Method Article

Ocena patofizjologiczna siatkówki w modelu szczurzym

DOI:

10.3791/63111

⸱

May 6th, 2022

 , 
1Translational Pharmaceutics Research Laboratory (TPRL), Department of Pharmacy, Birla Institute of Technology & Science — Pilani, Hyderabad Campus

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Retinopatia cukrzycowa jest jedną z głównych przyczyn ślepoty. Histologia, test rozpadu bariery krew-siatkówka i angiografia fluorescencyjna są cennymi technikami pozwalającymi zrozumieć patofizjologię siatkówki, co może jeszcze bardziej zwiększyć skuteczność badań przesiewowych leków przeciwko retinopatii cukrzycowej.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Choroba tylnego odcinka oka, taka jak retinopatia cukrzycowa, zmienia fizjologię siatkówki. Retinopatia cukrzycowa charakteryzuje się odwarstwieniem siatkówki, rozpadem bariery krew-siatkówka (BRB) i angiogenezą siatkówki. Model szczura in vivo jest cennym narzędziem eksperymentalnym do badania zmian w strukturze i funkcji siatkówki. Proponujemy trzy różne techniki eksperymentalne w modelu szczurzym w celu identyfikacji zmian morfologicznych komórek siatkówki, unaczynienia siatkówki i upośledzonego BRB. Histologia siatkówki służy do badania morfologii różnych komórek siatkówki. Pomiar ilościowy odbywa się również za pomocą liczby komórek siatkówki i pomiaru grubości różnych warstw siatkówki. Test rozpadu BRB służy do określenia wycieku białek zewnątrzgałkowych z osocza do tkanki szklistej w wyniku rozpadu BRB. Angiografia fluorescencyjna służy do badania angiogenezy i nieszczelności naczyń krwionośnych poprzez wizualizację unaczynienia siatkówki za pomocą barwnika FITC-dekstran.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Retinopatia cukrzycowa (DR) jest jednym z najbardziej złożonych wtórnych powikłań cukrzycy. Jest to również główna przyczyna możliwej do uniknięcia ślepoty w populacji w wieku produkcyjnym na całym świecie. W niedawnej metaanalizie obejmującej 32,4 miliona osób niewidomych, 830 000 (2,6%) osób było niewidomych z powodu DR1. Odsetek utraty wzroku przypisywanej cukrzycy znalazł się na siódmym miejscu w 2015 r. i wynosił 1,06% (0,15-2,38) na całym świecie2,3.

Retinopatia cukrzycowa jest diagnozowana na podstawie nieprawidłowości naczyniowych w tylnych tkankach oka. Klinicznie dzieli się go na dwa etapy - nieproliferacyjny DR (NPDR) i proliferacyjny DR (PDR), w oparciu o unaczynienie siatkówki. Hiperglikemia jest uważana za silny regulator DR, ponieważ wiąże się z kilkoma szlakami zaangażowanymi w neurodegenerację4,5, zapalenie6,7 i mikrokrążenie8 w siatkówce. Wiele powikłań metabolicznych wywołanych hiperglikemią obejmuje akumulację zaawansowanych produktów końcowych glikacji (AGE), szlaku poliolowego, szlaku heksozaminy i szlaku kinazy białkowej C. Szlaki te są odpowiedzialne za proliferację komórek (komórki śródbłonka), migrację (perycyty) i apoptozę (nerwowe komórki siatkówki, perycyty i komórki śródbłonka) w oparciu o różne stadia retinopatii cukrzycowej. Te zmiany metaboliczne mogą prowadzić do zmian fizjologicznych, takich jak odwarstwienie siatkówki, utrata komórek siatkówki, uszkodzenie bariery krew-siatkówka (BRB), tętniaki i angiogeneza9.

Cukrzyca typu 1 wywołana streptozotocyną (STZ) jest dobrze ugruntowaną i akceptowaną praktyką u szczurów do oceny patogenezy cukrzycy i jej powikłań. Cukrzycotwórcze działanie STZ wynika z selektywnego niszczenia komórek β wysp trzustkowych10. W rezultacie, zwierzęta będą doświadczać niedoboru insuliny, hiperglikemii, polidypsji i wielomoczu, z których wszystkie są charakterystyczne dla ludzkiej cukrzycy typu 1 11. W przypadku ciężkiej indukcji cukrzycy STZ podaje się w dawce 40-65 mg/kg masy ciała dożylnie lub dootrzewnowo w wieku dorosłym. Po około 72 godzinach poziom glukozy we krwi u tych zwierząt przekracza 250 mg/dl10,12.

Aby zrozumieć fizjologiczne zmiany siatkówki spowodowane neurodegeneracją, stanem zapalnym i angiogenezą, różne techniki powinny być zoptymalizowane w eksperymentalnych modelach zwierzęcych. Zmiany strukturalne i funkcjonalne w komórkach siatkówki i naczyniach siatkówki można badać za pomocą różnych technik, takich jak histologia, test rozpadu BRB i angiografia fluorescencyjna.

Histologia obejmuje badanie anatomii komórek, tkanek i organów na poziomie mikroskopowym. Ustanawia korelację między strukturą a funkcją komórek/tkanek. Wykonuje się kilka kroków w celu wizualizacji i identyfikacji mikroskopijnych zmian w strukturze tkanki, porównując w ten sposób zdrowe i chore odpowiedniki13. Dlatego tak ważna jest skrupulatna standaryzacja każdego etapu histologii. Różne etapy związane z histologią siatkówki to utrwalenie próbki, przycinanie próbki, odwodnienie, oczyszczanie, impregnacja parafiną, zatapianie parafiny, cięcie i barwienie (barwienie hematoksyliną i eozyną)13,14.

W zdrowej siatkówce transport cząsteczek przez siatkówkę jest kontrolowany przez BRB, złożony z komórek śródbłonka i perycytów po wewnętrznej stronie oraz komórek nabłonka barwnikowego siatkówki po zewnętrznej stronie. Jednak wewnętrzne komórki śródbłonka BRB i perycyty zaczynają się degenerować podczas choroby, a BRB jest również zagrożony15. Z powodu tego rozpadu BRB, wiele cząsteczek o niskiej masie cząsteczkowej przecieka do tkanki ciała szklistego i siatkówki16. W miarę postępu choroby wiele innych cząsteczek białka (o niskiej i wysokiej masie cząsteczkowej) również przedostaje się do tkanki ciała szklistego i siatkówki z powodu zaburzenia homeostazy17. Prowadzi to do różnych innych powikłań, a ostatecznie obrzęku plamki żółtej i ślepoty. W związku z tym ilościowe określenie poziomów białka w ciele szklistym i porównanie stanów zdrowych i cukrzycowych zmierzyło w naruszeniu BRB.

Angiografia fluorescencyjna to technika używana do badania krążenia krwi w siatkówce i naczyniówce za pomocą barwnika fluorescencyjnego. Służy do wizualizacji unaczynienia siatkówki i naczyniówki poprzez wstrzyknięcie barwnika fluoresceinowego drogą dożylną lub wstrzyknięcie do serca18. Po wstrzyknięciu barwnik najpierw dociera do tętnic siatkówkowych, a następnie do żył siatkówki. Ta cyrkulacja barwnika jest zwykle zakończona w ciągu 5 do 10 minut od wstrzyknięcia barwnika19. Jest to ważna technika diagnozowania różnych chorób tylnego odcinka oka, w tym retinopatii cukrzycowej i neowaskularyzacji naczyniówki20. Pomaga wykryć większe i mniejsze zmiany naczyniowe w normalnych i chorobowych stanach.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół jest zgodny ze wszystkimi wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami dostarczonymi przez Instytucjonalną Komisję Etyki Zwierząt, BITS-Pilani, kampus w Hajdarabadzie.

1. Histologia siatkówki

  1. Wyłuszczenie i unieruchomienie oka
    1. Poddaj eutanazji 2-3-miesięcznego samca szczura rasy Wistar z cukrzycą wraz z grupą kontrolną w tym samym wieku (14 do 15 tygodni) za pomocą wysokiej dawki pentobarbitalu (150 mg / kg) wstrzykniętej drogą dootrzewnową. Brak wykrywalnego bicia serca potwierdza śmierć w ciągu 2-5 minut.
    2. Wyłuszczenie oka poprzez wykonanie nacięć za pomocą ostrza skalpela w okolicy nosowej i skroniowej oka. Następnie przetnij wzdłuż jego krawędzi za pomocą kleszczy i mikronożyczek, aby usunąć oko z oczodołu.
      UWAGA: Przed złożeniem szczurów w ofierze należy przygotować roztwory utrwalające.
      UWAGA: Formaldehyd działa drażniąco na skórę, oczy, nos i drogi oddechowe. Może również powodować raka, ponieważ jest silnym środkiem uczulającym skórę. Załóż rękawice i zajmij się nim pod maską21.
    3. Dokładnie przemyć oko 10 ml roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) na szalce Petriego w celu usunięcia krwi. Usuń nadmiar tłuszczu otaczającego oko, aby ułatwić penetrację roztworu utrwalającego.
    4. Natychmiast umieść oko w 5 ml roztworu utrwalającego za pomocą kleszczy i upewnij się, że nie przykleiło się do ścianek szklanych fiolek. Mieszaj delikatnie przez kilka sekund i załóż nakrętkę z odpowiednim oznaczeniem. Inkubować oko w roztworze utrwalającym przez 24 do 48 godzin w ciemnych warunkach w temperaturze pokojowej.
  2. Przycinanie tkanki
    1. Po utrwaleniu wyjąć oko z roztworu utrwalającego, przemyć je 10 ml PBS i umieścić na szalce Petriego zawierającej 10 ml PBS schłodzonego w temperaturze 4 °C.
    2. Za pomocą mikrokleszczy przytrzymaj oko nerwem wzrokowym i wykonaj nacięcie na pars plana za pomocą mikronożyczek. Przeciąć cały brzeg rogówki, aby oddzielić przednią miseczkę oka. Za pomocą kleszczy delikatnie podnieś soczewkę, wyrzuć ją i przetnij nerw wzrokowy.
    3. Za pomocą zakrzywionych mikronożyczek wykonaj podłużny przekrój tylnej muszli ocznej, przechodząc przez tarczę nerwu wzrokowego, dzieląc ją na dwie połowy. Umieść go w podstawie kasety i prawidłowo zamknij pokrywę, nie naruszając tkanki. Oznacz kasety nazwą próbki tkanki i datą.
  3. Odwodnienie, oczyszczanie i impregnacja parafinowa tkanek
    1. Odwodnić przyciętą tkankę poprzez stopniowy transfer w 80 ml 50%, 70%, 90% i 100% etanolu. Podczas przenoszenia kaset z jednego stężenia do drugiego należy pamiętać o natarciu ich na czystą bibułkę, aby zminimalizować zanieczyszczenie.
      UWAGA: Pozostaw tkankę w każdym transferze na 30 minut (dwukrotnie). Całkowity czas potrzebny na ten etap to około 4 godziny.
    2. Po odwodnieniu przenieś kasety do 80 ml ksylenu na 30 minut (dwukrotnie), aby zastąpić etanol ksylenem.
      UWAGA: Po inkubacji z ksylenem tkanka staje się przezroczysta.
      UWAGA: Ksylen jest związkiem aromatycznym z pierścieniem benzenowym. Podrażnia oko i błonę śluzową, a także może powodować depresje.
    3. Na koniec zaimpregnować tkankę wstępnie podgrzaną parafiną w temperaturze 60 °C w celu zastąpienia ksylenu w tkance. Przetrzyj kasety kilka razy na bibułce, aby zminimalizować zawartość ksylenu i umieść w 200 ml parafiny (płyn o temperaturze 60 °C) na 2 godziny (1 h x 2).
      UWAGA: Unikaj wdychania stopionej parafiny, ponieważ wytwarza ona drobne kropelki lipidów, które mogą powodować dyskomfort w oddychaniu.
  4. Zatapianie parafiny
    1. Włącz maszynę do zatapiania parafiny co najmniej 1 godzinę przed użyciem, aby stopić parafinę i aby stacje osiągnęły żądaną temperaturę. Napełnij stalową formę stopionym woskiem parafinowym, umieszczając go na gorącej powierzchni, a następnie wyjmij jedną kasetę na raz z pojemnika na parafinę.
    2. Przenieś stalową formę z gorącej na zimną powierzchnię (4 °C). W tym momencie wosk w formie zacznie krzepnąć. Zanim całkowicie zastygnie, umieść tkankę w wosku za pomocą kleszczy i ustaw tkankę tak, aby część tarczy wzrokowej tylnej miseczki była skierowana w stronę podstawy formy.
      UWAGA: Upewnij się, że tkanka się nie porusza i utrzymuj pożądaną orientację. Jeśli nie, umieść formę z powrotem na ciepłej powierzchni roboczej, aż cała parafina się upłynni, a następnie zacznij od kroku 1.4.2.
    3. Gdy wosk w formie zacznie krzepnąć, natychmiast umieść podstawę kasety na wierzchu formy. Ostrożnie napełnij formę parafiną powyżej górnej krawędzi kasety i powoli przenieś ją na zimną powierzchnię (w pobliżu -20 °C) w celu szybkiego zestalenia. Aż zastygnie, powtarzaj proces z innymi kasetami od kroku 1.4.2.
    4. Gdy wszystkie formy zestalą się, oddziel stalową formę od kasety. Jeśli jest twardy, poczekaj trochę dłużej i spróbuj ponownie (nie usuwaj go na siłę). Separacja staje się łatwiejsza po całkowitym zestaleniu. Teraz kaseta staje się podstawą bloku parafinowego, który ma być trzymany podczas cięcia za pomocą mikrotomu.
      UWAGA: Ten blok może być przechowywany w temperaturze pokojowej do dalszego użytku. W tym momencie proces można zatrzymać i kontynuować później (jeśli jest to wymagane).
  5. Cięcia
    1. Zamontuj jednorazowe ostrze do mikrotomu w uchwycie ostrza. Usuń nadmiar wosku parafinowego wokół kaset tak, aby zarówno górna, jak i dolna część bloków pozostały równoległe do noża. Zamontuj blok na uchwycie kasety.
    2. Odblokuj pokrętło, aby przesunąć je, aż powierzchnia bloku zetknie się z krawędzią noża. Przytnij nadmiar wosku parafinowego na bloku, aż tkanka zostanie uwidoczniona na powierzchni bloku. Ustaw grubość przekroju na 5 μm i przetnij wstęgę od pięciu do sześciu sekcji.
    3. Za pomocą kleszczyków delikatnie przenieś wstążkę na powierzchnię podgrzanej kąpieli wodnej (około 50 °C), aby rozłożyć wstążkę. Zbierz skrawki na szkiełku pokrytym albuminą Mayera, przytrzymując szkiełko pod sekcją. Delikatnie podnieś sekcje i pozostaw szkiełka do wyschnięcia poziomo przez noc w temperaturze 37 °C.
      UWAGA: Preparaty można przechowywać w temperaturze pokojowej w suchych pudełkach przez kilka miesięcy. Na tym etapie proces można zatrzymać i kontynuować później.
  6. Barwienia
    1. Podgrzej szkiełka do barwienia w piecu z gorącym powietrzem w temperaturze 60 °C przez 1 godzinę przed użyciem, aby parafina się stopiła, i postępuj zgodnie z instrukcjami podanymi w tabeli 1.
      UWAGA: Plamy z hematoksyliny i eozyny są toksyczne w przypadku wdychania lub spożycia. Doniesiono, że są rakotwórcze.
OdczynnikCzas odstaniaPowtórzenie (liczba razy)
ksylenCzas trwania: 5 mincyfra arabska
100% etanolCzas trwania: 5 mincyfra arabska
90% etanoluCzas trwania: 5 mincyfra arabska
70% etanoluCzas trwania: 5 mincyfra arabska
50% etanoluCzas trwania: 5 mincyfra arabska
WodaCzas trwania: 5 mincyfra arabska
HematoksylinąCzas trwania: 4 min1
Mycie wodą
1% kwaśny alkohol w 70% etanolu30 sekund1
Mycie wodą
Woda Scotta1 min1
Mycie wodą
50% etanolu1 min1
95% etanolu1 min1
0,25% eozyny5 sekund1
Mycie wodą
WodaCzas trwania: 2 min1
95% etanolu1 min1
100% etanol1 min1
ksylenCzas trwania: 5 mincyfra arabska
Mocowanie i szkiełko nakrywkowe

Tabela 1. Procedura barwienia hematoksyliną i eozyną

2. Test przełamania bariery krew-mózg

  1. Pobieranie krwi i ciała szklistego
    1. Znieczulenie 2-3-miesięcznego samca szczura rasy Wistar z cukrzycą wraz z grupą kontrolną dopasowaną do wieku (14 do 15 tygodni) za pomocą ketaminy (80 mg/kg) i ksylazyny (8 mg/kg). Potwierdź stan znieczulenia za pomocą odruchu wycofania pedału (szczypanie palców). Natychmiast pobrać 1 ml krwi przez nakłucie serca do probówki pokrytej kwasem etylenodiaminotetraoctowym (EDTA) w celu oddzielenia osocza od krwi pełnej.
    2. Poddać szczura eutanazji za pomocą dużej dawki pentobarbitalu (150 mg/kg), wstrzykniętej drogą dootrzewnową. Brak wykrywalnego bicia serca potwierdza śmierć w ciągu 2-5 minut. Wyłuszczyć oko i natychmiast umieścić je na suchym lodzie.
    3. Umieścić oko na czystej szalce Petriego nad suchym lodem (zalecane) i rozpocząć sekcję oka, jak wspomniano w kroku 1.2.2.
    4. Wyjmij soczewkę, ostrożnie wyciągnij ciało szkliste z tylnej miseczki za pomocą mikrokleszczyków i umieść ją w probówce homogenizacyjnej zawierającej trzy do czterech szklanych koralików (2-4 mm).
      UWAGA: Zaleca się preparację na suchym lodzie, ponieważ usunięcie soczewki i ciała szklistego jest łatwiejsze w warunkach zamarzania.
  2. Przygotowanie próbek
    1. Homogenizować ciało szkliste w homogenizatorze perełkowym ze średnią prędkością przez 10 s.
    2. Przenieść krew (1 ml) i próbki szkliste (10-20 μl) do probówek do mikrowirówek i odwirować obie próbki w temperaturze 5200 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: W przypadku udanej homogenizacji ciało szkliste ma jednolitą konsystencję po odwirowaniu. Jednakże w przypadku niejednorodnej konsystencji ciała szklistego powtórzyć czynności od kroku 2.2.1 ze zwiększonym czasem homogenizacji.
    3. Zebrać supernatant z obu próbek i rozcieńczyć próbki ciała szklistego i osocza odpowiednio w stosunku 1:10 i 1:20 za pomocą PBS.
  3. Kwantyfikacja białek i stosunek białek w ciele szklistym do osocza
    1. Aby określić ilościowo stężenie białka w próbkach ciała szklistego i osocza, dodaj 5 μl rozcieńczonych próbek do 250 μl odczynnika Bradforda, dobrze wymieszaj i odczytaj absorbancję przy 590 nm w ciągu 40 min.
      UWAGA: Jeżeli wartość absorpcji próbek jest wyższa niż 1,0, należy je dalej rozcieńczyć i powtórzyć procedurę od kroku 2.2.3.
    2. Znormalizuj poziom białka szklistego do poziomu białka w osoczu tego samego szczura i zmierz różnicę w krotności między szczurami zdrowymi a szczurami z cukrzycą.

3. Angiografia fluorescencyjna

  1. FITC-dextran70000 iniekcja barwnika
    1. Znieczulij 2-3-miesięcznego samca szczura Wistar z cukrzycą wraz z grupą kontrolną dopasowaną do wieku (14 do 15 tygodni) za pomocą 3% izofluranu i potwierdź odruch wycofania pedału (szczypanie palców). Zanurzyć ogon w zlewce zawierającej ciepłą wodę (37–40 °C). Oczyść ogon 70% etanolem przed wstrzyknięciem barwnika. Zlokalizować żyłę boczną ogona i zaznaczyć miejsce wstrzyknięcia w dolnej części ogona.
      UWAGA: Jeśli wkłucie igły nie powiedzie się, spróbuj włożyć igłę w innym miejscu powyżej bieżącej pozycji (końcówka do podstawy ogona). Zaleca się jednak jednorazowe wstrzyknięcie, ponieważ powtarzające się nakłuwanie może prowadzić do rozwoju stresu u szczura, co może spowodować zwężenie naczyń krwionośnych.
    2. Wstrzyknąć 1 ml roztworu barwnika FITC-dextran70000 o stężeniu 50 mg/ml przez żyłę ogonową i pozwolić barwnikowi krążyć przez 5 minut. Szczura należy poddać eutanazji wysoką dawką pentobarbitalu (150 mg/kg), wstrzykniętą drogą dootrzewnową. Brak wykrywalnego bicia serca potwierdza śmierć w ciągu 2-5 minut. Wyłuszczyć oko, jak wspomniano w kroku 1.1.1.
      UWAGA: W razie potrzeby oko można utrwalić w 4% roztworze formaldehydu, nie dłużej niż 30 minut.
  2. Przygotowanie do montażu płaskiego
    1. Do przygotowania płaskich mocowań należy przygotować narzędzia do preparowania wraz ze szkiełkami i szkiełkami nakrywkowymi. Umieścić oko na szalce Petriego wypełnionej schłodzonym PBS i rozpocząć sekcję oka, jak wspomniano w kroku 1.2.2.
    2. Teraz umieść końcówkę spiczastego kleszcza między twardówką a siatkówką. Delikatnie przesuwaj go wzdłuż krawędzi miseczki, upewniając się, że siatkówka nie jest w żadnym miejscu przyczepiona do twardówki. Jeśli jest jakaś przeszkoda, powoli odetnij tę część wzdłuż krawędzi za pomocą zakrzywionych mikronożyczek.
    3. Po potwierdzeniu, że siatkówka nie jest przymocowana do twardówki z żadnej strony, przeciąć w pobliżu tarczy nerwu wzrokowego, wykonując mały otwór, tak aby siatkówka całkowicie odłączyła się od twardówki. Powoli wepchnij siatkówkę do roztworu PBS i umieść ją na czystym, płaskim szkiełku za pomocą szpatułki lub kleszczyków.
    4. Za pomocą mikronożyczek lub ostrzy skalpela wykonaj drobne nacięcia w tkance siatkówki, dzieląc ją na cztery ćwiartki. Upewnij się, że nacięcia są oddalone o co najmniej 2 mm od otworu pozostawionego przez tarczę nerwu wzrokowego pośrodku, jak pokazano na Rysunek 1.
    5. Usuń nadmiar PBS z boków tkanki za pomocą końcówek o pojemności 0,2 ml, nie naruszając płaskiego mocowania.
    6. Umieść kroplę przeciwblaknięcia środka montażowego (od 50 μl do 100 μl) na płaskim uchwycie, przykryj szkiełkiem nakrywkowym i natychmiast wyświetl pod mikroskopem konfokalnym.
      UWAGA: Utrzymuj minimalne światło podczas całej procedury.
  3. Wizualizacja montażu płaskiego
    1. Wizualizuj płaskie mocowanie pod 10-krotnym obiektywem mikroskopu konfokalnego. Wykonaj skanowanie kafelków, aby uchwycić cały płaski uchwyt jako pojedynczy obraz. Liczba płytek zależy od wielkości płaskiego mocowania siatkówki. Wykonaj również układanie Z, aby uwidocznić żyły i tętnice w różnych ogniskach (preferowany rozmiar stosu Z to 5 μm, w zależności od tego, liczba kroków stosu Z jest różna).
    2. Użyj detektora PMT i HyD przy wzmocnieniu % odpowiednio 700-900 i 100-150. Wybierz zakres emisji od 510 do 530 nm dla barwnika FITC-dekstranu.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Histologia siatkówki
W siatkówce cukrzycowej komórki siatkówki ulegają zwyrodnieniu. Ponadto grubość warstw siatkówki zwiększa się z powodu obrzęku22. Obrazy uzyskane po barwieniu Hematoksyliną i Eozyną mogą być wykorzystane do zliczania komórek i pomiaru grubości różnych warstw, jak pokazano w Rysunek 2 przy użyciu ImageJ.

Test przełamania bariery krew-siatkówka
Ponieważ BRB jest upośledzony u szcz...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Histologia
Histologia siatkówki jest wykonywana w celu uwidocznienia zmian morfologicznych komórek i warstw siatkówki. Należy zoptymalizować różne etapy, w tym wybór roztworu utrwalającego, czas utrwalania, odwodnienie i impregnację parafiną. Rozmiar tkanki nie powinien przekraczać 3 mm, ponieważ penetracja utrwalacza staje się powolna. Powszechnie stosowany 4% paraformaldehyd prowadzi do odwarstwienia siatkówki nawet w zdrowym oku ze względu na stosunkowo wysoką osmolarność roztworu w porównaniu z ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy pragną podziękować Indyjskiej Radzie Badań Medycznych (ICMR; ITR-2020-2882) o wsparcie finansowe dla dr Nirmala J. Chcielibyśmy również podziękować University Grant of Commission za zapewnienie stypendium Junior Research Fellowship dla Manishy Malani oraz Central Analytical Laboratory Facility, BITS-Pilani, kampus Hyderabad za zapewnienie infrastruktury obiektowej.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Histology
Reodczynniki
IsofluraneAbbottŚrodek znieczulający
Chlorowodorek ketaminyTroikaa PharmaceuticalsŚrodek znieczulający
KsylazynaIndian Immunologicals LimitedŚrodek znieczulający
Pentobarbital sodowyZora PharmaŚrodek do eutanazji
Roztwór utrwalający (1 % formaldehydu, 1,25 % aldehydu glutarowegoHiMedia, AvraMB059, ASG2529Przygotowany we własnym zakresie
etanolHaymanF204325Odwodnienie
KsylenHiMediaMB-180Usuwanie etanolu lub parafiny
Wosk parafinowyHiMediaGRM10702służy do zatapiania tkanek
GlycerolHiMediaTC503Do przygotowania preparatów powlekanych albuminą. Glicerol i albuminę jaja miesza się w stosunku 1:1 w celu pokrycia na szkiełkach
Kwas solnySisco Research laboratories Pvt. Ltd.65955Do przygotowania 1 % alkoholu kwasowego
Kwas octowyHiMediaAS119Do przygotowania eozyny
Scotts waterLeica3802900Odczynnik do niebieszczenia
Roztwór Papanicolaou 1b Roztwór hematoksylinySigma1.09254.0500Barwienie jąder
EozynaHiMediaGRM115Barwienie cytoplazmy, przygotowano 0,25 % roztwór Własny
DPX Mountant mediaSigma6522Wizualizacja i ochrona przekrojów siatkówki
Equipments
GlasswareBorosil
Kleszcz rogówkowyStephens InstrumentsS5-1200Preparacja
Kleszcz ColibriStephens InstrumentsS5-1135Sekcja
Zakrzywione mikronożyczkiStephens InstrumentsS7-1311Nożyczki do preparacji
VannasStephens InstrumentsS7-1387do preparacji
tęczówkiStephens InstrumentsS7-1015
KasetyHiMediaPW1292Do trzymania tkanki podczas przetwarzania histologicznego
Kąpiel wodnaGT SonicGT Sonic-D9Utrzymanie temperatury
Stacja zatapiania parafinyMyrEC 350Przygotowanie bloków parafinowych
MicrotomeZhengzhou Nanbei Instrument Equipment Co., Ltd.YD-335AOstrza do cięcia
LeicaLeica 818Prowadnice sekcyjne
HiMediaBG005Przechowywanie skrawków parafiny
Szkiełka nakrywkoweHiMediaBG014CDo pokrycia tkanki po dodaniu podłoża montażowego
Blood Retinal Barrier breakdown
Reagents
IsofluraneAbbottB506Anestezjolizacja
Suchy lódNie dotyczyNie dotyczyOdczynnik do rozwarstwienia
BradfordaSigmaB6916Kwantyfikacja białek
< strong>Wyposażenia
Kleszcz rogówkowyStephens InstrumentsS5-1200Preparacja
Colibri kleszczStephens InstrumentsS5-1135Preparacja
Zakrzywione mikronożyceStephens InstrumentsS7-1311Nożyczki do rozwarstwiania
VannasStephens InstrumentsS7-1387Nożyczki do rozwarstwiania
tęczówkiStephens InstrumentsS7-1015Wyroby szklane do preparacji
BorosilNie dotyczy
Probówki z powłoką EDTAJ.K DiagnosticsNie dotyczyOddziel osocze od krwi pełnej
Probówki homogenizacyjneMP BiomedicalsSKU: 115076200-CFHomogenizacja ciała szklistego
Nakrętki homogenizacyjneMP BiomedicalsSKU: 115063002-CFHomogenizacja ciała szklistego
Kulki szklaneMP BiomedicalsSKU: 116914801Homogenizacja ciała szklistego
HomogenizatorBertin InstrumentsP000673-MLYS0-AHomogenizacja szklistej
płytki 96-dołkowej - PrzezroczystaGN655101GrenieraKwantyfikacja białek
Czytnik płytekUrządzenia molekularneSpectrMax M4Pomiar absorbancji
WirówkaREMICPR240 PlusWirowanie
Angiografia fluorescencyjna
Odczynniki
IsofluraneAbbottB506Anesthesia
FITC-dextran 70 kD (FITC, Dextran, Dilaurynian Dibutyliny, DMSOFITC, Dekstran i Dilaurynian Dibutyliny z Sigma; DMSO od HiMediaFITC-F3651, Dextran-31390, Dilaurynian dibutyliny -29123, DMSO-TC185Przygotowany we własnym
zakresie FluoroshiedSigmaF6182Anty-blaknięcie medium montażowe
< mocne>Wyposażenie< / mocny>
Kleszcz rogówkowyStephens InstrumentsS5-1200Preparacja
kleszczyk ColibriStephens InstrumentsS5-1135Rozwarstwienie
Zakrzywione mikronożyczkiStephens InstrumentsS7-1311
Nożyczki doStephens InstrumentsS7-1387Nożyczki do rozwarstwiania
tęczówkiStephens InstrumentsS7-1015Wyroby szklane do preparacji
BorosilNie dotyczy
SlajdyHiMediaBG005Przygotowanie do montażu płaskiego
Szkiełka nakrywkoweHiMediaBG014CDo pokrycia tkanki po dodaniu podłoża montażowego
Mikroskop konfokalnyLeicaDMi8Wizualizacja płaskiego mocowania
Nożyczki preparacyjne rozwarstwiania Vannas

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jonas, J. B., Sabanayagam, C. Epidemiology and risk factors for diabetic retinopathy. Diabetic Retinopathy and Cardiovascular Disease. 27, 20-37 (2019).
  2. Pandova, M. G. Visual Impairment and Blindness. , IntechOpen. (2019).
  3. Mokdad, A. H., et al. Global, regional, national, and subnational big data to inform health equity research: perspectives from the Global Burden of Disease Study 2017. Ethnicity & Disease. 29, Suppl 1 159-172 (2019).
  4. Barber, A. J., et al. Neural apoptosis in the retina during experimental and human diabetes. Early onset and effect of insulin. The Journal of Clinical Investigation. 102 (4), 783-791 (1998).
  5. El-Asrar, A. M. A., Dralands, L., Missotten, L., Al-Jadaan, I. A., Geboes, K. Expression of apoptosis markers in the retinas of human subjects with diabetes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (8), 2760-2766 (2004).
  6. Schröder, S., Palinski, W., Schmid-Schönbein, G. Activated monocytes and granulocytes, capillary nonperfusion, and neovascularization in diabetic retinopathy. The American Journal of Pathology. 139 (1), 81(1991).
  7. Miyamoto, K., et al. Prevention of leukostasis and vascular leakage in streptozotocin-induced diabetic retinopathy via intercellular adhesion molecule-1 inhibition. Proceedings of the National Academy of Sciences. 96 (19), 10836-10841 (1999).
  8. Bhanushali, D., et al. Linking retinal microvasculature features with severity of diabetic retinopathy using optical coherence tomography angiography. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (9), 519-525 (2016).
  9. Wang, W., Lo, A. C. Diabetic retinopathy: pathophysiology and treatments. International Journal of Molecular Sciences. 19 (6), 1816(2018).
  10. Akbarzadeh, A., et al. Induction of diabetes by streptozotocin in rats. Indian Journal of Clinical Biochemistry. 22 (2), 60-64 (2007).
  11. Weiss, R. B. Streptozocin: a review of its pharmacology, efficacy, and toxicity. Cancer Treatment Reports. 66 (3), 427-438 (1982).
  12. Karunanayake, E. H., Hearse, D. J., Mellows, G. The metabolic fate and elimination of streptozotocin. Biochemical Society Transactions. 3 (3), 410-414 (1975).
  13. Luna, L. G. Manual of Histologic Staining Methods of the Armed Forces Institute of Pathology. , McGraw-Hill, Blakiston Division. New York. (1968).
  14. Okunlola, A., et al. Histological studies on the retina and cerebellum of Wistar rats treated with Arteether. Journal of Morphological Sciences. 31 (01), 028-032 (2014).
  15. Wallow, I., Engerman, R. Permeability and patency of retinal blood vessels in experimental diabetes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 16 (5), 447-461 (1977).
  16. do Cartmo, A., Ramos, P., Reis, A., Proença, R., Cunha-Vaz, J. Breakdown of the inner and outer blood retinal barrier in streptozotocin-induced diabetes. Experimental Eye Research. 67 (5), 569-575 (1998).
  17. Shires, T., Faeth, J., Pulido, J. Protein levels in the vitreous of rats with streptozotocin-induced diabetes mellitus. Brain Research Bulletin. 30 (1-2), 85-90 (1993).
  18. D'amato, R., Wesolowski, E., Smith, L. H. Microscopic visualization of the retina by angiography with high-molecular-weight fluorescein-labeled dextrans in the mouse. Microvascular Research. 46 (2), 135-142 (1993).
  19. Gupta, D. Fluorescein angiography refresher course: Here's how to interpret the findings of this useful diagnostic tool. Review of Optometry. 138 (11), 60-65 (2001).
  20. Edelman, J. L., Castro, M. R. Quantitative image analysis of laser-induced choroidal neovascularization in rat. Experimental Eye Research. 71 (5), 523-533 (2000).
  21. Formaldehyde, 2-Butoxyethanol and 1-tert-Butoxypropan-2-ol. IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans. , Available from: http://monographs.iarc.fr/ENG/Monographs/vol88/index.php (2009).
  22. Szabó, K., et al. Histological evaluation of diabetic neurodegeneration in the retina of Zucker diabetic fatty (ZDF) rats. Scientific Reports. 7 (1), 1-17 (2017).
  23. Margo, C. E., Lee, A. Fixation of whole eyes: the role of fixative osmolarity in the production of tissue artifact. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 233 (6), 366-370 (1995).
  24. Tokuda, K., et al. Optimization of fixative solution for retinal morphology: a comparison with Davidson's fixative and other fixation solutions. Japanese Journal of Ophthalmology. 62 (4), 481-490 (2018).
  25. Luna, L. G. Manual of Histologic Staining Methods of the Armed Forces Institute of Pathology. Third edition. , Blakiston Division, McGraw-Hill. McGraw-Hill, New York. (1968).
  26. Skeie, J. M., Tsang, S. H., Mahajan, V. B. Evisceration of mouse vitreous and retina for proteomic analyses. Journal of Visualized Experiments. (50), e2795(2011).
  27. D'Amato, R., Wesolowski, E., Smith, L. E. Microscopic visualization of the retina by angiography with high-molecular-weight fluorescein-labeled dextrans in the mouse. Microvascular Research. 46 (2), 135-142 (1993).
  28. Atkinson, E. G., Jones, S., Ellis, B. A., Dumonde, D. C., Graham, E. Molecular size of retinal vascular leakage determined by FITC-dextran angiography in patients with posterior uveitis. Eye (Lond). 5, Pt 4 440-446 (1991).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Diabetic RetinopathyRetinal PathophysiologyRat ModelBlood Retinal BarrierRetinal HistologyFluorescence AngiographyRetinal Cell CountRetinal Flat MountProtein Leakage AssayRetinal Angiogenesis

Related Articles