieszczeniu o kontrolowanej wilgotności i temperaturze ze stałym cyklem 12/12 godzin światła/ciemności. .).

1. Hodowla komórkowa i transdukcja wirusowa

  1. Różnicowanie neuronalnych komórek progenitorowych (NPC) od iPSC za pomocą inhibitorów małocząsteczkowych, jak opisano wcześniej14.
  2. Hodowla NPCs15 od przejścia 2 w pożywce do konserwacji neuronalnych komórek macierzystych (NSMM; Tabela 1) uzupełnione małymi cząsteczkami (Tabela 1) w płytkach 6-dołkowych (2 ml pożywki na studzienkę) pokrytych poliornityną/lamininą521 (pLO/L521). Zmieniaj medium codziennie.
    UWAGA: Aby przejść NPC, dodaj 1 ml odczynnika do dysocjacji komórek na studzienkę (patrz Tabela materiałów) i inkubuj w temperaturze 37 °C przez 1 minutę, aż większość komórek się odczepi.
    1. W celu powlekania inkubować 150 μl pLO w 1 ml 0,1 M soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) na studzienkę przez 2 godziny w temperaturze pokojowej (RT). Po trzech przemyciach PBS inkubować 10 μg L521 w 1 ml PBS na studzienkę przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
  3. W celu transdukcji wirusa umieść 50 000 komórek na studzience na 24-dołkowej płytce pokrytej pLO/L521 i dodaj wstępnie zapakowane wektory wirusowe (pLL-EF1a-rFLuc-T2A-GFP-mPGK-Puro, LL410PA-1) do każdej studzienki.
    UWAGA: Całkowita liczba podanych jednostek zakaźnych (IFU) wynosi >2 ×10 6 IFU i wystarcza do zainfekowania 100 000 komórek przy wielokrotności infekcji (MOI) wynoszącej 20. Zliczanie komórek zostało przeprowadzone za pomocą automatycznego licznika komórek. Wydajność transdukcji silnie zależy od zastosowanej linii komórkowej. Praca z lentiwirusem wymaga zgodności z lokalnymi wytycznymi dotyczącymi produktów o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL-2).
  4. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 72 godziny, kontynuując codzienną zmianę podłoża.
  5. Potwierdź pomyślną transdukcję, sprawdzając komórki pod kątem ekspresji GFP w mikroskopie fluorescencyjnym. Ustaw powiększenie mikroskopu na 10x lub 20x i użyj odpowiedniego zakresu wzbudzenia (460-480 nm) i emisji (490-520 nm), aby wykryć transdukowane komórki wykazujące ekspresję GFP.
  6. Określ ilościowo stosunek transdukcji GFP do całkowitej liczby komórek, aby oszacować ogólną skuteczność transdukcji.
    UWAGA: Dzięki temu protokołowi osiągnięto szybkość transdukcji na poziomie 65-95%. Skuteczność transdukcji na poziomie >50% jest zalecana jako kryterium wyboru/zakazu przed przeszczepem. Jeśli nie można osiągnąć 50% skuteczności transdukcji, należy przeprowadzić selekcję puromycyny lub posortować komórki za pomocą cytometrii przepływowej, aby zwiększyć wydajność transdukowanych komórek.
  7. Opcjonalnie: Zamrażanie komórek
    1. Odwirować komórki (300 × g, 5 min) i wyrzucić supernatant. Zawiesić osad w 1 ml pożywki do zamrażania (patrz Tabela materiałów) i przenieść zawiesinę do fiolek w celu uzyskania 10-6 komórek na fiolkę. Przenieść komórki do zamrażarek na 24 godziny w temperaturze -80 °C, a następnie do temperatury -150 °C w celu długotrwałego przechowywania.

2. Przygotowanie komórek do przeszczepu

  1. Pobrać fiolkę z komórkami z miejsca przechowywania w temperaturze -150 °C i przenieść ją do laboratorium. Policz komórki za pomocą automatycznego licznika komórek.
    UWAGA: Fiolka zawiera 1,5-2 × 106 komórek.
  2. Szybko przenieść fiolkę do łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, aż nie pozostaną kryształki lodu (2-3 min).
    UWAGA: Ważne jest, aby szybko się rozmrozić, aby zminimalizować wszelkie uszkodzenia błon komórkowych. Nie zanurzać fiolki całkowicie w łaźni wodnej, ponieważ może to zwiększyć ryzyko zanieczyszczenia.
  3. Przenieść fiolkę do szafki bezpieczeństwa biologicznego i odpipetować całą zawartość (~1 ml) do sterylnej probówki stożkowej o pojemności 15 ml.
    UWAGA: Praca z komórkami transdukowanymi lentiwirusowo wymaga BSL-2. Jednak komórki myjące i pasażujące usuwają cząsteczki wirusa z pożywki. Informacje o tym, kiedy transfer z BSL-2 do BSL-1 jest dozwolony, należy uzyskać od władz lokalnych.
  4. Dodać 9 ml sterylnego 1x PBS i wirować przez 5 minut przy 300 × g, RT.
  5. Usunąć supernatant przez aspirację za pomocą pipety (1-10 ml); delikatnie przechylić zawiesinę w kierunku końcówki pipety i rozpocząć zasysanie. Uważaj, aby nie naruszyć pelletu.
  6. Umyj komórki, ponownie zawieszając je w 10 ml sterylnego 1x PBS.
    UWAGA: Delikatnie wytknij rurkę, aby ponownie zawiesić komórki w pozostałej objętości. Zawiesinę komórkową należy powoli rozcierać za pomocą pipety o pojemności 1 ml, aż nie będzie zawierała grudek ani zagięć.
  7. Policz komórki przed ostatnim wirowaniem za pomocą automatycznego licznika komórek.
  8. Wirować przez 5 minut przy 300 × g, RT.
  9. Usunąć supernatant (krok 2.5) i ponownie zawiesić osad komórkowy w wymaganej objętości sterylnego PBS do stężenia 8 × 104 komórek/μl. Umieścić komórki na lodzie i użyć ich do przeszczepu w ciągu następnych 5 godzin.
    UWAGA: W tym protokole użyto objętości 1,6 × 105 komórek/2 μl PBS.

3. Procedura transplantacji

  1. Przygotowanie do zabiegu
    1. Wyczyść i wysterylizuj sprzęt chirurgiczny.
    2. Przygotować urządzenie stereotaktyczne i system pompy mikroiniekcyjnej.
      UWAGA: Bardzo ważne jest, aby przed rozpoczęciem przetestować strzykawkę Hamilton i igłę 30 G, 2 cale. Włożyć igłę do probówki zawierającej sterylne 0,9% NaCl i powoli wciągać i wyjmować roztwór.
    3. Ustaw aparat do znieczulenia. Przetestuj maszynę przed zaangażowaniem jakichkolwiek zwierząt. Wyczyść komorę indukcyjną 70% etanolem.
  2. Przygotowanie zwierząt
    1. Trzymaj myszy przez co najmniej 7 dni przed eksperymentami w standardowych warunkach, aby je zaaklimatyzować.
      UWAGA: Do tego protokołu wykorzystano następujące zwierzęta: samica NOD/SCID/IL2rγnull (30-35 g, znana również jako NSG) i samica C57BL/6J (20-25 g, znana również jako B6). Zabieg można również wykonać na samcach myszy.
    2. Zmierz masę ciała myszy i dostosuj dawkę środka przeciwbólowego, który ma zostać wstrzyknięty. Karprofen (5 mg/kg masy ciała) należy podawać dootrzewnowo w celu zmniejszenia bólu i/lub zapobieżenia reakcji zapalnej.
    3. Znieczulenie zwierząt za pomocą izofluranu (3% w fazie indukcji i 1,5-2% w fazie podtrzymującej podczas operacji) odparowanego w tlenie.
      UWAGA: Znieczulenie gazowe jest preferowane ze względu na szybkie wybudzenie po zabiegu chirurgicznym oraz ze względu na to, że poziom gazu znieczulającego można łatwo regulować.
    4. Użyj odruchów nocyceptywnych, aby upewnić się, że zwierzę jest głęboko znieczulone (np. szczypanie palców u stóp). Po osiągnięciu głębokiego znieczulenia należy przetransportować zwierzę z komory indukcyjnej do ramy stereotaktycznej. Utrzymuj znieczulenie za pomocą maski na twarz.
      UWAGA: Częstość oddechów musi być monitorowana wizualnie przez cały czas trwania zabiegu (40-60 oddechów na minutę). Użyj podkładki rozgrzewającej, aby uniknąć hipotermii podczas zabiegu.
    5. Zastosuj lubrykant okulistyczny, aby zapobiec wysuszeniu oczu.
    6. Ogol skórę głowy myszy elektryczną maszynką do golenia i zdezynfekuj skórę 5% roztworem betadyny za pomocą bawełnianych wacików.
    7. Zabezpiecz główkę myszy i włóż nauszniki do zewnętrznego przewodu moczowego.
      UWAGA: Uważaj, aby nie uszkodzić błony bębenkowej. Nałóż maść lidokainową na oba kanały słuchowe przed włożeniem wkładek dousznych. Aby sprawdzić, czy głowa zwierzęcia jest w stabilnej pozycji, ostrożnie dociśnij głowę, aby sprawdzić, czy jest ruch. Jeśli zauważy się ruch, oznacza to, że wkładka uszna, nausznik lub jedno i drugie są nieprawidłowe i należy je ponownie wyregulować.
  3. Kraniotomia
    1. Użyj ostrza chirurgicznego, aby wykonać cięcie wzdłuż linii środkowej wystarczająco duże, aby odsłonić punkty orientacyjne lambda i bregma.
      UWAGA: Retraktory skóry mogą być stosowane, aby czaszka była odsłonięta.
    2. Cofnij okostną i powięź skalpelem i użyj sterylnych bawełnianych wacików, aby osuszyć powierzchnię czaszki.
    3. Wyreguluj paski douszne i usta, aby ujednolicić pozycję głowy.
      UWAGA: Współrzędne pionowe dla bregmy i lambdy muszą być identyczne dla pozycjonowania przednio-tylnego.
    4. Umieścić igłę w bregmie i obliczyć współrzędne żądanych punktów iniekcji (współrzędne zainteresowania wybrane dla tego protokołu: przednio-tylne (AP): + 0,5 mm, przyśrodkowo-boczne (ML): + 1,5 mm). Przesuń igłę do tego punktu i oznacz ją atramentem.
      UWAGA: Współrzędne zostały wybrane na podstawie atlasu mózgu myszy Franklina i Paxinosa 16. Odległości są mm od bregmy.
    5. Nałóż sterylny 0,9% NaCl na czaszkę i wywierć otwór o średnicy 2-3 mm przez czaszkę za pomocą chirurgicznego wiertła dentystycznego.
    6. Przesuń igłę na powierzchnię opony twardej i oblicz współrzędne głębokości.
  4. Procedura transplantacji
    1. Zawiesić komórki w probówce (krok 2.9) i pobrać 2 μl zawiesiny komórek do strzykawki (5 μl lub 10 μl).
      UWAGA: Upewnij się, że w zawiesinie ogniw nie ma pęcherzyków powietrza. Strzykawka musi być utrzymywana w pozycji poziomej do momentu zamontowania w urządzeniu stereotaktycznym, aby uniknąć sedymentacji komórek.
    2. Umieścić strzykawkę nad miejscem docelowym (obliczone współrzędne: AP: + 0,5 mm, ML: + 1,5 mm) i powoli przesuwać igłę do powierzchni opony twardej.
      UWAGA: Jeśli nie masz pewności co do prawidłowych współrzędnych, wykonaj iniekcję z barwnikiem i oceną histologiczną miejsca wstrzyknięcia przed przeszczepieniem komórek (aby uzyskać więcej informacji, zobacz 17).
    3. Wprowadzić igłę z prędkością 0,02 mm/s do mózgu na odpowiednią głębokość (współrzędna wybrana dla tego protokołu to współrzędna grzbietowo-brzuszna (DV) - 0,8 mm). Przekroczyć głębokość o 0,1 mm i wycofać igłę na tę samą odległość, aby utworzyć kieszeń dla wstrzykniętych komórek.
    4. Nałóż klej tkankowy wokół igły za pomocą kleszczy, aby zapobiec wyciekaniu komórek.
    5. Wstrzyknąć 2 μl przygotowanej zawiesiny komórek ze stałą szybkością 3-5 nL/s.
      UWAGA: Zabieg iniekcji trwa od 7 do 12 minut.
    6. Po wstrzyknięciu należy pozostawić igłę na miejscu przez co najmniej 5 minut, a następnie powoli ją wyjąć. Nałóż klej tkankowy, aby uszczelnić otwór w czaszce i odczekaj kolejne 2 minuty.
  5. Szwy i pielęgnacja pozabiegowa
    1. Nałóż sterylny 0,9% roztwór NaCl na odsłoniętą czaszkę, aby uniknąć odwodnienia.
    2. Zamknij ranę jedwabną nicią do szwów 5/0.
    3. Nawodnij zwierzę 0,5 ml roztworu mleczanu pierścienia wstrzykniętego podskórnie w dolną część pleców.
    4. Przerwij podawanie znieczulenia i ostrożnie wyjmij mysz z aparatu stereotaktycznego i umieść ją z powrotem w klatce trzymanej na poduszce grzewczej.
    5. Monitoruj zwierzęta w ostrej fazie po urazie. Sprawdzaj szew, wagę zwierzęcia i ogólny stan zdrowia co najmniej dwa razy dziennie.

4. Obrazowanie in vivo

  1. Przygotowanie lucyferyny
    1. Rozmrozić sól potasową D-lucyferyny w temperaturze pokojowej i przygotować świeży roztwór podstawowy D-lucyferyny w stężeniu 30 mg/ml w PBS.
    2. Wysterylizować roztwór podstawowy przez filtr strzykawkowy 0,22 μm.
      UWAGA: Zaleca się natychmiastowe użycie roztworu roboczego. W razie potrzeby rozpuszczoną lucyferynę można przechowywać w temperaturze -20 °C. Jednak długotrwałe przechowywanie może spowodować degradację sygnału. Lucyferyna jest odczynnikiem wrażliwym na światło; Jeśli to możliwe, trzymaj go z dala od bezpośredniego światła. Można również rozważyć alternatywne podłoża, np. cycluc, aby poprawić limit rozdzielczości18.
  2. Obrazowania
    1. Konfiguracja wstępna
      UWAGA: Obrazowanie bioluminescencyjne przeprowadzono przy użyciu systemu obrazowania in vivo (patrz tabela materiałów) składającego się z ciemnej komory i chłodzonej kamery ze sprzężeniem ładunkowym (CCD).
      1. Kliknij dwukrotnie ikonę oprogramowania Living Image i wybierz identyfikator użytkownika z listy rozwijanej.
      2. Kliknij przycisk Zainicjuj w wyświetlonym panelu sterowania. Po zakończeniu procesu inicjalizacji pole temperatury w panelu sterowania zmieni kolor na zielony.
      3. Na panelu sterowania zaznacz pola Luminescencyjne i Zdjęcie i wybierz Automatyczna ekspozycja (~60 s). Wybierz pole widzenia (dla tego protokołu wybrano D/12,5 cm). Wprowadź wysokość obiektu (1,5 cm) i wybierz opcję ustawienia ostrości na wysokości obiektu. Ręcznie ustaw następujące parametry: duże binning, f/2, zablokowany filtr wzbudzenia i otwarty filtr emisji.
    2. Określić ilość wstrzyknięcia D-lucyferyny w stężeniu 300 mg/kg masy ciała. UWAGA: Standardowa zalecana dawka to 150 mg/kg D-lucyferyny. Procedura ta została dostosowana zgodnie z protokołem informującym o wyższej czułości przy użyciu 300 mg/kg18.
    3. Wstrzyknąć lucyferynę dootrzewnowo (i.p.).
      UWAGA: Jeśli zwierzę wymaga uspokojenia przed wstrzyknięciem, należy pamiętać, że może to wydłużyć czas maksymalnej ekspresji lucyferazy.
    4. Odczekaj 5 minut, a następnie znieczul zwierzęta ciągłym podawaniem izofluranu (4,5% w fazie indukcji i 1,5-2% w fazie podtrzymującej podczas procedury obrazowania).
    5. Nałóż lubrykant okulistyczny na oczy, a następnie ogol uspokojone zwierzęta w okolicy głowy za pomocą konwencjonalnej golarki do włosów. Umieść zwierzęta w komorze obrazowania i rozpocznij obrazowanie 15 minut po wstrzyknięciu lucyferyny, klikając Acquire w panelu sterowania.

5. Perfuzja

  1. Znieczulić zwierzęta przez wstrzyknięcie dożylnie pentobarbitalu sodu (150 mg/kg masy ciała). Poczekaj, aż mysz przestanie reagować na bolesne bodźce, takie jak szczypanie palców.
  2. Połóż mysz na plecach i użyj pęsety i nożyczek, aby otworzyć klatkę piersiową.
  3. Użyj standardowych nożyczek, aby otworzyć membranę.
  4. Odsłonić serce i wprowadzić igłę (z rurki z pierścieniem/4% roztworem paraformaldehydu (PFA)) do wierzchołka lewej komory.
    UWAGA: Należy uważać, aby końcówka igły znajdowała się w świetle komory.
  5. Przetnij prawą komorę za pomocą nożyczek.
  6. Utylizuj z roztworem dzwonka (może być przechowywany w temperaturze pokojowej) przez 3-4 minuty (przepływ: 17 ml/min). Kontynuuj, aż serce będzie czyste.
  7. Przełączyć zawór odcinający, aby umożliwić przepływ PFA (przechowywać w temperaturze 4 °C; przechowywać na lodzie podczas zabiegu) i perfować przez kolejne 5 minut (~100 ml).
  8. Zatrzymać pompę i wyjąć igłę z lewej komory.
    UWAGA: Perfuzja z PFA równomiernie zachowuje integralność tkanki. Ułatwia również zachowanie sygnału GFP w przeszczepach, który w przeciwnym razie mógłby zostać utracony w wyniku dyfuzji.

6. Przetwarzanie

  1. Pobieranie tkanek
    1. Zdejmij głowę za pomocą standardowych nożyczek i wykonaj nacięcie w linii środkowej skóry.
    2. Odwróć skórę nad oczami, aby odsłonić czaszkę.
    3. Zacznij od części ogonowej w miejscu kości ciemieniowej i wykonaj małe nacięcie za pomocą nożyczek sprężynowych. Przesuwaj nożyczki obrotowo wzdłuż szwu środkowego do punktu między oczami. Zacznij ponownie od części ogonowej i wykonaj dwa cięcia równolegle i w odległości ~4 mm od siebie w płaszczyźnie strzałkowej.
      UWAGA: Uważaj, aby nie uszkodzić mózgu, naciskając nożyczki na wewnętrzną powierzchnię czaszki.
    4. Użyj kleszczy, aby ostrożnie przechylić jedną stronę kości ciemieniowej i odłamać ją. Zrób to samo z drugą stroną.
      UWAGA: Użyj mikroszpatułki, aby uwolnić kość z opon mózgowych; W przeciwnym razie mogą uszkodzić mózg podczas odłamywania czaszki. Jeśli pozostaną części kości czołowej, wykonaj małe nacięcie, aby przechylić i odłamać płytkę kostną.
    5. Aby uwolnić mózg, ostrożnie wsuń mikroszpatułkę pod mózg (opuszki węchowe) i delikatnie przechyl ją do góry.
    6. Po pobraniu należy przechowywać mózg w 4% roztworze PFA przez 4-6 godzin w temperaturze 4 °C. Następnie przenieść go do sterylnego 1x PBS.
  2. Immunohistochemia
    1. Przenieść mózg do 30% roztworu sacharozy na co najmniej 48 godzin w temperaturze 4 °C, aby zapobiec tworzeniu się kryształów podczas zamrażania.
    2. Za pomocą przesuwanego mikrotomu wyciąć skrawki czołowe o grubości 40 μm. Zebrać skrawki i przechowywać je jako skrawki swobodnie pływające (na płytce 24-dołkowej) w roztworze krioprotektantu (tabela 1) w temperaturze -20 °C do czasu dalszego przetwarzania.
    3. Przepłukać sekcje 450 μl 1x PBS na każdą studzienkę (3 razy po 5 minut, RT).
    4. Blokować niespecyficzne miejsca za pomocą 450 μl roztworu blokującego dla każdej studzienki (tabela 1) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
    5. Inkubować każdą studzienkę z 450 μl pierwszorzędowych przeciwciał w temperaturze 4 °C przez noc. Rozcieńczyć przeciwciała w stosunku 1:200 w 3% surowicy osła; 0,1% Triton-X-100 w PBS. Aby zidentyfikować materiał dawcy w środowisku gospodarza, należy użyć przeciwciała przeciwko jądrom specyficznym dla człowieka (przeciwciało przeciwko jądrom ludzkim, klon 235-1).
    6. Umyj sekcje 450 μl 1x PBS na każdą studzienkę (3 razy po 5 minut, RT).
    7. Inkubować każdą studzienkę z 450 μl odpowiednich fluorescencyjnych przeciwciał drugorzędowych przez 2-3 godziny (RT). Rozcieńczyć przeciwciała w 3% surowicy osła; 0,1% Triton-X-100 w 1x PBS.
    8. Umyj sekcje 450 μl 1x PBS na każdą studzienkę (3 razy po 5 minut, RT).
    9. Wybarwić jądra 450 μl 0,1 μg/ml 4',6-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI).

Wyniki

Naszym celem jest długotrwałe śledzenie przeszczepionych neuralnych komórek progenitorowych w mózgu myszy przy użyciu obrazowania bioluminescencyjnego in vivo oraz identyfikacja przeszczepionych komórek w późniejszej analizie histologicznej (Rysunek 1A). W związku z tym neuralne komórki progenitorowe są transdukowane wektorem lentiwirusem składającym się z EF1α-rFluc-eGFP. Przed przeszczepieniem sprawdzono sukces transdukcji komórek poprzez ekspresję eGFP in vitro (Rysunek 1B). Pomyślnie transdukowane komórki zostały przeszczepione stereotaktycznie do mózgu myszy we wskazanych współrzędnych (np. do kory czuciowo-ruchowej). Po przeszczepieniu myszom podano systemowo D-lucyferynę, która jest substratem dla rFluc, a następnie zmierzono intensywność sygnału z przeszczepionych komórek, aby potwierdzić powodzenie zabiegu (Rysunek 1C).

Aby ocenić granicę wykrywalności obrazowania bioluminescencyjnego in vivo, do prawej kory czuciowo-ruchowej myszy przeszczepiono liczbę komórek w zakresie od 6 000 do 180 000 (Rycyna 2A). Bezpośrednio po transplantacji wykryto <6 000 komórek oraz sygnał bioluminescencyjny proporcjonalny do liczby przeszczepionych komórek (Rycyna 2B). Ponieważ ludzkie źródła komórek są immunogenne dla myszy immunokompetentnych, w celu obserwacji długoterminowego przeżycia przeszczepów komórkowych wykorzystano myszy immunodeficyjne NOD scid gamma (NSG). Po transplantacji komórek potwierdzono długoterminowe przeżycie oraz wykrywalność sygnału bioluminescencyjnego przez okres do 5 tygodni (Rycyna 2C,D). Przeszczepione komórki zostały pomyślnie wykryte ex vivo w późniejszej analizie histologicznej za pomocą reportera eGFP oraz immunobarwienia z wykorzystaniem przeciwciał przeciwko ludzkim jądrom oraz ludzkim mitochondriom (Rycyna 2E).

Schemat transdukcji lentiwirusowej; transplantacja stereotaktyczna, NPC rFluc-eGFP, obrazowanie in vivo.
Rysunek 1: Transplantacja komórek progenitorowych neuronów. (A) Schematyczna analiza generowania i transplantacji NPC rFluc-eGFP. (B) Reprezentatywne zdjęcie immunofluorescencyjne transdukowanych NPC (reporter GFP, zielony) z przeciwbarwieniem DAPI (niebieski); paski skali = 5 µm. (C) Detekcja sygnału bioluminescencji in vivo w transplantowanych komórkach; skala kolorystyczna = niebieski (0, min, brak sygnału), czerwony (4 flux, p/s × 105, sygnał maksymalny) Skróty: NPCs = komórki progenitorowe neuronów; GFP = zielone białko fluorescencyjne; rFluc-eGFP = czerwona lucyferaza świetlika i ulepszone zielone białko fluorescencyjne; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenyloindol; p/s = fotony/s. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Badanie transplantacji komórek mysich; obrazowanie bioluminescencyjne, liczba komórek, GFP, HuNu, wykres strumienia, mikroskopia.
Rysunek 2: Przebieg czasowy przeżycia przeszczepionych komórek. (A) Schematyczny widok liczby komórek do transplantacji. (B) Granica detekcji przeszczepionych komórek 1 h po transplantacji. (C, D) Przebieg czasowy transplantacji (180 000 komórek) do 35 dni u myszy NSG; pasek kolorów = niebieski (0, min, brak sygnału), czerwony (4 flux, p/s × 105, maksymalny sygnał). Dane przedstawiono jako średnia ± SEM (n = 3). (E) Reprezentatywne obrazy fluorescencyjne przekrojów histologicznych i przeszczepionych komórek 5 tygodni po transplantacji. Pasek skali = 10 µm. Skróty: D = dzień po transplantacji; NSG = immunodeficient NOD scid gamma; DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindole; GFP = zielone białko fluorescencyjne; HuNu = przeciwciało przeciwjądrowe ludzkie, klon 235-1; p/s = fotony/s. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

Regeneracja uszkodzonego mózgu, aby umożliwić powrót do sprawności, pozostaje niespełnionym wyzwaniem. Rozwinęło się wiele innowacyjnych podejść przedklinicznych ukierunkowanych na przykład modulację immunologiczną19,20, angiogenezę 1,21,22,23, integralność bariery krew-mózg 2,3,24,25 i wymianę komórek 5,26. Szczególnie w ostatnich latach terapie komórkowe stały się obiecującą strategią leczenia mózgu ze względu na znaczne postępy w technologii komórek macierzystych i skuteczne protokoły różnicowania15,28. Artykuł ten dostarcza cennego protokołu do przeszczepiania i śledzenia komórek nerwowych w mózgu myszy. Metoda ma zastosowanie do wszystkich transdukowalnych linii komórkowych do zastosowań in vivo w mózgu myszy.

Prezentowany układ wykorzystuje przeszczepy pochodzenia ludzkiego u myszy. Przeszczepy te nie są opłacalne w dłuższej perspektywie u immunokompetentnych myszy typu dzikiego ze względu na immunogenność. W związku z tym do pokonania tego ograniczenia wykorzystano myszy z NSG z niedoborem odporności. Alternatywnie, stosowanie przeszczepów myszy może być preferowane w celu przezwyciężenia aspektów immunogennych. Jeśli wymagany jest przeszczep komórek ludzkich, humanizowane modele myszy stanowią pojawiającą się alternatywę zmniejszającą prawdopodobieństwo odrzucenia przeszczepu29.

Do wizualizacji przeszczepów wykorzystano komercyjny wektor wirusowy z podwójnym reporterem, składający się z lucyferazy świetlika i eGFP pod promotorem EF1α. Ten promotor został wybrany w celu osiągnięcia wysokiej intensywności sygnału15. Jednak oprócz NPC wykazano, że inne typy komórek promują funkcjonowanie mózgu po urazie, w tym perycyty30 i astrocyty31; W związku z tym, w zależności od użytej linii komórkowej, inne promotory mogą być bardziej odpowiednie do osiągnięcia wysokich poziomów ekspresji. Ponadto stosowanie promotorów transgenów, takich jak CMV, może prowadzić do obniżenia regulacji, zwłaszcza w długoterminowych eksperymentach32. Skuteczność transdukcji wektora lentiwirusowego silnie zależy od użytej linii komórkowej i może się różnić w zależności od pojedynczych eksperymentów. W związku z tym skuteczność transdukcji musi być oceniona przed rozpoczęciem doświadczeń in vivo i w celu skorygowania różnic w skuteczności transdukcji między doświadczeniami. Obszar mózgu przeszczepu również wpływa na siłę sygnału. Chociaż osiągnięto granicę wykrywalności wynoszącą <6 000 komórek w przypadku przeszczepów kory mózgowej, może to wymagać większej liczby komórek do wykrycia sygnału w głębszych obszarach mózgu, na przykład prążkowiu lub hipokampie.

Objętości przeszczepu w mózgu myszy są ograniczone do 1-2 μl. Dlatego ważne jest, aby zidentyfikować odpowiedni numer komórki do eksperymentów. Wcześniej zaobserwowano, że wzrost liczby komórek prowadzi do zmniejszenia wskaźnika przeżycia, najprawdopodobniej z powodu ograniczonej dostępności składników odżywczych i tlenu w regionie przeszczepu33. Obrazowanie bioluminescencyjne in vivo zapewnia stosunkowo niską rozdzielczość przestrzenną w porównaniu z innymi metodami obrazowania in vivo , takimi jak MRI lub CT. W związku z tym krótkie drogi migracji przeszczepionych komórek można wiarygodnie ocenić dopiero w późniejszej analizie post-hoc .

Bezwzględna siła sygnału bioluminescencji jest na ogół proporcjonalna do liczby przeszczepionych komórek. Jednak siła sygnału może być zmniejszona, jeśli przeszczepy są przeszczepiane w głębsze struktury mózgu lub jeśli siła sygnału wykracza poza liniowe spektrum wykrywania systemu obrazowania in vivo . Obecnie opracowywane są nowe substraty, aby zapewnić skuteczniejszą penetrację przez barierę krew-mózg niż D-lucyferyna, w tym cycluc1. Substraty te mogą w przyszłości jeszcze bardziej poprawić granicę wykrywalności przeszczepionych komórek18. Ogólnie rzecz biorąc, protokół ten pozwala na prostą, minimalnie inwazyjną procedurę przeszczepu i obserwacji przeszczepów w mózgu myszy.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do zadeklarowania potencjalnego konfliktu interesów.

Podziękowania

Autorzy RR i CT dziękują za wsparcie ze strony Fundacji Mäxi i Centrum Kompetencji 3R.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Transduction
pLL-EF1a-rFLuc-T2A-GFP-mPGK-Puro (wirus Lenti-Labeler)SystembioLL410VA-1
Materiały eksploatacyjne
Falcon; 15 mlTPP91015
Szkiełka nakrywkowe mikroskopu Produktdo wyboru
SzkiełkaProdukt do wyboru
WacikiSterlie Produkt do wyboru
Szewy; 5/0 jedwab z zakrzywioną igłąB. BraunG0762482
Filtr strzykawkowy; 0,22 i mikro; mTPP99722
Strzykawka; 1 ml i 0,5 mlB. Braun9166017V
Płytka do hodowli tkankowej (24-dołkowa)TPP92024
Sprzęt
Automatyczny licznik komórek (Vi-CELL XR)Beckmann Coulter Life Science383721
KleszczeNarzędziado nauki precyzyjnej11064-07
Kleszcze, drobnenarzędzia do nauki11412-11
PoduszkaProdukt do wyboru
Zestaw szybkobieżnych bezszczotkowych mikrosilnikówForedomK.1060-22.
Idealny zestaw mikro wierteł z 5 specyficznymidla punktów60-1000
In-Vivo (pakiet oprogramowania IVIS Lumina III z pakietem oprogramowania Living Imaging 4.2)Parownik izofluranowy Perkin ElmerCLS136334
Provet AG330724
System pomp strzykawkowych do mikroiniekcjiWorld Precision InstrumentsUMP3T-1
Strzykawka mikrolitrowa; Seria 700; Objętość: 5-10 i mikro; LHamilton7635-01
MikrotomLeicaHM430
NanoFill-33 G-Needle (wyjmowany i wielokrotnego użytku)World Precision InstrumentsNF33BV-2
Uchwyt na igłęFine Science Tools12001-13
Pompa perfuzyjna i rurkaMasterflexHV-77120-42
SkalpelFine Science Tools10003-12
Nożyczki do małych bonn, prosteFine Science Tools14184-09
Nożyczki sprężynowe małe, prosteFine Science Tools15000-03
SzpatułkaMerckZ243213-2EA
Ramka stereotaktyczna dla gryzoni; zmotoryzowaneWorld Precision Instruments99401
Farmaceutyki i odczynniki
AccutaseInvitrogenA11105-01Proteolityczny i kolagenolilityczny; odczynnik do dysocjacji komórek
Przeciwciało przeciwko jądrom ludzkim, klon 235-1, koniugat biotynyMerckMAB1281B
B27 – Suplement (50x)Gibco17504-001
Betadine (11 mg Jod als Povidon-Iod pro 1 ml Lö sung)Mundipharma Medical CompanyWszystkie farmaceutyki zostały dostarczone przez aptekę kantonalną, Zurych, Szwajcaria
Roztwór blokujący (3% surowica osła; 0,1% Triton-X-100 w PBS)Produkt do wyboru; może być domowym
CHIR99021 (10 mM – 2,500x)StemMACS130-103-926
RoztwórkrioprotektantuProdukt z wyboru; może to być domowy
roztwór DAPI (1 mg / ml)Thermo Fisher Scientific62248
D-Lucyferin Sól potasowaPerkin Elmer122799
DMEM/F12Gibco11320-074
Przeciwciało wtórne o wysokiej adsorpcji krzyżowej przeciwko myszy, Alexa Fluor 555InvitrogenA-31570
SerumProdukt do wyboru
Esconarcon (Pentobarbitalum natricum 300 mg)Streuli Pharma AGem>Wszystkie farmaceutyki zostały dostarczone przez aptekę kantonalną, Zurych, Szwajcaria
Etanol; 70%Produkt do wyboru
FGF Podstawowe rekombinowane białko ludzkie, wolne od pochodzenia zwierzęcegoThermo Fisher Scientific 
Glutamax (100x)GibcoA12860-01
hLif (10 &mikro; g/ml – 1,000x)PeproTechAF-300-05-25UG
Izofluran (Isofluran (1-Chlor-2,2,2-trifluoretylo-difluorometylo­ eter) 99,9%)Provet AGem>Wszystkie leki zostały dostarczone przez aptekę kantonalną, Zurych, Szwajcaria
Laminin-L521 (L-521)Biolaminina LNLN521
Maść lidokainowa (Lidocaina: 25 mg, Prilocain: 25 mg)Aspen Pharma Schweiz GmbHWszystkie farmaceutyki zostały dostarczone przez aptekę kantonalną, Zurych, Szwajcaria
Montaż ŚredniProdukt do wyboru; może być domowej roboty
N2- Suplement (100x)Gibco  75202-001
Gibconeuropodstawny  21103-049
Smar oftalmiczny (Retinol palmitat: 15 000 UI)Bausch & Lomb Swiss AGem>Wszystkie farmaceutyki zostały dostarczone przez aptekę kantonalną w Zurychu, Szwajcaria
RoztwórProdukt do wyboru
PBSThermo Fisher Scientific10010023Może być również domowej roboty
Roztwór poli-L-ornityny (pLO)Sigma-AldrichP4957
Rimadyl (Karprofen 50 mg)Zoetis Schweiz GmbHWszystkie produkty farmaceutyczne zostały dostarczone przez aptekę kantonalną, Zurych, Szwajcaria
Mleczan RingeraB. Braun3570500
Roztwór RingeraB. Braun3570030
Sól fizjologiczna (0,9% NaCl)B. Braun3570160
SB431542 (10 mM – 3,333.3x)StemMACS130-106-543
Klej tkankowy (Histoacryl)B. Braun1050060
Eppendorf; 1,5 ml probówki Sigma Aldrich Z606340 mikroskopowe bawełniane grzewcza komórkowych systemem obrazowania osła<PHG6015<< paraformaldehydu

Bibliografia

  1. Rust, R., et al. Nogo-A targeted therapy promotes vascular repair and functional recovery following stroke. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (28), 14270-14279 (2019).
  2. Rust, R., et al. Anti-Nogo-A antibodies prevent vascular leakage and act as pro-angiogenic factors following stroke. Scientific Reports. 9 (1), 20040(2019).
  3. Weber, R. Z., et al. Characterization of the blood brain barrier disruption in the photothrombotic stroke model. Frontiers in Physiology. 11, 58226(2020).
  4. Sweeney, M. D., Sagare, A. P., Zlokovic, B. V. Blood-brain barrier breakdown in Alzheimer's disease and other neurodegenerative disorders. Nature Reviews. Neurology. 14 (3), 133-150 (2018).
  5. Wang, Y., et al. 3K3A-APC stimulates post-ischemic neuronal repair by human neural stem cells in mice. Nature Medicine. 22 (9), 1050-1055 (2016).
  6. Llorente, I. L., et al. Patient-derived glial enriched progenitors repair functional deficits due to white matter stroke and vascular dementia in rodents. Science Translational Medicine. 13 (590), (2021).
  7. Kokaia, Z., Llorente, I. L., Carmichael, S. T. Customized brain cells for stroke patients using pluripotent stem cells. Stroke. 49 (5), 1091-1098 (2018).
  8. Parmar, M., Grealish, S., Henchcliffe, C. The future of stem cell therapies for Parkinson disease. Nature Reviews Neuroscience. 21 (2), 103-115 (2020).
  9. Galgano, M., et al. Traumatic brain injury: current treatment strategies and future endeavors. Cell Transplantation. 26 (7), 1118-1130 (2017).
  10. Schweitzer, J. S., et al. Personalized iPSC-derived dopamine progenitor cells for Parkinson's disease. The New England Journal of Medicine. 382 (20), 1926-1932 (2020).
  11. Muir, K. W., et al. Intracerebral implantation of human neural stem cells and motor recovery after stroke: multicentre prospective single-arm study (PISCES-2). Journal of Neurology, Neurosurgery & Psychiatry. 91 (4), 396-401 (2020).
  12. Kawabori, M., et al. Cell therapy for chronic TBI: interim analysis of the randomized controlled STEMTRA trial. Neurology. 96 (8), 1202-1214 (2021).
  13. George, P. M., et al. Engineered stem cell mimics to enhance stroke recovery. Biomaterials. 178, 63-72 (2018).
  14. Sancho-Martinez, I., et al. Establishment of human iPSC-based models for the study and targeting of glioma initiating cells. Nature Communications. 7 (1), 1-14 (2016).
  15. Rust, R., et al. Xeno-free induced pluripotent stem cell-derived neural progenitor cells for in vivo applications. bioRxiv. , (2022).
  16. Franklin, K., Paxinos, G. Paxinos and Franklin's the Mouse brain in stereotaxic coordinates, compact: The coronal plates and diagrams. , Academic Press. (2019).
  17. Baker, S., Götz, J. A local insult of okadaic acid in wild-type mice induces tau phosphorylation and protein aggregation in anatomically distinct brain regions. Acta Neuropathologica Communications. 4, 32(2016).
  18. Cao, J., et al. In vivo optical imaging of myelination events in a myelin basic protein promoter-driven luciferase transgenic mouse model. ASN Neuro. 10, (2018).
  19. Aswendt, M., Adamczak, J., Couillard-Despres, S., Hoehn, M. Boosting bioluminescence neuroimaging: an optimized protocol for brain studies. PLoS One. 8 (2), 55662(2013).
  20. Roth, S., et al. Brain-released alarmins and stress response synergize in accelerating atherosclerosis progression after stroke. Science Translational Medicine. 10 (432), (2018).
  21. Rust, R., Hofer, A. -S., Schwab, M. E. Stroke promotes systemic endothelial inflammation and atherosclerosis. Trends in Molecular Medicine. 24 (7), 593-595 (2018).
  22. Rust, R., Gantner, C., Schwab, M. E. Pro- and antiangiogenic therapies: current status and clinical implications. FASEB Journal. 33 (1), 34-48 (2018).
  23. Rust, R., Grönnert, L., Weber, R. Z., Mulders, G., Schwab, M. E. Refueling the ischemic CNS: guidance molecules for vascular repair. Trends in Neurosciences. 42 (9), 644-656 (2019).
  24. Nih, L. R., Gojgini, S., Carmichael, S. T., Segura, T. Dual-function injectable angiogenic biomaterial for the repair of brain tissue following stroke. Nature Materials. 17 (7), 642(2018).
  25. Montagne, A., et al. Pericyte degeneration causes white matter dysfunction in the mouse central nervous system. Nature Medicine. 24 (3), 326-337 (2018).
  26. Montagne, A., et al. APOE4 leads to blood-brain barrier dysfunction predicting cognitive decline. Nature. 581 (7806), 71-76 (2020).
  27. George, P. M., Steinberg, G. K. Novel stroke therapeutics: unraveling stroke pathophysiology and its impact on clinical treatments. Neuron. 87 (2), 297-309 (2015).
  28. Weber, R. Z., et al. Deep learning based behavioral profiling of rodent stroke recovery. bioRxiv. , (2021).
  29. Nair, R. R., et al. Uses for humanised mouse models in precision medicine for neurodegenerative disease. Mammalian Genome. 30 (7), 173-191 (2019).
  30. Kirabali, T., Rust, R. iPS-derived pericytes for neurovascular regeneration. European Journal of Clinical Investigation. 51 (9), 13601(2021).
  31. Weber, R. Z., Perron, P., Rust, R. Astrocytes for brain repair: More than just a neuron's sidekick. Brain Pathology. 31 (5), Zurich, Switzerland. 12999(2021).
  32. Johansen, J., et al. Evaluation of Tet-on system to avoid transgene down-regulation in ex vivo gene transfer to the CNS. Gene Therapy. 9 (19), 1291-1301 (2002).
  33. Vogel, S., et al. Initial graft size and not the innate immune response limit survival of engrafted neural stem cells. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (3), 784-793 (2018).

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Śledzenie komórekwstrzyknięcie stereotaktycznetransdukcja lentiwirusowaobrazowanie bioluminescencyjneanaliza immunofluorescencyjnamigracja komórek
Przeszczep domózgowy i śledzenie bioluminescencji in vivo ludzkich nerwowych komórek progenitorowych w mózgu myszy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.