DetectSyn: szybka, bezstronna metoda fluorescencyjna do wykrywania zmian w gęstości synaps

Summary

DetectSyn to bezstronny, szybki test fluorescencyjny, który mierzy zmiany we względnej liczbie synaps (zaangażowanie pre- i postsynaptyczne) w różnych terapiach lub stanach chorobowych. Technika ta wykorzystuje technikę ligacji zbliżeniowej, która może być stosowana zarówno w hodowanych neuronach, jak i w tkance stałej.

Abstract

Synapsy są miejscem komunikacji między neuronami. Siła obwodu neuronalnego jest związana z gęstością synaps, a rozpad synaps jest charakterystyczny dla stanów chorobowych, takich jak duże zaburzenie depresyjne (MDD) i choroba Alzheimera. Tradycyjne techniki badania liczby synaps obejmują ekspresję genetyczną markerów fluorescencyjnych (np. białka zielonej fluorescencji (GFP)), barwników wypełniających neuron (np. barwnik karbocyjaninowy, DiI) oraz immunofluorescencyjne wykrywanie markerów kręgosłupa (np. gęstość postsynaptyczna 95 (PSD95)). Głównym zastrzeżeniem do tych technik proxy jest to, że identyfikują one tylko zmiany postsynaptyczne. Jednak synapsa jest połączeniem między zakończeniem presynaptycznym a kręgosłupem postsynaptycznym. Złoty standard pomiaru powstawania/eliminacji synaps wymaga czasochłonnych technik mikroskopii elektronowej lub tomografii matrycowej. Techniki te wymagają specjalistycznego szkolenia i kosztownego sprzętu. Co więcej, tylko ograniczona liczba neuronów może być oceniona i jest używana do reprezentowania zmian w całym regionie mózgu. DetectSyn to szybka technika fluorescencyjna, która identyfikuje zmiany w tworzeniu lub eliminacji synaps spowodowane stanem chorobowym lub aktywnością leku. DetectSyn wykorzystuje szybki test ligacji zbliżeniowej do wykrywania zestawionych białek pre- i postsynaptycznych oraz standardową mikroskopię fluorescencyjną, technikę łatwo dostępną dla większości laboratoriów. Fluorescencyjna detekcja powstałych punktów pozwala na szybką i bezstronną analizę eksperymentów. DetectSyn zapewnia bardziej reprezentatywne wyniki niż mikroskopia elektronowa, ponieważ można analizować większe obszary niż ograniczona liczba neuronów fluorescencyjnych. Co więcej, DetectSyn działa w przypadku neuronów hodowanych in vitro i utrwalonych wycinków tkanki. Na koniec przedstawiono metodę analizy danych zebranych za pomocą tej techniki. Ogólnie rzecz biorąc, DetectSyn oferuje procedurę wykrywania względnych zmian gęstości synaps w różnych terapiach lub stanach chorobowych i jest bardziej dostępny niż tradycyjne techniki.

Introduction

Synapsy są podstawową jednostką komunikacji między neuronami¹. Wiele synaps między neuronami w tych samych regionach powoduje powstawanie obwodów, które pośredniczą w zachowaniu². Synapsy składają się z zakończenia presynaptycznego z jednego neuronu, które uwalnia neuroprzekaźniki lub neuropeptydy, które przekazują informacje do receptorów postsynaptycznych innego neuronu. Suma sygnałów presynaptycznych określa, czy neuron postsynaptyczny wystrzeli potencjał czynnościowy i przekaże wiadomość do innych neuronów.

Synaptopatologia, rozpad synaps, występuje w chorobach i zaburzeniach charakteryzujących się zmniejszoną objętością neuronów, takich jak choroba Alzheimera i duże zaburzenie depresyjne, powodując powstawanie obwodów, które już nie działają optymalnie3^,4,5. Przywrócenie gęstości synaps prawdopodobnie leży u podstaw skuteczności potencjalnych metod leczenia tych zaburzeń. Na przykład, niedawno wykazano, że zwiększenie liczby synaps leży u podstaw skuteczności behawioralnej szybkich leków przeciwdepresyjnych⁶. Aby szybko przeprowadzić badania przesiewowe możliwych metod leczenia synaptopatologicznego, naukowcy potrzebują technik, które szybko identyfikują zmiany liczby synaps.

Obecne metodologie są albo czasochłonne i kosztowne (mikroskopia elektronowa, tomografia matrycowa), albo badają tylko zmiany postsynaptyczne bez uwzględnienia zaangażowania presynaptycznego (analizy kręgosłupa, immunofluorescencja/kolokalizacja). Barwniki takie jak DiI lub białka fluorescencyjne, takie jak GFP, pomagają wizualizować neurony i charakteryzować kolce postsynaptyczne. Jednak analiza kręgosłupa wykorzystuje współczynniki zdefiniowane przez badacza do określenia morfologii, co może zmniejszyć odtwarzalność⁷. Co więcej, wciąż odkrywane, w jaki sposób różne klasy kręgosłupa odnoszą się do funkcjonalnych synaps⁸. Powstawanie kręgosłupa może być przejściowe i może odzwierciedlać plastyczność postsynaptyczną, ale te kolce mogą zostać wyeliminowane przed ustabilizowaniem się w synapsę z neuronem presynaptycznym⁹.

Kolokalizacja zapewnia lepsze zastępstwo dla synaps niż analiza kręgosłupa, ponieważ można immunobarwić białka presynaptyczne i postsynaptyczne. Jednak białka synaptyczne mogą dawać niskie wartości kolokalizacji, ponieważ białka są zestawione i mogą nie nakładać się na siebie konsekwentnie. Tak więc, ponieważ białka nie są całkowicie nałożone, techniki kolokalizacji mogą nie mierzyć dokładnie zmian w tworzeniu synaps z powodu brakujących informacji. Wreszcie, chociaż zarówno mikroskopia elektronowa (EM), jak i tomografia matrycowa dostarczają obrazów synaps o wysokiej rozdzielczości, są one czasochłonne. EM wymaga ponadto specjalistycznego sprzętu, a badacze są ograniczeni do małych objętości tkanek w danym eksperymencie. Podczas gdy tomografia matrycowa elegancko zapewnia możliwość badania przesiewowego wielu białek na ultracienkich skrawkach i może być łączona z EM¹⁰, technika ta może być zbyt pracochłonna i wykraczać poza zakres eksperymentów, które wymagają szybkiego skanowania w poszukiwaniu zmian w tworzeniu synaps.

DetectSyn to specyficzne zastosowanie testu ligacji zbliżeniowej Duolink. Test PLA pozwala na ogólne wykrycie oddziaływań białko-białko. DetectSyn łączy proxy miary postsynaptyczne poprzez wzmocnienie sygnału fluorescencyjnego emitowanego przez znakowane białka pre- i postsynaptyczne w odległości 40 nm od siebie. Jeśli białka synaptyczne znajdują się w odległości 40 nm, tak jak w szczelinie synaptycznej, wówczas przeciwciała drugorzędowe, które zawierają sondy DNA, zhybrydyzują się z kolistym DNA. To zhybrydyzowane koliste DNA wyraża sondę fluorescencyjną, która jest następnie amplifikowana i wykrywana za pomocą standardowych technik mikroskopii fluorescencyjnej (patrz Rysunek 1). Co istotne, w przeciwieństwie do tomografii elektromagnetycznej i matrycowej, technika ta nie wymaga specjalistycznego sprzętu i zajmuje mniej więcej tyle samo czasu, co standardowa immunohistochemia. Dostępność tej techniki umożliwia zatem badaczom spoza instytucji prowadzących intensywne badania naukowe udział w badaniach synaptopatologicznych. Co więcej, technika ta może badać zmiany gęstości synaptycznej w wielu regionach mózgu w ramach jednego eksperymentu, oferując bardziej holistyczną reprezentację zmian synaptycznych spowodowanych chorobą lub leczeniem.

Protocol

Izolacja komórek i tkanek od zwierząt była zgodna z Przewodnikiem National Institutes of Health dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych oraz zatwierdzona przez Wake Forest Institutional Animal Care and Use Committee

UWAGA: Ten protokół jest używany na próbkach już poddanych działaniu i ustalonych zgodnie z określonymi paradygmatami i wymaganiami eksperymentalnymi. W celach demonstracyjnych wykorzystano tworzenie synaps w wyniku szybkiego leczenia przeciwdepresyjnego, aby podkreślić tę technikę wykrywania synaps⁶. Neurony wcześniej hodowane na szkiełkach nakrywkowych, traktowane, utrwalane w 4% paraformaldehydzie (PFA) i przechowywane w 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) zostaną wykorzystane do podkreślenia procedur in vitro. Wcześniej pokrojona tkanka hipokampa (o grubości 25 μm) od myszy leczonych, transcardialnie perfundowana lodowatym PBS i 4% PFA, a następnie przechowywana w krioprotektantach, zostanie użyta do podkreślenia procedur cięcia. Zobacz ^11,12, aby uzyskać więcej informacji na temat hodowli neuronów lub gryzoni z perfuzją przezsercową. Zobacz Rysunek 1 dla graficznej reprezentacji tej procedury.

Rysunek 1: Graficzne przedstawienie testu DetectSyn. Po przepuszczalności błon komórkowych pierwotne przeciwciała przeciwko Synapsynie1 i PSD95 wiążą się z tymi białkami synaptycznymi. Drugorzędowe ze znacznikami oligonukleotydowymi wiążą się następnie z przeciwciałami pierwszorzędowymi. Jeśli Synapsin1 i PSD95 znajdują się w zakresie 40 nm, tak jak w synapsie, wówczas oligonukleotydy oddziałują i amplifikowany jest znacznik fluorescencyjny. Ten sygnał fluorescencyjny może być następnie zobrazowany za pomocą standardowej mikroskopii i przeanalizowany. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

1. Próbki do płukania

1. Przepłukać próbki 500 μl 1x PBS + 0,75% glicyny przez 5 minut 3 razy, delikatnie mieszając na wytrząsarce orbitalnej w celu usunięcia pozostałości PFA lub krioprotektantu.

2. Blokowanie i przepuszczalność próbek

1. Przygotuj roztwór blokujący i przepuszczalny (10% normalna surowica osła, 0,25% Tween 20) w 1x PBS. Przygotuj się wystarczająco dużo, aby użyć do inkubacji blokującej, pierwotnej i wtórnej.
2. Do próbek (np. szkiełek nakrywkowych lub swobodnie pływających plastrów) na płytkach 24-dołkowych dodać 500 μl roztworu blokującego i przepuszczalnego. Upewnij się, że każda studzienka zawiera inną próbkę i jest odpowiednio oznakowana, aby zapobiec zamianie próbek.
3. Próbki należy inkubować w temperaturze pokojowej (RT) przez 60 minut w przypadku komórek hodowanych lub 2 godziny w przypadku tkanek w plastrach. Użyj wytrząsarki orbitalnej do delikatnego mieszania.

3. Inkubuj próbki w pierwotnych przeciwciałach

1. Przygotować przeciwciała pierwszorzędowe w buforze blokującym:
   1. Przygotuj gęstość postsynaptyczną 95 (PSD95; 1:500, poliklonalna królika), Synapsyna1 (1:500, monoklonalna mysie), MAP2 (1:400, poliklonalna kurczaka)
   2. Przygotować podwielokrotność kontroli ujemnej, która pomija jedną z par synaptycznych (np. bez PSD95)
2. Ostrożnie usuń roztwór blokujący za pomocą plastikowej pipety Pasteura. Postaraj się usunąć jak najwięcej, nie naruszając komórek ani nie rozrywając tkanki.
3. Dla komórek hodowanych:
   1. Wyłóż dużą plastikową szalkę Petriego parafilmem. Ostrożnie przenieś szkiełka nakrywkowe na parafilm za pomocą kleszczy.
   2. Ostrożnie dodać 60 μl roztworu przeciwciała pierwszorzędowego na wierzch szkiełek nakrywkowych. Należy uważać, aby nie rozlać roztworu przeciwciała pierwszorzędowego na bok szkiełka nakrywkowego.
   3. Aby zapewnić wilgotność i zapobiec wysychaniu próbek w okresie inkubacji, dodaj ultraczystą wodę do mniejszej szalki Petriego i ostrożnie ułóż małą szalkę Petriego wokół szkiełek nakrywkowych.
   4. Przykryć dużą szalkę Petriego i inkubować hodowane komórki przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
4. W przypadku tkanek pokrojonych w plastry:
   1. Ostrożnie dodać 250 μl roztworu przeciwciała pierwszorzędowego do swobodnie pływających plastrów na płytce 24-dołkowej.
   2. Przykryć płytkę i inkubować tkankę przez noc w temperaturze 4 °C, delikatnie mieszając na wytrząsarce orbitalnej.

4. Umyj próbki, a następnie inkubuj w drugorzędowych przeciwciałach

1. Przygotować przeciwciała drugorzędowe w buforze blokującym:
   1. Przygotuj osła anty-mysz (1:5), osła anty-królika (1:5), osła anty-kurczaka (1:400).
   2. Na tym etapie można uzyskać dodatkowe kontrole techniczne, przygotowując wtórną podwielokrotność, która pomija wtórną anty-mysz lub anty-królika.
2. Dla komórek hodowanych:
   1. Za pomocą kleszczy ostrożnie strzepnij podstawowy roztwór z szkiełek nakrywkowych na ręcznik papierowy
   2. Za pomocą kleszczy ostrożnie przenieś szkiełka nakrywkowe z powrotem na oryginalną 24-dołkową płytkę wypełnioną 500 μl 1x PBS.
3. W przypadku tkanek pokrojonych w plastry:
   1. Ostrożnie usunąć pierwotny roztwór przeciwciała za pomocą plastikowej pipety Pasteura. Staraj się usunąć jak najwięcej, nie rozrywając tkanki.
   2. Dodaj 500 μL 1x PBS
4. Myć próbki przez 10 minut 3 razy w 1x PBS z delikatnym mieszaniem na wytrząsarce orbitalnej. W tym czasie przynieś wszystkie myjące do RT.
   1. W tym czasie zmień parafilm na dużej szalce Petriego
5. Dla komórek hodowanych:
   1. Za pomocą kleszczy ostrożnie przenieś szkiełka nakrywkowe z powrotem na sparafilmowaną dużą szalkę Petriego
   2. Ostrożnie dodać 40 μl roztworu przeciwciał drugorzędowych na wierzch szkiełek nakrywkowych. Należy uważać, aby nie rozlać roztworu przeciwciała wtórnego na bok szkiełka nakrywkowego.
   3. W razie potrzeby dodaj więcej ultraczystej wody do mniejszej szalki Petriego i ostrożnie ułóż małą szalkę Petriego wokół szkiełek nakrywkowych.
   4. Przykryj dużą szalkę Petriego
6. W przypadku tkanek pokrojonych w plastry:
   1. Ostrożnie dodać 250 μl roztworu przeciwciał drugorzędowych do swobodnie pływających plastrów na płytce 24-dołkowej.
   2. Przykryj talerz
      UWAGA: Od tego momentu należy chronić próbki przed światłem, owijając górną część płytek folią.
7. Inkubować próbki w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę

5. Podwiązanie

1. Wymieszaj podwiązanie w stosunku 1:5 z wodą molekularną.
2. Podobnie jak w sekcji 4, ostrożnie przenieś szkiełka nakrywkowe i usuń wtórną mieszankę z pokrojonej tkanki.
3. Przemyć próbki w 500 μl buforu do przemywania A
   1. W przypadku hodowanych komórek myć 2 razy przez 5 minut. W przypadku pokrojonej chusteczki myj 2 razy przez 10 minut. Użyj delikatnego mieszania na wytrząsarce orbitalnej dla obu.
   2. W tym czasie zmień parafilm na dużej szalce Petriego
4. Utrzymując ligazę na zimnym bloku, rozcieńczyć ligazę w stosunku 1:40 w bulionie do podwiązania z kroku 5.1. Rozcieńczenie to należy przeprowadzić bezpośrednio przed dodaniem ligazy do próbek.
5. Podobnie jak w sekcji 4, przed dodaniem ligazy należy usunąć jak najwięcej buforu A z próbek.
6. W przypadku komórek hodowlanych: Przenieść szkiełka nakrywkowe z powrotem na sparafilmowaną szalkę Petriego. Dodać 40 μl mieszanki do podwiązania do szkiełek nakrywkowych, ułożyć małe wypełnione wodą szalki Petriego wokół szkiełek nakrywkowych i przykryć dużą szalkę Petriego.
7. W przypadku tkanek pokrojonych w plastry: Dodać 250 μl mieszanki ligacyjnej z kroku 5.4 do każdego dołka i przykryć płytkę.
8. Inkubować próbki przez 30 minut w temperaturze 37 °C.

6. Wzmocnienie

1. Wymieszaj materiał wzmacniający 1:5 w wodzie molekularnej.
2. Podobnie jak w punkcie 4, ostrożnie przenieść szkiełka nakrywkowe i usunąć mieszaninę ligacyjną z pokrojonej tkanki.
3. Przemyć próbki w 500 μl buforu do przemywania A
   1. W przypadku hodowanych komórek myć 2 razy przez 2 minuty. W przypadku pokrojonej chusteczki myj 2 razy przez 10 minut. Użyj delikatnego mieszania na wytrząsarce orbitalnej dla obu.
   2. W tym czasie zmień parafilm na dużej szalce Petriego
4. Rozcieńczenie to należy przeprowadzić bezpośrednio przed dodaniem polimerazy do próbek. Trzymając polimerazę na zimnym bloku, rozcieńczyć polimerazę
   1. W przypadku komórek hodowanych należy rozcieńczyć polimerazę w stosunku 1:80 w bulionie do amplifikacji z kroku 6.1.
   2. W przypadku tkanek pokrojonych w plastry rozcieńczyć polimerazę w stosunku 1:40 w bulionie do amplifikacji z kroku 6.1.
5. Podobnie jak w kroku 4, przed dodaniem polimerazy należy usunąć z próbek jak najwięcej buforu A.
6. W przypadku hodowanych komórek: Przenieść szkiełka nakrywkowe z powrotem na sparafilmowaną szalkę Petriego. Dodać 40 μl mieszanki amplifikacyjnej z kroku 6.4.1 do szkiełek nakrywkowych, ułożyć małe wypełnione wodą płytki Petriego wokół szkiełek nakrywkowych i przykryć dużą szalkę Petriego. Inkubować próbki przez 100 minut w temperaturze 37 °C.
7. W przypadku tkanek pokrojonych w plastry: Dodać 250 μl mieszanki amplifikacyjnej z etapu 6.4.2 do każdego dołka i przykryć płytkę. Inkubować próbki przez 2 godziny w temperaturze 37 °C.
   UWAGA: W tym czasie przygotuj i oznacz slajdy.

7. Montaż

1. Podobnie jak w kroku 4, ostrożnie przenieś szkiełka nakrywkowe i usuń mieszaninę amplifikacyjną z pokrojonej tkanki.
2. Przemyć próbki w 500 μl buforu B 2 razy przez 10 minut, delikatnie mieszając na wytrząsarce orbitalnej.
3. Próbki przemywać w 500 μl 1% buforu B do przemywania przez 1 minutę, delikatnie mieszając na wytrząsarce orbitalnej.
4. Dla komórek hodowanych:
   1. Upuść 3 μl nośnika montażowego na szkiełko
   2. Strząśnij nadmiar buforu do płukania ze szkiełka nakrywkowego, a następnie umieść szkiełko nakrywkowe (komórkami skierowanymi w dół) w podłożu montażowym. Uszczelnij boki niewielką ilością przezroczystego lakieru do paznokci, aby uszczelnić szkiełko nakrywkowe na miejscu.
5. W przypadku tkanek pokrojonych w plastry:
   1. Ostrożnie przenieś plasterek chusteczki na przygotowane szkiełko i ułóż go tak, aby plasterek leżał płasko. Upuść od 5 do 10 μl podłoża montażowego (ilość zależy od wielkości plasterka) na plasterek tkanki
   2. Ostrożnie umieść szklane szkiełko nakrywkowe na plasterku chusteczki i uszczelnij niewielką ilością przezroczystego lakieru do paznokci wzdłuż krawędzi, aby uszczelnić szkiełko nakrywkowe na miejscu.
6. Odczekaj co najmniej 15 minut przed analizą pod mikroskopem lub przechowuj w temperaturze -20 °C.

8. Uzyskaj obrazy cyfrowe za pomocą mikroskopu konfokalnego

1. Zoptymalizuj ustawienia akwizycji (np. moc lasera, wzmocnienie, przesunięcie) w próbkach ze wszystkich zabiegów. Upewnij się, że optymalizacja obejmuje zmniejszenie szumu tła i wzmocnienie sygnału bez nadmiernego nasycenia intensywności sygnałów fluorescencyjnych. Po określeniu ustawień zastosuj te same ustawienia akwizycji do wszystkich uzyskanych obrazów.
   UWAGA: Poniższe informacje o akwizycji mogą być używane z mikroskopem konfokalnym Nikon A1 i oprogramowaniem Nikon NIS AR Elements.
2. Ustaw szkiełko z próbką na stoliku i znajdź płaszczyznę ogniskową dla próbki za pomocą DAPI przez okular.
3. Wyłącz port oczu, klikając Port oka i wybierz przycisk konfiguracji optycznej, aby dostosować ustawienia.
4. Dostosuj wzmocnienie, przesunięcie i moc lasera dla każdego kanału fluorescencyjnego, aby zmniejszyć szum tła i wzmocnić sygnał fluorescencyjny. Upewnij się, że sygnał fluorescencyjny nie jest przesycony, jak wspomniano w krokach 8.5-8.6.
5. Monitoruj przesycenie za pomocą pseudokoloru dla sygnału fluorescencyjnego. U dołu obrazu na żywo kliknij prawym przyciskiem myszy zakładkę oznaczoną aktualnie używanym kanałem fluorescencyjnym.
6. Następnie wybierz Kolorowanie kanałów i wybierz pseudokolor, taki jak Rainbow Dark, aby zobrazować intensywność fluorescencji w pseudokolorze podobnym do mapy cieplnej. W Rainbow Dark chłodniejsze kolory wskazują na mniejszą intensywność fluorescencji, a cieplejsze kolory wskazują na większą intensywność fluorescencji.
7. Po zoptymalizowaniu wszystkich kanałów fluorescencyjnych kliknij prawym przyciskiem myszy wybrany wcześniej przycisk konfiguracji optycznej i wybierz Przypisz bieżące ustawienie kamery dla tego przycisku.
8. Sprawdzić, czy wybrane ustawienia są wystarczające dla losowej próbki z każdej grupy poddawanej zabiegowi. Jeśli wybrane ustawienia powodują przesycenie którejkolwiek z tych próbek, powtórz krok 8.4, aby wyeliminować przesycenie.
9. W przypadku hodowanych neuronów wykonaj kroki 8.10-8.16.
10. Korzystając z portu oka, poszukaj neuronu z dendrytami, które w minimalnym stopniu pokrywają się z innymi dendrytami.
11. Wyłącz port oka i użyj kanału DAPI, aby zobrazować ciało komórkowe wybranego neuronu. Kliknij dwukrotnie środek somy, aby wyśrodkować neuron w środku pola widzenia.
12. Korzystając z kanału MAP2, znajdź najlepszą płaszczyznę ostrości dla sygnału MAP2 za pomocą skanowania na żywo.
13. Na karcie Akwizycja ND kliknij Zapisz do pliku i wybierz plik, w którym chcesz zapisać obraz w obszarze Przeglądaj. Następnie wprowadź nazwę pliku.
14. Na karcie Z wybierz opcję Tryb symetryczny zdefiniowany przez zakres. Ustaw ostrość na najlepszą płaszczyznę MAP2 i kliknij przycisk Względny, aby ustawić tę płaszczyznę ogniskowej jako środek stosu z.
15. Ustaw zakres na 5 μm z krokami co 1 μm i upewnij się, że zaznaczyłeś opcję Zamknij aktywną migawkę podczas ruchu Z. Na karcie Wavelength (Długość fali) wybierz nazwę przycisku optycznego z poprzednio skonfigurowanymi ustawieniami akwizycji w obszarze Optical Conf. Następnie kliknij Uruchom teraz.
16. Powtórz kroki 8.1.10-8.1.15 dla około 10 neuronów na szkiełko nakrywkowe/zabieg.
17. W przypadku tkanki pokrojonej w plasterki wykonaj kroki 8.18-8.22.
18. Korzystając z portu na oczy, wyszukaj interesujący Cię obszar. Na przykład zlokalizuj CA1 hipokampa.
19. Wyłącz port oka i użyj kanału MAP2, aby znaleźć najlepszą płaszczyznę ostrości dla sygnału MAP2 podczas skanowania na żywo.
20. W menu Acquire (Pobieranie) wybierz opcję Scan Large Image (Skanuj duży obraz). Następnie wybierz nazwę przycisku optycznego z poprzednio skonfigurowanymi ustawieniami akwizycji w panelu Przechwytywanie z panelu, który zostanie otwarty. Upewnij się również, że wybrałeś właściwy cel w tym panelu.
21. Pod panelem Obszar i okularem użyj strzałek, aby ustawić granice obszaru zainteresowania. Następnie kliknij Zapisz duży obraz do pliku i utwórz nazwę pliku ścieżki zapisu dla obrazu.
22. Upewnij się, że w panelu Setup (Konfiguracja) jest zaznaczona opcja Multichannel Capture (Przechwytywanie wielokanałowe), a następnie wybierz nazwę przycisku optycznego z poprzednio skonfigurowanymi ustawieniami akwizycji w obszarze Optical Conf.
    UWAGA: Stos z dla dużego obrazu jest możliwy, ale wydłuży czas skanowania.

9. Analiza

1. Podobnie jak w przypadku ustawień akwizycji, użyj próbek ze wszystkich zabiegów, aby zoptymalizować ustawienia progowe. Upewnij się, że optymalizacja progu koncentruje się na zmniejszeniu szumu tła i wzmocnieniu sygnału bez nadmiernego nasycenia intensywności sygnałów fluorescencyjnych. Po określeniu tych ustawień zastosuj te same ustawienia progowe do wszystkich obrazów używanych do analizy, zgodnie z opisem w krokach 9.2-9.3.
2. W ImageJ opcja progu znajduje się w menu Obraz > Dostosuj > Próg. Wybierz opcję Ciemne tło, jeśli obraz ma ciemne tło.
3. Następnie dostosuj górną i dolną granicę progu zgodnie z wcześniej określonymi zoptymalizowanymi ustawieniami progu, a następnie kliknij Zastosuj.
4. W przypadku hodowanych komórek użyj kanału MAP2 i narzędzia do odręcznego regionu zainteresowania (ROI), aby narysować ROI dla każdego neuronu, w tym dendrytów i somy. W przypadku pokrojonej tkanki narysuj odręczny zwrot akcji na obrazie przekroju, który obejmuje obszar zainteresowania (np. warstwę promieniową CA1 w hipokampie).
5. Uzyskaj obszar zwrotu z inwestycji. W ImageJ zmierz obszar w menu Analizuj > Zmierz.
6. Wykryj liczbę punktów w każdym ROI za pomocą narzędzia do automatycznego wykrywania, takiego jak Analiza cząstek w ImageJ, wykonując kroki 9.7-9.9.
7. Znajdź opcję Analiza cząstek w menu Analizuj > Analizuj cząstki. Najpierw określ średnicę rozmiaru puncta, zwykle 0,1-3 μm2.
8. Następnie wybierz opcję Maski nakładki z menu rozwijanego Pokaż i zaznacz opcję Wyświetl wyniki. Następnie kliknij OK.
9. Jeśli puncta nie zostanie wykryty w wybranym zakresie średnic, dostosuj zakres, aż wszystkie puncta zostaną wykryte za pomocą tej analizy. Upewnij się, że używasz tych samych ustawień analizy cząstek dla wszystkich obrazów.
10. Podziel liczbę punktów przez obszar pojedynczego obszaru zainteresowania, wykonując kroki 9.11-9.13.
11. Skopiuj i wklej wyniki dla każdego obrazu z wyskakującego okienka Wyniki z ImageJ do arkusza kalkulacyjnego.
12. Najpierw określ, z którego pliku i próbki uzyskano dane. Następnie podziel obszar ROI przez liczbę puncta.
13. Następnie wyczyść dane z wyskakującego okienka Wyniki i powtórz kroki 9.2-9.12.
14. Normalizuj wyniki dla próbek kontrolnych: Uśrednij wyniki (liczbę obszarów puncta/ROI) dla próbek kontrolnych. Następnie należy podzielić uzyskane wyniki wszystkich próbek przez średnią z kontroli, aby uzyskać znormalizowane wyniki. Nowa średnia z próbek kontrolnych powinna być równa 1.

Results

Dane zmodyfikowane przez Heaney et al.⁶ są przedstawione w celu zademonstrowania eksperymentu, w którym spodziewane jest zwiększone tworzenie synaps (zobacz⁶ po więcej informacji i bardziej szczegółowe omówienie mechanizmu). Wcześniej wykazano, że szybkie leki przeciwdepresyjne wymagają aktywacji hamującego receptora metabotropowego, GABAB (kwas gamma-aminomasłowy podtyp B), aby były skuteczne¹³. Co więcej, wcześniejsze dane wskazywały, że szybkie le...

Discussion

DetectSyn to szybki test, który wykorzystuje test ligacji zbliżeniowej do wykrywania białek w odległości 40 nm od siebie, co pozwala na wykrycie tworzenia synaps. Technika ta ulepsza obecne testy fluorescencyjne, które służą jedynie jako pomiary zastępcze do tworzenia synaps. DetectSyn wykrywa mierzalne zmiany w białkach synaptycznych zlokalizowanych w promieniu 40 nm, tj. w obrębie szczeliny synaptycznej, od siebie. Co więcej, DetectSyn jest bardziej opłacalny i zajmuje mniej czasu niż techniki, takie jak mikroskopia el...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x	PBS Fisher Scientific	BP39920	PBS również wykonane we własnym zakresie.
Płytki 24-dołkowe	Fisher Scientific	FB012929	W przypadku plastrów tkanek wstępnie wysterylizowane płytki mogą być zbędne.
Probówki stożkowe 50 ml	Fisher Scientific	14-432-22
Folia aluminiowa	Fisher Scientific	15-078-290
Przeciwciało anty-MAP2 kurczaka	Abcam	ab5392
Bezbarwny lakier do paznokci	Fisher Scientific	NC1849418	Inne przezroczyste lakiery do paznokci również działają.
Zimny blok	Fisher Scientific	13131012
Komputerowa stacja robocza	HP
Mikroskop konfokalny lub fluorescencyjny	Nikon	A1R HD25
Osioł anty-kurczak FITC	Fisher Scientific	SA1-72000
Duolink osioł anty-Myszy PLUS	Sigma	DUO92001
Duolink osioł anty-Królik MINUS	Sigma	DUO92005
Duolink Odczynniki do wykrywania in situ Far Red	Sigma	DUO92013	Zawiera materiał do ligacji, zapas do amplifikacji, ligazę i polimerazę.
Duolink In Situ Medium montażowe z DAPI	Sigma	DUO82040
Duolink In Situ Wash Buffers, Fluorescence	Sigma	DUO82049	zawiera bufor do płukania A i bufor do płukania B; rozcieńczyć bufor do płukania B do 1% w diH20 dla 1% buforu do płukania B.
Pędzel z cienką końcówką	Fisher Scientific NC9691026		Włosy sobolowe, rozmiar 00 lub 000, można również znaleźć w sklepach rzemieślniczych
Fisherbrand Okulary przeciwsłoneczne: prostokąty	Fisher Scientific	12545MP	Szkło nakrywkowe nie jest konieczne w przypadku hodowanych neuronów już na szklanych szkiełkach nakrywkowych.
Szkiełka mikroskopowe Fisherbrand Superfrost Plus	Fisher Scientific	1255015	W przypadku hodowanych neuronów już na szklanych szkiełkach nakrywkowych, szkiełka Superfrost mogą być niepotrzebne.
Zamrażarka, -20° C	VWR	76449-108
Szkiełka nakrywkowe szklane	Fisher Scientific	125480
Glycine	Fisher Scientific	BP381-1
Oprogramowanie do przetwarzania obrazu	, np. NIS Elements, Inkubator ImageJ
	Fisher Scientific	15-015-2633
Duża szalka Petriego, 100mm	Fisher Scientific	FB0875712
Woda klasy molekularnej	Fisher Scientific	BP24701
Mysie przeciwciało anty-Synapsin1	Systemy synaptyczne	106-011
Normalna surowica osła	Jackson ImmunoResearch	017-000-121
Wytrząsarka orbitalna	Fisher Scientific	02-106-1013
Parafilm	Fisher Scientific	13-374-10
Końcówki do pipet	Fisher Scientific	02-707-025
Pipety	Fisher Scientific	14-388-100	Zakres objętości roboczej od 3 i mikro; L do 500 i mikro; L
Plastikowa pipeta Pasteura	Fisher Scientific	02-708-006
Precyzyjna pęseta/foreceps	Fisher Scientific	12-000-122
Królicze przeciwciało anty-PSD95	Abcam	ab18258	Inne pary przeciwciał mogą również działać z optymalizacją.
Lodówka	VWR	76470-402
Mała szalka Petriego, 60 mm	Fisher Scientific	FB0875713A
Timer	Fisher Scientific	14-649-17
Tween 20	Fisher Scientific	BP337-100