Artykuł metodologiczny

Kwantyfikacja parametrów naczyniowych w całych siatkówkach górskich myszy z retinopatiami nieproliferacyjnymi i proliferacyjnymi

DOI:

10.3791/63126

⸱

12 marca 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1Departamento de Bioquímica Clínica, Facultad de Ciencias Químicas, Universidad Nacional de Córdoba, 2Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología (CIBICI), Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET), 3Vitreo-retinal Department, Centro Privado de Ojos Romagosa-Fundación VER, 4Unidad de Investigación y Desarrollo en Tecnología Farmacéutica (UNITEFA), Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET)

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten artykuł opisuje dobrze sprawdzony i powtarzalny test barwienia lektyny dla całego preparatu siatkówki Mount oraz protokoły wymagane do ilościowego pomiaru parametrów naczyniowych często zmienianych w retinopatiach proliferacyjnych i nieproliferacyjnych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Retinopatie to niejednorodna grupa chorób, które wpływają na tkankę neurosensoryczną oka. Charakteryzują się neurodegeneracją, glejozą oraz postępującą zmianą funkcji i struktury naczyń krwionośnych. Chociaż początek retinopatii charakteryzuje się subtelnymi zaburzeniami percepcji wzrokowej, zmiany w splocie naczyniowym są pierwszymi objawami wykrywanymi przez klinicystów. Brak lub obecność neowaskularyzacji decyduje o tym, czy retinopatia jest klasyfikowana jako nieproliferacyjna (NPDR) czy proliferacyjna (PDR). W tym sensie kilka modeli zwierzęcych próbowało naśladować specyficzne cechy naczyniowe każdego etapu, aby określić mechanizmy leżące u podstaw zmian śródbłonka, śmierci neuronów i innych zdarzeń zachodzących w siatkówce. W tym artykule przedstawimy pełny opis procedur wymaganych do pomiaru parametrów naczyniowych siatkówki u dorosłych i myszy wcześnie urodzonych w dniu postnatalnym (P)17. Omówimy szczegółowo protokoły przeprowadzania barwienia naczyń siatkówki izolektyną GSA-IB4 w całych mocowaniach w celu późniejszej wizualizacji mikroskopowej. Podano również kluczowe kroki przetwarzania obrazu za pomocą oprogramowania Image J Fiji, dzięki czemu czytelnicy będą mogli zmierzyć gęstość naczyń, średnicę i krętość, rozgałęzienia naczyń krwionośnych, a także obszary jałowe i neowaskularne. Narzędzia te są bardzo pomocne w ocenie i ilościowym określaniu zmian naczyniowych zarówno w retinopatiach nieproliferacyjnych, jak i proliferacyjnych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oczy są odżywiane przez dwa układy tętniczo-żylne: naczyniówkę, zewnętrzną sieć naczyniową, która nawadnia barwnikowy nabłonek siatkówki i fotoreceptory; oraz układ nerwowo-siatkówkowy, który nawadnia warstwę komórek zwojowych i wewnętrzną warstwę jądrową siatkówki1. Unaczynienie siatkówki to zorganizowana sieć naczyń, które dostarczają składniki odżywcze i tlen do komórek siatkówki oraz zbierają produkty przemiany materii, aby zapewnić prawidłową transdukcję sygnalizacji wizualnej. Ten układ naczyniowy ma pewne wyraźne cechy, w tym: brak autonomicznego unerwienia, regulację napięcia naczyniowego przez wewnętrzne mechanizmy siatkówki oraz posiadanie złożonej bariery siatkówkowo-krwionośnej2. Dlatego unaczynienie siatkówki było przedmiotem zainteresowania wielu badaczy, którzy intensywnie badali nie tylko unaczynienie podczas rozwoju, ale także zmiany i patologiczną angiogenezę, której ulegają te naczynia w chorobach3. Najczęstszymi zmianami naczyniowymi obserwowanymi w retinopatiach są poszerzenie naczyń, neowaskularyzacja, utrata arboryzacji naczyń krwionośnych oraz deformacja głównych naczyń siatkówki, co sprawia, że stają się one bardziej zygzakowate4,5,6. Jedna lub więcej z opisanych zmian jest najwcześniejszymi objawami wykrywanymi przez klinicystów. Wizualizacja naczyń krwionośnych zapewnia szybką, nieinwazyjną i niedrogą metodę badań przesiewowych7. Szeroko zakrojone badanie zmian zaobserwowanych w drzewie naczyniowym określi, czy retinopatia jest nieproliferacyjna czy proliferacyjna i jakie będzie dalsze leczenie. Retinopatie nieproliferacyjne mogą objawiać się m.in. nieprawidłową morfologią naczyń krwionośnych, zmniejszoną gęstością naczyń krwionośnych, naczyniami włosowatymi bezkomórkowymi, śmiercią perycytów, obrzękiem plamki żółtej. Ponadto retinopatie proliferacyjne rozwijają również zwiększoną przepuszczalność naczyń, przebudowę zewnątrzkomórkową i tworzenie kępek naczyniowych w kierunku jamy ciała szklistego, które łatwo się rozpadają lub wywołują odwarstwienie siatkówki8.

Po wykryciu retinopatii można monitorować poprzez zmiany naczyniowe9,10. Postęp patologii można śledzić poprzez zmiany strukturalne naczyń, które wyraźnie określają etapy choroby11. Kwantyfikacja zmian naczyniowych w tych modelach pozwoliła na skorelowanie zmian naczyniowych i śmierci neuronów oraz przetestowanie terapii farmakologicznych dla pacjentów w różnych fazach choroby.

W świetle powyższych stwierdzeń uważamy, że rozpoznawanie i kwantyfikacja zmian naczyniowych ma fundamentalne znaczenie w badaniach nad retinopatiami. W tej pracy pokażemy, jak mierzyć różne parametry naczyniowe. W tym celu wykorzystamy dwa modele zwierzęce. Jednym z nich jest mysi model retinopatii indukowanej tlenem12, który naśladuje retinopatię wcześniaków i niektóre aspekty proliferacyjnej retinopatii cukrzycowej13,14. W tym modelu zmierzymy obszary jałowe, obszary neowaskularne oraz poszerzenie i krętość naczyń głównych. W naszym laboratorium opracowano mysi model zespołu metabolicznego (MetS), który indukuje retinopatię nieproliferacyjną15. Tutaj ocenimy gęstość naczyń krwionośnych i rozgałęzienia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

myszy C57BL/6J były obsługiwane zgodnie z wytycznymi Oświadczenia ARVO dotyczącego wykorzystania zwierząt w badaniach okulistycznych i wzrokowych. Procedury eksperymentalne zostały opracowane i zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (CICUAL) Wydziału Nauk Chemicznych Narodowego Uniwersytetu w Kordobie (Res. HCD 1216/18).

1. Przygotowanie roztworów buforowych i odczynników

  1. Przygotowanie 1x buforu fosforanowego soli fizjologicznej (PBS): Dodać 8 g chlorku sodu (NaCl), 0,2 g chlorku potasu (KCl), 14,4 g dwuwodnego fosforanu sodu (Na2HPO4 2H2O) i 0,24 g diwodorofosforanu potasu (KH2PO4) do 800 ml wody destylowanej. Mieszaj roztwór, aż do całkowitego rozpuszczenia soli. Doprowadzić pH do 7,4 za pomocą kwasu chlorkowego (HCl) i dostosować objętość do 1 l za pomocą dodatkowej wody destylowanej. Przefiltrować roztwór i przechowywać go w temperaturze 4 °C.
  2. Przygotowanie 4% paraformaldehydu (PFA): Dodać 40 g stałego PFA do 800 ml świeżo przygotowanego PBS. Wymieszać roztwór na płycie grzewczej o stałej temperaturze 60 °C. Dodać 1 M wodorotlenek sodu (NaOH) aż do całkowitego rozpuszczenia PFA, sprawdzając, czy pH jest utrzymywane w zakresie 7,2-7,4. Uzupełnij objętość do 1,000 ml za pomocą PBS i wymieszaj. Wyłączyć płytę grzewczą i przefiltrować roztwór, gdy jego temperatura spadnie poniżej 35 °C. Roztwór należy przechowywać w temperaturze 4 °C do 3 dni.
    UWAGA: PFA jest szkodliwy w przypadku połknięcia lub wdychania i prawdopodobnie jest związkiem mutagennym. Podczas całego procesu należy używać rękawiczek i maski na twarz oraz pracować w kabinie bezpieczeństwa.
  3. Przygotowanie 1x soli fizjologicznej buforowanej Tris (TBS): Dodać 6,1 g Tris i 9 g NaCl do 800 ml wody destylowanej. Mieszaj roztwór, aż do całkowitego rozpuszczenia soli. Za pomocą HCl należy dostosować pH do 7,4 i zwiększyć objętość do 1 litra za pomocą dodatkowej wody destylowanej. Przefiltrować roztwór i przechowywać go w temperaturze 4 °C.
  4. Przygotowanie TBS-0,1% Triton X-100: Dodać 0,1 ml TritonX-100 do 100 ml TBS. Delikatnie wymieszać i przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 1 tygodnia.
    UWAGA: Ponieważ Triton jest bardzo gęstym detergentem, należy lekko przeciąć końcówkę końcówki, aby uzyskać lepsze pipetowanie.
  5. Przygotowanie TBS-5%-Albuminy surowicy bydlęcej (BSA) -0,1% Triton-X-100: Odważyć 5 g BSA i dodać TBS-0,1% roztwór tritonu X-100 do końcowej objętości 100 ml. Delikatnie wymieszaj. Porcjować i przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do 2 miesięcy.
  6. Izolektyna GSA-IB4 Alexa fluor-488 koniugat (Izolektyna GSA-IB4): Waga 36,75 mg dwuwodnego chlorku wapnia (CaCl2·2H2O) i dodać go do 500 ml świeżo przygotowanego PBS. Wymieszaj roztwór za pomocą mieszadła. Pobrać pipetą 500 μl roztworu CaCl2/PBS i dodać go do fiolki zawierającej 500 μg liofilizowanego proszku izolektyny GSA-IB4. Delikatnie wymieszać i rozdzielić roztwór na porcje do probówek o pojemności 0,5 ml. Przechowywać je w temperaturze -20 °C, chronić przed światłem.
  7. Poli(alkohol winylowy) w glicerolu/Tris: Zważ 2,4 g poli(alkoholu winylowego), dodaj 6 g glicerolu i delikatnie wymieszaj. Następnie dodaj 6 ml wody i kontynuuj mieszanie przez kilka godzin w temperaturze pokojowej. Dodać 12 ml podgrzanego 0,2 M roztworu Tris (pH: 8,5) i podgrzewać w stałej temperaturze 50 °C przez 10 minut i od czasu do czasu mieszać. Na koniec odwirować roztwór o sile 5 000 x g przez 15 minut w celu klarowania.
    UWAGA: Pozostawić roztwór do ostygnięcia w temperaturze pokojowej, podzielić go na porcje i przechowywać w temperaturze -20 °C.

2. Barwienie fluorescencyjne lektynami

  1. Po złożeniu ofiar na myszach przez wdychanie dwutlenku węgla (CO2) wyłuszczenie oczu nożyczkami16. Utrwalić wyłuszczone oczy świeżo przygotowanym 4% PFA przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej (RT).
    UWAGA: Utrwalenie można również przeprowadzić poprzez inkubację oczu w 4% PFA przez noc (ON) w temperaturze 4 °C. Myszy zostały uśmiercone zgodnie z wytycznymi Oświadczenia ARVO dotyczącego wykorzystania zwierząt w badaniach okulistycznych i wzrokowych oraz Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (CICUAL) Wydziału Nauk Chemicznych Narodowego Uniwersytetu w Kordobie (Res. HCD 1216/18).
  2. Pod mikroskopem preparacyjnym usuń rogówki nożyczkami, przecinając wzdłuż rąbka i wypreparuj całe siatkówki. Wyrzuć przedni odcinek oka, a następnie oddziel siatkówkę od naczyniówki RPE.
    UWAGA: Upewnij się, że usunąłeś pozostałe zanieczyszczenia i naczynia hialoidalne z siatkówki za pomocą kleszczy.
  3. Umieść siatkówki w probówkach o pojemności 200 μl. Następnie zablokować i przepuścić siatkówki w 100 μl roztworu soli fizjologicznej buforowanej trisem (TBS) zawierającego 5% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) i 0,1% Triton-X-100 przez 6 godzin w temperaturze 4 °C, delikatnie mieszając w shakerze.
    UWAGA: Ten krok można wykonywać przez 2 godziny w RT.
  4. Następnie odwróć rurkę, aby umieścić siatkówkę w nasadce i usuń roztwór blokujący za pomocą pipety.
  5. Dodać 100 μl roztworu zawierającego 0,01 μg/μl izolektyny GSA-IB4 (GSA-IB4). Owiń probówki folią aluminiową, aby chronić próbki przed światłem. Inkubować siatkówki w włączonym roztworze lektyny w temperaturze 4 °C lub przez 2 godziny w temperaturze pokojowej, delikatnie mieszając w wytrząsarce.
  6. Przemyć siatkówkę 100 μl TBS zawierającego 0,1% Triton-X-100 przez 20 minut, delikatnie mieszając w shakerze. Aby zapewnić prawidłowe mycie, umieść siatkówkę w nasadce rurki, odwracając ją. Ustawić probówkę z powrotem w pozycji stojącej i usunąć pożywkę pozostałą w pojemniku. Powtórz ten krok trzy razy.
  7. Umieść siatkówkę na szkiełku i dodaj kroplę PBS. Pod mikroskopem preparacyjnym wykonaj cztery jednakowo odległe nacięcia od krawędzi siatkówki w kierunku nerwu wzrokowego.
  8. Aby rozłożyć płatki siatkówki, użyj kleszczy lub małych kawałków bibuły filtracyjnej. Upewnij się, że strona fotoreceptora jest skierowana w dół.
  9. Usunąć pozostały PBS ze szkiełka za pomocą bibuły filtracyjnej. Następnie dodaj podłoże montażowe (poli(alkohol winylowy) w glicerolu/Tris) i szkiełko nakrywkowe. Pozostaw do wyschnięcia na 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  10. Szkiełka należy przechowywać w temperaturze 4 °C z dala od światła.
    UWAGA: Siatkówki mogą być również przechowywane w PBS w temperaturze 4 °C do czasu wizualizacji mikroskopii konfokalnej.

3. Wizualizacja mikroskopii konfokalnej i akwizycja mikrofotografii

  1. Przed wizualizacją inkubuj szkiełka przez 10 minut w temperaturze pokojowej pod osłoną światła.
  2. W mikroskopie konfokalnym umieść szkiełko na płytce ekranem do dołu.
  3. Skoncentruj splot górny układu naczyniowego siatkówki i wybierz obszar, aby rozpocząć akwizycję obrazu.
  4. Ustaw ogólne parametry lasera w oprogramowaniu: Długość fali: 488 nm; Intensywność lasera; HV; Przesunięcie; Zysk.
    UWAGA: Intensywność lasera, PMT, przesunięcie i wzmocnienie mogą się różnić w zależności od warunków i użytkowania lampy. Optymalne ustawienia zapewniają wyraźny obraz naczyń krwionośnych, unikając nasycenia czułości lampy fotopowielacza, aby mieć liniową zależność od sygnału fluorescencji.
  5. Ustaw inne parametry akwizycji: Tryb; Rozmiar; Obiektywny, bez zoomu; Nie ma Kalmana; Rozmiar kroku.
    UWAGA: Identyczne warunki akwizycji muszą być stosowane do obrazowania próbek kontrolnych i eksperymentalnych.
  6. Ustaw współrzędne w osiach x i y: Zeskanuj siatkówkę w ostrości 2x. Jeśli obszar pokazuje naczynia, zaznacz go, klikając dwukrotnie obszar, aby oznaczyć go do późniejszego pobrania obrazu.
    UWAGA: Zdecydowanie zaleca się wybór obszaru siatkówki zgodnie ze splotem naczyniowym górnym, ponieważ fluorescencja większych naczyń jest wyższa.
  7. Przesuń siatkę do sąsiedniego kwadratu, ustaw ostrość siatkówki i wybierz obszar, jeśli odpowiada. Powtarzaj ten krok, aż wybrany obszar obejmie całą siatkówkę.
  8. Wybierz jeden obszar i ustaw współrzędne w osi z, aby zdefiniować zakres grubości do skanowania. Aby to zrobić, wizualizuj siatkówkę w ostrości 2x; za pomocą mikrometru przejdź do górnej części siatkówki i kliknij Ustaw w pozycji Start. Następnie przejdź do dolnej części siatkówki i kliknij Ustaw w pozycji końcowej.
  9. Powtórz krok 3.8 w każdym obszarze zaznaczonym w siatce.
    UWAGA: Aby dokładnie sprawdzić zeskanowany obszar, naciśnij Go w pozycji Start. Jeśli naczynia są nadal wizualizowane, dostosuj pozycję, przesuwając mikrometr, a następnie kliknij Ustaw. Powtórz proces w pozycji końcowej.
  10. Zainicjuj skanowanie automatyczne.
  11. Po zakończeniu procesu skanowania otwórz obraz.
  12. Wybierz format Seria, aby nagrać obraz jako mozaikę i zapisać go z preferowanym rozszerzeniem. Na koniec zszyty obraz zostanie wyświetlony na ekranie.

4. Przetwarzanie obrazu

  1. W oprogramowaniu ImageJ FIJI przejdź do paska menu i kliknij Plik > Otwórz. Wybierz obraz do przetworzenia. W oknie Opcje importu formatów biologicznych wybierz opcję Wyświetl metadane OME-XML i kliknij przycisk OK.
    UWAGA: Obrazy o podobnej nazwie powinny być zapisywane w osobnych folderach.
  2. W oknie Metadane OME wyszukaj informacje o rozmiarze piksela o nazwach PhysicalSizeX, PhysicalSizeY i PhysicalSizeZ. Skopiuj te dane.
  3. Aby skalibrować obraz, przejdź do paska menu i wybierz Image > Properties (Właściwości obrazu). Skopiuj informacje z obrazu w kroku 4.2 i kliknij OK. Obraz otwiera się jako okno z kilkoma zdjęciami, z których każde reprezentuje mikrofotografie wykonane w osi z.
  4. Przypisz preferowaną tabelę lut do obrazu, aby przypisać kolor do etykiety fluorescencyjnej. Aby to zrobić, przejdź do paska menu i kliknij ikonę LUT.
  5. Aby zwizualizować wszystkie stosy na jednym obrazie, przejdź do paska menu i wybierz pozycję Obraz > stosy > projekt Z.
  6. W wyświetlonym oknie Projekcja Z zaznacz wszystkie stosy, w których wizualizowane są naczynia. W polu Projection Type (Typ projekcji) wybierz opcję Average Intensity (Średnia intensywność) i kliknij OK.
    UWAGA: Wynik sumy stosów zostanie wyświetlony na nowym obrazie o nazwie AVG (nazwa obrazu).
  7. Dostosuj jasność i kontrast na wynikowym obrazie, aby zmniejszyć tło i podświetlić naczynia. Przejdź do paska menu i kliknij Obraz> Dostosuj> Jasność/Kontrast. W oknach B i C przesuwaj paski, aż do momentu zaobserwowania lepszej intensywności. Kliknij Zastosuj i zapisz zmiany.
  8. Skopiuj parametry wybrane dla opcji Jasność/Kontrast; muszą one być identyczne dla wszystkich obrazów.
  9. Przed kwantyfikacją obrazu należy zdefiniować parametry, które będą mierzone. Na pasku menu przejdź do opcji Analizuj > ustaw pomiary. W opisanych tutaj procedurach konieczne będzie uzyskanie Obszaru i Obwodu (docelowo jest to również potrzebne do pomiaru odległości). Kliknij OK.
  10. Pobierz wtyczkę wymaganą do kwantyfikacji gęstości naczyń17 i postępuj zgodnie z instrukcjami instalacji dostarczonymi przez wtyczkę.
  11. Kontynuuj kwantyfikację określonego parametru naczyniowego.

5. Kwantyfikacja obszarów beznaczyniowych

  1. Na pasku menu wybierz narzędzie Różdżka. Wybierz obszar siatkówki, w którym brakuje naczyń.
    UWAGA: W zależności od tolerancji można wybrać większe lub mniejsze obszary. Aby dostosować tolerancję, kliknij dwukrotnie ikonę narzędzia różdżki. Zastosowany tryb: Dziedzictwo.
  2. Naciśnij literę T na klawiaturze, aby zarejestrować wybrany obszar w Menedżerze ROI. Powtórz kroki 5.1 i 5.2 dla wszystkich jałowych obszarów siatkówki.
  3. Kliknij Zmierz w menedżerze ROI, aby uzyskać informacje o obszarze bezczynności. Program wyświetli nowe okno z wymaganymi informacjami. Skopiuj dane do innego programu lub zapisz plik.
    UWAGA: Na niektórych obrazach można preferować ręczne wybieranie obszarów bezczynności. W takim przypadku wybierz narzędzie Zaznaczanie wielokątów, narysuj krótkie odległości wokół obszaru beznaczyniowego i kliknij obraz, gdy nowa odległość ma się rozpocząć. Zamknij wybrany obszar, klikając pierwszy punkt.
  4. Powtórz kroki 5.1, 5.2 i 5.3, aby zmierzyć całkowitą powierzchnię siatkówki.
  5. Oblicz obszar jałowy siatkówki jako sumę wszystkich zmierzonych obszarów jałowych podzieloną przez całkowitą powierzchnię siatkówki.

6. Kwantyfikacja obszarów neowaskularnych

  1. Na pasku menu wybierz narzędzie Różdżka.
  2. Powiększ obraz, aby lepiej zobrazować neonaczynia. Wybierz nowe naczynia jeden po drugim za pomocą narzędzia różdżki.
    UWAGA: Dostosuj tolerancję nie wyższą niż 20, aby zapewnić wybór pojedynczego naczynia neo. Ten poziom tolerancji musi pozostać niezmienny podczas wszystkich kwantyfikacji obrazu.
  3. Naciśnij literę T na klawiaturze, aby zarejestrować wybrany obszar w Menedżerze ROI. Powtórz kroki 6.1 i 6.2 dla wszystkich neowaskularnych obszarów siatkówki.
  4. Kliknij Zmierz w menedżerze ROI, aby uzyskać dane obszaru. Program wyświetli nowe okno z wymaganymi informacjami. Skopiuj dane do innego programu lub zapisz plik.
  5. Powtórz kroki 6.1, 6.2 i 6.3, aby określić ilościowo całkowitą powierzchnię siatkówki.
  6. Oblicz obszar neowaskularny siatkówki jako sumę wszystkich zmierzonych obszarów naczyń neovessel podzieloną przez całkowitą powierzchnię siatkówki.

7. Kwantyfikacja średnicy naczynia

  1. Na pasku menu wybierz narzędzie Linia prosta
    2. .
  2. Powiększ obraz, aby lepiej zobrazować ścianę naczynia. Wykonaj trzy linie poprzeczne do głównego naczynia przed pierwszym odgałęzieniem. Należy to zrobić, rysując linię od granicy jednej ściany naczynia do przeciwnej.
    UWAGA: Linia musi być idealnie prostopadła do naczynia ściennego, aby uniknąć błędów kwantyfikacji.
  3. Naciśnij literę T na klawiaturze, aby zarejestrować wybrany obszar w Menedżerze ROI. Powtórzyć kroki 7.1 i 7.2 dla wszystkich zbiorników, które muszą zostać oznaczone ilościowo.
  4. Kliknij Zmierz w menedżerze ROI, aby uzyskać dane dotyczące odległości. Program wyświetli nowe okno z wymaganymi informacjami. Skopiuj dane do innego programu lub zapisz plik.

8. Kwantyfikacja krętości statku

  1. Na pasku menu kliknij prawym przyciskiem myszy ikonę narzędzia linii prostej i wybierz opcję Linia segmentowa lub Linia odręczna. Narysuj linię wewnątrz naczynia od nerwu wzrokowego do pierwszego rozgałęzienia naczynia zgodnie z kształtem naczynia.
    UWAGA: Linia musi podążać za kształtem naczyń krwionośnych, aby uniknąć błędów kwantyfikacji.
  2. Naciśnij literę T na klawiaturze, aby zarejestrować wybrany obszar w Menedżerze ROI.
  3. Na pasku menu wybierz narzędzie Linia prosta. Narysuj linię od nerwu wzrokowego do pierwszego rozgałęzienia naczynia.
  4. Naciśnij literę T na klawiaturze, aby zarejestrować wybrany obszar w Menedżerze ROI.
  5. Kliknij Zmierz w Menedżerze ROI, aby uzyskać dane dotyczące odległości. Program wyświetli nowe okno z wymaganymi informacjami. Skopiuj dane do innego programu lub zapisz plik.
  6. Oblicz wskaźnik krętości w następujący sposób: odległość uzyskana za pomocą linii segmentowej podzielona przez odległość uzyskaną za pomocą linii prostej.

9. Kwantyfikacja rozgałęzień naczyniowych

  1. Za pomocą narzędzia Owal na pasku menu zdefiniuj obszar stosowany jednakowo do wszystkich warunków eksperymentalnych. Wybrany obszar musi być koncentrycznym okręgiem narysowanym wokół nerwu wzrokowego.
  2. Naciśnij literę T na klawiaturze, aby zarejestrować wybrany obszar w Menedżerze ROI.
    UWAGA: W takim przypadku zaleca się zapisanie zwrotu z inwestycji, ponieważ kwantyfikacja jest powolna i identyczny zwrot z inwestycji musi być używany na wszystkich obrazach. Aby to zrobić, w Menedżerze ROI kliknij WIĘCEJ > Zapisz.
  3. Ręcznie policz liczbę głównych gałęzi wyrastających z głównych statków znajdujących się w obszarze wyboru.
  4. Powtórz kroki 9.2 i 9.3 w sąsiednich obszarach, zachowując kryteria obwodu nerwu wzrokowego.

10. Kwantyfikacja gęstości naczyń krwionośnych

  1. Przekształć obraz do trybu 8-bitowego.
  2. Przejdź do Wtyczki na pasku menu, wybierz Analiza naczyń > Gęstość naczyniowa.
  3. Za pomocą narzędzia Kwadrat na pasku menu zdefiniuj obszar, w którym należy zmierzyć gęstość naczynia. Kliknij OK.
  4. Program wyświetli nowe okno z wymaganymi informacjami. Skopiuj dane do innego programu lub zapisz plik.
  5. Powtórz kroki 10.2, 10.3 i 10.4 w sąsiednich obszarach, utrzymując zwrot z inwestycji, ale umieszczając go dziewięć razy obejmując obwód i środek całej siatkówki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jak opisano w sekcji protokołu, z pojedynczego testu barwienia fluorescencyjnego można uzyskać morfologię naczyń krwionośnych i ocenić ilościowo kilka interesujących parametrów. Poszukiwanie konkretnej zmiany będzie zależało od rodzaju badanej retinopatii. W tym artykule oceniano obszary jałowe i neowaskularne, krętość i poszerzenie w mysim modelu retinopatii proliferacyjnej, podczas gdy rozgałęzienia i gęstość naczyń przeanalizowano w mysim modelu MetS, który indukuje retinopatię nieproliferacyjną.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zwierzęce modele retinopatii są potężnymi narzędziami do badania rozwoju naczyń krwionośnych, przebudowy lub patologicznej angiogenezy. Sukces tych badań w terenie zależy od łatwego dostępu do tkanki, który pozwala na wykonywanie szerokiej gamy technik, dostarczając danych od myszy in vivo i pośmiertnych 26,27. Co więcej, stwierdzono dużą korelację między badaniami in vivo a analizą kliniczną, co zapewnia solidną identyfikowalność i wia...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują, że badanie zostało przeprowadzone przy braku jakichkolwiek powiązań handlowych lub finansowych, które mogłyby być interpretowane jako potencjalny konflikt interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Carlosowi Masowi, Maríi Pilar Crespo i Cecilii Sampedro z CEMINCO (Centro de Micro y Nanoscopía Córdoba, CONICET-UNC, Córdoba, Argentyna) za pomoc w mikroskopii konfokalnej, Soledad Miró i Victorii Blanco za troskę o zwierzęta oraz Laurze Gatica za pomoc histologiczną. Dziękujemy również Victorowi Diazowi (Pro-Sekretarzowi ds. Komunikacji Instytucjonalnej FCQ) za produkcję i edycję filmu oraz Paulowi Hobsonowi za jego krytyczną lekturę i korektę językową manuskryptu.

Ten artykuł został sfinansowany z grantów Secretaría de Ciencia y Tecnología, Universidad Nacional de Córdoba (SECyT-UNC) Consolidar 2018-2021, Fondo para la Investigación Científica y Tecnológica (FONCyT), Proyecto de Investigación en Ciencia y Tecnología (PICT) 2015 N° 1314 (wszystkie dla M.C.S.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Folia
Albumina surowicy bydlęcej MerckA4503jakość
Dwuwodny chlorek wapniaMerckC3306
Kwas solnyBiopack9632.08
Mikroskop konfokalny FV1200OlympusFV1200z płytką z napędem silnikowym
PokrowcePaul Marienfeld GmnH & Współ.111520
Mikroskop preparacyjnyNIKONSMZ645
Dihydrat fosforanu disodu i wodoruMerck119753
200 µ L  rurkaMerckZ316121
Bibuła filtracyjnaMerckWHA5201090
Wytrząsarka do inkubatora GyroMiniLabNet InternationalS0500
Izolektyna GS-IB4 Z Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 488 SprzężonyInvitrogenI21411
Poli(alkohol winylowy) (Mowiol 4-88)Merck475904
Miernik pH158127Merck
SANXINPHS-3D-03
Chlorek potasuMerckP9541
Diwodorofosforan potasuMerck1,04,873
SlajdyFisher Scientific12-550-15
Chlorek soduMerckS3014
Sód wodorotlenekMerckS5881
TrisMerckGE17-1321-01
Triton X-100MerckX100-1GA
Analiza statków Fidżi oprogramowanieMai Elfarnawanyhttps://imagej.net/Vessel_Analysis
aluminiowaParaformaldehydu

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kur, J., Newman, E. A., Chan-Ling, T. Cellular and physiological mechanisms underlying blood flow regulation in the retina and choroid in health and disease. Progress in Retinal and Eye Research. 31 (5), 377-406 (2012).
  2. McDougal, D. H., Gamlin, P. D. Autonomic control of the eye. Comprehensive Physiology. 5 (1), 439-473 (2015).
  3. Selvam, S., Kumar, T., Fruttiger, M. Retinal vasculature development in health and disease. Progress in Retinal and Eye Research. 63, 1-19 (2018).
  4. Wei, Y., et al. Age-related alterations in the retinal microvasculature, microcirculation, and microstructure. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (9), 3804-3817 (2017).
  5. Lavia, C., et al. Reduced vessel density in the superficial and deep plexuses in diabetic retinopathy is associated with structural changes in corresponding retinal layers. PLoS One. 14 (7), 0219164(2019).
  6. Rosenblatt, T. R., et al. Key factors in a rigorous longitudinal image-based assessment of retinopathy of prematurity. Scientific Reports. 11 (1), 5369(2021).
  7. Edwards, A. L. Funduscopic examination of patients with diabetes who are admitted to hospital. Canadian Medical Association Journal. 134 (11), 1263-1265 (1986).
  8. Lechner, J., O'Leary, O. E., Stitt, A. W. The pathology associated with diabetic retinopathy. Vision Research. 139, 7-14 (2017).
  9. Sun, Z., et al. angiography metrics predict progression of diabetic retinopathy and development of diabetic macular edema: A prospective study. Ophthalmology. 126 (12), 1675-1684 (2019).
  10. Jia, Y., et al. Quantitative optical coherence tomography angiography of vascular abnormalities in the living human eye. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (18), 2395-2402 (2015).
  11. Pauleikhoff, D., Gunnemann, F., Book, M., Rothaus, K. Progression of vascular changes in macular telangiectasia type 2: comparison between SD-OCT and OCT angiography. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 257 (7), 1381-1392 (2019).
  12. Gammons, M. V., Bates, D. O. Models of oxygen induced retinopathy in rodents. Methods in Molecular Biology. 1430, 317-332 (2016).
  13. Grossniklaus, H. E., Kang, S. J., Berglin, L. Animal models of choroidal and retinal neovascularization. Progress in Retinal and Eye Research. 29 (6), 500-519 (2010).
  14. Han, N., Xu, H., Yu, N., Wu, Y., Yu, L. MiR-203a-3p inhibits retinal angiogenesis and alleviates proliferative diabetic retinopathy in oxygen-induced retinopathy (OIR) rat model via targeting VEGFA and HIF-1α. Clinical and Experimental Pharmacology & Physiology. 47 (1), 85-94 (2020).
  15. Paz, M. C., et al. Metabolic syndrome triggered by fructose diet impairs neuronal function and vascular integrity in ApoE-KO mouse retinas: Implications of autophagy deficient activation. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 573987(2020).
  16. Connor, K. M., et al. Quantification of oxygen-induced retinopathy in the mouse: a model of vessel loss, vessel regrowth and pathological angiogenesis. Nature Protocols. 4 (11), 1565-1573 (2009).
  17. Zarb, Y., et al. Ossified blood vessels in primary familial brain calcification elicit a neurotoxic astrocyte response. Brain. 142 (4), 885-902 (2019).
  18. Smith, L. E., et al. Oxygen-induced retinopathy in the mouse. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 35 (1), 101-111 (1994).
  19. Subirada, P. V., et al. Effect of autophagy modulators on vascular, glial, and neuronal alterations in the oxygen-induced retinopathy mouse model. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 279(2019).
  20. Lutty, G. A., McLeod, D. S. Development of the hyaloid, choroidal and retinal vasculatures in the fetal human eye. Progress in Retinal and Eye Research. 62, 58-76 (2018).
  21. Kim, C. B., D'Amore, P. A., Connor, K. M. Revisiting the mouse model of oxygen-induced retinopathy. Eye and Brain. 8, 67-79 (2016).
  22. Guaiquil, V. H., et al. A murine model for retinopathy of prematurity identifies endothelial cell proliferation as a potential mechanism for plus disease. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (8), 5294-5302 (2013).
  23. Mezu-Ndubuisi, O. J. In vivo angiography quantifies oxygen-induced retinopathy vascular recovery. Optometry and Vision Science: Official Publication of the American Academy of Optometry. 93 (10), 1268-1279 (2016).
  24. Scott, A., Powner, M. B., Fruttiger, M. Quantification of vascular tortuosity as an early outcome measure in oxygen induced retinopathy (OIR). Experimental Eye Research. 120, 55-60 (2014).
  25. Kim, A. Y., et al. Quantifying microvascular density and morphology in diabetic retinopathy using spectral-domain optical coherence tomography angiography. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (9), 362(2016).
  26. Liu, C. H., Wang, Z., Sun, Y., Chen, J. Animal models of ocular angiogenesis: from development to pathologies. FASEB Journal. 31 (11), 4665-4681 (2017).
  27. Grossniklaus, H. E., Kang, S. J., Berglin, L. Animal models of choroidal and retinal neovascularization. Progress in Retinal and Eye Research. 29 (6), 500-519 (2010).
  28. Kern, T. S., Antonetti, D. A., Smith, L. E. H. Pathophysiology of diabetic retinopathy: Contribution and limitations of laboratory research. Ophthalmic Research. 62 (4), 196-202 (2019).
  29. Lorenc, V. E., et al. IGF-1R regulates the extracellular level of active MMP-2, pathological neovascularization, and functionality in retinas of OIR mouse model. Molecular Neurobiology. 55 (2), 1123-1135 (2018).
  30. Ma, N., Streilein, J. W. Contribution of microglia as passenger leukocytes to the fate of intraocular neuronal retinal grafts. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 39 (12), 2384-2393 (1998).
  31. Mazzaferri, J., Larrivée, B., Cakir, B., Sapieha, P., Costantino, S. A machine learning approach for automated assessment of retinal vasculature in the oxygen induced retinopathy model. Scientific Reports. 8 (1), 3916(2018).
  32. Milde, F., Lauw, S., Koumoutsakos, P., Iruela-Arispe, M. L. The mouse retina in 3D: quantification of vascular growth and remodeling. Integrative Biology: Quantitative Biosciences from Nano to Macro (Camb). 5 (12), 1426-1438 (2013).
  33. Yang, T., et al. Pericytes of indirect contact coculture decrease integrity of inner blood-retina barrier model in vitro by upgrading MMP-2/9 activity. Disease Markers. 2021, 7124835(2021).
  34. Huang, Q., Wang, S., Sorenson, C. M., Sheibani, N. PEDF-deficient mice exhibit an enhanced rate of retinal vascular expansion and are more sensitive to hyperoxia-mediated vessel obliteration. Experimental Eye Research. 87 (3), 226-241 (2008).
  35. Jiang, H., Zhang, H., Jiang, X., Wu, S. Overexpression of D-amino acid oxidase prevents retinal neurovascular pathologies in diabetic rats. Diabetologia. 64 (3), 693-706 (2021).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Ilo ciowa ocena naczy siatk wkipreparat ca ej siatk wkiretinopatia indukowana tlenemretinopatia nieproliferacyjnaretinopatia proliferacyjnag sto naczyrednica naczyrozga zianie naczybarwienie izolektynanaliza ImageJ Fiji

Powiązane artykuły