DetectSyn: szybka, bezstronna metoda fluorescencyjna do wykrywania zmian w gęstości synaps

Podsumowanie

DetectSyn to bezstronny, szybki test fluorescencyjny, który mierzy zmiany we względnej liczbie synaps (zaangażowanie pre- i postsynaptyczne) w różnych terapiach lub stanach chorobowych. Technika ta wykorzystuje technikę ligacji zbliżeniowej, która może być stosowana zarówno w hodowanych neuronach, jak i w tkance stałej.

Streszczenie

Synapsy są miejscem komunikacji między neuronami. Siła obwodu neuronalnego jest związana z gęstością synaps, a rozpad synaps jest charakterystyczny dla stanów chorobowych, takich jak duże zaburzenie depresyjne (MDD) i choroba Alzheimera. Tradycyjne techniki badania liczby synaps obejmują ekspresję genetyczną markerów fluorescencyjnych (np. białka zielonej fluorescencji (GFP)), barwników wypełniających neuron (np. barwnik karbocyjaninowy, DiI) oraz immunofluorescencyjne wykrywanie markerów kręgosłupa (np. gęstość postsynaptyczna 95 (PSD95)). Głównym zastrzeżeniem do tych technik proxy jest to, że identyfikują one tylko zmiany postsynaptyczne. Jednak synapsa jest połączeniem między zakończeniem presynaptycznym a kręgosłupem postsynaptycznym. Złoty standard pomiaru powstawania/eliminacji synaps wymaga czasochłonnych technik mikroskopii elektronowej lub tomografii matrycowej. Techniki te wymagają specjalistycznego szkolenia i kosztownego sprzętu. Co więcej, tylko ograniczona liczba neuronów może być oceniona i jest używana do reprezentowania zmian w całym regionie mózgu. DetectSyn to szybka technika fluorescencyjna, która identyfikuje zmiany w tworzeniu lub eliminacji synaps spowodowane stanem chorobowym lub aktywnością leku. DetectSyn wykorzystuje szybki test ligacji zbliżeniowej do wykrywania zestawionych białek pre- i postsynaptycznych oraz standardową mikroskopię fluorescencyjną, technikę łatwo dostępną dla większości laboratoriów. Fluorescencyjna detekcja powstałych punktów pozwala na szybką i bezstronną analizę eksperymentów. DetectSyn zapewnia bardziej reprezentatywne wyniki niż mikroskopia elektronowa, ponieważ można analizować większe obszary niż ograniczona liczba neuronów fluorescencyjnych. Co więcej, DetectSyn działa w przypadku neuronów hodowanych in vitro i utrwalonych wycinków tkanki. Na koniec przedstawiono metodę analizy danych zebranych za pomocą tej techniki. Ogólnie rzecz biorąc, DetectSyn oferuje procedurę wykrywania względnych zmian gęstości synaps w różnych terapiach lub stanach chorobowych i jest bardziej dostępny niż tradycyjne techniki.

Wprowadzenie

Synapsy są podstawową jednostką komunikacji między neuronami¹. Wiele synaps między neuronami w tych samych regionach powoduje powstawanie obwodów, które pośredniczą w zachowaniu². Synapsy składają się z zakończenia presynaptycznego z jednego neuronu, które uwalnia neuroprzekaźniki lub neuropeptydy, które przekazują informacje do receptorów postsynaptycznych innego neuronu. Suma sygnałów presynaptycznych określa, czy neuron postsynaptyczny wystrzeli potencjał czynnościowy i przekaże wiadomość do innych neuronów.

Synaptopatologia, rozpad synaps, występuje w chorobach i zaburzeniach charakteryzuj....

Protokół

Izolacja komórek i tkanek od zwierząt została przeprowadzona zgodnie z wytycznymi National Institutes of Health's Guide for the Care and Use of Laboratory Animals i została zatwierdzona przez Wake Forest Institutional Animal Care and Use Committee

UWAGA: Niniejszy protokół stosuje się do próbek, które zostały już poddane działaniu preparatów i utrwalone zgodnie z konkretnymi paradygmatami i wymogami eksperymentalnymi. W celach demonstracyjnych, aby zaprezentować tę technikę detekcji synaps, wykorzystano tworzenie synaps indukowane szybkim leczeniem przeciwdepresyjnym⁶. W celu przedstawienia procedur in vitro....

Wyniki

Dane zmodyfikowane na podstawie pracy Heaney i wsp.⁶ zostały przedstawione w celu zdemonstrowania eksperymentu, w którym oczekiwany jest wzrost tworzenia synaps (więcej informacji oraz bardziej szczegółową dyskusję nad mechanizmem można znaleźć w ⁶). Wcześniej wykazano, że szybkodziałające leki przeciwdepresyjne wymagają aktywacji hamującego receptora metabotropowego GABAB (podtyp B kwasu gamma-aminomasłowego), aby były skuteczne¹³. Ponadto wcześniej.......

Dyskusja

DetectSyn to szybki test, który wykorzystuje test ligacji zbliżeniowej do wykrywania białek w odległości 40 nm od siebie, co pozwala na wykrycie tworzenia synaps. Technika ta ulepsza obecne testy fluorescencyjne, które służą jedynie jako pomiary zastępcze do tworzenia synaps. DetectSyn wykrywa mierzalne zmiany w białkach synaptycznych zlokalizowanych w promieniu 40 nm, tj. w obrębie szczeliny synaptycznej, od siebie. Co więcej, DetectSyn jest bardziej opłacalny i zajmuje mniej czasu niż techniki, takie jak mikroskopia el.......

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
10x	PBS Fisher Scientific	BP39920	PBS również wykonane we własnym zakresie.
Płytki 24-dołkowe	Fisher Scientific	FB012929	W przypadku plastrów tkanek wstępnie wysterylizowane płytki mogą być zbędne.
Probówki stożkowe 50 ml	Fisher Scientific	14-432-22
Folia aluminiowa	Fisher Scientific	15-078-290
Przeciwciało anty-MAP2 kurczaka	Abcam	ab5392
Bezbarwny lakier do paznokci	Fisher Scientific	NC1849418	Inne przezroczyste lakiery do paznokci również działają.
Zimny blok	Fisher Scientific	13131012
Komputerowa stacja robocza	HP
Mikroskop konfokalny lub fluorescencyjny	Nikon	A1R HD25
Osioł anty-kurczak FITC	Fisher Scientific	SA1-72000
Duolink osioł anty-Myszy PLUS	Sigma	DUO92001
Duolink osioł anty-Królik MINUS	Sigma	DUO92005
Duolink Odczynniki do wykrywania in situ Far Red	Sigma	DUO92013	Zawiera materiał do ligacji, zapas do amplifikacji, ligazę i polimerazę.
Duolink In Situ Medium montażowe z DAPI	Sigma	DUO82040
Duolink In Situ Wash Buffers, Fluorescence	Sigma	DUO82049	zawiera bufor do płukania A i bufor do płukania B; rozcieńczyć bufor do płukania B do 1% w diH20 dla 1% buforu do płukania B.
Pędzel z cienką końcówką	Fisher Scientific NC9691026		Włosy sobolowe, rozmiar 00 lub 000, można również znaleźć w sklepach rzemieślniczych
Fisherbrand Okulary przeciwsłoneczne: prostokąty	Fisher Scientific	12545MP	Szkło nakrywkowe nie jest konieczne w przypadku hodowanych neuronów już na szklanych szkiełkach nakrywkowych.
Szkiełka mikroskopowe Fisherbrand Superfrost Plus	Fisher Scientific	1255015	W przypadku hodowanych neuronów już na szklanych szkiełkach nakrywkowych, szkiełka Superfrost mogą być niepotrzebne.
Zamrażarka, -20° C	VWR	76449-108
Szkiełka nakrywkowe szklane	Fisher Scientific	125480
Glycine	Fisher Scientific	BP381-1
Oprogramowanie do przetwarzania obrazu	, np. NIS Elements, Inkubator ImageJ
	Fisher Scientific	15-015-2633
Duża szalka Petriego, 100mm	Fisher Scientific	FB0875712
Woda klasy molekularnej	Fisher Scientific	BP24701
Mysie przeciwciało anty-Synapsin1	Systemy synaptyczne	106-011
Normalna surowica osła	Jackson ImmunoResearch	017-000-121
Wytrząsarka orbitalna	Fisher Scientific	02-106-1013
Parafilm	Fisher Scientific	13-374-10
Końcówki do pipet	Fisher Scientific	02-707-025
Pipety	Fisher Scientific	14-388-100	Zakres objętości roboczej od 3 i mikro; L do 500 i mikro; L
Plastikowa pipeta Pasteura	Fisher Scientific	02-708-006
Precyzyjna pęseta/foreceps	Fisher Scientific	12-000-122
Królicze przeciwciało anty-PSD95	Abcam	ab18258	Inne pary przeciwciał mogą również działać z optymalizacją.
Lodówka	VWR	76470-402
Mała szalka Petriego, 60 mm	Fisher Scientific	FB0875713A
Timer	Fisher Scientific	14-649-17
Tween 20	Fisher Scientific	BP337-100