Method Article

Ekonomiczny i wydajny protokół izolacji i hodowli komórek dendrytycznych pochodzących ze szpiku kostnego od myszy

DOI:

10.3791/63125

⸱

July 1st, 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1Tianjin Institute of Urology, The Second Hospital of Tianjin Medical University, 2Department of Pathology, The Second Hospital of Tianjin Medical University, 3Department of Urology, The Affiliated Wuxi No.2 People’s Hospital of Nanjing Medical University

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy ekonomiczną i efektywną metodę izolowania i generowania komórek dendrytycznych pochodzących ze szpiku kostnego o wysokiej czystości od myszy po 7 dniach hodowli z 10 ng/mL GM-CSF/IL-4.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zapotrzebowanie na komórki dendrytyczne (DC) stopniowo wzrasta wraz z postępem badań immunologicznych. Jednak DC są rzadkie we wszystkich tkankach. Tradycyjna metoda izolowania DC polega przede wszystkim na indukowaniu różnicowania szpiku kostnego (BM) w DC poprzez wstrzykiwanie dużych dawek (>10 ng/ml) czynnika stymulującego tworzenie kolonii granulocytów-makrofagów/interleukiny-4 (GM-CSF/IL-4), co sprawia, że procedura jest skomplikowana i kosztowna. W tym protokole, wykorzystując wszystkie komórki BM hodowane w pożywce 10 ng / mL GM-CSF / IL-4, po 3-4 wymianach półhodowli, pobrano do 2,7 x 107 komórek CD11c+ (DC) na mysz (dwie kości udowe) o czystości 80%-95%. Po 10 dniach w hodowli ekspresja CD11c, CD80 i MHC II wzrosła, podczas gdy liczba komórek zmniejszyła się. Liczba komórek osiągnęła szczyt po 7 dniach hodowli. Co więcej, ta metoda zajęła tylko 10 minut, aby zebrać wszystkie komórki szpiku kostnego, a dużą liczbę DC uzyskano po 1 tygodniu hodowli.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki dendrytyczne (DC) są najpotężniejszymi komórkami prezentującymi antygen (APC) do aktywacji naiwnych limfocytów T i indukowania specyficznych odpowiedzi cytotoksycznych limfocytów T (CTL) przeciwko chorobom zakaźnym, alergiom i komórkom nowotworowym1,2,3. DC są głównym ogniwem między odpornością wrodzoną a odpornością nabytą i odgrywają istotną rolę w obronie immunologicznej i utrzymaniu tolerancji immunologicznej. W ciągu ostatnich 40 lat wielu badaczy starało się zdefiniować podzbiory DC i ich funkcje w zapaleniu i odporności. Zgodnie z tymi badaniami, DC rozwijają się wzdłuż linii szpikowej i limfatycznej z komórek szpiku kostnego. Szczepionki przeciwnowotworowe osiągnęły w ostatnich latach znaczące kamienie milowe i mają przed sobą obiecującą przyszłość. Mechanicznie szczepionki przeciwnowotworowe modulują odpowiedź immunologiczną i zapobiegają wzrostowi guza poprzez aktywację cytotoksycznych limfocytów T za pomocą antygenów nowotworowych. Szczepionka oparta na DCs odgrywa ważną rolę w immunoterapii nowotworów i została uznana za jedną z najbardziej obiecujących terapii przeciwnowotworowych1,4. Ponadto, DC są szeroko stosowane w testowaniu nowych leków ukierunkowanych molekularnie i inhibitorów immunologicznych punktów kontrolnych5.

Naukowcy pilnie potrzebują dużej liczby DC o wysokiej czystości, aby dalej badać rolę DC. Jednak DC są rzadkie w różnych tkankach i krwi, stanowiąc tylko 1% komórek krwi u ludzi i zwierząt. Hodowla in vitro komórek dendrytycznych szpiku kostnego (BMDC) jest ważną metodą pozyskiwania dużych ilości komórek prądu stałego. Tymczasem protokół Lutza do generowania DC ze szpiku kostnego jest szeroko stosowany przez badaczy6. Chociaż protokół jest skuteczny w pozyskiwaniu komórek DC, jest złożony i kosztowny, obejmuje dodanie wysokich stężeń cytokin i lizę czerwonych krwinek.

W tym badaniu opisujemy metodę izolowania prawie wszystkich komórek szpiku kostnego od szpiku kostnego myszy (BM) i wywoływania różnicowania do BMDC po 7-9 dniach inkubacji in vitro, przy niższym stężeniu GM-CSF i IL-4. Ta procedura zajmuje tylko 10 minut, aby zebrać prawie wszystkie komórki szpiku kostnego i zawiesić je w kompletnym pożywce. Krótko mówiąc, w tych badaniach zapewniamy wydajną i opłacalną metodę hodowli BMDC.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Medycznego w Nankinie.

1. Izolacja szpiku kostnego i przygotowanie komórek BM

  1. Uśmierc myszy C57BL/6 (18-22 g, 6-8 tygodni) poprzez uduszenie CO2. Zamocuj mysz na stole operacyjnym myszy. Zdezynfekuj powierzchnie 70% etanolem.
  2. Przetnij skórę nogi, aby odsłonić mięśnie i tętnicę udową. Zaciśnij i oderwij tętnicę udową za pomocą dwóch kleszczy, a następnie pociągnij bliższy koniec w kierunku brzucha.
    UWAGA: Nie przecinaj tętnicy udowej bezpośrednio. W przeciwnym razie spowoduje to nadmierne krwawienie i zanieczyszczenie pola widzenia.
  3. Przetnij wszystkie mięśnie wokół kości udowej.
  4. Powoli rozciągnij dolne kończyny myszy na zewnątrz, aż usłyszysz dźwięk zwichnięcia stawu biodrowego i zobaczysz wypadnięcie głowy kości udowej.
  5. Oddziel kończyny dolne od ciała za pomocą nożyczek wzdłuż wewnętrznej strony głowy kości udowej.
  6. Odetnij tylne nogi od końca stawu kolanowego, aby uzyskać wolną i kompletną kość udową.
  7. Usuń mięśnie przyczepione do kości udowej za pomocą gazy.
    UWAGA: Nie narzynaj mięśni bezpośrednio. Kość udowa myszy jest delikatna, należy zachować jej integralność.
  8. Zanurz kość udową w 75% alkoholu na 2-5 minut.

2. Hodowla indukcyjna BMDC

  1. Wypłucz pozostały alkohol za pomocą PBS. Użyj kleszczy hemostatycznych, aby zacisnąć środkową i dolną część kości udowej, a drugi zestaw do zaciśnięcia dolnego końca kości udowej. Kleszcze hemostatyczne są przykładane bocznie do kości udowej, a kość udowa jest oddzielona od linii nasady.
    UWAGA: Linia nasady nie jest łatwo widoczna, dopóki kość udowa nie pęknie. Ten i kolejne kroki są wykonywane w sterylnym środowisku.
  2. Za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml (igła: 0,6 mm x 25 mm) należy wniknąć do jamy szpiku kostnego od przerwania linii nasadowej i obrócić igłę, aby przebić głowę kości udowej i jamę szpiku kostnego. Pulsować i przepłukiwać jamę szpiku kostnego za pomocą 1 ml kompletnego podłoża zawierającego GM-CSF/IL-4, aż kość stanie się biała.
    UWAGA: Kompletna pożywka hodowlana: 10% FBS, 1% penicylina-streptomycyna, 55 μM β-merkaptoetanolu, 10 ng/mL GM-CSF i 10 ng/ml IL-4.
  3. Ponownie zawiesić wszystkie komórki w 24 ml kompletnej pożywki hodowlanej (~5 x 105 komórek/ml). Po wymieszaniu całe podłoże wysiewano na 6-dołkowej płytce z 4 ml/dołk, a następnie inkubowano w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 2 dni.
    UWAGA: Nie jest konieczna liza erytrocytów.
  4. Po 2 dniach zastąp całą pożywkę podłożem zawierającym GM-CSF/IL-47. W czwartym, szóstym i ósmym dniu zastąp połowę pożywki kompletną pożywką zawierającą 10 ng/mL GM-CSF/IL-4,
    UWAGA: Na tym etapie usuwane są zawieszone komórki, takie jak erytrocyty i limfocyty.
  5. Rób zdjęcia każdego dnia, aby rejestrować wzrost komórek. Począwszy od szóstego dnia, zbieraj jedną studzienkę komórek, aby policzyć liczbę komórek i wykryć CD11c, CD80 i MHC II expression6,7.

3. Cytometryczne wykrywanie ekspresji CD11c, CD80 i MHC II metodą cytometrii

przepływowej
  1. Po przemyciu DC PBS ponownie zawiesić 1 x 106 komórek w 100 μl buforu FACS, dodać 0,5 μg przeciwciała anty-mysiego CD16/32 i inkubować przez 10 minut na lodzie w celu zablokowania niespecyficznych miejsc antygenowych.
  2. Dodać 1 μg Percp/cy5,5-CD11c, 0,5 μg PE-CD80 i 0,04 μg przeciwciał APC-MHC II i inkubować na lodzie przez 30 minut.
  3. Odwirować przy 1 000 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C, usunąć supernatant, dodać 1 ml 4% paraformaldehydu, utrwalić na 30 minut w temperaturze 4 °C i ponownie zawiesić w 300 μl buforu FACS.
  4. Wykonaj cytometrię przepływową.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki 1 x 10 7-1,7 x 107 zostały pobrane z dwóch kości udowych i ponownie zawieszone w 24 ml pożywki przed umieszczeniem na płytce 6-dołkowej (Rysunek 1A). Po 2 dniach nieprzylegające komórki usunięto poprzez całkowitą zmianę pożywki hodowlanej. Przed zmianą pożywki zaobserwowano znaczną liczbę zawieszonych komórek (Ryc. 1B). Po 3 dniach hodowli zaczęły tworzyć się kolonie małych komórek. Szóstego dnia wielkość i liczba kolonii znacznie wzrosła. Siódmego dni...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ludzie i myszy mają różne podzbiory DC, w tym klasyczne DC (cDC, w tym cDC1 i cDC2), plazmocytoidalne DC (pDC) i DC pochodzące z monocytów (MoDCs)9,10,11. Ogólnie przyjmuje się, że cDC1 regulują odpowiedzi cytotoksycznych limfocytów T (CTL) na patogeny wewnątrzkomórkowe i raka, a cDC2 regulują odpowiedź immunologiczną na patogeny zewnątrzkomórkowe, pasożyty i alergeny12. Znaczna liczba DC może być wytwarz...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszyscy autorzy oświadczają, że nie mają konfliktu interesów i że nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Program Planu Nauki i Technologii Tianjin (20JCQNJC00550), Tianjin Health Science and Technology Project (TJWJ202021QN033 i TJWJ202021QN034).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
β-MerkaptoetanolSolarbioM8211
Płytka 6-dołkowaCorning3516
APC-MHC IIBiolegend116417
FBSGibco10100
PE-CD80Biolegend104707
Penicylina-StreptomycynaSolarbioP1400
Percp/cy5.5-CD11cBiolegend117327
PRMI-1640Mysz
GM-CSFSolarbioP00184
Mysz rekombinowana IL-4SolarbioP00196
TruStain Fc PLUS (anty-mysz CD16/32) PrzeciwciałoBiolegend156603
rekombinowana Thermo 11875093

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Huang, M. N., et al. Antigen-loaded monocyte administration induces potent therapeutic antitumor T cell responses. Journal of Clinical Investigation. 130 (2), 774-788 (2020).
  2. Wang, P., Dong, S., Zhao, P., He, X., Chen, M. Direct loading of CTL epitopes onto MHC class I complexes on dendritic cell surface in vivo. Biomaterials. 182, 92-103 (2018).
  3. Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392 (6673), 245-252 (1998).
  4. Jiang, P. L., et al. Galactosylated liposome as a dendritic cell-targeted mucosal vaccine for inducing protective anti-tumor immunity. Acta Biomaterialia. 11, 356-367 (2015).
  5. Shi, Y., et al. Next-generation immunotherapies to improve anticancer immunity. Frontiers in Pharmacology. 11, 566401(2020).
  6. Lutz, M. B., et al. An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow. Journal of Immunological Methods. 223 (1), 77-92 (1999).
  7. Son, Y. I., et al. A novel bulk-culture method for generating mature dendritic cells from mouse bone marrow cells. Journal of Immunological Methods. 262 (1-2), 145-157 (2002).
  8. Guo, L., et al. Fusion protein vaccine based on Ag85B and STEAP1 induces a protective immune response against prostate cancer. Vaccines. 9 (7), 786(2021).
  9. Olweus, J., et al. Dendritic cell ontogeny: A human dendritic cell lineage of myeloid origin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (23), 12551-12556 (1997).
  10. Martin, P., et al. Concept of lymphoid versus myeloid dendritic cell lineages revisited: both CD8alpha(-) and CD8alpha(+) dendritic cells are generated from CD4(low) lymphoid-committed precursors. Blood. 96 (-), 2511-2519 (2000).
  11. Anderson, D. A., Dutertre, C. A., Ginhoux, F., Murphy, K. M. Genetic models of human and mouse dendritic cell development and function. Nature Reviews: Immunology. 21 (2), 101-115 (2021).
  12. Vu Manh, T. P., Bertho, N., Hosmalin, A., Schwartz-Cornil, I., Dalod, M. Investigating evolutionary conservation of dendritic cell subset identity and functions. Frontiers in Immunology. 6, 260(2015).
  13. Scheicher, C., Mehlig, M., Zecher, R., Reske, K. Dendritic cells from mouse bone marrow: in vitro differentiation using low doses of recombinant granulocyte-macrophage colony-stimulating factor. Journal of Immunological Methods. 154 (2), 253-264 (1992).
  14. Brasel, K., De Smedt, T., Smith, J. L., Maliszewski, C. R. Generation of murine dendritic cells from flt3-ligand-supplemented bone marrow cultures. Blood. 96 (9), 3029-3039 (2000).
  15. Mayordomo, J. I., et al. marrow-derived dendritic cells pulsed with synthetic tumour peptides elicit protective and therapeutic antitumour immunity. Nature Medicine. 1 (12), 1297-1302 (1995).
  16. Condon, C., Watkins, S. C., Celluzzi, C. M., Thompson, K., Falo, L. D. DNA-based immunization by in vivo transfection of dendritic cells. Nature Medicine. 2 (10), 1122-1128 (1996).
  17. Brunner, G. A., et al. Post-prandial administration of the insulin analogue insulin aspart in patients with type 1 diabetes mellitus. Diabetic Medicine. 17 (5), 371-375 (2000).
  18. Koido, S., et al. Induction of antitumor immunity by vaccination of dendritic cells transfected with MUC1 RNA. Journal of Immunology. 165 (10), 5713-5719 (2000).
  19. Jonasson, P. S., et al. Strength of the porcine proximal femoral epiphyseal plate: The effect of different loading directions and the role of the perichondrial fibrocartilaginous complex and epiphyseal tubercle - An experimental biomechanical study. Journal of Experimental Orthopaedics. 1 (1), 4(2014).
  20. Labeur, M. S., et al. Generation of tumor immunity by bone marrow-derived dendritic cells correlates with dendritic cell maturation stage. Journal of Immunology. 162 (1), 168-175 (1999).
  21. Hinkel, A., et al. Immunomodulatory dendritic cells generated from nonfractionated bulk peripheral blood mononuclear cell cultures induce growth of cytotoxic T cells against renal cell carcinoma. Journal of Immunotherapy. 23 (1), 83-93 (2000).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Bone Marrow Dendritic CellsDendritic Cell IsolationMouse Bone MarrowGM CSF IL 4Cell Culture ProtocolCD11c ExpressionFlow CytometryBone Marrow HarvestDendritic Cell DifferentiationImmune Cell Markers

Related Articles