Artykuł metodologiczny

Klasyfikacja stanu aktywacji neuronalnych komórek macierzystych in vitro za pomocą autofluorescencji

1.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63110

⸱

12 kwietnia 2024

 ,  ,  , 
1Department of Neuroscience, University of Wisconsin-Madison, 2Morgridge Institute for Research, 3Department of Biomedical Engineering, University of Wisconsin-Madison

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje strategie identyfikacji i wzbogacania stanu komórki w pierwotnych hodowlach dorosłych mysich nerwowych komórek macierzystych za pomocą obrazowania autofluorescencyjnego przy użyciu i) mikroskopu konfokalnego, ii) aktywowanego fluorescencyjnie sortera komórek do wykonywania obrazowania intensywności, lub iii) mikroskopu wielofotonowego do wykonywania obrazowania czasu życia fluorescencji.

Streszczenie

Neuronalne komórki macierzyste (NSC) dzielą się i wytwarzają nowo narodzone neurony w dorosłym mózgu w procesie zwanym neurogenezą dorosłych. Dorosłe NSC są przede wszystkim w stanie spoczynku, odwracalnym stanie komórkowym, w którym opuściły cykl komórkowy (G0), ale pozostają wrażliwe na środowisko. W pierwszym etapie neurogenezy u dorosłych spoczynkowe NSC (qNSC) odbierają sygnał i aktywują się, wychodząc ze stanu spoczynku i ponownie wchodząc w cykl komórkowy. W związku z tym zrozumienie regulatorów spoczynku NSC i wyjścia w stanie spoczynku ma kluczowe znaczenie dla przyszłych strategii ukierunkowanych na neurogenezę dorosłych. Jednak nasze zrozumienie spoczynku NSC jest ograniczone przez ograniczenia techniczne w identyfikacji spoczynkowych NSC (qNSC) i aktywowanych NSC (aNSC). Protokół ten opisuje nowe podejście do identyfikacji i wzbogacania qNSC i aNSC generowanych w hodowlach in vitro poprzez obrazowanie autofluorescencji NSC. Po pierwsze, protokół ten opisuje, jak używać mikroskopu konfokalnego do identyfikacji markerów autofluorescencyjnych qNSC i aNSC w celu sklasyfikowania stanu aktywacji NSC przy użyciu intensywności autofluorescencji. Po drugie, protokół ten opisuje, jak używać sortera komórek aktywowanych fluorescencyjnie (FACS) do klasyfikowania stanu aktywacji NSC i wzbogacania próbek pod kątem qNSC lub aNSC przy użyciu intensywności autofluorescencji. Po trzecie, protokół ten opisuje, jak używać mikroskopu wielofotonowego do wykonywania obrazowania czasu życia fluorescencji (FLIM) w rozdzielczości pojedynczej komórki, klasyfikowania stanu aktywacji NSC i śledzenia dynamiki wyjścia w stanie spoczynku przy użyciu zarówno intensywności autofluorescencji, jak i czasu życia fluorescencji. W związku z tym protokół ten zapewnia zestaw narzędzi do rozpoznawania pojedynczych komórek w żywych komórkach, bez znaczników, do badania stanu spoczynku NSC i wyjścia w stanie spoczynku.

Wprowadzenie

NSC tworzą nowo narodzone neurony przez całe życie w wielu organizmach w procesie określanym jako neurogeneza dorosłych1,2. Aby wytworzyć nowo narodzone neurony, qNSC musi się najpierw aktywować, wchodząc w cykl komórkowy, aby rozszerzyć populację i wytworzyć neuronalne komórki progenitorowe3,4,5,6. Chociaż wiele wiadomo na temat spoczynku NSC, nasza zdolność do pełnej identyfikacji czynników powodujących i regulatorów stanu spoczynku NSC jest ograniczona przez ograniczenia techniczne, które istnieją w celu wyizolowania i zidentyfikowania qNSC oraz ich przejścia do aktywacji. Obrazowanie autofluorescencyjne było wcześniej skuteczne w badaniu zmian stanu komórek w wielu różnych typach komórek, takich jak mikroglej i limfocyty T, rozwiązując problem przebudowy metabolicznej, która wpływa na właściwości optyczne autofluorescencyjnych kofaktorów metabolicznych, takich jak fosforan dinukleotydu nikotynamidoadeninowego (NAD(P)H) i dinukleotyd flawinoadeninowy (FAD)7,8. NSC znacznie przebudowują swoje sieci metaboliczne, gdy przechodzą przez wyjście w stanie spoczynku9,10,11,12,13,14. Tak więc, aby wykorzystać te różnice, autofluorescencja NSC została niedawno wykorzystana do identyfikacji i wzbogacenia stanu aktywacji NSC poprzez wykrywanie zmian w autofluorescencji przypisywanych przebudowie metabolicznej, która zachodzi, gdy NSC wychodzą ze stanu spoczynku15. Obrazowanie autofluorescencji ma kilka zalet technicznych: i) nie wymaga dodawania egzogennych znaczników, które mogą wpływać na zachowanie komórek; ii) może dostarczać danych jednokomórkowych o wysokiej rozdzielczości na temat stanu aktywacji NSC; oraz iii) nie wymaga zniszczenia komórki7,16. Protokół ten przedstawia trzy strategie wykorzystania autofluorescencji NSC do badania stanów spoczynku i aktywacji komórek NSC15.

Niedawno, NSC wyizolowane od 6-tygodniowych samców myszy ze strefy subziarnistej hipokampa, hodowane i odwracalnie wprowadzane w stan spoczynku in vitro10,13,17,18,19,20,21stwierdzono, że wykazują podwyższone poziomy autofluorescencji punktowej (PAF), która wzbudza w zakresie 400-600 nm i emituje w zakresie 500-700 nm. Ten sygnał był specyficzny dla qNSC w porównaniu z aktywowanymi, cyklicznymi NSCs15. Możliwość wizualnego oddzielenia tych dwóch populacji bez użycia dodatkowych markerów przeciwciał lub reporterów jest przydatna w przypadku wielu pytań eksperymentalnych dotyczących natury qNSC i wyjść spoczynku. Tak więc, po pierwsze, protokół ten opisuje strategie obrazowania PAF w qNSC za pomocą mikroskopu konfokalnego, który może być użyty do identyfikacji stanu aktywacji NSC. Po drugie, protokół ten opisuje strategie wykrywania PAF za pomocą sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) i dalej opisuje, jak sortować na podstawie tego sygnału w celu wzbogacenia qNSC lub aNSC. Strategie te zapewniają jedną miarę, której można użyć do grupowania i oddzielania NSC na podstawie stanu komórki.

Aby opracować metodę separacji NSC o wyższej rozdzielczości nie tylko w różnych stanach, ale także podczas przechodzenia przez wyjście w stanie spoczynku w kierunku pełnej aktywacji, przeprowadzono obrazowanie czasu życia fluorescencji (FLIM) za pomocą mikroskopu wielofotonowego do zobrazowania autofluorescencji NAD(P)H (określanej jako Kanał 1) i autofluorescencji zielonej (określanej jako Kanał 2; która wykrywa zarówno autofluorescencję FAD, jak i PAF w qNSC) wraz z ich intensywnością. Podejście to wykorzystuje fakt, że właściwości optyczne cząsteczek w komórce zależą od ich właściwości fizycznych16,22. Na przykład NAD(P) (NAD i NADP są optycznie nierozróżnialne, a zatem NAD(P) jest używany w odniesieniu do obu gatunków) nie jest autofluorescencyjny w stanie utlenionym, ale jest autofluorescencyjny w stanie zredukowanym (NAD(P)H)23. Co więcej, dodatkowe właściwości fizyczne cząsteczek autofluorescencyjnych, takie jak ich status wiązania z enzymami, można ekstrapolować, wykonując obrazowanie czasu życia fluorescencji7,22,24. Na przykład NAD(P)H ma krótszy czas trwania fluorescencji, gdy nie jest związany z enzymem22. Ponieważ cząsteczki autofluorescencyjne, takie jak NAD(P)H, która bierze udział w setkach reakcji metabolicznych, są w różny sposób wykorzystywane przez komórki przechodzące przez różne stany lub zachowania komórek, przesunięcia te można wykryć i określić ilościowo za pomocą mikroskopu wielofotonowego wykrywającego czas życia autofluorescencji23. Wraz z obfitością lub intensywnością autofluorescencji, pomiary te dostarczają wielowymiarowych informacji do rozdzielania NSC na jeden lub drugi stan komórki oraz poprzez dynamiczne przejścia między stanami. Po trzecie, protokół ten opisuje wykonywanie, analizowanie i interpretację pomiarów FLIM i intensywności sygnałów kanału 1 (NAD(P)H) i kanału 2 (PAF) przy użyciu mikroskopu wielofotonowego. Podsumowując, protokół ten opisuje żywy, wolny od znaczników zestaw narzędzi do badania stanu spoczynku NSC, który dostarcza danych o wysokiej rozdzielczości z pojedynczej komórki na temat stanu NSC.

Protokół

Wszystkie procedury w tym protokole są zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) na Uniwersytecie Wisconsin-Madison.

1. Użycie mikroskopu konfokalnego do obrazowania PAF w qNSC i aNSC w celu identyfikacji stanu komórki NSC

  1. Generuj qNSC i aNSC in vitro z pierwotnych kultur NSC.
    1. Hodowla NSC oczyszczona z mózgów dorosłych myszy w pożywce proliferacyjnej w celu ekspansji (Tabela 1)18,20,21. W związku z tym domyślnie hodowle NSC in vitro są aNSC.
    2. Aby wygenerować qNSC, użyj następującego protokołu, aby pokryć aNSC na powlekanym szkle, a następnie potraktuj je pożywką qNSC w celu wywołania stanu spoczynku przez 3 dni.
    3. Przygotować naczynia szklane o współczynniku załamania światła odpowiednim do celów zanurzeniowych w oleju do przylegania NSC, pokrywając najpierw roztworem poli-L-ornityny (PLO; 10 mg/ml w wodzie dla tworzywa sztucznego, 50 mg/ml w wodzie dla szkła) wystarczającym do pokrycia dna naczynia (dla studzienki kubełkowej o średnicy 1cm2 należy użyć ~150 μL) przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C w ddH2O.
    4. Usunąć roztwór PLO i przemyć 3 razy solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS).
    5. Pokryć roztworem lamininy (5 mg/ml) w ilości wystarczającej do pokrycia dna naczynia (w przypadku studzienki do obrazowania o średnicy 1cm2 należy użyć ~150 μl) w PBS i inkubować przez co najmniej 3 godziny w temperaturze 37 °C lub przez noc.
    6. Usuń roztwór lamininy, a następnie dodaj pożywkę hodowlaną wystarczającą do pokrycia dna naczynia (w przypadku studzienki z kuwetą obrazową o średnicy 1cm2 użyj ~150 μL).
    7. Przygotuj komórki do trypsynizacji poprzez odwirowanie aNSC (mogą zaczynać się jako monowarstwy lub neurosfery) w 120 x g przez 4 minuty w temperaturze pokojowej (RT, ~25 °C).
    8. Trypsynizować granulowane aNSC z poprzedniego etapu w 100 μl mieszanki trypsyny przez 5 minut w temperaturze 37 °C, a następnie wygasić trypsynizację 200 μl mieszaniny inhibitorów trypsyny (Tabela 1).
    9. Pozostawić NSC na 2 minuty, a następnie mechanicznie je rozcierać, pipetując w górę i w dół 10 razy.
    10. Dodać 5 ml pożywki aNSC i wirować komórki w temperaturze 120 x g przez 4 minuty.
    11. Ponownie zawiesić NSC w 1 ml pożywki aNSC i pokryć komórki przy 10%-20% zbiegu w pożywce aNSC. Na przykład umieść ~ 5,000 komórek w jednym dołku w studzience kuwety obrazowej o średnicy 1cm2 z podłożem o pojemności 150 μl.
    12. Po odczekaniu 24 godzin, aby aNSC przylgnęły do powierzchni naczynia, usuń pożywkę aNSC i zastąp ją pożywką qNSC wystarczającą do pokrycia dna naczynia (w przypadku studzienki do obrazowania o średnicy 1cm2 użyj ~150 μL; Tabela 1- jak opisano wcześniej10,13,17,18) w studzienkach, w których zostanie wywołany stan spoczynku.
    13. Zmieniaj pożywkę aNSC i qNSC co najmniej raz na 2 dni. Po 3 dniach w pożywce qNSC, NSC są w stanie spoczynku i mogą być używane do eksperymentów obrazowych.
  2. Użyj mikroskopu konfokalnego, aby zobrazować żywe qNSC i aNSC in vitro.
    UWAGA: Każdy mikroskop ma swoje autorskie oprogramowanie; W związku z tym należy postępować zgodnie z poniższymi krokami, wykonując analogiczne czynności w celu skonfigurowania konkretnego mikroskopu. Protokół ten zawiera instrukcje dotyczące pracy w NIS-Elements.
    1. Skonfiguruj mikroskop konfokalny do obrazowania autofluorescencyjnego.
      1. Kliknij przycisk 405 Laser (Laser 405) i wpisz tekst w oknie emisji w menu 405 Laser (Laser 405). Kliknij TD, aby zebrać obraz w świetle przechodzącym i ustawić wartość HV, aby zobrazować próbkę.
      2. Ustaw moc lasera na 3,5% i wzmocnienie na 75. Ustaw wartość Zoom na 2. Skonfiguruj parametry skanowania konfokalnego, ustaw opcję Zatrzymanie pikseli na 0,5 i ustaw Rozdzielczość na 2048 x 2048 pikseli.
    2. Ustaw ostrość komórek pod soczewką obiektywu zanurzonego w oleju ~60x, używając jasnego pola do ustawiania ostrości.
    3. Przełącz się w tryb skanowania konfokalnego, klikając Port oka, upewniając się, że ścieżka światła przechodzi teraz do głowicy skanującej i że na ścieżce światła nie ma kostki filtra.
    4. PAF jest wzbogacony w qNSC i jest szeroko pobudliwy i emituje (patrz Rysunek 1). Wybierz najlepszą konfigurację optyczną w oparciu o możliwości systemu, korzystając z Rysunek 1 jako przewodnik. Aby uzyskać najsilniejszy i najczystszy sygnał, wzbudz laserem o długości fali ~400-500 nm, zbierz ~580-620 nm i użyj soczewki obiektywowej z ~60-krotnym zanurzeniem w olejku.
      UWAGA: Obrazowanie autofluorescencyjne wymaga większych mocy lasera do wzbudzenia niż wymagałyby tego typowe eksperymenty obrazowania. W przypadku obrazowania innych cząsteczek autofluorescencyjnych lub innych znaczników razem z PAF, należy starannie zaprojektować konfigurację optyczną, aby uniknąć przedostawania się do kanałów autofluorescencyjnych.
    5. Uzyskaj obrazy autofluorescencji w qNSC i aNSC. Kliknij przycisk Skanuj, a następnie ustaw ostrość na obrazie, a następnie kliknij przycisk Przechwyć. Aby uzyskać najlepsze obrazy, zbierz obrazy jednopłaszczyznowe z cytoplazmą komórek (opartą na autofluorescencji ściemniacza rozproszonej w komórce) w ostrości, aby uzyskać reprezentatywny przekrój każdej komórki.
    6. Użyj identycznej konfiguracji optycznej (np. tej samej mocy lasera) i próbek obrazu tego samego dnia, jeśli chcesz bezpośrednio porównać różne obrazy.
    7. Dokładne moce lasera i detektora będą zależeć od każdego konkretnego systemu. Zacznij od użycia niskich mocy lasera, a następnie powoli zwiększaj moce, aż sygnał będzie wykrywalny bez nasycenia.
  3. Analiza PAF w żywych qNSC i aNSC in vitro.
    1. Po uzyskaniu obrazów autofluorescencji w qNSC lub aNSC, określ ilościowo obrazy, otwierając plik w ImageJ25.
    2. Użyj opcji Process > Filters > Gaussian Blur (Sigma: 2) na obrazie autofluorescencji qNSC/aNSC, aby wygładzić nierówne piksele.
    3. Użyj opcji Image > Dostosuj próg>, aby wybrać piksele reprezentujące PAF (wyeliminuj piksele tła) i kliknij Zastosuj. Użyj tych samych parametrów progowych dla wszystkich obrazów, które będą bezpośrednio porównywane.
    4. Użyj Process > Binary > Watershed, aby oddzielić PAF w bliskiej odległości przestrzennej.
    5. Za pomocą myszy komputerowej narysuj obszar zainteresowania (ROI) wokół komórki, określony przez spojrzenie na obraz w jasnym polu lub przez przyjrzenie się rozproszonej autofluorescencji obecnej równomiernie w cytoplazmie komórki.
      UWAGA: Generalnie dobrze jest wykluczyć cienkie procesy obwodowe i uwzględnić jądro, ponieważ autofluorescencja zazwyczaj nie występuje w tych miejscach, a zatem nie zakłóca analizy.
    6. Użyj funkcji Analizuj > Analizuj cząstki (rozmiar: 0.1-nieskończoność μm; Cyrkularność: 0-1) z zaznaczonym podsumowaniem.
      UWAGA: ImageJ następnie utworzy okno wyjściowe z danymi o cząstkach w obszarze zainteresowania, co pozwala na tabelaryczne zestawienie liczby PAF w każdej komórce. Inne cząsteczki fluorescencyjne można sparować z obrazowaniem PAF. Ponieważ jednak PAF jest stosunkowo słabym sygnałem, ważne jest, aby sprawdzić, czy inne fluorofory nie przenikają do kanału PAF. Zazwyczaj fluorofory pochłaniające 600+ nm i emitujące 650+ nm można połączyć z obrazowaniem PAF, takim jak LipidSpot 610.

2. Wykorzystanie FACS do wzbogacenia stanu aktywacji NSC w hodowanych NSC opartych na autofluorescencji

  1. Wygeneruj qNSC i aNSC zgodnie z opisem w sekcji 1.
  2. Sortuj mieszaninę żywych qNSC i aNSC na podstawie autofluorescencji.
    UWAGA: Jako przykład, w tym protokole omówiono, jak wzbogacić aNSC lub qNSC w próbce wygenerowanej przez zmieszanie qNSC i aNSC w stosunku 1:1.
    1. Przed trypsynizacją i sortowaniem komórek należy oznaczyć komórki przechodzące przez fazę S, dodając 10 μM 5-etynylo-2'-deoksyurydyny (EdU; analog tymidyny, który włącza się do komórek syntetyzujących DNA, takich jak w fazie S cyklu komórkowego) do pożywki do hodowli komórkowej przez 1 godzinę.
    2. Trypsynizować qNSC i aNSCs zgodnie z opisem w krokach 1.1.8, ponownie zawiesić w 0,5 ml buforu FACS (Tabela 1), a następnie umieścić na lodzie.
      UWAGA: qNSC mocno przylegają do potrawy. Przy stosunkowo większej konfluencji qNSC mogą być mechanicznie oddzielone od naczynia. Jeśli jednak qNSC znajdują się w stosunkowo mniejszym zbiegu lub są trudne do mechanicznego usunięcia z naczynia za pomocą pipetowania, należy użyć trypsyny, aby usunąć je z naczynia.
      1. Usunąć pożywkę hodowlaną z qNSC i dodać 0,25% trypsyny w ilości wystarczającej do pokrycia dna naczynia (w przypadku studzienki do obrazowania o średnicy 1cm2 należy użyć ~150 μl), inkubując przez 3 minuty w temperaturze 37 °C.
      2. Po inkubacji wygasić reakcję trypsyny, dodając pożywkę odpowiadającą każdemu typowi komórki równą objętości dodanej trypsyny. Mechanicznie oddzielić komórki od naczynia przed zebraniem i odwirowaniem.
    3. Używając dyszy ~130 μm, analizuj qNSC i aNSC za pomocą cytometru przepływowego lub FACS z warunkami optycznymi opartymi na możliwościach przyrządu i wykryj PAF, jak pokazano na Rysunek 1. Na przykład użyj lasera o długości fali 405 nm do wzbudzenia próbki i użyj filtra o długości fali 580-620 nm do wykrywania.
    4. Zbierz co najmniej 10 000 singletowych qNSC i aNSC w pliku danych, a następnie użyj ich do zaprojektowania bramek w celu zebrania wzbogacenia qNSC lub aNSC. Na przykład ustaw bramki tak, aby zbierały górne 25% lub dolne 25% NSC w oparciu o intensywność autofluorescencji w mieszanej próbce aNSC:qNSC (1:1).
    5. Po ustawieniu bramek do sortowania singletów z jaśniejszą lub ciemniejszą autofluorescencją, jak opisano powyżej, posortuj komórki do studzienek pokrytych PLO, lamininą, wypełnionych pożywką aNSC (10 000 komórek/cm2, patrz krok 1.1.3).
    6. Po FACS pozwól NSC siedzieć przez 3 godziny w inkubatorze. Utrwal komórki, traktując je 4% paraformaldehydem wystarczającym do pokrycia dna naczynia (w przypadku studzienki kubowej o średnicy 1cm2 użyj ~150 μL) przez 15 minut w temperaturze RT.
      UWAGA: Aby uwidocznić EdU w komórkach, najłatwiej jest zaopatrzyć się w komercyjny zestaw do wykrywania EdU i postępować zgodnie z zalecanym przez producenta protokołem.
    7. Najpierw należy przeniknąć do komórek poprzez traktowanie 0,25% trytonem w PBS przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
    8. Następnie potraktuj komórki roztworem barwiącym EdU w temperaturze pokojowej przez 30 min.
      UWAGA: Dokładny skład roztworu barwiącego EdU będzie się różnić w zależności od źródła odczynników, ale z grubsza składa się z buforu reakcyjnego, dodatku buforu reakcyjnego, siarczanu miedzi i cząsteczki zmodyfikowanej alkinem lub azydkiem. Zapoznaj się z tabelą materiałów, aby zapoznać się z zalecanym zestawem.
    9. Po barwieniu w celu wizualizacji EdU należy przemyć próbki 3 razy przez 10 minut za pomocą PBS.

3. Używanie mikroskopu wielofotonowego do wykrywania autofluorescencji kanału 1 i kanału 2 oraz przeprowadzanie FLIM na NSC in vitro w celu identyfikacji populacji i przejść stanu komórki NSC.

UWAGA: Każdy mikroskop ma swoje zastrzeżone oprogramowanie; dlatego postępuj zgodnie z poniższymi krokami, wykonując analogiczne czynności, aby skonfigurować konkretny mikroskop. Ten protokół zawiera instrukcje dotyczące pracy w Prairie View.

  1. Wygeneruj qNSC i aNSC zgodnie z opisem w sekcji 1.
  2. Skonfiguruj mikroskop wielofotonowy do obrazowania czasu życia fluorescencji.
    1. Użyj soczewki obiektywowej o powiększeniu 40x lub większym (~1.15 NA).
    2. Użyj mikroskopu wielofotonowego z następującymi lub równoważnymi komponentami: przestrajalnym ultraszybkim laserem, dichroicznym długim przepustem 720 nm, lampą fotopowielacza (PMT) z fosforku arsenku galu (GaAsP), skorelowaną w czasie elektroniką zliczającą pojedyncze fotony oraz analogowy miernik mocy.
    3. W przypadku obrazowania kanału 1 ustaw przestrajalny laser na 750 nm i użyj kostki filtra emisyjnego 440/80 nm. W przypadku kanału 2 należy ustawić laser na 890 nm i użyć kostki filtra emisyjnego 550/100 nm.
      UWAGA: Wyłącz światła w pomieszczeniu przed włączeniem PMT.
  3. Funkcja reakcji przyrządu
    1. Uchwyć funkcję odpowiedzi instrumentu (IRF), obrazując zmiażdżony kryształ mocznika, aby uwzględnić czasową reakcję instrumentu w mierzonym rozpadzie.
      UWAGA: IRF jest zbieżny z zanikiem, aby dokładnie obliczyć krzywą dopasowania zaniku. Do akwizycji laser jest ustawiony na 890 nm i używana jest kostka filtra emisyjnego 440/80 nm. GaAsP PMT jest ustawiony na wzmocnienie 800, a pockels (moc lasera) jest początkowo ustawiona bardzo nisko, zwykle 1.
    2. Wybierz pole view z krystalicznym mocznikiem i nieznacznie zwiększ posążki (maksymalnie do 15).
    3. Następnie uzyskaj obraz przy użyciu tych samych parametrów, które są używane do obrazowania komórek: dyskryminator stałej frakcji (CFD) 1 x 104 - 1 x 105, rozdzielczość 256 x 256, czas przebywania ustawiony na 4,8 μs, zoom optyczny ustawiony na 1,5x i czas integracji 60 s.
  4. Wykonaj obrazowanie czasu życia fluorescencji i obrazowanie intensywności autofluorescencji kanału 1 i kanału 2 na żywych qNSC i aNSC in vitro
    1. Znajdź pole widzenia do obrazu: Użyj okularów, aby znaleźć odpowiednie pole widzenia i zmień ścieżkę światła do próbki na mikroskopie, aby umożliwić obrazowanie.
      UWAGA: Najpierw zostanie uzyskany obraz z kanału 1, a następnie obraz z kanału 2 o tym samym polu view.
    2. Konfiguracja zbierania obrazu z kanału 1: Kliknij zakładkę Power/Gain i ustaw wzmocnienie na PMT na 800, kliknij zakładkę 2-P Laser i wybierz 750 nm dla lasera i upewnij się, że używana jest właściwa kostka filtra (440/80 nm).
    3. Zbierz obraz kanału 1.
      1. Uruchom tryb podglądu, przechodząc do zakładki Moc/Wzmocnienie i ustawiając Pockels na 30, a następnie przechodząc do sekcji Skanowanie na tym ekranie i klikając Skanowanie na żywo.
      2. Zwiększ Pockels, aby znaleźć dobre pole widzenia przy niskiej mocy lasera (poniżej 3,6 mW). Po znalezieniu pola widzenia wyreguluj Pockels tak, aby miernik mocy wskazywał ~3,6 mW mocy za ogniwem pockel, a dyskryminator stałej frakcji (CFD) w zakładce Count Rates mierzy 1 x 104 - 1 x 105.
    4. Przejdź do sekcji Skanowanie i kliknij Pojedyncze skanowanie, gdy te parametry zostaną spełnione. Spowoduje to uzyskanie obrazu kanału 1 w ciągu 60 sekund.
    5. Aby zebrać obraz z kanału 2, kliknij na zakładkę 2-P Laser i wybierz 890 nm dla lasera, zamień kostkę filtra na kostkę emisyjną kanału 2 (550/100 nm).
    6. Uruchom tryb podglądu zgodnie z opisem w 3.4.3, zwiększaj Pockels, aż miernik mocy wskaże ~7 mW, a liczniki CFD ponownie wynoszą 1 x 104 -1 x 105.
    7. Przejdź do sekcji Skanowanie i kliknij Pojedyncze skanowanie, gdy te parametry zostaną spełnione. Spowoduje to uzyskanie obrazu kanału 2 w ciągu 60 sekund.
    8. Uzyskaj więcej obrazów — po uzyskaniu obrazu kanału 1 i kanału 2 znajdź nowe pole view i powtórz kroki 3.4.2 - 3.4.4. Zazwyczaj zebranie 4-6 pól widzenia w celu zobrazowania ~50-100 komórek wystarcza dla jednego warunku w eksperymencie.
      UWAGA: mCherry może być używany jako dodatkowa etykieta fluorescencyjna bez przebijania do kanałów kanału 1 i kanału 2.
  5. Analizuj obrazy z czasów eksploatacji fluorescencji.
    1. Wygeneruj matryce rozpadów dla obrazów czasu życia fluorescencji w SPCImage, wykonując kroki 3.5.2-3.1.14.
      UWAGA: Aby uzyskać dodatkowe informacje, zapoznaj się z zaktualizowanymi podręcznikami dostępnymi bezpłatnie online26.
    2. Otwórz SPCImage i otwórz obraz IRF FLIM zebrany w sekcji 3.3.
    3. Dostosuj pionowe czarne paski na histogramie tak, aby były ograniczone do krzywej zaniku IRF. Na górnym pasku menu kliknij IRF > Kopiuj do schowka.
    4. Otwórz plik obrazu FLIM w zestawie danych, który ma być analizowany, uzyskanym w sekcji 3.4.
    5. Na górnym pasku menu kliknij IRF > Wklej ze schowka.
    6. W prawym dolnym rogu oprogramowania ustaw Komponenty na 2.
    7. Na górnym pasku menu oprogramowania kliknij Opcje > modelu. Następnie wybierz MLE dla opcji Fit Method, Spatial Binning to Square, Threshold to Peak, a następnie w obszarze Settings (Ustawienia) wybierz opcję Multiexponential Decay (Zanik wielowykładniczy).
    8. W lewym dolnym rogu oprogramowania zwiększaj Bin, aż liczba fotonów wyniesie co najmniej 100 w reprezentatywnych pikselach cytoplazmatycznych w szczycie liczby fotonów bezpośrednio po wzbudzeniu.
    9. W lewym dolnym rogu oprogramowania ustaw próg. W przypadku kanału 1 użyj progu "50". W przypadku kanału 2 użyj progu "0".
    10. W górnym pasku menu oprogramowania (protokół ten opisuje sposób działania wersji 8.3) kliknij na Calculate > Decay Matrix.
      UWAGA: Upewnij się, że wartości Chi2 wynoszą ~0,8-1,2 na całym obrazie. Potwierdza to, że dane będą solidne dzięki walidacji modelowania rozpadu dwuwykładniczego.
    11. Na górnym pasku menu kliknij Plik > Zapisz.
    12. Na górnym pasku menu oprogramowania kliknij Plik > Eksportuj i wyeksportuj następujące elementy:
      Wartość oznaczona kolorami, T1, T2, chi2, intensywność pikseli, A1[%], A2[%] i obraz oznaczony kolorem (z legendą)
      UWAGA: Teraz SPCImage jest skonfigurowany do wykonywania procesu wsadowego, analizując wszystkie obrazy danego kanału (przeanalizuj obrazy FLIM kanału 1 razem, a następnie powtórz czynność, zaczynając od kroku 3.5.2 dla obrazów FLIM kanału 2).
    13. Aby przeprowadzić proces wsadowy, kliknij opcję Calculate > Batch Processing (Oblicz przetwarzanie wsadowe) i wybierz obrazy FLIM do przetworzenia.
    14. Na górnym pasku menu kliknij Plik > Eksportuj > Eksport wsadowy i wybierz macierze rozpadu do wyeksportowania (wygenerowane w poprzednim kroku).
    15. Użyj CellProfiler, aby utworzyć maski cytoplazmatyczne, wykonując kroki 3.5.16-3.5.24.
      UWAGA: Aby to zrobić, jądra będą ręcznie znajdować się wokół obrazów intensywności kanału 1, gdzie jądro jest czarne i wyraźnie widoczne. Następnie potok CellProfiler manual_segmentation.cpproj27 (Plik uzupełniający 1) automatycznie wytworzy całą komórkę i maskę cytoplazmatyczną, zgodnie z zaleceniami maski jądrowej. Jądra mogą być alternatywnie znakowane za pomocą mCherry i obrazowane wraz z autofluorescencją kanału 1 i kanału 2, aby zapewnić możliwość zautomatyzowania identyfikacji jąder. Jednak wiele konwencjonalnych barwników jądrowych będzie widmowo przenikać do kanałów autofluorescencyjnych, a zatem są niekompatybilne z tą techniką.
    16. W programie R Studio użyj R_ASCtoTIFF.rmd27 (Plik uzupełniający 2), aby przekonwertować pliki X_photons.asc, gdzie X to nazwa uzyskanego obrazu z zestawu obrazu kanału 1 na pliki TIF.
    17. Otwórz program Cell Profiler i otwórz plik manual_segmentation.cpproj.
    18. Załaduj fotony TIF kanału 1 utworzone w kroku 3.5.16 w kroku Obrazy w górnej części potoku.
    19. W 3 dolnych krokach potoku zatytułowanego SaveImages ustaw ścieżkę zapisu dla masek generowanych przez CellProfiler.
    20. Kliknij Rozpocznij tryb testowy w lewym dolnym rogu CellProfiler.
    21. Kliknij Uruchom w lewym dolnym rogu CellProfiler. Gdy CellProfiler przejdzie do kroku IdentifyObjectsManual, pojawi się okno wyświetlające bieżący obraz kanału 1, który jest przetwarzany.
    22. Kliknij F na klawiaturze, a następnie ręcznie narysuj ślad jąder jednej komórki, przytrzymując wciśnięty przycisk myszy po kliknięciu lewym przyciskiem myszy. Po narysowaniu jąder zwolnij przycisk lewego przycisku myszy na myszy. Powtórz ten krok dla wszystkich komórek na obrazie.
    23. Kliknij Gotowe w prawym dolnym rogu wyskakującego okienka z obrazem intensywności. Oprogramowanie zakończy teraz proces produkcyjny i wyeksportuje maski cytoplazmatyczne, jądrowe i komórkowe.
    24. W lewym dolnym rogu kliknij Następny zestaw obrazów i powtórz kroki 3.5.21-3.5.23 dla wszystkich obrazów TIF kanału 1.
    25. Użyj skryptu R (Integrate decay matrices and cytoplasmic masks.rmd), aby zintegrować macierze rozpadu wygenerowane w krokach 3.5.2-3.5.14 i maski cytoplazmatyczne wygenerowane w krokach 3.5.15-3.5.24, aby uzyskać średnie zmienne obrazowania czasu życia fluorescencji dla cytoplazmy każdej komórki, wykonując kroki 3.5.26-3.5.30
    26. Korzystając z arkusza kalkulacyjnego (np. Microsoft Excel), utwórz .csv dokument o nazwie test_key27 [Plik uzupełniający 3] dla przykładu) z 3 kolumnami.
    27. Nadaj kolumnom tytuły Folder, NADH i FAD. Wypełnij tabelę, aby wyświetlić listę lokalizacji folderu w folderze, a następnie prefiks tytułu obrazu odpowiednio w NADH i FAD, aby połączyć każdy obraz kanału 1 z każdym obrazem kanału 2 (patrz przykładowe dane - tabela 2).
  6. W R Studio otwórz Integruj macierze rozpadu i maski cytoplazmatyczne.rmd27(Plik uzupełniający 4).
    1. Ustaw następujące ścieżki plików zgodnie z adnotacjami w skrypcie: Ustaw katalog roboczy, lokalizację pliku kanału 1, lokalizację pliku FAD, lokalizację pliku maski oraz lokalizację i nazwę pliku wyjściowego.
    2. Uruchom cały skrypt. Po pomyślnym zakończeniu skryptu zostanie wygenerowany plik wyjściowy, w tym metadane i średnie zmienne FLIM.
    3. Wykonaj analizę za pomocą autofluorescencji FLIM data.rmd27 (Plik uzupełniający 5) lub przy użyciu dowolnego innego oprogramowania do analizy.

Wyniki

Konfokalne obrazowanie autofluorescencji w celu rozróżnienia stanu komórek NSC (Rysunek 1)
Aby wykorzystać mikroskopię konfokalną do rozróżnienia stanu aktywacji NSC, qNSC i aNSC wygenerowano in vitro z użyciem pożywki aktywującej lub pożywki utrzymującej spoczynek, zgodnie z wcześniejszymi opisami10,13,17,18. W celu wykrycia PAF w komórkach NSC, żywe qNSC i aNSC obrazowano przy użyciu tego samego czasu ekspozycji na mikroskopie konfokalnym (Ex: 405 nm, Em: 580-620 nm). qNSC wykazywały większą liczbę PAF w porównaniu do aNSC (Rysunek 1A,B). Wynik ten pokazuje, w jaki sposób właściwości autofluorescencji mogą służyć jako markery do identyfikacji stanu komórkowego qNSC i aNSC.

Wzbogacenie populacji komórek NSC w konkretnym stanie komórkowym za pomocą FACS z wykorzystaniem autofluorescencji (Rysunek 2)
Aby wzbogacić o stan cyklu komórkowego z wykorzystaniem FACS, wygenerowano qNSC i aNSC in vitro10,13,17,18,19 zgodnie z opisem w niniejszym protokole i wcześniej znakowanych EdU przez 1 h przed trypsynizacja i analiza w cytometrze przepływowym w celu oznakowania komórek przechodzących przez fazę S. Następnie qNSC i aNSC analizowano metodą cytometrii przepływowej, albo oddzielnie, albo zmieszane w stosunku 1 qNSC:1 aNSC (Rycina 2). Wyznaczono bramki w celu wzbogacenia populacji aNSC lub qNSC z populacji mieszanej, a następnie dokonano sortowania komórek na podstawie tych bramek. Po FACS komórki z każdej próbki wysiano na szklane podłoża pokryte PLO i lamininą i pozostawiono na 3 h w celu adhezji do naczynia, po czym utrwalono, zabarwiono i przeanalizowano pod kątem odsetka komórek EdU+. Zgodnie z oczekiwaniami, komórki posortowane z bramki wysokiej autofluorescencji wykazywały mniejszy odsetek komórek EdU+ niż próbka Mix, natomiast próbki posortowane przez bramkę niskiej autofluorescencji wykazywały większą zdolność do proliferacji niż próbka Mix (Rycina 2C). Wynik ten potwierdza zdolność do wzbogacania o Stan aktywacji NSC z heterogenicznej mieszaniny qNSC i aNSC z wykorzystaniem FACS.

Wielofotonowe obrazowanie czasu życia fluorescencji w celu klasyfikacji stanu komórek NSCRysunek 3)
Wygenerowano qNSC oraz aNSC in vitro a następnie obrazowano za pomocą mikroskopu wielofotonowego w celu przeprowadzenia FLIM dla autofluorescencji w kanale 1 (wzbudzenie: 750 nm (2P), emisja: 360–520 nm) oraz w kanale 2 (wzbudzenie: 890 nm (2P), emisja: 450–650 nm) (Rysunek 3A, Tabela 2). qNSC i aNSC wykazywały profile autofluorescencji, które w dużej mierze różniły się znacząco. Na przykład qNSC charakteryzowały się wyższą średnią żywotnością fluorescencji w kanale 1 τmale niższą α1 w porównaniu z aNSCs. Aby ocenić zdolność danych autofluorescencji FLIM z NSC do przewidywania stanu aktywacji NSC, wygenerowano model regresji logistycznej z wykorzystaniem intensywności Kanału 1, α1, τ1, τ2 oraz natężenie kanału 2, α1, τ1, τ2. Krzywa ROC (receiver operator characteristic) wykazuje, że dane te są wystarczające do stworzenia niemal idealnego modelu (pole pod krzywą = 0,963), który precyzyjnie przewiduje stan aktywacji NSC. Wspólnie dane te ilustrują możliwość wykorzystania FLIM i autofluorescencji do klasyfikacji stanu komórek NSC.

figure-results-1
Rysunek 1: Obrazowanie konfokalne pozwala rozróżnić autofluorescencyjne biomarkery stanu aktywacji NSC. (A-B) qNSCs (fioletowe) i aNSCs (czarne) obrazowano przy tym samym czasie ekspozycji na mikroskopie konfokalnym (czerwone; Ex. 405 nm, Em 580-620 nm) i analizowano pod kątem liczby PAF (N = 3, test Mann-Whitneya, średnia ± SD). Białe przerywane linie wyznaczają krawędź komórki, a niebieskie przerywane linie wyznaczają jądra. (C) Autofluorescencję w tej samej qNSC obrazowano przy różnych warunkach wzbudzenia i emisji, wskazanych na rysunku, przy identycznej mocy lasera i wzmocnieniu. Paski skali: 10 µm. **** p < 0.0001. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rycina 2FACS pozwala na wzbogacenie populacji o Stan aktywacji NSC. (A-C) qNSCs, aNSCs lub mieszaninę qNSCs:aNSCs (1:1) poddano inkubacji z EdU przez 1 h, a następnie trypsynizowano, następnie poddano analizie metodą cytometrii przepływowej (Ex: 405 nm, Em: 580-620 nm). Mieszaninę komórek (1:1) posortowano następnie za pomocą systemu FACS pod kątem niskiej lub wysokiej autofluorescencji, a następnie wysiano na płytki, oraz przeanalizowano pod kątem proliferacji, mierząc odsetek komórek EdU+. Jednostki arbitralne zapisywane są w skrócie jako "j.a." (N = 4, dwuczynnikowa analiza wariancji ANOVA z testem post hoc Tukeya, średnia ± SD). **** p < 0.0001. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

figure-results-3
Rycina 3: Wielofotonowe obrazowanie czasu życia fluorescencji ujawnia biomarkery stanu aktywacji NSC. (A) Schemat przedstawiający analizę dopasowania krzywych dla uzyskanych danych FLIM. (B) Pomiary FLIM dla kanału 1 i kanału 2, obejmujące wartości natężenia, średniego czasu życia (Tm) oraz wkładu ułamkowego (α1) dla danych qNSC (fioletowy) i aNSC (czarny) (n = 501 komórek, dwustronna regresja logistyczna, uogólniony model liniowy). (C) Krzywa charakterystyki pracy odbiornika (ROC) prezentująca model regresji logistycznej wygenerowany przy użyciu natężenia kanału 1, α1, τ1, τ2 oraz natężenia kanału 2, α1, τ1, τ2 w celu klasyfikacji NSC jako aNSC lub qNSC. *** p < 0.001. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Tabela 1: Pożywki i roztwory. Przepisy na wszystkie roztwory użyte w tym protokole. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 2: Przykładowe dane. Reprezentatywne dane FLIM dla qNSC i aNSC dla autofluorescencji w kanale 1 i kanale 2. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Plik uzupełniający 1: manual_segmentation.cpproj Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 2: R_ASCtoTIFF.rmd Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 3: test_key Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 4: Integrate decay matrices and cytoplasmic masks.rmd Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 5: dane autofluorescencyjne FLIM.rmd Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Protokół ten opisuje żywą, wolną od znaczników, nieniszczącą technikę rozpoznawania pojedynczych komórek, która pozwala na klasyfikację stanu komórki NSC in vitro poprzez obrazowanie sygnałów autofluorescencyjnych w NSC. Podejście to wykrywa zmiany metaboliczne, które zachodzą podczas wychodzenia w stanie spoczynku NSC, które wpływają na właściwości optyczne kofaktorów metabolicznych, takich jak NAD(P)H, i oferuje wiele zalet w porównaniu z istniejącymi technologiami do badania spoczynku NSC. Na przykład wiele konwencjonalnych technik badania qNSC i aNSC, takich jak znakowanie markerami cyklu komórkowego, takimi jak EdU, wymaga utrwalenia próbek. Obecnie istniejące metody, które są w stanie badać żywe NSC, są dodatkowo ograniczone przez wymóg wprowadzenia egzogennych znaczników, zazwyczaj poprzez generowanie transgenów kodujących białka fluorescencyjne. Narzędzia te są ograniczone zarówno pod względem zasobów wymaganych do ich wygenerowania, jak i wielu zastrzeżeń technicznych. Na przykład pośrednie białka włókien nestyna i kwaśne białko fibrylarne glejowe (GFAP) są powszechnie stosowane jako markery qNSC i aNSC 12,13,18,28,29. Wiadomo jednak, że nestyna i GFAP ulegają zróżnicowanej ekspresji między qNSC i aNSCs 12,13,18,28,29. Co więcej, obrazowanie autofluorescencyjne dostarcza danych o pojedynczych komórkach o wysokiej rozdzielczości, które mogą rozwikłać niejednorodność pojedynczych komórek, która jest zagubiona lub skomplikowana do interpretacji w eksperymentach, których kulminacją jest masowa analiza populacji komórek.

Jednak obrazowanie autofluorescencyjne ma również kilka ograniczeń. Wiele sygnałów autofluorescencyjnych zostaje utraconych po utrwaleniu komórki. Tak więc obrazowanie autofluorescencyjne jest w dużej mierze ograniczone do badania żywych komórek. Obrazowanie autofluorescencyjne opiera się również na braku egzogennie wprowadzonych fluoroforów, które mogą przenikać do kanałów autofluorescencyjnych. Chociaż wiele fluoroforów może być kompatybilnych z obrazowaniem autofluorescencyjnym w określonych sytuacjach, sparowanie obrazowania autofluorescencyjnego z wieloma istniejącymi narzędziami nie zawsze jest możliwe. Obrazowanie żywych komórek może również wywoływać fototoksyczność. Jedna iteracja obrazowania przy użyciu tego protokołu nie indukuje wystarczającej fototoksyczności, aby zmniejszyć żywotność NSC. Jednak wielokrotne obrazowanie komórek w czasie w częstszych odstępach czasu, wiele razy dziennie, może generować znaczną fototoksyczność, a zatem nie jest realną strategią badania spoczynku NSC. Wreszcie, chociaż obrazowanie autofluorescencyjne może być wykorzystane do badania NSC od 6-tygodniowych samców myszy z hipokampa lub komór bocznych, nie jest jasne, jak szeroko ta technika może być stosowana do badania NSC z innych źródeł, wieku lub innych typów komórek macierzystych.

Opisany tutaj protokół zakłada również dokładne wytwarzanie qNSC i aNSC in vitro przy użyciu wcześniej ustalonych protokołów 10,13,17,18,19. Jeśli odtworzenie wyników tego protokołu jest trudne, upewnij się, że qNSC i aNSC są prawidłowo generowane, sondując obecność lub brak różnych markerów qNSC i aNSC, jak opisano wcześniej 10,13,17,18,19. Podsumowując, obrazowanie autofluorescencyjne zapewnia nowatorskie podejście techniczne do identyfikacji qNSC i aNSC oraz badania wyjść spoczynkowych NSC.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Podziękowania

Dziękujemy głównemu instytutowi cytometrii przepływowej UW-Madison (P30 CA014520 i 1S10RR025483-01) oraz członkom społeczności Moore lab i UW-Madison za ich wkład. Dziękujemy naszym źródłom finansowania: NIH T32 T32GM008688 (do C.S.M.), Diana Jacobs Kalman Fellowship od AFAR (do CSM), Wisconsin Graduate Fellowship (do CSM), DP2 NIH New Innovator Award (1DP2OD025783, do D.L.M.), Vallee Scholar Award (do D.L.M.), NIH 1R56NS130450 (do D.L.M.) i MCS.), R01 CA185747 (do M.C.S.), R01 CA205101 (do M.C.S.), R01 CA211082 (do M.C.S.) oraz grant National Science Foundation nr. CBET-1642287 (do MCS).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Soczewka obiektywu wodnego 40xNikonMRD77410Soczewka obiektywowa stosowana w mikroskopie wielofotonowym w części 3
Kuweta 8-dołkowaIbidi80826-90Do obrazowania aNSC / qNSC
Analogowy miernik mocyThorlabsPM100AUżywany w mikroskopie wielofotonowym w części 3
Antybiotyk-Antybiotyk Przeciwgrzybiczy (100X) (PSF)Thermo Fisher15240062Antybiotyk do pożywek NSC
B-27Invitrogen17504044Suplement diety dla pożywek NSC
BMP4Fisher Scientific5020BP010Czynnik wywołujący spoczynek
Albumina surowicy bydlęcejSigmaA4919-25GDo wytwarzania
ultraszybkiego lasera BMP4 ChameleonKoherentnynie dotyczystosowany w mikroskopie wielofotonowym w części 3
MikroskopkonfokalnyMikroskop NikonC2używany do części 1
DMEM/F-12 (bez GlutaMAX)Invitrogen11320033Pożywka bazowa dla NSCs
DNAzy SigmaD5025-15KUEdU inhibitora trypsyny
InvitrogenC10337Test proliferacji do hodowli komórkowych
EGFPeproTechAF-100-15-500UGCzynnik wzrostu dla pożywek NSC
FGFPeproTech100-18BCzynnik wzrostu dla pożywek NSC
Fluorescencyjny aktywowany sortownik komórekBDFACSAriaFluorescencyjny sortownik komórek używany do części 2
HeparynaSigmaH3149-50KUDodatek do pożywki NSC
L-15Invitrogen21083027Do przygotowania roztworu inhibitora trypsyny
LamininSigmaL2020-1MGDo powlekania wyrobów szklanych
Mikroskop odwrócony Nikon TiERamka mikroskopu NikonN/AUżywany do części 3
PLOSigmaP3655-100MGDo powlekania wyrobów szklanych
SPC-150 Elektronika licząca pojedyncze fotonyBecker i HicklN/AStosowany w mikroskopie wielofotonowym w części 3
Trypsyna (do trypsynizacji granulek aNSC, które rosły jako kulki lub monowarstwy)Gibco15090046Do trypsynizacji neurosfer lub przylegających aNSC
Trypsyna (do trypsynizacji qNSCs)Gibco25200072Do trypsynizacji adherentnych qNSC
Inhibitor trypsynySigmaT6522-100MGDo hamowania trypsynizacji aNSC
Kryształy mocznikaSigmaU5128-5GSłuży do zbierania IRF
VerseneThermo Fisher15040066Do przygotowania trypsyny
laser Dodano do zestawu testowego

Bibliografia

  1. Goncalves, J. T., Schafer, S. T., Gage, F. H. Adult neurogenesis in the hippocampus: From stem cells to behavior. Cell. 167 (4), 897-914 (2016).
  2. Kuhn, H. G., Dickinson-Anson, H., Gage, F. H. Neurogenesis in the dentate gyrus of the adult rat: age-related decrease of neuronal progenitor proliferation. J Neurosci. 16 (6), 2027-2033 (1996).
  3. Silva-Vargas, V., Maldonado-Soto, A. R., Mizrak, D., Codega, P., Doetsch, F. Age-dependent niche signals from the choroid plexus regulate adult neural stem cells. Cell Stem Cell. 19 (5), 643-652 (2016).
  4. Urban, N., Blomfield, I. M., Guillemot, F. Quiescence of adult mammalian neural stem cells: A highly regulated rest. Neuron. 104 (5), 834-848 (2019).
  5. Urban, N., et al. Return to quiescence of mouse neural stem cells by degradation of a proactivation protein. Science. 353 (6296), 292-295 (2016).
  6. Kalamakis, G., et al. Quiescence modulates stem cell maintenance and regenerative capacity in the aging brain. Cell. 176 (6), 1407-1419 (2019).
  7. Walsh, A. J., et al. Classification of T-cell activation via autofluorescence lifetime imaging. Nat Biomed Eng. 5 (1), 77-88 (2021).
  8. Sagar, M. A. K., et al. Microglia activation visualization via fluorescence lifetime imaging microscopy of intrinsically fluorescent metabolic cofactors. Neurophotonics. 7 (3), 035003(2020).
  9. Knobloch, M., et al. Metabolic control of adult neural stem cell activity by Fasn-dependent lipogenesis. Nature. 493 (7431), 226-230 (2013).
  10. Knobloch, M., et al. A fatty acid oxidation-dependent metabolic shift regulates adult neural stem cell activity. Cell Rep. 20 (9), 2144-2155 (2017).
  11. Knobloch, M., et al. SPOT14-positive neural stem/progenitor cells in the hippocampus respond dynamically to neurogenic regulators. Stem Cell Reports. 3 (5), 735-742 (2014).
  12. Shin, J., et al. Single-cell RNA-Seq with waterfall reveals molecular cascades underlying adult neurogenesis. Cell Stem Cell. 17 (3), 360-372 (2015).
  13. Leeman, D. S., et al. Lysosome activation clears aggregates and enhances quiescent neural stem cell activation during aging. Science. 359 (6381), 1277-1283 (2018).
  14. Beckervordersandforth, R. Mitochondrial metabolism-mediated regulation of adult neurogenesis. Brain Plast. 3 (1), 73-87 (2017).
  15. Morrow, C. S., et al. Autofluorescence is a biomarker of neural stem cell activation state. Cell Stem Cell. , (2024).
  16. Kolenc, O. I., Quinn, K. P. Evaluating cell metabolism through autofluorescence imaging of NAD(P)H and FAD. Antioxid Redox Signal. 30 (6), 875-889 (2019).
  17. Mira, H., et al. Signaling through BMPR-IA regulates quiescence and long-term activity of neural stem cells in the adult hippocampus. Cell Stem Cell. 7 (1), 78-89 (2010).
  18. Morrow, C. S., et al. Vimentin coordinates protein turnover at the aggresome during neural stem cell quiescence exit. Cell Stem Cell. 26 (4), 558-568 (2020).
  19. Martynoga, B., et al. Epigenomic enhancer annotation reveals a key role for NFIX in neural stem cell quiescence. Genes Dev. 27 (16), 1769-1786 (2013).
  20. Bin Imtiaz, M. K., Jessberger, S. Isolation of adult mouse hippocampal neural stem cells for fluorescence loss in photobleaching assays. STAR Protoc. 2 (3), 100695(2021).
  21. Guo, W., Patzlaff, N. E., Jobe, E. M., Zhao, X. Isolation of multipotent neural stem or progenitor cells from both the dentate gyrus and subventricular zone of a single adult mouse. Nat Protoc. 7 (11), 2005-2012 (2012).
  22. Lakowicz, J. R., Szmacinski, H., Nowaczyk, K., Johnson, M. L. Fluorescence lifetime imaging of free and protein-bound NADH. Proc Natl Acad Sci U S A. 89 (4), 1271-1275 (1992).
  23. Blacker, T. S., Duchen, M. R. Investigating mitochondrial redox state using NADH and NADPH autofluorescence. Free Radic Biol Med. 100, 53-65 (2016).
  24. Datta, R., Heaster, T. M., Sharick, J. T., Gillette, A. A., Skala, M. C. Fluorescence lifetime imaging microscopy: fundamentals and advances in instrumentation, analysis, and applications. J Biomed Opt. 25 (7), 1-43 (2020).
  25. ImageJ. , Available from: https://imagej.nih.gov/ij/ (2021).
  26. Becker & Hichl Handbooks. , Available from: https://imagej.nih.gov/ij/ (2024).
  27. GitHub Materials. , Available from: https://github.com/chrismorrow5/Neural-Stem-Cell-Autofluorescence-Analysis/ (2024).
  28. Codega, P., et al. Prospective identification and purification of quiescent adult neural stem cells from their in vivo niche. Neuron. 82 (3), 545-559 (2014).
  29. Llorens-Bobadilla, E., et al. Single-cell transcriptomics reveals a population of dormant neural stem cells that become activated upon brain injury. Cell Stem Cell. 17 (3), 329-340 (2015).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

neuronalne kom rki macierzysteaktywacja NSCneurogeneza u osobnik w doros ychspoczynek NSCobrazowanie autofluorescencjimikroskopia konfokalnacytometria przep ywowaobrazowanie czasu ycia fluorescencjiklasyfikacja stanu kom rkianaliza ywych kom rek

Powiązane artykuły