Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Iniekcja komórek zrębu tkanki tłuszczowej pochodzącej z tkanki tłuszczowej świń za pomocą technologii strumienia wody

1.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63132

⸱

23 listopada 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Urology, University Hospital Tübingen, 2Department of Orthopaedic Surgery, University Hospital Tübingen, 3ERBE Elektromedizin GmbH Tübingen

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Prezentujemy metodę wstrzykiwania komórek za pomocą technologii strumienia wody bez użycia igieł w połączeniu z kontynuacją badań po porodzie pod kątem żywotności komórek, proliferacji i pomiarów elastyczności.

Streszczenie

Nietrzymanie moczu (UI) jest bardzo rozpowszechnionym schorzeniem charakteryzującym się niedoborem mięśnia zwieracza cewki moczowej. Gałęzie medycyny regeneracyjnej, w szczególności terapia komórkowa, to nowatorskie podejścia do poprawy i przywrócenia funkcji zwieracza cewki moczowej. Mimo że wstrzykiwanie aktywnych komórek funkcjonalnych jest rutynowo wykonywane w warunkach klinicznych za pomocą igły i strzykawki, metody te mają istotne wady i ograniczenia. W tym kontekście technologia bezigłowego strumienia wody (WJ) jest wykonalną i innowacyjną metodą, która może wstrzykiwać żywe komórki za pomocą cystoskopii pod kontrolą wzroku do zwieracza cewki moczowej. W niniejszym badaniu wykorzystaliśmy WJ do dostarczenia komórek zrębowych pochodzących z tkanki tłuszczowej świń (pADSC) do tkanki cewki moczowej zwłok, a następnie zbadaliśmy wpływ dostarczania WJ na wydajność i żywotność komórek. Oceniliśmy również cechy biomechaniczne (tj. elastyczność) za pomocą pomiarów mikroskopii sił atomowych (AFM). Wykazaliśmy, że pADSC dostarczane przez WJ miały znacznie obniżoną elastyczność komórkową. Rentowność była znacznie niższa w porównaniu z grupą kontrolną, ale nadal wynosi ponad 80%.

Wprowadzenie

Nietrzymanie moczu (UI) jest powszechnym zaburzeniem, którego częstość występowania wynosi 1,8 - 30,5% w populacjach europejskich1 i charakteryzuje się przede wszystkim nieprawidłowym funkcjonowaniem zwieracza cewki moczowej. Z klinicznego punktu widzenia leczenie chirurgiczne jest często oferowane pacjentom, gdy terapie zachowawcze lub fizjoterapia nie rozwiązują i nie łagodzą pojawiających się objawów.

Terapia komórkowa w celu potencjalnej regeneracyjnej naprawy nieprawidłowego działania kompleksu zwieraczy staje się awangardowym podejściem do leczenia patologii UI2,3. Jego głównym celem jest wymiana, naprawa i przywrócenie biologicznej funkcjonalności uszkodzonej tkanki. W modelach zwierzęcych dla UI przeszczep komórek macierzystych wykazał obiecujące wyniki w zakresie wyników urodynamicznych2,4,5. Komórki macierzyste są optymalnymi kandydatami komórkowymi, ponieważ mają zdolność do samoodnawiania się i różnicowania multipotencjalnego, wspomagając w ten sposób regenerację dotkniętych chorobą tkanek6. Pomimo nadchodzącego potencjału regeneracyjnego, praktyczne zastosowanie terapii komórkowej pozostaje utrudnione, ponieważ minimalnie inwazyjne dostarczanie komórek nadal napotyka szereg wyzwań związanych z precyzją iniekcji i pokryciem celu. Mimo że obecnie stosowanym podejściem do dostarczania komórek jest wstrzykiwanie za pomocą systemu igły-strzykawki7, zwykle powoduje to ogólny deficyt żywotnych komórek, z deklarowaną żywotnością na poziomie zaledwie 1%-31% po przeszczepie8. Ponadto wykazano również, że dostarczanie komórek za pomocą iniekcji igłowej wpływa na umiejscowienie, szybkość retencji, a także dystrybucję przeszczepionych komórek do docelowej tkanki9,10,11. Wykonalnym, nowatorskim podejściem, które pozwala przezwyciężyć wyżej wymienione ograniczenie, jest bezigłowe dostarczanie komórek za pomocą technologii strumienia wody.

Technologia strumienia wody (WJ) jawi się jako nowe podejście, które umożliwia wysokowydajne dostarczanie komórek przez cystoskop pod kontrolą wizualną w zwieracz cewki moczowej12,13. WJ umożliwia dostarczanie ogniw przy różnych ciśnieniach (E = efekty w barach) w zakresie od E5 do E8013. W pierwszej fazie (faza penetracji tkanki) roztwór izotoniczny jest nakładany pod wysokim ciśnieniem (tj. E60 lub E80) w celu rozluźnienia macierzy zewnątrzkomórkowej otaczającej tkankę docelową i otwarcia małych łączących się mikroluk. W drugiej fazie (faza iniekcji) ciśnienie jest obniżane w ciągu milisekund (tj. do E10) w celu delikatnego dostarczenia komórek do docelowej tkanki. Po tej dwuetapowej aplikacji komórki nie są poddawane dodatkowemu naciskowi na tkankę podczas wyrzucania, ale unoszą się w strumieniu o niskim ciśnieniu do wypełnionego cieczą obszaru jamistego13. W modelu ex vivo, w którym komórki macierzyste zostały wstrzyknięte za pośrednictwem WJ do tkanki cewki moczowej zwłok, żywe komórki mogły być następnie aspirowane i pobierane z tkanki oraz dalej namnażane in vitro13. Chociaż badanie przeprowadzone w 2020 r. przez Webera i wsp. wykazało wykonalność i możliwość zastosowania WJ do dostarczania kardiomiocytów wolnych od śladów stóp do mięśnia sercowego14, należy pamiętać, że technologia WJ jest nadal w fazie prototypu.

Poniższy protokół opisuje, jak przygotować i oznaczyć komórki zrębu pochodzące z tkanki tłuszczowej świni (pADSC) oraz jak dostarczyć je do płynu wychwytującego i tkanki zwłok za pomocą technologii WJ i igieł do cystoskopii Williamsa (WN). Po wstrzyknięciu komórkowym ocenia się żywotność i elastyczność komórki za pomocą mikroskopii sił atomowych (AFM). Dzięki instrukcjom krok po kroku protokół zapewnia jasne i zwięzłe podejście do pozyskiwania wiarygodnych danych. W części poświęconej dyskusji przedstawiono i opisano główne zalety, ograniczenia i perspektywy na przyszłość tej techniki. Opisywane tutaj analizy potranslacyjne WJ, a także analizy potranslacyjne w następstwie zastępują standardowe wstrzykiwanie igłą i zapewniają solidne ramy dostarczania komórek do regeneracyjnego gojenia tkanki docelowej. W naszych ostatnich badaniach dostarczyliśmy dowodów na to, że WJ dostarczał komórki bardziej precyzyjnie i co najmniej z porównywalną żywotnością w porównaniu do iniekcji igłowych15,16.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Próbki tkanki tłuszczowej świń zostały pobrane z Instytutu Chirurgii Eksperymentalnej Uniwersytetu w Tybindze. Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez lokalne organy ds. dobrostanu zwierząt pod numerem doświadczenia na zwierzętach CU1/16.

1. Izolacja komórek zrębowych pochodzących z tkanki tłuszczowej świni

  1. Do laboratorium należy użyć świńskiej tkanki tłuszczowej dostarczonej z Instytutu Chirurgii Doświadczalnej w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml.
  2. Przenieść tkankę na sterylną szalkę Petriego pod sterylną ławą i zmielić ją dwoma skalpelami (nr 10) na małe fragmenty i papkę.
    UWAGA: Nożyczki mogą być również używane w celu uzyskania małych fragmentów. Im mniejsze są fragmenty, tym lepiej dla następnego trawienia.
    1. Przenieść małe fragmenty/papkę do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml i inkubować ją z 5 ml roztworu homogenizatora przez 30 minut w temperaturze 37 °C na wytrząsarce. Roztworem homogenizatora jest PBS z 1% albuminą surowicy bydlęcej (BSA) (roztwór podstawowy: 1% (w/v) BSA w PBS) i 0,1% kolagenazy typu I.
      UWAGA: Zawsze przygotowuj roztwór homogenizatora na świeżo. Wytrząsarka wykonuje okrężny ruch wytrząsający przy niskiej prędkości 25-500 obr./min.
  3. Aby zatrzymać inkubację, dodać 10 ml pożywki wzrostowej [Dulbecco's Modified Eagle's Medium - niski poziom glukozy (DMEM-LG), 2,5% roztwór soli sodowej HEPES (1 M), 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 1% L-glutaminy (200 mM), 1% penicyliny-streptomycyny (10000 U/ml penicyliny; 10 000 μg/ml streptomycyny) i 1% amfoterycyny B (250 μg/ml)].
    UWAGA: Pożywkę wzrostową można przygotować wcześniej. Antybiotyki i leki przeciwgrzybicze są niezbędne w przygotowaniu pożywki wzrostowej do hodowli komórkowej w celu ochrony komórek przed zanieczyszczeniami.
  4. Inkubować probówki wirówkowe przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  5. Odessać frakcję z adipocytami, która jest lżejsza i dlatego pływa na wierzchu cieczy, za pomocą pipety o pojemności 10 ml i wyrzucić.
  6. Przefiltrować pozostałą frakcję zrębu przez sito komórkowe o wielkości 100 μm z membraną z politereftalanu etylenu (PET) wolną od metali ciężkich, aby zatrzymać fragmenty tkanki tłuszczowej i pobrać tylko zawiesinę komórkową.
  7. Odwirować przefiltrowaną zawiesinę komórkową przez 7 minut przy 630 x g w temperaturze pokojowej.
  8. Ponownie zawiesić osad komórkowy w 2 ml PBS, aby raz umyć komórki.
  9. Ponownie odwirować zawiesinę komórkową przez 7 minut przy 630 x g w temperaturze pokojowej.
  10. Po odwirowaniu i wielokrotnym ponownym zawieszeniu osadu komórkowego w 10 ml pożywki wzrostowej na kolbę, komórki nasienne w kolbach do hodowli komórkowych o długości 75 cm 2.
    UWAGA: W zależności od wielkości osadu komórkowego po etapie mycia PBS, komórki nasienne w jednej do czterech kolb.

2. Hodowla komórek zrębu pochodzących z tkanki tłuszczowej świni

  1. Zbieraj i pasuj komórki, gdy osiągną 70% konfluencji.
  2. Umyj komórki dwukrotnie 10 ml PBS i całkowicie odessaj PBS.
    UWAGA: Ten krok jest konieczny, aby usunąć pozostałą pożywkę wzrostową, którą uzupełnia 10% FBS. FBS zawiera kilka inhibitorów proteazy, które mogą utrudniać działanie następującej po niej trypsynizacji.
  3. Dodaj 3 ml 0,05% -trypsyny-EDTA na kolbę, aby odłączyć komórki.
  4. Inkubować kolby przez 3 minuty w temperaturze 37 °C.
  5. Sprawdź pod mikroskopem, czy komórki są odłączone.
    UWAGA: Czasami odłączenie komórek zajmuje trochę więcej czasu. W takim przypadku należy inkubować kolby maksymalnie 5 minut w temperaturze 37 °C.
  6. Aby zatrzymać proces inkubacji i odłączania, dodaj 3 ml pożywki wzrostowej.
    UWAGA: Jak wspomniano powyżej, pożywka wzrostowa jest uzupełniona 10% FBS, który zawiera inhibitory proteazy.
  7. Przenieść oderwane komórki do probówki wirówkowej i wirować przez 7 minut przy 630 x g w temperaturze pokojowej.
  8. Ponownie zawiesić komórki w 10 ml pożywki wzrostowej i policzyć je za pomocą hemocytometru.
  9. Komórki nasienne o gęstości inokulacji 3 x 10 5 komórek na 75 cm2 kolba.

3. Znakowanie komórek za pomocą calceiny-AM

UWAGA: Komórki, które są wstrzykiwane do tkanek zwłok, są barwione barwnikiem żywych komórek przepuszczającym zieloną fluorescencyjną błonę oraz wskaźnikiem żywotności nieprzepuszczalnej dla błony czerwono-fluorescencyjnej, aby sprawdzić, czy pobrane komórki są takie same jak wstrzyknięte komórki, a nie fragmenty tkanki cewki moczowej.

  1. Umyj komórki dwukrotnie 10 ml PBS.
  2. Dodać 5 ml roztworu barwnika na 75cm2 kolbę. Roztwór barwnika składa się z pożywki wzrostowej zawierającej 2 μM barwnika żywej krwi przepuszczającego błonę fluorescencyjną na zielono i 4 μM wskaźnika żywotności nieprzepuszczalnego dla membrany czerwonej fluorescencji.
  3. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
  4. Odessać i wyrzucić roztwór barwnika.
  5. Ponownie przemyć komórki dwukrotnie 10 ml PBS.
  6. Dodaj pożywkę wzrostową i udokumentuj zielony i czerwony sygnał fluorescencji za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.
    1. Umieść kolbę o średnicy 75 cm2 na stole mikroskopu, użyj obiektywu 10x, wybierz brak filtra fluorescencyjnego i upewnij się, że ścieżka światła przechodzącego jest aktywna.
      UWAGA: Wszystkie te czynności są wykonywane ręcznie na mikroskopie.
    2. Równolegle z krokiem 3.6.1 otwórz oprogramowanie.
    3. Naciśnij przycisk Live (Na żywo) na karcie Locate (Zlokalizuj), aby uzyskać obraz na żywo komórek w kolbie na stole i skupić się na nich za pomocą napędów do regulacji zgrubnej i precyzyjnej.
      UWAGA: Po prawej stronie pojawi się obraz na żywo po aktywacji przycisku Na żywo.
    4. W podzakładce Komponenty mikroskopu wybierz właściwy obiektyw (10x).
    5. Na karcie podrzędnej Aparat zastosuj znacznik wyboru dla opcji Automatyczna ekspozycja.
    6. Naciśnij przycisk Snap, aby zrobić pierwsze zdjęcie w świetle przechodzącym.
    7. Wstaw podziałkę liniową, korzystając z karty Grafika na pasku menu i wybierając pozycję Podziałka liniowa.
    8. Zapisz obraz, korzystając z karty Pliki na pasku menu i wybierając opcję Zapisz jako czi.
    9. W przypadku zdjęć fluorescencyjnych zmień filtr na filtr właściwy dla fluorescencji zielonej lub czerwonej i wybierz ścieżkę światła odbitego.
      UWAGA: Zmiany te należy wykonać ręcznie w mikroskopie.
    10. Naciśnij ponownie przycisk Na żywo pod zakładką Zlokalizuj, aby uzyskać obraz komórek na żywo.
    11. Naciśnij przycisk Snap, aby zrobić drugie zdjęcie z zieloną lub czerwoną fluorescencją.
    12. Wstaw podziałkę liniową, korzystając z karty Grafika na pasku menu i wybierając pozycję Podziałka liniowa.
    13. Zapisz obraz, korzystając z karty Pliki na pasku menu i wybierając opcję Zapisz jako czi.
    14. Powtórzyć kroki od 3.6.9 do 3.6.13 dla drugiego kanału fluorescencji.

4. Przygotuj próbki tkanki cewki moczowej do wstrzyknięć

  1. Wyciąć cewkę moczową i pęcherz łączący ze świni.
    UWAGA: Do eksperymentów wykorzystano próbki tkanki cewki moczowej ze świeżych próbek zwłok dorosłych samic świń rasy landrace.
  2. Przetransportuj go do laboratorium w workach na mokrym lodzie.
    UWAGA: Próbki należy pozostawić na lodzie do czasu dalszej obróbki. Do próbek nie dodano żadnych dodatków.
  3. Umieść cewkę moczową z pęcherzem moczowym na gąbce, która naśladuje elastyczność dolnego dna miednicy.
    1. Użyj pęcherza, aby określić orientację (proksymalna, dystalna, grzbietowa i brzuszna) cewki moczowej. Jest to możliwe dzięki lokalizacji moczowodów i trzech więzadeł, które mocują pęcherz moczowy w jamie brzusznej i miednicy. Trzy więzadła to dwa więzadła boczne pęcherzyków po bokach pęcherza moczowego i pęcherzyk przyśrodkowy, który powstaje z brzusznej powierzchni pęcherza moczowego (Ryc. 1).
  4. Rozciąć cewkę moczową wzdłużnie po stronie grzbietowej za pomocą cewnika.
  5. Wstrzyknąć komórki do otwartej cewki moczowej zgodnie z opisem w następnych rozdziałach.

5. Iniekcje komórek za pomocą igły Williamsa do płynów i próbek tkanek

  1. Zbierz komórki zgodnie z opisem w kroku 2.
  2. W przeciwieństwie do kroku 2.9, dostosuj gęstość komórek do wstrzykiwań do 2,4 x 106 komórek na ml.
    UWAGA: W przypadku wstrzyknięć do próbek tkanek należy oznaczyć komórki żywą komórką przepuszczalną przez błonę fluorescencyjną na zielono.
  3. Odessać zawiesinę komórkową za pomocą strzykawki i przyłożyć do niej cystoskopową igłę do wstrzykiwań Williamsa (WN).
  4. Albo trzymać igłę krótko powyżej 2 ml pożywki wzrostowej w probówce wirówkowej o pojemności 15 ml, albo wprowadzić igłę do otwartej tkanki cewki moczowej. W obu przypadkach należy ręcznie wstrzyknąć 250 μl komórek.
    UWAGA: Komórki wstrzyknięte do cewki moczowej zwłok tworzą kopułę iniekcyjną.
  5. Zebrać komórki wstrzyknięte do pożywki bezpośrednio przez odwirowanie przez 7 minut przy 630 x g w temperaturze pokojowej.
  6. W przypadku komórek wstrzykiwanych do cewki moczowej zwłok należy je odessać z kopuły iniekcyjnej za pomocą igły 18G umieszczonej na strzykawce.
  7. Przenieść wstrzyknięte i zassane komórki do probówki wirówkowej i wirować przez 7 minut przy 630 x g w temperaturze pokojowej porównywalnej do komórek wstrzykniętych do pożywki.
  8. Po odwirowaniu ponownie zawieś komórki w 4 ml pożywki wzrostowej w obu przypadkach.
  9. Określ wydajność i żywotność komórek za pomocą wykluczenia barwnika błękitu trypanowego za pomocą hemocytometru.
    1. Dokładnie wymieszać 20 μl zawiesiny komórkowej z 20 μl błękitu trypanowego.
    2. Napełnij 10 μl tej mieszaniny w każdej komorze hemocytometru.
      UWAGA: Obie komory są napełniane i zliczane w celu uzyskania optymalizacji statystycznej poprzez podwojenie próbkowania.
    3. Pod mikroskopem policz komórki we wszystkich czterech kwadratach narożnych.
      UWAGA: Policz komórki świecące na biało (niebarwione) jako komórki żywotne, podczas gdy komórki świecące na niebiesko (barwione) są liczone jako komórki martwe.
    4. Aby obliczyć liczbę komórek na ml, oblicz średnią z dwóch komór, podziel tę liczbę przez dwa i pomnóż ją przez 104.

6. Iniekcje komórek strumieniem wody do płynów i próbek tkanek

  1. Zbierz komórki zgodnie z opisem w kroku 2.
  2. W przeciwieństwie do kroków 2.9 i 5.2, należy dostosować gęstość komórek do wstrzykiwań do 6 x 106 komórek na ml.
    UWAGA: Do wstrzykiwań do próbek tkanek należy używać komórek oznaczonych żywą komórką przepuszczalną przez błonę fluorescencyjną na zielono.
  3. Wlej zawiesinę komórek do jednostki dozującej urządzenia WJ.
  4. Trzymać dyszę iniekcyjną krótko nad 2 ml pożywki wzrostowej w probówce wirówkowej o pojemności 15 ml lub krótko nad otwartą tkanką cewki moczowej.
  5. W obu przypadkach należy wstrzyknąć 100 μl komórek za pomocą urządzenia, używając wysokiego ciśnienia do penetracji tkanki, a następnie fazy niskiego ciśnienia do wstrzykiwania komórek. Użyj ustawień ciśnienia E60-10.
    UWAGA: Komórki wstrzyknięte do cewki moczowej zwłok tworzą kopułę iniekcyjną.
  6. Zebrać komórki wstrzyknięte do pożywki bezpośrednio przez odwirowanie przez 7 minut przy 630 x g w temperaturze pokojowej.
  7. W przypadku komórek wstrzykiwanych do cewki moczowej zwłok należy je odessać z kopuły iniekcyjnej za pomocą igły 18G umieszczonej na strzykawce.
  8. Przenieść wstrzyknięte i zassane komórki do probówki wirówkowej i wirować przez 7 minut przy 630 x g w temperaturze pokojowej porównywalnej do komórek wstrzykniętych do pożywki.
  9. Po odwirowaniu ponownie zawieś komórki w 4 ml pożywki wzrostowej w obu przypadkach.
  10. Oznaczyć wydajność i żywotność komórek za pomocą wykluczenia barwnika błękitu trypanowego za pomocą hemocytometru, jak opisano szczegółowo w ppkt 5.10.

7. Biomechaniczna ocena elastyczności komórkowej za pomocą mikroskopii sił atomowych (AFM)

  1. Przygotowanie próbek
    UWAGA: Komórki pobrane po wstrzyknięciu są teraz poddawane dalszym analizom przez AFM. Dodatkowo komórki, które nie zostały wstrzyknięte, są używane jako kontrole.
    1. Komórki nasienne w szalkach do hodowli tkankowych o gęstości 5 x 10 5 komórek na szalkę.
      UWAGA: Wysiewaj jedną miskę do hodowli tkankowej na warunek. Warunki są następujące: kontrole, ADSC wstrzykiwane przez WJ lub WN do pożywki i ADSC wstrzykiwane przez WJ lub WN do tkanki zwłok.
    2. Inkubować komórki w szalkach do hodowli tkankowych przez 3 godziny w temperaturze 37 °C.
      UWAGA: Aby uniknąć odchyleń spowodowanych komórkami w fazie G1 i podczas mitozy, przeprowadziliśmy pomiary AFM 3 godziny po etapie wysiewu komórek.
    3. Tuż przed pomiarem za pomocą AFM zastąp pożywkę wzrostową 3 ml pożywki L-15 Leibovitz bez L-glutaminy.
    4. Umieścić naczynie do hodowli tkankowych w uchwycie na próbkę urządzenia AFM i włączyć podgrzewacz do szalek Petriego ustawiony na 37 °C.
  2. Przygotowanie AFM i kalibracji wspornika
    1. Użyj pusta szklanego, który jest przeznaczony do pomiarów w cieczach i wyreguluj go na uchwycie AFM.
      UWAGA: Górna powierzchnia pustaka szklanego musi być prosta i równoległa do uchwytu AFM.
    2. Ostrożnie umieść wspornik na powierzchni pustaka szklanego. Końcówka A musi leżeć nad wypolerowaną płaszczyzną optyczną.
      UWAGA: Nie rysuj polerowanej powierzchni optycznej pustaka szklanego, ponieważ zarysowania mogą prowadzić do zakłóceń w pomiarach. Końcówka A musi wystawać ponad wypolerowaną płaszczyznę optyczną, ponieważ w przeciwnym razie odbicie lasera AFM od fotodetektora nie jest możliwe.
    3. Aby ustabilizować wspornik na pustaku szklanym, dodaj metalową sprężynę za pomocą pęsety.
    4. Gdy wspornik jest zamocowany na pustaku szklanym, umieść blok na głowicy AFM i zablokuj zintegrowany mechanizm blokujący.
    5. Zamontuj głowicę AFM na urządzeniu AFM.
      UWAGA: Aby sprężyna była prawidłowo umieszczona, musi być skierowana w lewą stronę. Jeśli tak nie jest, skoryguj położenie pustaka szklanego i ponownie wyreguluj głowicę AFM.
    6. Zainicjuj konfigurację oprogramowania i otwórz oprogramowanie wraz z oknem wyrównania laserowego i ustawieniami parametrów podejścia. Dodatkowo włącz silnik krokowy, światło lasera i kamerę CCD.
    7. Zidentyfikuj końcówkę wspornika A za pomocą kamery CCD.
    8. Opuść wspornik, aż zostanie całkowicie zanurzony w podłożu. Użyj funkcji silnika krokowego, aby osiągnąć ten cel.
    9. Gdy wspornik zostanie całkowicie pokryty medium, laser jest wyrównywany na górze wspornika za pomocą regulacyjnych. Odbita wiązka musi padać na środek fotodetektora, a suma sygnałów musi wynosić 1 V lub więcej. Ugięcia boczne i pionowe powinny być bliskie 0,
      UWAGA: Jeśli środek zostanie osiągnięty, można monitorować w funkcji wyrównania lasera, a także wartości sygnału. Jeśli wartości sygnału nie są prawidłowe, konieczne są dalsze regulacje.
    10. Uruchom teraz skaner Approach z parametrami podejścia (Tabela 1).
    11. Cofnij wspornik o 100 μm, gdy dotrze do dna, naciskając przycisk Wycofanie.
      UWAGA: Upewnij się, że żadna komórka nie jest podłączona w tym polu, w którym wykonywane jest podejście, ponieważ spowodowałoby to fałszowanie kalibracji.
    12. Ustaw parametry biegu zgodnie z następującymi specyfikacjami: Nastawa 1 V, Długość ciągnięcia 90 μm, Prędkość: 5 μm/s, Częstotliwość próbkowania: 2000 Hz i jako tryb opóźnienia: Stała siła.
    13. Rozpocznij pomiar krzywej siła-odległość kalibracji, naciskając przycisk Run.
      UWAGA: Klikając przycisk Uruchom w oprogramowaniu, uzyskuje się krzywą siła-odległość.
    14. Wybierz obszar dopasowania liniowego cofniętej krzywej w oprogramowaniu na uzyskanej krzywej siła-odległość kalibracji. Oblicz pomiar stałej sprężystości za pomocą oprogramowania.
    15. Skalibruj wspornik zgodnie z dokładnymi parametrami i krokami opisanymi przez Danalache et al.17.
  3. Pomiar elastyczności poszczególnych komórek
    1. Wizualnie zidentyfikuj komórkę i skup się na niej. Umieść mysz komputerową na środku komórki. Aby poprawić precyzję pomiarów, umieść końcówkę AFM bezpośrednio nad jądrem komórkowym.
      UWAGA: Mysz komputerowa służy jako znacznik wizualny do identyfikacji docelowego miejsca wcięcia.
    2. Teraz skup się na wsporniku i przesuń go na myszy komputerowej.
    3. Rozpocznij pomiar od Run z parametrami podanymi w tabeli 2.
      UWAGA: Używany jest parametr wartości zadanej uzyskany przez kalibrację wspornika. Ponadto jedna komórka jest mierzona trzy razy. Zmierz co najmniej 50 komórek.
  4. przetwarzanie danych
    1. Przetwarzaj dane, wykonując dokładne kroki i parametry, zgodnie z wcześniejszym opisem Danalache17.
    2. Zapisz i wyeksportuj plik.

8. Analiza statystyczna

  1. Otwórz oprogramowanie statystyczne.
  2. Wybierz wybór Nowy zestaw danych.
    UWAGA: Otwierane są dwa pliki. Jeden to "DataSet", a drugi to plik "Output".
  3. Wybierz plik DataSet i otwórz kartę Widok zmiennych.
  4. Wstaw zmienne numeryczne dla miejsca wstrzyknięcia (wychwytywanie płynu lub tkanki zwłok), kategorii (kontrola, wstrzyknięcie WJ, wstrzyknięcie WN) i elastyczności.
  5. Wstaw zmierzone dane sprężystości wraz z odpowiadającym im numerem wstrzyknięcia w miejscu i numerem kategorii na karcie Widok danych.
  6. Analizuj dane, wybierając kartę paska menu Analizuj | Statystyka opisowa i wybierz opcję Eksploracyjna analiza danych.
  7. Jako zmienną zależną wybierz pozycję Elastyczność i lista czynników wybierz pozycję Kategoria.
    UWAGA: Wyniki są wyświetlane w pliku "Wyjście" wraz z wykresem pudełkowym, który jest używany w sekcji wyników.
  8. Aby wykonać test statystyczny, wybierz Niezależne próbki w ramach testu nieparametrycznego w zakładce Analizuj na pasku menu.
  9. W nowo otwartym pliku zachowaj ustawienia w zakładce Cel i Ustawienia.
  10. Otwórz zakładkę Pola i wybierz Elastyczność jako Pola testowe i Kategoria jako Grupy.
  11. Naciśnij przycisk Uruchom.
    UWAGA: Wyniki są wyświetlane w pliku "Wyjście". Do tych analiz wykonywany jest test Manna-U-Whitneya.
  12. Uwzględnij wynik testu nieparametrycznego na wykresie pudełkowym eksploracyjnej analizy danych.
  13. Zapisz pliki, wybierając pozycję Plik na pasku menu, a następnie wybierając pozycję Zapisz.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Po dostarczeniu komórek za pomocą obu metod stwierdzono, że żywotność komórek dostarczonych poprzez WN (97,2 ± 2%, n=10, p<0,002) była wyższa w porównaniu do iniekcji przez WJ przy użyciu ustawień E60-10 (85,9 ± 0,16%, n=12) (Rycina 2). Wyniki oceny biomechanicznej wykazały, że: w przypadku iniekcji komórek WN w płynie przechwytującym nie stwierdzono istotnej różnicy w zakresie modułów sprężystości (EM; 0,992 kPa) w porównaniu do kontroli (1,176 kPa; Rycina 3A

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W niniejszym badaniu zademonstrowaliśmy i przedstawiliśmy podejście krok po kroku do procedury dostarczania komórek WJ i zastosowaliśmy następstwa badań ilościowych w celu oceny wpływu dostarczania WJ na cechy komórkowe: żywotność komórkową i cechy biomechaniczne (tj. EM). Po wstrzyknięciu WJ 85,9% pobranych komórek było zdolnych do życia. Jeśli chodzi o wstrzyknięcie WN, 97,2% komórek zachowało swoją żywotność po wstrzyknięciu. W ten sposób podejście WJ spełnia absolutny wymóg wdrożenia klinicznego: ponad 80% żywotnych ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy J.K., M.D., T.A., A.S., W.K.A. nie mają nic do ujawnienia. Autorzy W.L. i M.D.E. są pracownikami ERBE Medizintechnik Lt. Tübingen, producenta ERBEJet2 i prototypu WJ zatrudnionego w tym badaniu.

Podziękowania

Dziękujemy naszym współautorom z oryginalnych publikacji za pomoc i wsparcie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Probówka wirówkowa 50 mlGreiner BioOne227261
1 mL BD Luer-LokTM StrzykawkaBD Plastik Incn.a.100
µ m sito komórkoweGreiner BioOne542000
15 ml probówka wirówkowaGreiner BioOne188271
75 cm2 kolba do hodowli tkankowychCorning Incorporated353136
głowica AFM(CellHesion 200) Oprogramowanie do
AFM
AFMSystemJPK00518
Cell Hesion 200Wspornik BrukerJPK00518
All-In-One-AlCzujniki budżetoweAIO-10końcówka A, tryb kontct, kształt: Belka
Stała siły: 0,2 N / m (0,04 - 0,7 N / m)
Częstotliwość rezonansowa: 15 kHz (10 - 20 kHz)
Długość: 500 &mikro; m (490 - 510 &mikro; m)
Szerokość: 30 & mikro; m (35 - 45 &mikro; m)
Grubość: 2,7 i mikro; m (1,7 - 3,7 &mikro; m)
Amfoterycyna B roztwórSigmaA2942250 &mikro; g/ml
Mikroskop sił atomowych (AFM)CellHesion 200, JPK Instruments, Berlin, NiemcyJPK00518
BD Microlance 3 18GBD304622
albumina surowicy bydlęcejGibcoA10008-01
Wspornik&nbsp; All-In-One-AleTl, Czujniki budżetowe, Sofia, BułgariaAIO-TL-10końcówka A, k ¼ 0,2 N/m
jednorazowy hemocytometr C-chipWirówka NanoEnTek631-1098
: Rotina 420RHettich Zentrifugen
Collagenase, Typ I, proszekGibco17100-017
Dulbecco' s Zmodyfikowany Orzeł" s Średni - niski poziom glukozySigmaD5546
Jednorazowy skalpel z piór (nr 10)Feather02.001.30.010
płodowa surowica bydlęca (FBS)SigmaF7524
HEPES roztwór soli sodowej (1 M)SigmaH3662
Mikroskop kontrastowy z odwróconymi fazami (zintegrowany z AFM)AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, NiemcyL201306_ 03
torby laboratoryjneMarka759705
Leibovitz's L-15 medium bez l-glutaminyMerckF1315
Leibovitz's L-15 bez L-glutaminy(Merck KGaA, Darmstadt, Niemcy)F1315
L-glutaminaLonzaBE 17-605C1200
mM LIVE/DEADTM Zestawdo żywotności/cytotoksycznościZ tego zestawu zastosowano Invitrogen firmy Thermo Fisher ScientificL3224Calcein AM i EthD-1.
Oprogramowanie mikroskopu: Zen 2.6Zeiss
Mikroskop: AxioVertA.1Zeiss
żeńskiBicakcilar19512051
Penicylina-StreptomycynaGibco15140-12210000 U/ml Penicylina
10000 &mikro; g/ml Streptomycyna
Podgrzewacz do szalek Petriego związany z AFMBrukerT-05-0117
Podgrzewacz do szalek Petriego związany z AFMJPK Instruments AG, Berlin, NiemcyT-05-0117
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Gibco10010-015
Oprogramowanie statystyczne: SPSS Statistics 22Sterylna
- CellStarGreiner BioOne664160
Naczynia do hodowli tkankowychTPP AGTPP93040
Naczynia do hodowli tkankowychTPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, SzwajcariaTPP93040
Błękit trypanowy 0,4%
0,85% NaCl		Lonza17-942E
Roztwór trypsyny-EDTASigmaT3924
Waterjet: urządzenie ERBEJET2Erbe Elektromedizin GmbH
Williams Cystoskopowa igła iniekcyjnaCook MedicalG1422023G, 5.0 Fr, 35 cm
przetwarzania JPK JPK00518 Oprogramowanie Bruker JPK00518 AFM Bruker Cewnik nelatonowy szalka Petriego IBM

Bibliografia

  1. Milsom, I., et al. Global prevalence and economic burden of urgency urinary incontinence: a systematic review. European Urology. 65 (1), 79-95 (2014).
  2. Lee, J. Y., et al. The effects of periurethral muscle-derived stem cell injection on leak point pressure in a rat model of stress urinary incontinence. International Urogynecology Journal and Pelvic Floor Dysfunction. 14 (1), 31-37 (2003).
  3. Tran, C., Damaser, M. S. The potential role of stem cells in the treatment of urinary incontinence. Therapeutic Advances in Urology. 7 (1), 22-40 (2015).
  4. Fu, Q., Song, X. F., Liao, G. L., Deng, C. L., Cui, L. Myoblasts differentiated from adipose-derived stem cells to treat stress urinary incontinence. Urology. 75 (3), 718-723 (2010).
  5. Corcos, J., et al. marrow mesenchymal stromal cell therapy for external urethral sphincter restoration in a rat model of stress urinary incontinence. Neurourology and Urodynamics. 30 (3), 447-455 (2011).
  6. Smaldone, M. C., Chen, M. L., Chancellor, M. B. Stem cell therapy for urethral sphincter regeneration. Minerva Urologica e Nefrologica. 61 (1), 27-40 (2009).
  7. Perin, E. C., López, J. Methods of stem cell delivery in cardiac diseases. Nature Clinical Practice Cardiovascular Medicine. 3, Suppl 1 110-113 (2006).
  8. Zhang, M., et al. Cardiomyocyte grafting for cardiac repair: graft cell death and anti-death strategies. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 33 (5), 907-921 (2001).
  9. Amer, M. H., White, L. J., Shakesheff, K. M. The effect of injection using narrow-bore needles on mammalian cells: administration and formulation considerations for cell therapies. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 67 (5), 640-650 (2015).
  10. Amer, M. H., Rose, F. R. A. J., Shakesheff, K. M., Modo, M., White, L. J. Translational considerations in injectable cell-based therapeutics for neurological applications: concepts, progress and challenges. NPJ Regenerative Medicine. 2, 23-23 (2017).
  11. Linzenbold, W., Fech, A., Hofmann, M., Aicher, W. K., Enderle, M. D. Novel Techniques to Improve Precise Cell Injection. International Journal of Molecular Sciences. 22 (12), 6367(2021).
  12. Adamo, A., Roushdy, O., Dokov, R., Sharei, A., Jensen, K. F. Microfluidic jet injection for delivering macromolecules into cells. Journal of Micromechanics and Microengineering: Structures, Devices, and Systems. 23, 035026(2013).
  13. Jäger, L., et al. A novel waterjet technology for transurethral cystoscopic injection of viable cells in the urethral sphincter complex. Neurourology and Urodynamics. 39 (2), 594-602 (2020).
  14. Weber, M., et al. Hydrojet-based delivery of footprint-free iPSC-derived cardiomyocytes into porcine myocardium. Scientific Reports. 10 (1), 16787(2020).
  15. Jäger, L., et al. A novel waterjet technology for transurethral cystoscopic injection of viable cells in the urethral sphincter complex. Neurourology and Urodynamics. 39 (2), 594-602 (2020).
  16. Linzenbold, W., et al. Rapid and precise delivery of cells in the urethral sphincter complex by a novel needle-free waterjet technology. BJU International. 127 (4), 463-472 (2021).
  17. Danalache, M., Tiwari, A., Sigwart, V., Hofmann, U. K. Application of Atomic Force Microscopy to Detect Early Osteoarthritis. Journal of Visualized Experiments. (159), e61041(2020).
  18. Gálvez-Martín, P., Hmadcha, A., Soria, B., Calpena-Campmany, A. C., Clares-Naveros, B. Study of the stability of packaging and storage conditions of human mesenchymal stem cell for intra-arterial clinical application in patient with critical limb ischemia. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 86 (3), 459-468 (2014).
  19. Danalache, M., et al. Injection of Porcine Adipose Tissue-Derived Stromal Cells by a Novel Waterjet Technology. International Journal of Molecular Sciences. 22 (8), (2021).
  20. Amend, B., et al. Precise injection of human mesenchymal stromal cells in the urethral sphincter complex of Göttingen minipigs without unspecific bulking effects. Neurourology and Urodynamics. 36 (7), 1723-1733 (2017).
  21. Danalache, M., et al. Injection of Porcine Adipose Tissue-Derived Stromal Cells by a Novel Waterjet Technology. International Journal of Molecular Sciences. 22 (8), 3958(2021).
  22. Strasser, H., et al. 328: Transurethral Ultrasound Guided Stem Cell Therapy of Urinary Incontinence. Journal of Urology. 175 (4), 107(2006).
  23. Vining, K. H., Mooney, D. J. Mechanical forces direct stem cell behaviour in development and regeneration. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 18 (12), 728-742 (2017).
  24. Ding, Y., Xu, G. -K., Wang, G. -F. On the determination of elastic moduli of cells by AFM based indentation. Scientific Reports. 7 (1), 45575(2017).
  25. Charras, G. T., Horton, M. A. Single cell mechanotransduction and its modulation analyzed by atomic force microscope indentation. Biophysical Journal. 82 (6), 2970-2981 (2002).
  26. Carl, P., Schillers, H. Elasticity measurement of living cells with an atomic force microscope: data acquisition and processing. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 457 (2), 551-559 (2008).
  27. Darling, E. M., Topel, M., Zauscher, S., Vail, T. P., Guilak, F. Viscoelastic properties of human mesenchymally-derived stem cells and primary osteoblasts, chondrocytes, and adipocytes. Journal of Biomechanics. 41 (2), 454-464 (2008).
  28. Thomas, G., Burnham, N. A., Camesano, T. A., Wen, Q. Measuring the mechanical properties of living cells using atomic force microscopy. Journal of Visualized Experiments. (76), e50497(2013).
  29. Li, M., Dang, D., Liu, L., Xi, N., Wang, Y. Atomic Force Microscopy in Characterizing Cell Mechanics for Biomedical Applications: A Review. IEEE Trans Nanobioscience. 16 (6), 523-540 (2017).
  30. Morimoto, A., et al. A conserved KASH domain protein associates with telomeres, SUN1, and dynactin during mammalian meiosis. The Journal of Cell Biology. 198 (2), 165(2012).
  31. Lombardi, M. L., et al. The interaction between nesprins and sun proteins at the nuclear envelope is critical for force transmission between the nucleus and cytoskeleton. Journal of Biological Chemistry. 286 (30), 26743-26753 (2011).
  32. Isermann, P., Lammerding, J. Nuclear Mechanics and Mechanotransduction in Health and Disease. Current Biology. 23 (24), 1113-1121 (2013).
  33. Méjat, A. LINC complexes in health and disease. Nucleus. 1 (1), 40-52 (2010).
  34. Folker, E. S., Östlund, C., Luxton, G. G., Worman, H. J., Gundersen, G. G. Lamin A variants that cause striated muscle disease are defective in anchoring transmembrane actin-associated nuclear lines for nuclear movement. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (1), 131-136 (2011).
  35. Guilluy, C., et al. Isolated nuclei adapt to force and reveal a mechanotransduction pathway in the nucleus. Nature cell biology. 16 (4), 376-381 (2014).
  36. Fischer, T., Hayn, A., Mierke, C. T. Effect of Nuclear Stiffness on Cell Mechanics and Migration of Human Breast Cancer Cells. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 393(2020).
  37. Kuznetsova, T. G., Starodubtseva, M. N., Yegorenkov, N. I., Chizhik, S. A., Zhdanov, R. I. Atomic force microscopy probing of cell elasticity. Micron. 38 (8), 824-833 (2007).
  38. Schillers, H., et al. Standardized Nanomechanical Atomic Force Microscopy Procedure (SNAP) for Measuring Soft and Biological Samples. Scientific Reports. 7 (1), 5117(2017).
  39. Costa, K. D., Yin, F. C. Analysis of indentation: implications for measuring mechanical properties with atomic force microscopy. Journal of Biomechanical Engineering. 121 (5), 462-471 (1999).
  40. Stolz, M., et al. Dynamic elastic modulus of porcine articular cartilage determined at two different levels of tissue organization by indentation-type atomic force microscopy. Biophysical Journal. 86 (5), (2004).
  41. Park, S., Costa, K. D., Ateshian, G. A., Hong, K. S. Mechanical properties of bovine articular cartilage under microscale indentation loading from atomic force microscopy. Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part H. 223 (3), 339-347 (2009).
  42. Usukura, E., Narita, A., Yagi, A., Ito, S., Usukura, J. An Unroofing Method to Observe the Cytoskeleton Directly at Molecular Resolution Using Atomic Force Microscopy. Scientific Reports. 6 (1), 27472(2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Wtryskiwanie strumieniem wodyzrąb tkanki tłuszczowejterapia komórkowanietrzymanie moczuwtryskiwanie bezigłowezwieracz cewki moczowejmikroskopia sił atomowychżywotność komórekocena biomechanicznakomórki zrębowe świni
Iniekcja komórek zrębu tkanki tłuszczowej pochodzącej z tkanki tłuszczowej świń za pomocą technologii strumienia wody
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.