Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

DetectSyn: szybka, bezstronna metoda fluorescencyjna do wykrywania zmian w gęstości synaps

3.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63139

⸱

22 lipca 2022

 ,  , 
1Wake Forest Translational Alcohol Research Center, Wake Forest School of Medicine, 2Physiology and Pharmacology, Wake Forest School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

DetectSyn to bezstronny, szybki test fluorescencyjny, który mierzy zmiany we względnej liczbie synaps (zaangażowanie pre- i postsynaptyczne) w różnych terapiach lub stanach chorobowych. Technika ta wykorzystuje technikę ligacji zbliżeniowej, która może być stosowana zarówno w hodowanych neuronach, jak i w tkance stałej.

Streszczenie

Synapsy są miejscem komunikacji między neuronami. Siła obwodu neuronalnego jest związana z gęstością synaps, a rozpad synaps jest charakterystyczny dla stanów chorobowych, takich jak duże zaburzenie depresyjne (MDD) i choroba Alzheimera. Tradycyjne techniki badania liczby synaps obejmują ekspresję genetyczną markerów fluorescencyjnych (np. białka zielonej fluorescencji (GFP)), barwników wypełniających neuron (np. barwnik karbocyjaninowy, DiI) oraz immunofluorescencyjne wykrywanie markerów kręgosłupa (np. gęstość postsynaptyczna 95 (PSD95)). Głównym zastrzeżeniem do tych technik proxy jest to, że identyfikują one tylko zmiany postsynaptyczne. Jednak synapsa jest połączeniem między zakończeniem presynaptycznym a kręgosłupem postsynaptycznym. Złoty standard pomiaru powstawania/eliminacji synaps wymaga czasochłonnych technik mikroskopii elektronowej lub tomografii matrycowej. Techniki te wymagają specjalistycznego szkolenia i kosztownego sprzętu. Co więcej, tylko ograniczona liczba neuronów może być oceniona i jest używana do reprezentowania zmian w całym regionie mózgu. DetectSyn to szybka technika fluorescencyjna, która identyfikuje zmiany w tworzeniu lub eliminacji synaps spowodowane stanem chorobowym lub aktywnością leku. DetectSyn wykorzystuje szybki test ligacji zbliżeniowej do wykrywania zestawionych białek pre- i postsynaptycznych oraz standardową mikroskopię fluorescencyjną, technikę łatwo dostępną dla większości laboratoriów. Fluorescencyjna detekcja powstałych punktów pozwala na szybką i bezstronną analizę eksperymentów. DetectSyn zapewnia bardziej reprezentatywne wyniki niż mikroskopia elektronowa, ponieważ można analizować większe obszary niż ograniczona liczba neuronów fluorescencyjnych. Co więcej, DetectSyn działa w przypadku neuronów hodowanych in vitro i utrwalonych wycinków tkanki. Na koniec przedstawiono metodę analizy danych zebranych za pomocą tej techniki. Ogólnie rzecz biorąc, DetectSyn oferuje procedurę wykrywania względnych zmian gęstości synaps w różnych terapiach lub stanach chorobowych i jest bardziej dostępny niż tradycyjne techniki.

Wprowadzenie

Synapsy są podstawową jednostką komunikacji między neuronami1. Wiele synaps między neuronami w tych samych regionach powoduje powstawanie obwodów, które pośredniczą w zachowaniu2. Synapsy składają się z zakończenia presynaptycznego z jednego neuronu, które uwalnia neuroprzekaźniki lub neuropeptydy, które przekazują informacje do receptorów postsynaptycznych innego neuronu. Suma sygnałów presynaptycznych określa, czy neuron postsynaptyczny wystrzeli potencjał czynnościowy i przekaże wiadomość do innych neuronów.

Synaptopatologia, rozpad synaps, występuje w chorobach i zaburzeniach charakteryzujących się zmniejszoną objętością neuronów, takich jak choroba Alzheimera i duże zaburzenie depresyjne, powodując powstawanie obwodów, które już nie działają optymalnie3,4,5. Przywrócenie gęstości synaps prawdopodobnie leży u podstaw skuteczności potencjalnych metod leczenia tych zaburzeń. Na przykład, niedawno wykazano, że zwiększenie liczby synaps leży u podstaw skuteczności behawioralnej szybkich leków przeciwdepresyjnych6. Aby szybko przeprowadzić badania przesiewowe możliwych metod leczenia synaptopatologicznego, naukowcy potrzebują technik, które szybko identyfikują zmiany liczby synaps.

Obecne metodologie są albo czasochłonne i kosztowne (mikroskopia elektronowa, tomografia matrycowa), albo badają tylko zmiany postsynaptyczne bez uwzględnienia zaangażowania presynaptycznego (analizy kręgosłupa, immunofluorescencja/kolokalizacja). Barwniki takie jak DiI lub białka fluorescencyjne, takie jak GFP, pomagają wizualizować neurony i charakteryzować kolce postsynaptyczne. Jednak analiza kręgosłupa wykorzystuje współczynniki zdefiniowane przez badacza do określenia morfologii, co może zmniejszyć odtwarzalność7. Co więcej, wciąż odkrywane, w jaki sposób różne klasy kręgosłupa odnoszą się do funkcjonalnych synaps8. Powstawanie kręgosłupa może być przejściowe i może odzwierciedlać plastyczność postsynaptyczną, ale te kolce mogą zostać wyeliminowane przed ustabilizowaniem się w synapsę z neuronem presynaptycznym9.

Kolokalizacja zapewnia lepsze zastępstwo dla synaps niż analiza kręgosłupa, ponieważ można immunobarwić białka presynaptyczne i postsynaptyczne. Jednak białka synaptyczne mogą dawać niskie wartości kolokalizacji, ponieważ białka są zestawione i mogą nie nakładać się na siebie konsekwentnie. Tak więc, ponieważ białka nie są całkowicie nałożone, techniki kolokalizacji mogą nie mierzyć dokładnie zmian w tworzeniu synaps z powodu brakujących informacji. Wreszcie, chociaż zarówno mikroskopia elektronowa (EM), jak i tomografia matrycowa dostarczają obrazów synaps o wysokiej rozdzielczości, są one czasochłonne. EM wymaga ponadto specjalistycznego sprzętu, a badacze są ograniczeni do małych objętości tkanek w danym eksperymencie. Podczas gdy tomografia matrycowa elegancko zapewnia możliwość badania przesiewowego wielu białek na ultracienkich skrawkach i może być łączona z EM10, technika ta może być zbyt pracochłonna i wykraczać poza zakres eksperymentów, które wymagają szybkiego skanowania w poszukiwaniu zmian w tworzeniu synaps.

DetectSyn to specyficzne zastosowanie testu ligacji zbliżeniowej Duolink. Test PLA pozwala na ogólne wykrycie oddziaływań białko-białko. DetectSyn łączy proxy miary postsynaptyczne poprzez wzmocnienie sygnału fluorescencyjnego emitowanego przez znakowane białka pre- i postsynaptyczne w odległości 40 nm od siebie. Jeśli białka synaptyczne znajdują się w odległości 40 nm, tak jak w szczelinie synaptycznej, wówczas przeciwciała drugorzędowe, które zawierają sondy DNA, zhybrydyzują się z kolistym DNA. To zhybrydyzowane koliste DNA wyraża sondę fluorescencyjną, która jest następnie amplifikowana i wykrywana za pomocą standardowych technik mikroskopii fluorescencyjnej (patrz Rysunek 1). Co istotne, w przeciwieństwie do tomografii elektromagnetycznej i matrycowej, technika ta nie wymaga specjalistycznego sprzętu i zajmuje mniej więcej tyle samo czasu, co standardowa immunohistochemia. Dostępność tej techniki umożliwia zatem badaczom spoza instytucji prowadzących intensywne badania naukowe udział w badaniach synaptopatologicznych. Co więcej, technika ta może badać zmiany gęstości synaptycznej w wielu regionach mózgu w ramach jednego eksperymentu, oferując bardziej holistyczną reprezentację zmian synaptycznych spowodowanych chorobą lub leczeniem.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Izolacja komórek i tkanek od zwierząt została przeprowadzona zgodnie z wytycznymi National Institutes of Health's Guide for the Care and Use of Laboratory Animals i została zatwierdzona przez Wake Forest Institutional Animal Care and Use Committee

UWAGA: Niniejszy protokół stosuje się do próbek, które zostały już poddane działaniu preparatów i utrwalone zgodnie z konkretnymi paradygmatami i wymogami eksperymentalnymi. W celach demonstracyjnych, aby zaprezentować tę technikę detekcji synaps, wykorzystano tworzenie synaps indukowane szybkim leczeniem przeciwdepresyjnym6. W celu przedstawienia procedur in vitro wykorzystane zostaną neurony wcześniej hodowane na szkiełkach podstawkowych, poddane działaniu preparatów, utrwalone w 4% paraformaldehydzie (PFA) i przechowywane w 1x roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanowo (PBS). W celu przedstawienia procedur dotyczących skrawków wykorzystane zostaną wcześniej pocięte tkanki hipokampa myszy (grubość 25 µm), poddane działaniu preparatów, perfundowane transkardialnie lodowatym PBS i 4% PFA, a następnie przechowywane w krioprotektorze. Więcej informacji na temat hodowli neuronów lub perfuzji transkardialnej gryzoni znajduje się w źródłach11,12. Graficzną reprezentację tej procedury przedstawiono na Ryc. 1.

Schemat procesu inkubacji przeciwciał, kroki obejmują ligację, polimeryzację, szczegóły dotyczące temperatury.
Rycina 1: Przedstawienie graficzne testu DetectSyn. Po permeabilizacji błon komórkowych przeciwciała pierwszorzędowe przeciwko Synapsin1 i PSD95 wiążą się z tymi białkami synaptycznymi. Następnie przeciwciała drugorzędowe z tagami oligonukleotydowymi wiążą się z przeciwciałami pierwszorzędowymi. Jeśli Synapsin1 i PSD95 znajdują się w odległości do 40 nm, jak ma to miejsce w synapsie, oligonukleotydy wchodzą w interakcję, a tag fluorescencyjny ulega amplifikacji. Sygnał fluorescencyjny może być następnie obrazowany za pomocą standardowej mikroskopii i analizowany. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

1. Płukanie próbek

  1. Próbki płukać 500 µL 1x PBS + 0,75% glicyny przez 5 min, powtarzając czynność 3 razy przy delikatnym mieszaniu na wytrząsarce orbitalnej, aby usunąć pozostałości PFA lub krioprotektanta.

2. Blokowanie i permeabilizacja próbek

  1. Przygotuj roztwór blokujący i permeabilizujący (10% normal donkey serum, 0,25% Tween 20) w 1x PBS. Przygotuj ilość wystarczającą do blokowania oraz inkubacji z przeciwciałami pierwszorzędowymi i drugorzędowymi.
  2. Do próbek (np. szkiełek podstawowych lub wolno pływających przekrojów) w płytkach 24-dołkowych dodaj 500 µL roztworu blokującego i permeabilizującego. Upewnij się, że każdy dołek zawiera inną próbkę i jest odpowiednio oznakowany, aby zapobiec ich pomyleniu.
  3. Inkubuj próbki w temperaturze pokojowej (RT) przez 60 min w przypadku hodowli komórkowych lub przez 2 h w przypadku przekrojów tkanek. Użyj inkubatora orbitalnego w celu zapewnienia łagodnego mieszania.

3. Inkubacja próbek z przeciwciałami pierwotnymi

  1. Przygotuj przeciwciała pierwszorzędowe w buforze blokującym:
    1. Przygotuj roztwory dla Postsynaptic density 95 (PSD95; 1:500, królicze poliklonalne), Synapsin1 (1:500, mysie monoklonalne), MAP2 (1:400, kurze poliklonalne)
    2. Przygotuj alikwot kontroli negatywnej z pominięciem jednej z par synaptycznych (np. bez PSD95)
  2. Ostrożnie usuń roztwór blokujący za pomocą plastikowej pipety Pasteura. Postaraj się usunąć jak największą ilość cieczy, nie naruszając komórek ani nie rozdzierając tkanki.
  3. W przypadku hodowli komórkowych:
    1. Wyłóż dużą plastikową szalkę Petriego parafilmem. Ostrożnie przenieś szkiełka nakrywkowe na parafilm za pomocą pęsety.
    2. Ostrożnie nanieś 60 µL roztworu przeciwciał pierwszorzędowych na górną powierzchnię szkiełek nakrywkowych. Upewnij się, że roztwór przeciwciał pierwszorzędowych nie wycieknie poza krawędź szkiełka.
    3. Aby zapewnić wilgotność i zapobiec wysychaniu próbek podczas inkubacji, wlej wodę ultraczystą do mniejszej szalki Petriego i ostrożnie umieść mniejszą szalkę wokół szkiełek nakrywkowych.
    4. Przykryj dużą szalkę Petriego i inkubuj hodowle komórkowe przez 1 h w RT.
  4. W przypadku skrawków tkanki:
    1. Ostrożnie dodaj 250 µL roztworu przeciwciał pierwszorzędowych do swobodnie pływających skrawków w płytce 24-dołkowej.
    2. Przykryj płytkę i inkubuj tkankę przez noc w 4 °C przy łagodnym mieszaniu na wytrząsarce orbitalnej.

4. Przemyj próbki, a następnie inkubuj z przeciwciałami wtórnymi

  1. Przygotuj przeciwciała wtórne w buforze blokującym:
    1. Przygotuj przeciwciała osioł anty-mysie (1:5), osioł anty-królicze (1:5), osioł anty-kurze (1:400).
    2. Na tym etapie można uzyskać dodatkowe kontrole techniczne, przygotowując alikwot wtórny z pominięciem przeciwciał anty-mysich lub anty-króliczych.
  2. W przypadku hodowlanych komórek:
    1. Używając pęsety, ostrożnie usuń roztwór przeciwciał pierwszorzędowych z szkiełek nakrywkowych, odsączając go ręcznikiem papierowym
    2. Używając pęsety, ostrożnie przenieś szkiełka nakrywkowe z powrotem do oryginalnej płytki 24-dołkowej wypełnionej 500 µL 1x PBS.
  3. W przypadku skrawków tkanki:
    1. Ostrożnie usuń roztwór przeciwciał pierwszorzędowych za pomocą plastikowej pipety Pasteura. Staraj się usunąć jak najwięcej, nie rozrywając tkanki.
    2. Dodaj 500 µL 1x PBS
  4. Myj próbki przez 10 min 3 razy w 1x PBS przy łagodnym mieszaniu na wytrząsarce orbitalnej. W tym czasie doprowadź wszystkie bufory do mycia do RT.
    1. W tym czasie wymień parafilm w dużej płytce Petriego
  5. W przypadku hodowlanych komórek:
    1. Używając pęsety, ostrożnie przenieś szkiełka nakrywkowe z powrotem do dużej płytki Petriego z parafilmem
    2. Ostrożnie dodaj 40 µL roztworu przeciwciał wtórnych na górną powierzchnię szkiełek nakrywkowych. Upewnij się, że roztwór przeciwciał wtórnych nie ścieka po bokach szkiełka.
    3. W razie potrzeby dodaj więcej wody ultrapurej do mniejszej płytki Petriego i ostrożnie ustaw małą płytkę wokół szkiełek nakrywkowych.
    4. Przykryj dużą płytkę Petriego
  6. W przypadku skrawków tkanki:
    1. Ostrożnie dodaj 250 µL roztworu przeciwciał wtórnych do swobodnie pływających skrawków w płytce 24-dołkowej.
    2. Przykryj płytkę
      UWAGA: Od tego momentu chronić próbki przed światłem, owijając górne części płytek folią.
  7. Inkubuj próbki w temperaturze 37 °C przez 1 h

5. Ligacja

  1. Wymieszać roztwór zapasowy do ligacji w stosunku 1:5 z wodą klasy molekularnej.
  2. Podobnie jak w sekcji 4, ostrożnie przenieść szkiełka podstawowe i usunąć mieszaninę wtórną z plastrów tkanki.
  3. Przemyć próbki w 500 µL buforu piorącego A
    1. W przypadku komórek hodowlanych przemywać 2 razy przez 5 min. W przypadku plastrów tkanki przemywać 2 razy przez 10 min. W obu przypadkach stosować łagodne wytrząsanie na wytrząsarce orbitalnej.
    2. W tym czasie wymienić parafilm w dużej szalce Petriego
  4. Trzymając ligazę w bloku chłodzącym, rozcieńczyć ligazę 1:40 w roztworze zapasowym do ligacji z kroku 5.1. Rozcieńczenie to należy wykonać bezpośrednio przed dodaniem ligazy do próbek.
  5. Podobnie jak w sekcji 4, przed dodaniem ligazy usunąć z próbek jak największą ilość buforu piorącego A.
  6. Dla komórek hodowlanych: Przenieść szkiełka podstawowe z powrotem do szalki Petriego z parafilmem. Dodać 40 µL mieszaniny do ligacji na szkiełka, ustawić małe szalki Petriego wypełnione wodą wokół szkiełek i przykryć dużą szalkę Petriego.
  7. Dla plastrów tkanki: Dodać 250 µL mieszaniny do ligacji z kroku 5.4 do każdego dołka i przykryć płytkę.
  8. Inkubować próbki przez 30 min w temperaturze 37 °C.

6. Amplifikacja

  1. Zmieszać roztwór zapasowy do amplifikacji w stosunku 1:5 z wodą klasy molekularnej.
  2. Podobnie jak w sekcji 4, ostrożnie przenieść szkiełka nakrywkowe i usunąć mieszaninę do ligacji z plastrów tkanki.
  3. Przemyć próbki w 500 µL buforu do płukania A
    1. W przypadku komórek hodowlanych płukać 2 razy po 2 min. W przypadku plastrów tkanki płukać 2 razy po 10 min. W obu przypadkach zastosować łagodne mieszanie na wytrząsarze orbitalnym.
    2. W tym czasie wymienić parafilm w dużej szalce Petriego
  4. Wykonać to rozcieńczenie bezpośrednio przed dodaniem polimerazy do próbek. Trzymając polimerazę w bloku chłodzącym, rozcieńczyć polimerazę
    1. W przypadku komórek hodowlanych rozcieńczyć polimerazę 1:80 w roztworze zapasowym do amplifikacji z kroku 6.1.
    2. W przypadku plastrów tkanki rozcieńczyć polimerazę 1:40 w roztworze zapasowym do amplifikacji z kroku 6.1.
  5. Podobnie jak w kroku 4, usunąć z próbek jak najwięcej buforu do płukania A przed dodaniem polimerazy.
  6. W przypadku komórek hodowlanych: Przenieść szkiełka nakrywkowe z powrotem do zabezpieczonej parafilmem szalki Petriego. Dodać do szkiełek 40 µL mieszaniny do amplifikacji z kroku 6.4.1, ustawić wokół szkiełek małe szalki Petriego wypełnione wodą i przykryć dużą szalkę Petriego. Inkubować próbki przez 100 min w temperaturze 37 °C.
  7. W przypadku plastrów tkanki: Dodać 250 µL mieszaniny do amplifikacji z kroku 6.4.2 do każdego dołka i przykryć płytkę. Inkubować próbki przez 2 h w temperaturze 37 °C.
    UWAGA: W tym czasie przygotować i opisać szkiełka.

7. Montowanie

  1. Podobnie jak w kroku 4, ostrożnie przenieś szkiełka nakrywkowe i usuń mieszaninę do amplifikacji z plasterków tkanki.
  2. Przemyj próbki w 500 µL buforu do płukania B 2 razy przez 10 min przy łagodnym wytrząsaniu na wytrząsarce orbitalnej.
  3. Przemyj próbki w 500 µL 1% buforu do płukania B przez 1 min przy łagodnym wytrząsaniu na wytrząsarce orbitalnej.
  4. W przypadku hodowli komórkowych:
    1. Naniesienie 3 µL medium montażowego na preparat
    2. Odsącz nadmiar buforu do płukania ze szkiełka nakrywkowego, a następnie umieść szkiełko nakrywkowe (komórkami skierowanymi w dół) w medium montażowym. Zabezpiecz brzegi niewielką ilością bezbarwnego laku do paznokci, aby utrwalić szkiełko nakrywkowe na miejscu.
  5. W przypadku plasterków tkanki:
    1. Ostrożnie przenieś plasterek tkanki na przygotowany preparat i ułóż go tak, aby plasterek leżał płasko. Naniesienie od 5-10 µL medium montażowego (ilość zależy od wielkości plasterka) na plasterek tkanki.
    2. Ostrożnie połóż szklane szkiełko nakrywkowe na plasterku tkanki i zabezpiecz krawędź niewielką ilością bezbarwnego laku do paznokci, aby utrwalić szkiełko nakrywkowe na miejscu.
  6. Odczekaj co najmniej 15 min przed analizą pod mikroskopem lub przechowuj w temperaturze -20 °C.

8. Pozyskanie obrazów cyfrowych za pomocą mikroskopu konfokalnego

  1. Zoptymalizuj ustawienia akwizycji (np. moc lasera, wzmocnienie, offset) dla próbek ze wszystkich grup badawczych. Upewnij się, że optymalizacja obejmuje zmniejszenie szumu tła i wzmocnienie sygnału bez doprowadzenia do nasycenia intensywności sygnałów fluorescencyjnych. Po ustaleniu ustawień zastosuj te same parametry akwizycji do wszystkich pozyskiwanych obrazów.
    UWAGA: Poniższe szczegóły akwizycji można zastosować przy użyciu mikroskopu konfokalnego Nikon A1 oraz oprogramowania Nikon NIS AR Elements.
  2. Umieść preparat z próbką na stoliku i za pomocą kanału DAPI przez okular znajdź płaszczyznę ogniskowania próbki.
  3. Wyłącz podgląd przez okular, klikając Eye port , a następnie wybierz przycisk konfiguracji optycznej, aby dostosować ustawienia.
  4. Dostosuj wzmocnienie, offset i moc lasera dla każdego kanału fluorescencyjnego, aby zmniejszyć szum tła i wzmocnić sygnał fluorescencyjny. Upewnij się, że sygnał fluorescencyjny nie ulegnie nasyceniu, zgodnie z opisem w krokach 8.5-8.6.
  5. Monitoruj nasycenie sygnału fluorescencyjnego za pomocą pseudokolorów. Na dole obrazu na żywo kliknij prawym przyciskiem myszy zakładkę oznaczoną aktualnie używanym kanałem fluorescencyjnym.
  6. Następnie wybierz Channel Coloring i wybierz pseudokolor taki jak Rainbow Dark, aby zwizualizować intensywność fluorescencji w formie mapy ciepła. W trybie Rainbow Dark chłodniejsze kolory wskazują mniejszą intensywność fluorescencji, a cieplejsze kolory większą intensywność.
  7. Po zoptymalizowaniu wszystkich kanałów fluorescencyjnych kliknij prawym przyciskiem myszy wcześniej wybrany przycisk konfiguracji optycznej i wybierz Assign Current Camera Setting dla tego przycisku.
  8. Zweryfikuj, czy wybrane ustawienia są odpowiednie dla losowej próbki z każdej grupy badawczej. Jeśli wybrane ustawienia powodują nasycenie którejkolwiek z tych próbek, powtórz krok 8.4 w celu wyeliminowania nasycenia.
  9. W przypadku neuronów hodowlanych wykonaj kroki 8.10-8.16.
  10. Za pomocą podglądu przez okular wyszukaj neuron z dendrytami, które wykazują minimalne nakładanie się na inne dendryty.
  11. Wyłącz podgląd przez okular i użyj kanału DAPI, aby zwizualizować ciało komórkowe wybranego neuronu. Kliknij dwukrotnie w centrum somy, aby wyśrodkować neuron w polu widzenia.
  12. Używając kanału MAP2, znajdź najlepszą płaszczyznę ogniskowania dla sygnału MAP2 podczas skanowania na żywo.
  13. W zakładce ND Acquisition kliknij Save to File, a następnie w oknie Browse wybierz plik, w którym ma zostać zapisany obraz. Następnie wprowadź nazwę pliku.
  14. W zakładce Z wybierz opcję Symmetric Mode Defined by Range. Ustaw ostrość na najlepszej płaszczyźnie MAP2 i kliknij przycisk Relative button, aby ustawić tę płaszczyznę ogniskowania jako środek stosu z (z-stack).
  15. Ustaw zakres na 5 µm z krokiem 1 µm i upewnij się, że zaznaczono opcję Close Active Shutter During Z Movement. W zakładce Wavelength wybierz nazwę przycisku optycznego z wcześniej skonfigurowanymi ustawieniami akwizycji w polu Optical Conf. Następnie kliknij Run Now.
  16. Powtórz kroki 8.1.10-8.1.15 dla około 10 neuronów na szkiełko podstawne/grupę badawczą.
  17. W przypadku skrawków tkanki wykonaj kroki 8.18-8.22.
  18. Za pomocą podglądu przez okular wyszukaj obszar zainteresowania. Na przykład zlokalizuj obszar CA1 hipokampa.
  19. Wyłącz podgląd przez okular i użyj kanału MAP2, aby podczas skanowania na żywo znaleźć najlepszą płaszczyznę ogniskowania dla sygnału MAP2.
  20. W menu Acquire wybierz Scan Large Image. Następnie, z otwartego panelu, w sekcji Capturing wybierz nazwę przycisku optycznego z wcześniej skonfigurowanymi ustawieniami akwizycji. Upewnij się również, że w tym panelu wybrano odpowiedni obiektyw.
  21. W panelu Area oraz za pomocą okularu użyj klawiszy strzałek, aby ustawić granice obszaru zainteresowania. Następnie kliknij Save Large Image to File i utwórz ścieżkę zapisu oraz nazwę pliku dla obrazu.
  22. W panelu Setup upewnij się, że opcja Multichannel Capture jest zaznaczona, a następnie w polu Optical Conf wybierz nazwę przycisku optycznego z wcześniej skonfigurowanymi ustawieniami akwizycji.
    UWAGA: Możliwe jest wykonanie stosu z (z-stack) dla dużego obrazu, ale zwiększy to czas skanowania.

9. Analiza

  1. Podobnie jak w przypadku ustawień akwizycji, należy wykorzystać próbki ze wszystkich grup badawczych w celu optymalizacji ustawień progu (threshold). Należy upewnić się, że optymalizacja progu koncentruje się na zmniejszeniu szumu tła i wzmocnieniu sygnału, bez doprowadzenia do nasycenia intensywności sygnałów fluorescencyjnych. Po ustaleniu tych ustawień należy zastosować te same wartości progu we wszystkich obrazach wykorzystywanych do analizy, zgodnie z opisem w krokach 9.2-9.3.
  2. W programie ImageJ opcja progu znajduje się w menu Image > Adjust > Threshold. Jeśli obraz ma ciemne tło, należy wybrać opcję Dark Background.
  3. Następnie należy dostosować górną i dolną granicę progu zgodnie z wcześniej ustalonymi zoptymalizowanymi ustawieniami, a następnie kliknąć Apply.
  4. W przypadku hodowli komórkowych należy użyć kanału MAP2 oraz narzędzia do ręcznego wyznaczania obszaru zainteresowania (ROI), aby narysować ROI dla każdego neuronu, obejmując dendryty i somę. W przypadku skrawków tkanki należy narysować ręczne ROI na obrazie skrawka, które obejmuje obszar zainteresowania (np. stratum radiatum obszaru CA1 w hipokampie).
  5. Należy wyznaczyć powierzchnię ROI. W programie ImageJ pomiar powierzchni wykonuje się w menu Analyze > Measure.
  6. Liczbę punktów (puncta) w obrębie każdego ROI należy wykryć za pomocą narzędzia do automatycznej detekcji, takiego jak Particle Analysis w programie ImageJ, zgodnie z krokami 9.7-9.9.
  7. Opcję Particle Analysis znajduje się w menu Analyze > Analyze Particles. W pierwszej kolejności należy zdefiniować średnicę rozmiaru punktów, zazwyczaj od 0,1-3 µm2.
  8. Następnie z rozwijanego menu Show należy wybrać opcję Overlay Masks i zaznaczyć opcję Display Results. Następnie należy kliknąć OK.
  9. Jeśli punkty nie zostaną wykryte w wybranym zakresie średnic, należy korygować ten zakres do momentu wykrycia wszystkich punktów w analizie. Należy pamiętać o zastosowaniu tych samych ustawień Particle Analysis dla wszystkich obrazów.
  10. Liczbę punktów należy podzielić przez powierzchnię poszczególnego obszaru zainteresowania, postępując zgodnie z krokami 9.11-9.13.
  11. Wyniki dla każdego obrazu należy skopiować z okna Results w programie ImageJ i wkleić do arkusza kalkulacyjnego.
  12. W pierwszej kolejności należy zidentyfikować, z którego pliku i próbki pochodzą dane. Następnie należy podzielić powierzchnię ROI przez liczbę punktów.
  13. Następnie należy wyczyścić dane z okna Results i powtórzyć kroki 9.2-9.12.
  14. Normalizacja wyników względem próbek kontrolnych: Należy obliczyć średnią wyników (liczba punktów/powierzchnia ROI) dla próbek kontrolnych. Następnie wyniki wszystkich próbek należy podzielić przez średnią z grupy kontrolnej, aby uzyskać wyniki znormalizowane. Nowa średnia dla próbek kontrolnych powinna wynosić 1.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Dane zmodyfikowane na podstawie pracy Heaney i wsp.6 zostały przedstawione w celu zdemonstrowania eksperymentu, w którym oczekiwany jest wzrost tworzenia synaps (więcej informacji oraz bardziej szczegółową dyskusję nad mechanizmem można znaleźć w 6). Wcześniej wykazano, że szybkodziałające leki przeciwdepresyjne wymagają aktywacji hamującego receptora metabotropowego GABAB (podtyp B kwasu gamma-aminomasłowego), aby były skuteczne13. Ponadto wcześniej...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

DetectSyn to szybki test, który wykorzystuje test ligacji zbliżeniowej do wykrywania białek w odległości 40 nm od siebie, co pozwala na wykrycie tworzenia synaps. Technika ta ulepsza obecne testy fluorescencyjne, które służą jedynie jako pomiary zastępcze do tworzenia synaps. DetectSyn wykrywa mierzalne zmiany w białkach synaptycznych zlokalizowanych w promieniu 40 nm, tj. w obrębie szczeliny synaptycznej, od siebie. Co więcej, DetectSyn jest bardziej opłacalny i zajmuje mniej czasu niż techniki, takie jak mikroskopia el...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie zgłaszają konfliktu interesów.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez National Institutes of Health NINDS R01 NS105005 (KRG) i NS105005-03S1 (KRG), Departament Obrony USAMRMC W81XWH-14-1-0061 (KRG), NIAAA R01AA016852, NIAAA T32AA007565 (CFH), oraz grant od FRAXA Research (CFH) i Alzheimer's Association, AARG-NTF-21-852843 (KRG), AARF-19-614794-RAPID (KRG).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
10xPBS Fisher ScientificBP39920PBS również wykonane we własnym zakresie.
Płytki 24-dołkoweFisher ScientificFB012929W przypadku plastrów tkanek wstępnie wysterylizowane płytki mogą być zbędne.
Probówki stożkowe 50 mlFisher Scientific14-432-22
Folia aluminiowaFisher Scientific15-078-290
Przeciwciało anty-MAP2 kurczakaAbcamab5392
Bezbarwny lakier do paznokciFisher ScientificNC1849418Inne przezroczyste lakiery do paznokci również działają.
Zimny blokFisher Scientific13131012
Komputerowa stacja roboczaHP
Mikroskop konfokalny lub fluorescencyjnyNikonA1R HD25
Osioł anty-kurczak FITCFisher ScientificSA1-72000
Duolink osioł anty-Myszy PLUSSigmaDUO92001
Duolink osioł anty-Królik MINUSSigmaDUO92005
Duolink Odczynniki do wykrywania in situ Far RedSigmaDUO92013Zawiera materiał do ligacji, zapas do amplifikacji, ligazę i polimerazę.
Duolink In Situ Medium montażowe z DAPISigmaDUO82040
Duolink In Situ Wash Buffers, FluorescenceSigmaDUO82049zawiera bufor do płukania A i bufor do płukania B; rozcieńczyć bufor do płukania B do 1% w diH20 dla 1% buforu do płukania B.
Pędzel z cienką końcówkąFisher Scientific NC9691026Włosy sobolowe, rozmiar 00 lub 000, można również znaleźć w sklepach rzemieślniczych
Fisherbrand Okulary przeciwsłoneczne: prostokątyFisher Scientific12545MPSzkło nakrywkowe nie jest konieczne w przypadku hodowanych neuronów już na szklanych szkiełkach nakrywkowych.
Szkiełka mikroskopowe Fisherbrand Superfrost PlusFisher Scientific1255015W przypadku hodowanych neuronów już na szklanych szkiełkach nakrywkowych, szkiełka Superfrost mogą być niepotrzebne.
Zamrażarka, -20° CVWR76449-108
Szkiełka nakrywkowe szklaneFisher Scientific125480
GlycineFisher ScientificBP381-1
Oprogramowanie do przetwarzania obrazu, np. NIS Elements, Inkubator ImageJ
Fisher Scientific15-015-2633
Duża szalka Petriego, 100mmFisher ScientificFB0875712
Woda klasy molekularnejFisher ScientificBP24701
Mysie przeciwciało anty-Synapsin1Systemy synaptyczne106-011
Normalna surowica osłaJackson ImmunoResearch017-000-121
Wytrząsarka orbitalnaFisher Scientific02-106-1013
ParafilmFisher Scientific13-374-10
Końcówki do pipetFisher Scientific02-707-025
PipetyFisher Scientific14-388-100Zakres objętości roboczej od 3 i mikro; L do 500 i mikro; L
Plastikowa pipeta PasteuraFisher Scientific02-708-006
Precyzyjna pęseta/forecepsFisher Scientific12-000-122
Królicze przeciwciało anty-PSD95Abcamab18258Inne pary przeciwciał mogą również działać z optymalizacją.
LodówkaVWR76470-402
Mała szalka Petriego, 60 mmFisher ScientificFB0875713A
TimerFisher Scientific14-649-17
Tween 20Fisher ScientificBP337-100

Bibliografia

  1. Südhof, T. C. Towards an understanding of synapse formation. Neuron. 100 (2), 276-293 (2018).
  2. Bliss, T. V., Collingridge, G. L. A synaptic model of memory: long-term potentiation in the hippocampus. Nature. 361 (6407), 31-39 (1993).
  3. Heaney, C. F., Raab-Graham, K. F. Dysregulated protein synthesis in major depressive disorder. The Oxford Handbook of Neuronal Protein Synthesis. , Oxford University Press. NY. 510-532 (2018).
  4. Masliah, E., Crews, L., Hansen, L. Synaptic remodeling during aging and in Alzheimer's disease. Journal of Alzheimer's Disease. 9, 91-99 (2006).
  5. van Spronsen, M., Hoogenraad, C. C. Synapse pathology in psychiatric and neurologic disease. Current Neurology and Neuroscience Reports. 10 (3), 207-214 (2010).
  6. Heaney, C. F., Namjoshi, S. V., Uneri, A., Bach, E. C., Weiner, J. L., Raab-Graham, K. F. Role of FMRP in rapid antidepressant effects and synapse regulation. Molecular Psychiatry. 26 (6), 2350-2362 (2021).
  7. Pchitskaya, E., Bezprozvanny, I. Dendritic spines shape analysis-Classification or clusterization? Perspective. Frontiers in Synaptic Neuroscience. 12, 31(2020).
  8. Alvarez, V. A., Sabatini, B. L. Anatomical and physiological plasticity of dendritic spines. Annual Review of Neuroscience. 30 (1), 79-97 (2007).
  9. Berry, K. P., Nedivi, E. Spine Dynamics: Are they all the same. Neuron. 96 (1), 43-55 (2017).
  10. Micheva, K. D., Smith, S. J. Array tomography: A new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits. Neuron. 55 (1), 25-36 (2007).
  11. Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nature Protocols. 1 (5), 2406-2415 (2006).
  12. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), e3564(2012).
  13. Workman, E. R., Niere, F., Raab-Graham, K. F. mTORC1-dependent protein synthesis underlying rapid antidepressant effect requires GABABR signaling. Neuropharmacology. 73, 192-203 (2013).
  14. Li, N., et al. mTOR-dependent synapse formation underlies the rapid antidepressant effects of NMDA antagonists. Science. 329 (5994), 959-964 (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Analiza ligacji w bliskościmikroskopia fluorescencyjnatworzenie synapseliminacja synapsobrazowanie konfokalnehodowane neuronyutrwalone skrawki tkanekdetekcja punktówanaliza w programie ImageJ
DetectSyn: szybka, bezstronna metoda fluorescencyjna do wykrywania zmian w gęstości synaps
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.