Przedstawiamy metodę izolowania komórek i jąder śródbłonka od światła tętnic szyjnych myszy wystawionych na stabilne lub zaburzone warunki przepływu w celu przeprowadzenia eksperymentów omicznych na pojedynczych komórkach.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Izolacja komórek śródbłonka ze światła tętnic szyjnych myszy do eksperymentów multiomicznych na pojedynczych komórkach
* These authors contributed equally
W tym artykule
Informacja o sprostowaniu
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
Podsumowanie
Streszczenie
Miażdżyca jest chorobą zapalną obszarów tętniczych narażonych na zaburzony przepływ krwi (d-flow). D-flow reguluje ekspresję genów w śródbłonku na poziomie transkryptomicznym i epigenomicznym, powodując odpowiedzi proaterogenne. Niedawno przeprowadzono badania sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki (scRNAseq) i testu jednokomórkowego sekwencjonowania chromatyny dostępnej dla transpozazy (scATACseq) w celu określenia zmian transkryptomicznych i dostępności chromatyny w rozdzielczości pojedynczej komórki przy użyciu mysiego modelu częściowej ligacji tętnicy szyjnej (PCL). Ponieważ komórki śródbłonka (EC) stanowią niewielki ułamek wszystkich populacji komórek w ścianie tętnicy, zastosowano metodę trawienia świetlnego w celu uzyskania preparatów jednokomórkowych wzbogaconych w EC. W tym badaniu myszy poddano operacji PCL w celu wywołania przepływu d w lewej tętnicy szyjnej (LCA) przy użyciu prawej tętnicy szyjnej (RCA) jako kontroli. Tętnice szyjne zostały wycięte dwa dni lub dwa tygodnie po operacji PCL. Światło każdej tętnicy szyjnej poddano trawieniu kolagenazą i uzyskano wzbogacone śródbłonkiem pojedyncze komórki lub pojedyncze jądra. Te preparaty jednokomórkowe i jednojądrowe zostały następnie oznaczone kodami kreskowymi przy użyciu zestawu mikroprzepływowego 10x Genomics. Oznaczone kodami kreskowymi pojedyncze komórki i pojedyncze jądra zostały następnie wykorzystane do przygotowania RNA, generowania biblioteki i sekwencjonowania na wysokoprzepustowym sekwenatorze DNA. Po przetworzeniu bioinformatycznym zestawy danych scRNAseq i scATACseq zidentyfikowały różne typy komórek z trawienia świetlnego, składające się głównie z EC. Obecne były również komórki mięśni gładkich, fibroblasty i komórki odpornościowe. Ta metoda wzbogacania EC pomogła w zrozumieniu wpływu przepływu krwi na śródbłonek, co mogło być trudne w przypadku metody całkowitego trawienia tętnic. Metoda przygotowania pojedynczych komórek wzbogacona we włókna elektromagnetyczne może być stosowana do przeprowadzania badań omicznych nad pojedynczymi komórkami u myszy z nokautem EC i myszy transgenicznych, u których nie badano wpływu przepływu krwi na te geny. Co ważne, technikę tę można zaadaptować do izolowania pojedynczych komórek wzbogaconych w EC z eksplantatów tętnic ludzkich w celu przeprowadzenia podobnych badań mechanistycznych.
Wprowadzenie
To laboratorium wcześniej wykazało, że indukcja przepływu d prowadzi do szybkiego i trudnego rozwoju miażdżycy u myszy z hiperlipidemią1,2. Nowatorski mysi model miażdżycy wywołanej przepływem d był możliwy przy użyciu operacji częściowego podwiązania tętnicy szyjnej (PCL) 3. Operacja PCL wywołuje stan niskiego i oscylacyjnego przepływu krwi lub przepływ d w podwiązanej lewej tętnicy szyjnej (LCA). W przeciwieństwie do tego, przeciwległa prawa tętnica szyjna (RCA) nadal boryka się ze stabilnym przepływem laminarnym (s-flow). Wcześniej, aby zrozumieć wpływ przepływu d na komórki śródbłonka, tętnice szyjne zostały wypreparowane po operacji częściowego podwiązania i przepłukane środkiem lizującym na bazie izotiocyjanianu fenolu i guanidyny (metoda płukania luminalnego RNA / DNA)2,4, które dostarczyły wzbogacone w śródbłonek "pule" RNA lub DNA. Te połączone masowe RNA lub DNA zostały następnie przetworzone odpowiednio do badań transkryptomicznych lub badań epigenomicznych metylomów DNA4,5,6. Badania te pomogły odkryć wiele wrażliwych na przepływ genów i mikroRNA, których rola w biologii śródbłonka i miażdżycy była szeroko badana4,6,7.
Jednakże, pomimo wzbogacenia śródbłonka, te masowe badania RNA/DNA nie były w stanie rozróżnić specyficznej roli każdego typu komórek w ścianie tętnicy w miażdżycy wywołanej przepływem d. Aby przezwyciężyć to ograniczenie, przeprowadzono badania izolacji pojedynczej komórki (sc) wzbogaconej śródbłonkiem oraz sekwencjonowania scRNA i scATAC w celu przezwyciężenia tego ograniczenia8. W tym celu myszy C57Bl6 poddano operacji PCL w celu wywołania przepływu d w LCA, przy użyciu RCA narażonego na przepływ s jako kontroli. Dwa dni lub dwa tygodnie po operacji PCL myszy zostały złożone w ofierze, a tętnice szyjne zostały wypreparowane i oczyszczone. Światło zarówno LCA, jak i RCA podano do infuzji kolagenazy, a kolagenazę luminalną trawiono zawierającą EC jako znaczącą frakcję i inne komórki tętnicze. Zawiesinę pojedynczej komórki (scRNAseq) lub zawiesinę pojedynczego jądra (scATACseq) przygotowano i oznaczono kodami kreskowymi z unikalnymi identyfikatorami dla każdej komórki lub jądra przy użyciu konfiguracji 10x Genomics. RNA poddano przygotowaniu biblioteki cDNA i zsekwencjonowaniu.
Zestawy danych scRNAseq i scATACseq zostały przetworzone za pomocą oprogramowania Cell Ranger Single-Cell Software i następnie przeanalizowane przez pakiety Seurat i Signac R9,10. Każdej komórce i jądru przypisano typ komórki na podstawie tych analiz i zgrupowano w typ komórki w oparciu o geny markerowe i unikalne wzorce ekspresji genów. Wyniki badań scRNAseq i scATACseq wykazały, że te preparaty jednokomórkowe są wzbogacone w EC, a także zawierają komórki mięśni gładkich (SMC), fibroblasty i komórki odpornościowe.
Dalsza analiza wykazała, że populacja EC w trawieniu luminalnym jest bardzo rozbieżna i plastyczna (8 różnych klastrów EC) oraz reagująca na przepływ krwi. Co najważniejsze, wyniki te wykazały, że przepływ d przeprogramowuje EC z fenotypu przeciwzapalnego chronionego przed miażdżycą na fenotypy proaterogenne, w tym prozapalne, przejście śródbłonka do mezenchymalnej, przejście śródbłonka macierzystego / komórki progenitorowej i, co najbardziej zaskakujące, przejście podobne do komórki śródbłonkowej do immunologicznej. Ponadto dane scATACseq ujawniają nowe, zależne od przepływu zmiany dostępności chromatyny i miejsca wiązania czynników transkrypcyjnych w całym genomie, które stanowią podstawę kilku nowych hipotez. Metodologia i protokół przygotowania pojedynczych komórek śródbłonka do jednokomórkowych badań multiomicznych z tętnic szyjnych myszy są szczegółowo opisane poniżej.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie procedury opisane poniżej zostały zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt na Uniwersytecie Emory. Myszy C57BL / 6 bez hipercholesterolemii, dopasowane pod względem wieku i płci wykorzystano w celu złagodzenia zmienności zależnej od płci i zrównoważenia wszelkich powikłań stanów hipercholesterolemii.
1. Operacja częściowego podwiązania tętnicy szyjnej (PCL)
UWAGA: Częściowe podwiązanie LCA tętnicy szyjnej zostało przeprowadzone zgodnie z wcześniejszym opisem i demonstracją3.
- Znieczulij mysz przez inhalację izofluranu (5% izofluoranu w tlenie do indukcji i 1,5% następnie do podtrzymania) przez cały zabieg za pomocą parownika znieczulającego. Umieść mysz na wznak na podkładce izotermicznej Deltaphase, aby zapobiec utracie ciepła ciała podczas operacji.
- Zastosuj maść do oczu, aby zapobiec ekspozycji zapalenia rogówki i potwierdź głębokość znieczulenia przez brak reakcji na uszczypnięcie palca u nogi.
- Buprenorfinę należy wstrzykiwać podskórnie w dawce 0,05 mg/kg mc. w celu prewencyjnego opanowania bólu. Zdezynfekuj depilowany obszar, nakładając i czyszcząc trzykrotnie roztworem betadyny i izopropanolu. Upewnij się, że betadyna jest ostatnim krokiem do sterylizacji obszaru operacyjnego, zaczynając od środka, a kończąc po bokach.
- Stosując techniki aseptyczne, wykonaj brzuszne nacięcie linii środkowej (~1 cm) w okolicy szyi i odsłoń punkt rozgałęzienia LCA przez rozwarstwienie.
- Podwiązać lewą tętnicę szyjną wewnętrzną, tętnicę szyjną zewnętrzną i tętnicę potyliczną szwem jedwabnym 6-0; pozostawić tętnicę tarczycy górną nietkniętą.
- Przybliżyć skórę i zamknąć nacięcie za pomocą kleju tkankowego i/lub szwów.
- Przenieś mysz do wstępnie ogrzanej klatki regeneracyjnej (utrzymywanej w temperaturze 37 °C) i umieść ją na czystym ręczniku na maksymalnie 1 godzinę, aby uniknąć hipotermii pooperacyjnej.
UWAGA: Z naszego doświadczenia wynika, że prewencyjna pojedyncza dawka buprenorfiny (0,05 mg/kg) jest zwykle wystarczająca do leczenia bólu pooperacyjnego. Powtórzoną dawkę buprenorfiny można podać, jeśli zwierzę jest w niebezpieczeństwie po pierwszych 24 godzinach. Jeśli zostanie wykonana prawidłowo, nie ma śmiertelności związanej z tą procedurą, a stres pooperacyjny myszy jest minimalny. Myszy są wracane do odpowiednich klatek i monitorowane codziennie po operacji. - Przygotuj konfigurację do perfuzji.
- Użyj 0,9% NaCl (sól fizjologiczna) zawierającą 10 U/ml heparyny w worku dożylnym. Zaczep worek dożylny 244-274 cm (8-9 stóp) od ziemi lub około 122-152 cm (4-5 stóp) wyżej niż deska do sekcji. Przymocuj igłę motylkową do końca linii soli fizjologicznej i wypłucz wszelkie pęcherzyki powietrza z przewodu dożylnego.
2. Izolacja tętnic szyjnych po złożeniu ofiary
- Złożyć ofiary myszy przez wdychanie CO2 zgodnie z instytucjonalnym protokołem IACUC.
- Rozpyl 70% etanolu na skórę myszy i umieść go w pozycji leżącej na plecach na desce rozbiorowej zawierającej adsorpcyjne ręczniki papierowe. Przymocuj łapki myszy do ręczników adsorpcyjnych na desce rozbiorowej za pomocą taśmy klejącej lub igły 21 G.
- Za pomocą sterylnych nożyczek usuń skórę myszy, zaczynając od brzucha i kończąc na górnej części klatki piersiowej.
- Użyj nożyczek, aby otworzyć ścianę brzucha poniżej klatki piersiowej przez rozwarstwienie.
- Za pomocą nożyczek ostrożnie wykonaj nacięcie wzdłuż przepony i kontynuuj przez żebra po obu stronach klatki piersiowej, aż mostek będzie można podnieść. Delikatnie unieś mostek za pomocą kleszczy; Następnie usuń klatkę piersiową, aby odsłonić serce.
- Ostrożnie usuń grasicę i tkankę łączną nad sercem, aby uwidocznić główne naczynia.
- Przeciąć żyłę główną nożyczkami, aby krew mogła wydostać się z zamkniętego krążenia.
- Włóż igłę motylkową 21 G podłączoną do linii dożylnej przez wierzchołek serca do lewej komory i pozwól na wsteczną perfuzję przez 2-3 minuty z normalną solą fizjologiczną w temperaturze pokojowej. Upewnij się, że utrzymywane jest stałe natężenie przepływu normalnej soli fizjologicznej, trzymając worek z solą fizjologiczną na wysokości 8-9 stóp nad ziemią.
UWAGA: Płuca i wątroba stają się blade, co wskazuje na optymalne ukrwienie. Na każdą mysz stosuje się około 20 ml buforu perfuzyjnego. - Usuń skórę z okolicy szyi i usuń cały tłuszcz, mięśnie i tkankę łączną, aby odsłonić tętnice szyjne (Rysunek 1A).
UWAGA: Pozostała część zabiegu odbywa się pod mikroskopem preparacyjnym. - Dostosuj pole widzenia, aby zlokalizować miejsca podwiązania. Za pomocą nożyczek do mikrodysekcji 10 mm wykonaj małe nacięcie poniżej miejsca podwiązania w LCA, aby umożliwić perfuzję.
- Ponownie wykonać fuzję przez dodatkową 1 minutę przez lewą komorę i upewnić się, że LCA jest dobrze ukrwiona i wolna od wszelkich widocznych śladów krwi.
- Użyj kleszczyków z cienką końcówką i małych nożyczek sprężynowych, aby ostrożnie usunąć tkanki okołoprzybyszowe otaczające tętnicę szyjną, podczas gdy tętnica szyjna jest przyczepiona do ciała.
UWAGA: Zachowaj szczególną ostrożność, aby nie ściskać ani nie rozciągać tętnic szyjnych podczas tego etapu czyszczenia, ponieważ może to zwiększyć liczbę komórek niezdolnych do życia. Jeśli zostanie wykonane prawidłowo, żywotność komórek w końcowej zawiesinie komórek wynosi zwykle >93%.
3. Izolacja pojedynczej komórki wzbogaconej o komórki śródbłonka z tętnic szyjnych myszy
UWAGA: Odczynniki opisane poniżej mogą być przygotowane wcześniej i przechowywane w temperaturze 4 °C do momentu użycia: 1x i 0,1x do lizy pojedynczych jąder z odczynnikami wymienionymi w Tabeli 1; bufor do płukania pojedynczych jąder z odczynnikami wymienionymi w Tabeli 1; receptura pojedynczego jądra Nuclei Nuclei Buffer z odczynnikami wymienionymi w Tabeli 1. Zapasy obrotowe tych należy przygotować zgodnie z protokołem producenta. Skład buforu wytrawiającego: Kolagenaza typu II 600 U/ml i DNaza I 60 U/ml w 0,5% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) zawierającej sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS).
- Podczas gdy tętnice szyjne są nadal przyczepione, przemyj zewnętrzną część tętnic szyjnych zwykłym roztworem soli fizjologicznej, aby wypłukać wszelkie ślady krwi.
- Za pomocą strzykawki insulinowej wyposażonej w igłę o sile 29 G wstrzyknąć ~ 50 μl buforu wytrawiającego do światła dystalnego końca lewej tętnicy szyjnej. Gdy bufor trawienny zacznie wypełniać tętnicę szyjną, zaciśnij bliższy koniec tętnicy szyjnej za pomocą mikroklipsa (Rysunek 1B). Wprowadzić dodatkowe 15-20 μl buforu wytrawiającego do światła i przyciąć dystalny koniec, aby uniknąć uwolnienia buforu wytrawiającego.
- Ostrożnie usuń tętnice szyjne myszy (Rysunek 1B,C) i umieść je w 35-milimetrowych naczyniach zawierających ciepły (w temperaturze 37 °C) buforowany przez Hepes roztwór soli fizjologicznej.
UWAGA: Upewnij się, że oba zaciski są bezpiecznie umieszczone. Jeśli zacisk się poluzuje, roztwór trawiący może wycieknąć ze światła i wpłynąć na uzyskaną liczbę komórek. Jeśli tak się stanie, dodaj dodatkowy roztwór enzymatyczny za pomocą strzykawki insulinowej wyposażonej w igłę 29 G od otwartego końca tętnicy szyjnej i ponownie zabezpiecz zacisk (Rysunek 1D). Jeśli roztwór buforowy enzymu ponownie wycieknie, jest prawdopodobne, że tętnica szyjna zostanie przecięta podczas procesu eksplantacji. W takim przypadku należy wyrzucić tętnicę szyjną i wykluczyć próbkę z badania. Powtarzające się nieostrożne obchodzenie się z tętnicą szyjną zmniejszy żywotność komórek i jakość preparatu jednokomórkowego. Zadbaj o zidentyfikowanie i prawidłowe oznaczenie lewej i prawej tętnicy szyjnej. - Inkubować rozsadzone tętnice szyjne przez 45 minut w temperaturze 37 °C z przerywanym kołysaniem.
4. Przepłukiwanie tętnic szyjnych
- Po zakończeniu trawienia enzymatycznego należy usunąć tętnicę szyjną wraz z zaciskami z naczynia 35 mm. Ostrożnie zdejmij każdy zacisk, uważając, aby bufor mineralizacyjny nie przeciekał.
- Delikatnie przytrzymaj jeden koniec tętnicy szyjnej cienkimi kleszczami na górze probówki do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml. Drugą ręką wprowadzić igłę o sile 29 g wyposażoną w strzykawkę insulinową zawierającą 100 μl ciepłego buforu do wytrawiania (37 °C) do światła (Rycina 1D).
- Szybko przepłucz światło tętnicy szyjnej do probówki mikrowirówkowej. Zablokuj reakcję enzymatyczną, dodając 0,3 ml FBS do probówki o pojemności 1,5 ml. Umieść probówkę na lodzie.
UWAGA: Płukanie zawiera komórki z trawienia enzymatycznego światła. Dodanie FBS i obniżenie temperatury zatrzymuje proces trawienia enzymatycznego. Jeśli liczba komórek w preparacie jest duża i zawiera zanieczyszczenia lub tkankę tłuszczową, zdecydowanie zaleca się użycie sitka do komórek o wielkości 50 lub 70 μm w celu odfiltrowania niechcianych resztek tkanek. Aby zwiększyć liczbę pojedynczych komórek, zaleca się płukanie wielu tętnic szyjnych. Tutaj, aby uzyskać co najmniej 5000 komórek, 10-12 tętnic szyjnych przepłukano i połączono jako jedną próbkę. - Odwirować komórki o masie 500 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C za pomocą wirówki wyposażonej w wirnik o stałym kącie nachylenia (patrz tabela materiałów).
- Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w buforze do wytrawiania zawierającym odczynnik do dysocjacji komórek (patrz tabela materiałów) na 5 minut w temperaturze 37 °C w celu rozdzielenia wszystkich komórek na pojedyncze komórki.
UWAGA: Jeśli liczba komórek w preparacie jest mała, zwiększ prędkość wirówki do 2,000-3,000 × g, aby odwirować komórki. Co więcej, użycie probówek wirówkowych o pojemności 0,5 ml ułatwia lepszą wizualizację osadu komórkowego na dnie probówki. - Zablokuj reakcję enzymatyczną, dodając 0,15 ml FBS do probówki o pojemności 0,5 ml.
- Odwirować zawiesinę jednokomórkową o masie 500 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C za pomocą wirówki wyposażonej w wirnik o stałym kącie nachylenia, jak w kroku 4.4.
- Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 100 μl lodowatego 1% roztworu albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w PBS w probówce do mikrowirówek o pojemności 0,2 ml.
UWAGA: Użycie probówek wirówkowych o pojemności 0,2 ml poprawia wizualizację jednokomórkowego osadu na dnie probówki.
5. Analizy pojedynczych komórek i pojedynczych jąder
- Ponownie zawiesić i przesłać preparat jednokomórkowy do scRNAseq.
- Zawiesić jednokomórkowy osad ze 100 μl lodowatego 1% BSA w PBS w probówce o pojemności 0,2 ml.
- Po ponownym zawieszeniu komórek do enkapsulacji pojedynczej komórki, należy natychmiast przystąpić do enkapsulacji pojedynczej komórki i kodowania kreskowego przy użyciu systemu partycjonowania i kodowania kreskowego pojedynczych komórek opartego na mikrofluidyce (patrz tabela materiałów).
- Przed przekazaniem próbek do rdzenia genomicznego należy policzyć i sprawdzić preparaty jednokomórkowe; upewnić się, że nie ma w nich agregatów komórkowych.
UWAGA: Agregację pojedynczych komórek można dodatkowo zminimalizować, zwiększając ilość BSA do 2%.
- Ponownie zawieś i prześlij przygotowanie pojedynczej komórki do scATACseq.
- Zawiesić osad komórkowy w 100 μl 0,04% BSA w lodowatym 1x PBS i odwirować zawiesinę jednokomórkową w temperaturze 500 × g w temperaturze 4 °C.
- Zawiesinę jednokomórkową poddać lizie lodowato zimnemu 0,1-krotnemu buforowi do lizy (Tabela 1) i inkubować przez 5 minut na lodzie.
- Wymieszaj lizat 10 razy za pomocą pipety P-20 i inkubuj przez dodatkowe 10 minut.
- Dodać 500 μl schłodzonego buforu do przemywania (Tabela 1) do zlizowanych komórek i wymieszać 5 razy za pomocą pipety.
UWAGA: Użyj sitka do komórek o wielkości 70 μm, aby odfiltrować wszelkie zanieczyszczenia z zawiesiny komórek i przenieś je do probówki o pojemności 2 ml. - Odwirować lizat o stężeniu 500 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić jądra-osad w rozcieńczonym buforze jąder (150 μl) (patrz tabela materiałów i tabela 1). Policz i sprawdź preparaty jednojądrowe za pomocą hemocytometru11.
- Prześlij próbkę pojedynczego jądra do Genomics Core w celu transpozycji pojedynczych jąder, partycjonowania jąder, przygotowania biblioteki i sekwencjonowania.
UWAGA: Jeśli początkowa liczba komórek jest niska, często obserwuje się szczątki wzdłuż jąder. Dlatego zaleca się rozpoczęcie od dużej liczby komórek.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
U 44 myszy przeprowadzono operacje częściowego podwiązania tętnicy szyjnej, a wystąpienie d-flow w LCA potwierdzono, wykonując ultrasonografię jeden dzień po operacji częściowego podwiązania. Pomyślna operacja częściowego podwiązania powoduje zmniejszenie prędkości przepływu krwi i odwrócenie kierunku przepływu (przepływ zaburzony) w LCA3. Tętnice szyjne wypreparowano albo dwa dni, albo dwa tygodnie po podwiązaniu. Światło każdej tętnicy szyjnej poddano trawieniu kolagenazą, a następnie p...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W artykule przedstawiono szczegółowy protokół izolowania preparatów jednokomórkowych z tętnic szyjnych myszy. Wpływ przepływu d na komórki śródbłonka można dokładnie zbadać, jeśli operacja PCL zostanie wykonana prawidłowo. Kluczowe znaczenie ma prawidłowa identyfikacja gałęzi tętnicy szyjnej wspólnej, takich jak tętnica szyjna zewnętrzna, tętnica szyjna wewnętrzna, tętnica potyliczna i tętnica tarczycy górna. Walidacja wzorców przepływu za pomocą ultrasonografii dodatkowo potwierdza pomyślne wystąpienie warunków...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
HJ jest założycielem firmy FloKines Pharma. Pozostali autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez fundusze z grantów National Institutes of Health HL119798, HL095070 i HL139757 dla HJ. HJ jest również wspierany przez Wallace H. Coulter Distinguished Faculty Chair Professorship. Usługi świadczone przez Emory Integrated Genomics Core (EIGC) były subsydiowane przez Emory University School of Medicine, a także były częściowo wspierane przez Georgia Clinical and Translational Science Alliance of the National Institutes of Health w ramach nagrody nr. UL1TR002378. Wyłączną odpowiedzialność za powyższą treść ponoszą jej autorzy i nie odzwierciedlają one oficjalnych poglądów National Institutes of Health.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Chemikalia, peptydy i białka rekombinowane | |||
| 1x PBS (klasa hodowli komórkowych) | Corning | 21040CMX12 | |
| 1,5 ml białka Mikroprobówki wirówkowe LoBind | Eppendorf | 022-43-108-1 | |
| 15 ml - stojak piankowy, sterylne | probówki | FL4022 | |
| 50 ml SuperClear | Labcon | 3191-335-028 | |
| 6-0 Jedwabny szew sterylny | Covidien | s-1172 c2 | |
| 70 µ m Sitko do komórek, białe, sterylne, pakowane pojedynczo | Thermo Fisher Scientic | 08-771-2 | |
| Roztwór Accutase, sterylnie filtrowany | bufor Sigma-Aldrich | A6964-100ML | lub równoważny |
| ATAC (składnik I mieszanki transpozycyjnej) | 10x Genomics | 2000122 | |
| ATAC Enzyme (składnik II mieszanki transpozycyjnej) | 10x Genomics | 2000123/ 2000138 | |
| Surowica bydlęca Albumina | Sigma-Aldrich | A7906-500G | |
| Buprenorfina | Med-Vet International | RXBUPRENOR5-V | |
| Kontroler chromu i Następny Zestaw akcesoriów GEM | 10X Genomics | 1000204 | |
| Chromium Następne zestawy odczynników GEM Single Cell 3' v3.1 | 10X Genomics | 1000121 | |
| Chromium Next GEM Zestawy odczynników jednokomórkowych ATAC v1.1 | 10X Genomics | 1000175 | |
| Kolagenaza II | MP Biomedicals | 2100502.5 | |
| Digitonina | Sigma-Aldrich | D141-100MG | |
| Kleszcze preparacyjne | Roboz Surgical Instruments Co | RS-5005 | |
| Dnase1 | New England Biolabs Inc | M0303S | |
| (model stołowy # 5425) | Eppendorf | 22620444230VR | |
| Surowica bydlęca płodu - Premium Select | R& D systems | S11550 | |
| Rotor o stałym kącie | nachylenia Eppendorf | FA-45-24-11-Kit Rotor | |
| HEPES buforowana sól fizjologiczna | Millipore Sigma | 51558 | |
| Strzykawka insulinowa (strzykawka 3/10 ml 29 G) | BD | 305932 | |
| Isoflurane | Patterson vet | 789 313 89 | |
| MAC Inteligentne sitka (30 i mikro; m) | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
| Inteligentne filtry siatkowe MACS (100 &mikro; m) | Miltenyi Biotec | 130-098-463 | |
| Sól fizjologiczna (0,9% chlorku sodu) | Baxter International Inc | 2B1323 | |
| Bufor jąder (20x) | 10x Genomics | PN 2000153/2000207 | |
| PBS (10x), pH 7,4 | Thermo Fisher Scientic | 70011-044 | |
| Małe nożyczki | Roboz Surgical Instruments Co | RS-5675 | |
| Mikroklips ze stali nierdzewnej do nakładania kleszczy z zamkiem | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5480 | lub podobny |
| Tissue II | Webster Veteinanry | 07-856-7946 | |
| Typ II Kolagenaza | MP biomedyczne | 2100502.1 | |
| Zdeponowane dane | |||
| scATACseq Pliki FastQ | NCBI | www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject Accession # PRJNA646233 | |
| scRNAseq Pliki | FastQAkcesja www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject NCBI | # PRJNA646233 | |
| Software and Algorithms | |||
| Cell Ranger 3.1.0 | 10X Genomics | https://support.10xgenomics.com/ single-cell-gene-exp | |
| Cicero | Pliner et al., 2018 | https://cole-trapnell-lab.github.io/cicero-release/ | |
| Ggplot2 v3.2.1 | Hadley Wickham | https://cran.r-project.org | |
| Harmony | Korsunsky i wsp., 2019 | https://github.com/immunogenomics/harmony | |
| ImageJ | Schneider i wsp., 2012 | https://imagej.nih.gov | |
| Monocle 2.8.0 | Qiu i wsp., 2017 | https://github.com/cole-trapnell-lab/ monokl | |
| R wersja 3.6.2 | R Foundation | ||
| Seurat 3.1.3 | Stuart i wsp., 2019 | https://github.com/satijalab/seurat | |
| Signac 0.2.5 | Stuart i wsp., 2019 | https://github.com/timoast/signac |
Bibliografia
- Kumar, S., Kang, D. W., Rezvan, A., Jo, H. Accelerated atherosclerosis development in C57Bl6 mice by overexpressing AAV-mediated PCSK9 and partial carotid ligation. Laboratory Investigation. 97 (8), 935-945 (2017).
- Nam, D., et al. Partial carotid ligation is a model of acutely induced disturbed flow, leading to rapid endothelial dysfunction and atherosclerosis. American Journal of Physiology Heart and Circulation Physiology. 297 (4), 1535-1543 (2009).
- Nam, D., et al. A model of disturbed flow-induced atherosclerosis in mouse carotid artery by partial ligation and a simple method of RNA isolation from carotid endothelium. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (40), e1861(2010).
- Dunn, J., et al. Flow-dependent epigenetic DNA methylation regulates endothelial gene expression and atherosclerosis. Journal of Clinical Investigation. 124 (7), 3187-3199 (2014).
- Kumar, S., Kim, C. W., Son, D. J., Ni, C. W., Jo, H. Flow-dependent regulation of genome-wide mRNA and microRNA expression in endothelial cells in vivo. Scientific Data. 1 (1), 140039(2014).
- Ni, C. W., et al. Discovery of novel mechanosensitive genes in vivo using mouse carotid artery endothelium exposed to disturbed flow. Blood. 116 (15), 66-73 (2010).
- Son, D. J., et al. The atypical mechanosensitive microRNA-712 derived from pre-ribosomal RNA induces endothelial inflammation and atherosclerosis. Nature Communications. 4, 3000(2013).
- Andueza, A., et al. Endothelial reprogramming by disturbed flow revealed by single-cell RNA and chromatin accessibility study. Cell Reports. 33 (11), 108491(2020).
- Stuart, T., Srivastava, A., Lareau, C., Satija, R. Multimodal single-cell chromatin analysis with Signac. bioRxiv. , (2020).
- Stuart, T., et al. Comprehensive integration of single-cell data. Cell. 177 (7), 1888-1902 (2019).
- Crowley, L. C., Marfell, B. J., Christensen, M. E., Waterhouse, N. J. Measuring cell death by trypan blue uptake and light microscopy. Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (7), (2016).
- Li, F., et al. Single-cell RNA-seq reveals cellular heterogeneity of mouse carotid artery under disturbed flow. Cell Death and Discovery. 7 (1), 180(2021).
- Wu, Y. E., Pan, L., Zuo, Y., Li, X., Hong, W. Detecting activated cell populations using single-cell RNA-seq. Neuron. 96 (2), 313-329 (2017).
- O'Flanagan, C. H., et al. Dissociation of solid tumor tissues with cold active protease for single-cell RNA-seq minimizes conserved collagenase-associated stress responses. Genome Biology. 20 (1), 210(2019).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
Sprostowanie
Formal Correction: Erratum: Isolation of Endothelial Cells from the Lumen of Mouse Carotid Arteries for Single-cell Multi-omics Experiments
Posted by JoVE Editors on 6/22/2022. Citeable Link.
An erratum was issued for: Isolation of Endothelial Cells from the Lumen of Mouse Carotid Arteries for Single-cell Multi-omics Experiments. The Authors section was updated.
The Authors section was updated from:
Sandeep Kumar*1
Aitor Andueza*1
Juyoung Kim1
Dong-Won Kang1
Hanjoong Jo1,2
1Wallace H. Coulter Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology and Emory University, 2Division of Cardiology, Georgia Institute of Technology and Emory University
* These authors contributed equally
to:
Sandeep Kumar*1
Aitor Andueza*1
Nicolas Villa-Roel1
Juyoung Kim1
Dong-Won Kang1
Hanjoong Jo1,2
1Wallace H. Coulter Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology and Emory University, 2Division of Cardiology, Georgia Institute of Technology and Emory University
* These authors contributed equally
