Artykuł metodologiczny

Test mikrowzorcowy do pomiaru chiralności komórek

DOI:

10.3791/63105

⸱

11 marca 2022

 ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Rensselaer Polytechnic Institute, 2Center for Biotechnology & Interdisciplinary Studies, Rensselaer Polytechnic Institute, 3Department of Biomedical Engineering, Columbia University, 4Department of Medicine, Columbia University, 5Department of Biological Sciences, Rensselaer Polytechnic Institute, 6Center for Modeling, Simulation, and Imaging in Medicine, Rensselaer Polytechnic Institute

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiamy protokół do określania chiralności wielokomórkowej in vitro, przy użyciu techniki mikrowzorcowania. Test ten pozwala na automatyczną kwantyfikację odchyleń od lewej do prawej różnych typów komórek i może być stosowany do celów przesiewowych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chiralność to wewnętrzna właściwość komórkowa, która obrazuje asymetrię w kategoriach polaryzacji wzdłuż osi lewy-prawa komórki. Ponieważ ta wyjątkowa właściwość przyciąga coraz większą uwagę ze względu na jej ważną rolę zarówno w rozwoju, jak i chorobie, ustandaryzowana metoda kwantyfikacji do charakteryzowania chiralności komórek przyczyniłaby się do postępu w badaniach i potencjalnych zastosowaniach. W tym protokole opisujemy wielokomórkowy test charakteryzujący chiralności, który wykorzystuje mikrowzorzyste układy komórek. Mikrowzory komórkowe są wytwarzane na szkiełkach pokrytych tytanem/złotem za pomocą druku mikrokontaktowego. Po wysiewie na geometrycznie zdefiniowanych (np. w kształcie pierścienia), pokrytych białkiem wyspach, komórki migrują kierunkowo i tworzą stronnicze wyrównanie w kierunku zgodnym z ruchem wskazówek zegara lub przeciwnym do ruchu wskazówek zegara, które może być automatycznie analizowane i określane ilościowo przez specjalnie napisany program MATLAB. Tutaj szczegółowo opisujemy wytwarzanie substratów mikrowzorcowych, wysiewanie komórek, zbieranie obrazów i analizę danych oraz pokazujemy reprezentatywne wyniki uzyskane przy użyciu komórek NIH / 3T3. Protokół ten został wcześniej zatwierdzony w wielu opublikowanych badaniach i jest skutecznym i niezawodnym narzędziem do badania chiralności komórek in vitro.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Asymetria lewo-prawo (LR) komórki, znana również jako komórkowa ręczność lub chiralności, opisuje polaryzację komórki na osi LR i jest uznawana za podstawową, zachowaną, biofizyczną właściwość1,2,3,4,5. Chiralność komórek obserwowano zarówno in vivo, jak i in vitro w wielu skalach. Poprzednie odkrycia ujawniły chiralne wirowanie cytoszkieletu aktynowego w pojedynczych komórkach wysianych na okrągłych wyspach6, tendencyjną migrację i wyrównanie komórek w ograniczonych granicach7,8,9,10,11, oraz asymetryczne zapętlenie rurki grzewczej kurczaka12.

Na poziomie wielokomórkowym chiralność komórek można określić na podstawie kierunkowej migracji lub wyrównania, rotacji komórek, dynamiki cytoszkieletu i pozycjonowania organelli komórkowych7,8,9,10,11,12,13. Opracowaliśmy test oparty na mikrowzorcach14, aby skutecznie scharakteryzować odchylenie chiralne komórek przylegających7,8,9,10. Dzięki mikrowzorom w kształcie pierścienia geometrycznie ograniczającym skupiska komórek, komórki łącznie wykazują migrację kierunkową i stronnicze wyrównanie. Opracowano program MATLAB, który automatycznie wykrywa i mierzy wyrównanie komórek na obrazach pierścienia z kontrastem fazowym. Kierunek lokalnego wyrównania komórek jest określany ilościowo za pomocą kąta spolaryzowanego, w zależności od jego odchylenia od kierunku obwodowego. Po analizie statystycznej układ pierścieni komórek jest oznaczany jako odchylenie w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara (CCW) lub odchylenie w kierunku zgodnym z ruchem wskazówek zegara (CW).

Ten test został użyty do scharakteryzowania chiralności wielu fenotypów komórkowych (Tabela 1), a asymetria LR komórek została uznana za specyficzną dla fenotypu7,11,15. Co więcej, zakłócenie dynamiki i morfologii aktyny może spowodować odwrócenie odchylenia chiralnego7,8, a stres oksydacyjny może również zmienić chiralność komórki9. Ze względu na prostotę procedury i solidność podejścia7,8,9,10, ten test chiralności 2D zapewnia wydajne i niezawodne narzędzie do określania i badania chiralności wielokomórkowej in vitro.

Celem tego protokołu jest zademonstrowanie użycia tej metody do scharakteryzowania chiralności komórek. Protokół ten opisuje, w jaki sposób wytwarzać wzorzyste macierze komórkowe za pomocą techniki drukowania mikrokontaktowego i przeprowadzać analizę chiralności w sposób zautomatyzowany za pomocą programu MATLAB.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Produkcja znaczków z polidimetylosiloksanu (PDMS)16

  1. Narysuj tablicę pierścieni w mikroskali za pomocą oprogramowania CAD, o średnicy wewnętrznej 250 μm i średnicy zewnętrznej 450 μm. Wzorzec używany w tym protokole to tablica 10 x 10 z odległością między pierścieniami 850 μm.
  2. Wydrukuj przezroczystą maskę wzoru w żądanej rozdzielczości, korzystając z usługi drukowania masek firmy zajmującej się mikrofabrykacją (patrz Tabela materiałów).
    UWAGA: Udowodniono, że podane wymiary pierścienia działają dla wielu typów komórek7.
  3. Przeprowadź fotolitografię w ultrafiolecie (UV) przy użyciu maski zawierającej pożądane cechy, aby uzyskać ujemną formę fotorezystu (taką jak SU-8)8.
    1. Przykryj płytkę krzemową pokrytą spinowo fotorezystem za pomocą maski przezroczystej wykonanej w krokach 1.1-1.2.
    2. Na nakładce kontaktowej UV spolimeryzuj fotorezystor pod przezroczystymi obszarami maski za pomocą światła UV.
      UWAGA: Po dalszym myciu i opracowaniu, forma główna z pożądanymi cechami jest wytwarzana8. Szczegóły operacyjne zależą od konkretnego używanego sprzętu.
  4. Przygotuj prepolimery elastomerowe PDMS, mieszając je z utwardzaczem w stosunku 10:1, a następnie odlej mieszaninę na formę na szalce Petriego.
  5. Umieść naczynie w komorze próżniowej na 30 minut w celu usunięcia pęcherzyków powietrza z PDMS i piecz w piekarniku w temperaturze 60 °C przez co najmniej 2 godziny.
  6. Po całkowitym utwardzeniu PDMS wytnij tablice wzorów na stemple.
    UWAGA: Grubsze stemple (około 1 cm) mogą być preferowane ze względu na łatwość obsługi na późniejszych etapach druku mikrokontaktowego.

2. Powłoka szkiełek

  1. Wyczyść szkiełka podstawowe. Namocz szkiełka w kąpieli 100% etanolowej, sonikuj przez 5 minut, a następnie spłucz wodą.
  2. Powtórz ten krok najpierw z acetonem, następnie z izopropanolem, a następnie susz w strumieniu azotu.
  3. Użyj urządzenia do odparowywania wiązką elektronów (wiązką elektronów), aby pokryć warstwy tytanu i złota na szkiełkach szkiełkowych.
    UWAGA: W przypadku warstwy tytanu pożądana grubość wynosi 15 A (1 A = 10-10 m). W przypadku warstwy złota pożądana grubość wynosi 150 A. Najpierw pokryj tytan, a następnie złoto, ponieważ warstwa tytanu służy jako klej między złotem a szkiełkiem.
  4. Oczyszczone szkiełka należy umieścić w komorze parowania i włożyć pod żaluzje tygle złote i tytanowe.
  5. Przepompuj w dół komory, aby wytworzyć podciśnienie niższe niż 10-5 Pa przed stopieniem metali. Skoncentruj wiązkę elektronów na metalu i dostosuj moc tak, aby szybkość osadzania była odpowiednia do kontrolowania grubości osadzania.
  6. Otwórz migawkę, aby rozpocząć osadzanie metalu. Zamknij żaluzję, gdy zostanie osiągnięta żądana grubość.
  7. Przełączać tygle między sekwencyjnym odparowywaniem dwóch metali.
  8. Poczekaj, aż tygle ostygną zgodnie z wymaganiami urządzenia, odwietrz komorę i wyjmij szkiełka pokryte złotem.
  9. Ponownie przepompuj komorę w dół w celu konserwacji sprzętu.
    UWAGA: Szczegóły operacyjne mogą zależeć od konkretnego parownika z wiązką elektronową. Ważne jest, aby dobrze kontrolowany, niski stopień osadzania tytanu był ważny. Gruba warstwa tytanu często prowadzi do słabej widoczności, szczególnie w przypadku obrazowania fluorescencyjnego komórek. Po pokryciu szkiełka ze szkła pokrytego tytanem/złotem można przechowywać w suchej komorze próżniowej w temperaturze pokojowej przez co najmniej 1 miesiąc.

3. Druk mikrokontaktowy

  1. W razie potrzeby pokrój szkiełko pokryte tytanem/złotem na mniejsze kawałki. Do typowego zastosowania zalecany jest kwadratowy kształt 12 mm x 12 mm (Rysunek 1B).
  2. Użyj noża do szkła, aby przesunąć się po powierzchni, aby pozostawić wgniecioną ścieżkę, a następnie przytrzymaj szkiełko po obu stronach i zegnij wgłębienie, aby rozbić się na małe ćwiartki. Unikaj dotykania powierzchni pokrytej złotem.
    UWAGA: Aby wizualnie określić, która strona szkła jest powlekaną powierzchnią w przypadku przypadkowego przewrócenia, porównaj odbicie światła po obu stronach. Powierzchnia pokryta złotem będzie miała jaśniejsze odbicie, podczas gdy strona niepowlekana będzie miała ciemniejsze odbicie (od warstwy tytanu po drugiej stronie szkła). Alternatywnym sposobem jest obserwacja krawędzi prowadnicy, a stronę powłoki można określić na podstawie pionowej powierzchni cięcia.
  3. Wyczyść szkiełka, mocząc je w 100% etanolu na szalce Petriego złotą stroną do góry na wytrząsarce orbitalnej przez co najmniej 10 minut. Odessać etanol, a następnie wysuszyć każde szkiełko, przedmuchując strumieniem azotu.
  4. Wyczyść stemple PDMS wodą z mydłem, a następnie 100% etanolem. Wysuszyć stemple gazowym azotem.
  5. Przygotować 2 mM roztwór oktadekanetiolu (C18), rozpuszczając 5,74 mg proszku C18 w 10 ml 100% etanolu.
    UWAGA: Zamknij i przechowuj roztwór C18 w temperaturze pokojowej. Drukowanie wzorów za pomocą C18 tworzy samoprzylepną, samoorganizującą się monowarstwę, do której preferencyjnie przyczepi się fibronektyna i komórki.
  6. Namocz stemple PDMS w roztworze C18 wzorzystą powierzchnią skierowaną w dół na 10 s i delikatnie osusz azotem przez 60 s.
    UWAGA: Podczas suszenia najpierw umieść strumień z dala od stempla (około 1 m), aż większość płynu wyparuje, a następnie powoli przesuń strumień bliżej, aby całkowicie wysuszyć stempel. Ma to na celu uniknięcie zdmuchnięcia roztworu C18 zamiast wyschnięcia na stemplu.
  7. Połóż stempel stroną zadrukowaną do dołu na złotych szkiełkach przez 60 sekund przed usunięciem.
  8. Aby zapewnić prawidłowe stemplowanie, delikatnie postukaj pęsetą o stempele, aby prawidłowo przenieść wzory. Nie naciskaj zbyt mocno, a waga pęsety jest zwykle wystarczająca.
    UWAGA: Oględziny stempla podczas stukania zapewnią, że stempel i szkiełko zetknęły się równomiernie.
  9. Przygotuj komory wilgotnościowe.
    1. Odpipetować 1 ml 70% etanolu do odwróconej pokrywki szalki Petriego i położyć kawałek parafilmu, aby pokryć powierzchnię (przykryty stroną zadrukowaną do góry).
    2. Użyj pęsety, aby podnieść, połóż parafilm, aby upewnić się, że nie ma pęcherzyków powietrza, i w razie potrzeby usuń nadmiar etanolu.
  10. Przygotować 2 mM ROZTWÓR HS-(CH 2)11-EG 3-OH (EG3): Rozcieńczyć 5 μl roztworu podstawowego w 5 ml 100% etanolu.
    UWAGA: Rozcieńczony roztwór EG3 można szczelnie zamknąć i przechowywać w temperaturze 4 °C, a nierozcieńczony roztwór EG3 należy przechowywać w temperaturze -20 °C. Obróbka EG3 służy do tego, aby szklany obszar bez C18 nie przywierał do komórek.
  11. Mikropipeta 40 μl kropelek EG3 na każdą ćwiartkę szkła wsunąć na parafilm w komorze wilgotnościowej, pozostawiając wystarczająco dużo miejsca między kropelkami, aby uwzględnić odstępy między złotymi szkiełkami.
  12. Użyj pęsety, aby umieścić złote szkiełka z nadrukiem C18 zadrukowane twarzą w dół na kropelkach i upewnij się, że pod szkiełkami nie ma pęcherzyków. Delikatnie dociśnij szkiełka do siebie, nie podnosząc ich, aby zminimalizować parowanie.
    UWAGA: Umieść jedną krawędź szkiełka w dół w pobliżu kropli, a następnie powoli opuść drugi koniec szkiełka w dół. Jeśli bańka jest obecna, popchnij złoty szkiełko bez podnoszenia go, aż bańka zniknie.
  13. Szczelnie zamknąć szalkę Petriego parafilmem i pozostawić w temperaturze pokojowej na co najmniej 3 godziny
    UWAGA: Jeśli pożądana jest intensywna inkubacja, należy dwukrotnie zamknąć szalkę Petriego i pozostawić ją na maksymalnie 24 godziny.
  14. W komorze bezpieczeństwa biologicznego umieść złote szkiełka zadrukowaną do góry na szalce Petriego, namocz i spłucz 3 razy w 70% etanolu, aby usunąć EG3, a następnie pozostaw w etanolu na 10 minut w celu sterylizacji.
  15. Odessać etanol i zastąpić go sterylnym PBS.
  16. Przygotuj kolejną komorę wilgotnościową zgodnie z opisem w kroku 3.9, z PBS zamiast etanolu.
    UWAGA: Ze względu na różnicę w napięciu powierzchniowym łatwiej jest najpierw dodać 4-5 ml PBS, aby położyć parafilm i usunąć pęcherzyki, a następnie odessać nadmiar.
  17. Przygotować 50 μg/ml roztworu fibronektyny (inne białka, jeśli jest to pożądane) w sterylnym PBS i mikropipetować 50 μl kropelek roztworu fibronektyny na każdą ćwiartkę szkiełka na parafilm, pozostawiając trochę miejsca między kropelkami.
    UWAGA: Powłoka Fibronektyny ułatwia przyleganie komórek do wzorzystych powierzchni.
  18. Użyj pęsety waflowej, aby umieścić szkiełka zadrukowaną w dół na kropelkach i upewnij się, że pod szkiełkami nie ma pęcherzyków. Delikatnie dociśnij prowadnice do siebie, nie podnosząc ich.
    UWAGA: Do obsługi szkiełek zalecana jest pęseta do szkiełek lub pęseta waflowa z prostymi, szerokimi końcówkami.
  19. Pozostawić szalkę Petriego w komorze bezpieczeństwa biologicznego na 30 minut.
  20. Po 30 minutach umieść złote szkiełka zadrukowaną do góry w PBS po 3-krotnym spłukaniu.
    UWAGA: Szkiełka z wzorem fibronektyny można przechowywać w PBS w temperaturze 4 °C przez około miesiąc.

4. Umieszczanie komórek na szkiełkach z mikrowzorami

  1. Podgrzej pożywkę do hodowli komórkowych i trypsynę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
    UWAGA: Poniższy opis subkultury dotyczy komórek NIH / 3T3. Warunki hodowli mogą się różnić w zależności od typu komórek.
  2. (Opcjonalnie) Namocz wzorzyste szkiełka w pożywkach hodowlanych na 12-dołkowej płytce, rozgrzej do 37 °C w inkubatorze przed trypsynizacją komórek w celu lepszego przyłączenia komórek.
  3. Trypsynizować komórki, neutralizować pożywką zawierającą FBS, odwirowywać przy 100 x g przez 3 minuty, a następnie ponownie zawiesić, dobrze mieszając ze świeżą pożywką.
    UWAGA: Upewnij się, że komórki są całkowicie oddzielone od siebie.
  4. Policz komórki, rozcieńcz do 200 000 komórek/ml i dodaj 0,5 ml zawiesiny komórek do każdej studzienki zawierającej jedno złote szkiełko.
  5. Delikatnie potrząśnij płytką studzienki kilka razy, aby uzyskać równomierny wysiew komórek i przechowuj ją w inkubatorze przez 15 minut, aby umożliwić przyczepienie komórek.
  6. Po 15 minutach sprawdź przyczepienie komórek pod mikroskopem. W razie potrzeby daj dodatkowy czas.
    UWAGA: Przyczepione komórki rozprzestrzenią się na powierzchni z widocznym filopodium lub spłaszczeniem i nie odsuną się od powierzchni, gdy płytka studzienki zostanie delikatnie stuknięta lub przesunięta.
  7. Odessać pożywkę zawierającą nieprzyłączone komórki z każdej studzienki i dodać 1 ml pożywki hodowlanej. W przypadku leczenia farmakologicznego na tym etapie należy uzupełnić dodatkowe odczynniki do pożywek hodowlanych.
  8. Hoduj komórki w inkubatorze przez 24 godziny i sprawdzaj zbieżność, aby określić, czy utworzyła się chiralności.
    UWAGA: Powyżej 75% konfluencji jest zalecana dla większości typów komórek, a nadmierna konfluencja może wpływać na charakterystykę chiralności.

5. Kolekcja obrazów

  1. Napraw komórki po zbiegu.
    1. Usunąć pożywkę hodowlaną z płytki studzienki i spłukać raz PBS.
    2. Dodać 4% roztwór paraformaldehydu, inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut, a następnie spłukać 3 razy PBS.
      UWAGA: Jeśli fiksacja znacząco zmienia morfologię komórki, zaleca się obrazowanie przed fiksacją
  2. Użyj mikroskopu z kontrastem fazowym z funkcją kamery, zobrazuj każdy pierścień na szkiełkach w wysokiej rozdzielczości (do analizy wystarczy soczewka obiektu 10x).

6. Charakterystyka chiralności komórek (Rysunek 2)

  1. Pobierz pliki kodu MATLAB do charakterystyki chiralności z plików uzupełniających (Plik uzupełniający 1).
    UWAGA: Kod został przetestowany pod kątem pracy z MATLAB_R2015b i nowszymi wersjami zarówno w systemach Windows, jak i macOS. Do uruchomienia plików wymagany jest również przybornik statystyk cyklicznych, który można znaleźć w katalogu reference17.
  2. Dodaj folder kodu i podfoldery (z cyklicznym przybornikiem statystycznym w środku) do ścieżki MATLAB i otwórz plik "ROI_selection.m". W wierszu 4 zmień katalog na żądany folder danych (dla użytkowników okien zmień "/" na "\" w wierszach 4 i 5).
  3. Zmień rozmiar obrazu w wierszu 14, przy czym pierwsze dwie cyfry reprezentują rozmiar wewnętrznego okręgu pierścienia, a pozostałe dwie reprezentują zewnętrzny.
    UWAGA: Upewnij się, że rozmiary wszystkich obrazów w folderze, który ma być analizowany, są identyczne.
  4. Kliknij przycisk Uruchom, aby wykonać kod MATLAB "ROI_selection.m" w celu określenia obszaru zainteresowania (ROI) na obrazach z kontrastem fazowym.
  5. Ręcznie przeciągnij kwadrat zaznaczenia, aby pasował do pierścienia, a następnie kliknij dwukrotnie obraz, aby potwierdzić wybór.
  6. Powtórz ten krok dla każdego obrazu w folderze (następny obraz pojawi się automatycznie po potwierdzeniu wyboru ROI poprzedniego obrazu); zostanie wygenerowany plik ".mat" do przechowywania informacji o ROI dla każdego obrazu.
  7. Otwórz plik "Analysis_batch.m" i zmień katalog folderu tak samo, jak w kroku 6.2. (Dla użytkowników okien, przy pierwszym użyciu, zamień "/" na "\" w wierszach 5, 6, 124 i 130)
  8. Kliknij przycisk Uruchom, aby wykonać kod "Analysis_batch.m" w celu określenia chiralności wielu wzorców pierścieni komórkowych. Zostanie wygenerowany plik "datatoexcel.txt", zawierający statystyki kołowe dla każdego pierścienia, a także liczbę pierścieni zgodnych z ruchem wskazówek zegara, niechiralnych i przeciwnych do ruchu wskazówek zegara.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Piętnaście minut po wysiewie komórek NIH/3T3, adhezja komórek na wzorze pierścienia została wizualnie potwierdzona przez obrazowanie z kontrastem fazowym. Po kolejnej hodowli trwającej 24 godziny, komórki na wzorach stawały się zlewające i wydłużone z wyraźnie asymetrycznymi wyrównaniami, odchylonymi w kierunku zgodnym z ruchem wskazówek zegara (Rysunek 2). Kierunkowa migracja przyłączonych komórek jest rejestrowana za pomocą obrazowania poklatkowego, ruchliwość i morfogenezę komórek można określić il...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisany tutaj test wzorca w kształcie pierścienia zapewnia łatwe w użyciu narzędzie do ilościowej charakterystyki chiralności wielokomórkowej, zdolne do uzyskania wysoce wiarygodnych i powtarzalnych wyników. Szybkie generowanie identycznie zdefiniowanych mikrośrodowisk i bezstronna analiza umożliwiają zautomatyzowane, wysokowydajne przetwarzanie próbek o dużych rozmiarach. Protokół ten omawia wytwarzanie mikrowzorów pierścieniowych, tworzenie wzorów komórek oraz automatyczną analizę tendencyjnego wyrównania komórek i ruc...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca została sfinansowana przez National Institutes of Health (OD/NICHD DP2HD083961 i NHBLI R01HL148104). Leo Q. Wan jest stypendystą Pew Scholar in Biomedical Sciences (PEW 00026185), wspieranym przez Pew Charitable Trusts. Haokang Zhang jest wspierany przez American Heart Association Predoctoral Fellowship (20PRE35210243).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
200-procentowy systemKoptecDSP-MD-43
BZXKeyenceBZX-600
Zmodyfikowana pożywka orła (DMEM) firmy Dulbecco, wysoka glukozaGibco11965092
Parownik wiązki elektronówTemscalBJD-1800Powłoka złoto-tytanowa
Surowica bydlęcapłodu VWR89510-186
Fibronektyna z osocza bydlęcegoSigmaF1141-5MG
Szkiełka mikroskopoweszklane VWR10024-048
Pęseta szklanaExelta390BSAPI Granulki
do odparowywania złotaMiędzynarodowe materiały zaawansowaneAU18
HS-(CH2)11-EG3-OH (EG3)ProchimiaTH 001-m11.n3-0.2
MATLABKomórki MathworksMATLAB_R2020b
NIH/3T3ATCCCRL-1658
OAI Aligner kontaktowyOAI200Fotolitografia UV
Oktadekanotiol (C18)SigmaO1858-25ML
Wytrząsarka orbitalnaVWR89032-088
buforowana fosforanami (PBS)Produkt badawczy międzynarodowyP32080-100T
Polidimetylosiloksan Sylgard 184Dow CorningDC4019862
Wafel krzemowyUniversity WaferID#809
Pirogronian soduThermo fisher scientific11360-070
SU-8 3050 fotorezystorMicroChemY311075 0500L1GL
Tytanowe pelety do odparowywania InternationalAdvanced MateriałyTI14
Maska przezroczysta (z funkcją Outputicity.comNie dotyczyusługi drukowania maski
Trypsin-EDTA (0,25%)Thermo fisher scientific25200-072
mikroskopowy Sól fizjologiczna

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wan, L. Q., Chin, A. S., Worley, K. E., Ray, P. Cell chirality: emergence of asymmetry from cell culture. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 371, 20150413(2016).
  2. Rahman, T., Zhang, H., Fan, J., Wan, L. Q. Cell chirality in cardiovascular development and disease. APL Bioengineering. 4 (3), (2020).
  3. Inaki, M., Liu, J., Matsuno, K. Cell chirality: Its origin and roles in left-right asymmetric development. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 371 (1710), 20150413(2016).
  4. Utsunomiya, S., et al. Cells with broken left-right symmetry: Roles of intrinsic cell chirality in left-right asymmetric epithelial morphogenesis. Symmetry. 11 (4), 505(2019).
  5. Tamada, A. Chiral neuronal motility: The missing link between molecular chirality and brain asymmetry. Symmetry. 11 (1), 102(2019).
  6. Tee, Y. H., et al. Cellular chirality arising from the self-organization of the actin cytoskeleton. Nature Cell Biology. 17 (4), 445-457 (2015).
  7. Wan, L. Q., et al. Micropatterned mammalian cells exhibit phenotype-specific left-right asymmetry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (30), 12295-12300 (2011).
  8. Fan, J., et al. Cell chirality regulates intercellular junctions and endothelial permeability. Science Advances. 4 (10), 2111(2018).
  9. Singh, A. V., et al. Carbon nanotube-induced loss of multicellular chirality on micropatterned substrate is mediated by oxidative stress. ACS Nano. 8 (3), 2196-2205 (2014).
  10. Zhang, H., Fan, J., Zhao, Z., Wang, C., Wan, L. Q. Effects of Alzheimer's disease-related proteins on the chirality of brain endothelial cells. Cellular and Molecular Bioengineering. 14, 231-240 (2021).
  11. Chen, T. H., et al. Left-right symmetry breaking in tissue morphogenesis via cytoskeletal mechanics. Circulation Research. 110 (4), 551-559 (2012).
  12. Ray, P., et al. Intrinsic cellular chirality regulates left-right symmetry breaking during cardiac looping. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (50), 11568-11577 (2018).
  13. Fan, J., Zhang, H., Rahman, T., Stanton, D. N., Wan, L. Q. Cell organelle-based analysis of cell chirality. Communicative and Integrative Biology. 12 (1), 78-81 (2019).
  14. Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. Geometric control of cell life and death. Science. 276 (5317), 1425-1428 (1997).
  15. Liu, W., et al. Nanowire magnetoscope reveals a cellular torque with left-right bias. ACS Nano. 10 (8), 7409-7417 (2016).
  16. Wan, L. Q., et al. Geometric control of human stem cell morphology and differentiation. Integrative Biology. 2 (7-8), 346-353 (2010).
  17. Circular Statistics Toolbox. MathWorks. , Available from: https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/10676-circular-statistics-toolbox-directional-statistics (2021).
  18. Chin, A. S., Worley, K. E., Ray, P., Kaur, G., Fan, J., Wan, L. Q. Epithelial cell chirality revealed by three-dimensional spontaneous rotation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (48), 12188-12193 (2018).
  19. Worley, K. E., Chin, A. S., Wan, L. Q. Lineage-specific chiral biases of human embryonic stem cells during differentiation. Stem Cells International. 2018, 1848605(2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Chiralno wielokom rkowamikrodruk kontaktowyszkie ko titanowo z otetest z wzorem pier cieniowymmikroskopia kontrastowaanaliza w programie MATLABpolimeryzacja aktynymigracja kom rek

Powiązane artykuły