Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wykorzystanie analizatora strumienia metabolicznego komórek w czasie rzeczywistym do monitorowania bioenergetyki osteoblastów

3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63142

⸱

1 marca 2022

 ,  , 
1Vanderbilt Center for Bone Biology, Division of Clinical Pharmacology, Vanderbilt University Medical Center, 2Department of Medicine, Division of Clinical Pharmacology, Vanderbilt University Medical Center, 3Department of Molecular Physiology and Biophysics, Vanderbilt University

W tym artykule

Podsumowanie

Test przepływu metabolicznego komórek w czasie rzeczywistym mierzy zużycie tlenu i stopień zakwaszenia zewnątrzkomórkowego, co odpowiada produkcji mitochondrialnego i glikolitycznego trifosforanu adenozyny, przy użyciu czujników pH i tlenu. W manuskrypcie wyjaśniono metodę pozwalającą zrozumieć stan energetyczny osteoblastów oraz charakterystykę i interpretację statusu bioenergetycznego komórek.

Streszczenie

Tworzenie kości przez osteoblasty jest niezbędnym procesem dla prawidłowego pozyskiwania kości i obrotu kostnego w celu utrzymania homeostazy szkieletu i ostatecznie zapobiegania złamaniom. W celu optymalizacji szczytowej masy kostnej i zwalczania różnych chorób układu mięśniowo-szkieletowego (tj. osteoporozy pomenopauzalnej, jadłowstrętu psychicznego, cukrzycy typu 1 i 2), w dziedzinie biologii kości podjęto niesamowite wysiłki, aby w pełni scharakteryzować osteoblasty w całym procesie różnicowania. Biorąc pod uwagę podstawową rolę dojrzałych osteoblastów w wydzielaniu białek macierzy i pęcherzyków mineralizacyjnych, zauważono, że procesy te wymagają niesamowitej ilości energii komórkowej, czyli adenozynotrójfosforanu (ATP). Ogólny stan energii komórkowej jest często określany jako bioenergetyka komórkowa i obejmuje szereg reakcji metabolicznych, które wyczuwają dostępność substratu w celu uzyskania ATP w celu zaspokojenia potrzeb komórkowych. W związku z tym obecna metoda szczegółowo opisuje proces izolowania pierwotnych, mysich komórek zrębu szpiku kostnego (BMSC) i monitorowania ich stanu bioenergetycznego za pomocą analizatora strumienia metabolicznego komórek w czasie rzeczywistym na różnych etapach różnicowania osteoblastów. Co ważne, dane te wykazały, że profil metaboliczny zmienia się dramatycznie podczas różnicowania osteoblastów. W związku z tym użycie tego fizjologicznie istotnego typu komórki jest konieczne, aby w pełni zrozumieć, w jaki sposób status bioenergetyczny komórki może regulować ogólną funkcję.

Wprowadzenie

Tworzenie kości przez osteoblasty towarzyszy skoordynowana destrukcja lub resorpcja kości przez osteoklasty. Równowaga między osteoblastyczną formacją kości a resorpcją osteoklastyczną jest procesem sprzężonym, opisującym obrót lub przebudowę kości, co jest niezbędne dla homeostazy szkieletowej. Dysfunkcja osteoblastów prowadzi do upośledzenia formowania kości i skutkuje różnymi chorobami, w tym osteoporozą1,2,3. Różnicowanie ex vivo/in vitro mezenchymalnych komórek macierzystych szpiku kostnego (BMSCs) w prekursory osteoblastów i dojrzałe osteoblasty prowadzi z czasem do tworzenia i odkładania zmineralizowanej macierzy kostnej w naczyniu hodowlanym4,5,6. Tworzenie kości przez osteoblasty wymaga znacznej ilości energii komórkowej. Wykazano w szczególności, że synteza i sekrecja kolagenu w dużym stopniu zależą od stosunku ATP:ADP w komórce, a transport i sekrecja zmineralizowanych pęcherzyków prawdopodobnie wymagają dodatkowego ATP7,8,9,10,11. Wielu badaczy udowodniło, że proces osteoblastogenezy oraz funkcja osteoblastów wymagają odpowiedniej podaży energii, aby zaspokoić zapotrzebowanie metaboliczne związane z formowaniem kości12,13,14,15,16. Celem niniejszej metody jest zatem charakterystyka stanu bioenergetycznego pierwotnych mysich komórek zrębowych podczas różnicowania w osteoblasty przy użyciu analizatora przepływu metabolicznego komórek w czasie rzeczywistym. Techniki te pomagają w lepszym zrozumieniu homeostazy szkieletowej, co w ostateczności może prowadzić do opracowania nowych opcji terapeutycznych zdolnych do leczenia zaburzeń szkieletu.

Analizator metabolicznego przepływu komórkowego w czasie rzeczywistym może być wykorzystywany do pomiaru szybkości zużycia tlenu (OCR) oraz szybkości zakwaszenia zewnątrzkomórkowego (ECAR) w żywych osteoblastach, co odpowiada odpowiednio mitochondrialnej i glikolitycznej produkcji ATP. Podstawą tej metodologii jest fakt, że podczas glikolizy, w procesie przekształcania glukozy w mleczan, uwalniany jest jeden jon H+ na cząsteczkę mleczanu, co zmienia pH medium, co znajduje odzwierciedlenie w wartościach ECAR. Z kolei podczas cyklu TCA (cyklu kwasu trójkarboksylowego) fosforylacja oksydacyjna via mitochondria produkuje CO2 poprzez wykorzystywanie lub zużywanie tlenu, zatem monitorowanie OCR odzwierciedla ten proces metaboliczny. Analizator mierzy jednocześnie i w czasie rzeczywistym zarówno OCR, jak i ECAR w mikrośrodowisku zewnątrzkomórkowym, co stwarza ogromny potencjał w badaniu bioenergetyki komórkowej6,17. Ponadto przeprowadzanie tych testów jest stosunkowo proste i łatwo modyfikowalne w zależności od celu eksperymentalnego. Podobne techniki były stosowane w celu lepszego zrozumienia regulacji metabolicznej limfocytów T w układzie odpornościowym18,19, inicjacji i progresji nowotworów20, a także w badaniach nad wieloma innymi typami komórek przyczyniającymi się do zespołów metabolicznych21,22.

Zalety analizatora strumieni metabolicznych w czasie rzeczywistym w porównaniu do alternatywnych technik obejmują (1) możliwość pomiaru bioenergetyki komórkowej żywych komórek w czasie rzeczywistym, (2) zdolność do przeprowadzania analiz przy stosunkowo niewielkiej liczbie komórek (wymagane jest zaledwie 5 000 komórek), (3) porty wtryskowe umożliwiające równoległe wprowadzanie wielu substancji testowych w wysokoprzepustowym systemie 96-dołkowym, (4) zastosowanie zautomatyzowanego obrazowania komórek bez użycia znaczników radioaktywnych w celu normalizacji18,23,24. Poniższe metody mają na celu zapewnienie ogólnego, lecz szczegółowego opisu monitorowania bioenergetyki komórkowej w mysich BMSCs podczas różnicowania w osteoblasty z wykorzystaniem tego analizatora. Opis obejmie rutynowo wykonywane analizy; jednak, jak w przypadku wielu technik i metod, zaleca się, aby poszczególne laboratoria samodzielnie określiły szczegóły specyficzne dla swoich eksperymentów.

Wybór analizy oraz dostępne rodzaje analiz: Dostępna jest szeroka gama zestawów do analiz i odczynników pozwalających na badanie bioenergetyki komórek przy jednoczesnym zapewnieniu wiarygodności i spójności wyników eksperymentalnych. Ponadto oprogramowanie komputerowe oferuje szablony analiz, które można łatwo dostosować. Analizę można zdefiniować w zależności od potrzeb użytkownika, aby zmierzyć różne parametry metaboliczne. Analizy te można modyfikować na różne sposoby, w zależności od celu eksperymentalnego i/lub pytania naukowego. Na przykład, dzięki czterem portom wtryskowym do medium analitycznego można wprowadzić wiele związków w celu analizy odpowiedzi komórkowej specyficznej dla każdego szlaku metabolicznego.

Test fenotypu energetycznego komórek: Ten test mierzy fenotyp metaboliczny oraz potencjał metaboliczny żywych komórek. Jest on również zalecany jako pierwszy krok w celu uzyskania ogólnego obrazu metabolizmu specyficznego dla danej ścieżki. Aby zbadać potencjał energetyczny komórek, wstrzykuje się mieszaninę oligomycyny A – inhibitora syntazy ATP – oraz cyjanorku karbonylowego 4-(trifluorometoksy) fenylohydrazonu (FCCP), który jest czynnikiem rozprzęgającym mitochondrialnym. Wstrzyknięcie oligomycyny A hamuje syntezę ATP, co prowadzi do zwiększenia tempa glikolizy (ECAR), aby umożliwić komórkom zaspokojenie ich zapotrzebowania energetycznego; z kolei wstrzyknięcie FCCP skutkuje wyższym OCR ze względu na depolaryzację błony mitochondrialnej. W istocie test ten obrazuje podstawowe oddychanie metaboliczne, a po podwójnych wstrzyknięciach, impulsach lub stresach – odpowiedź metaboliczną. Na podstawie tych parametrów oprogramowanie wykreśla OCR i ECAR komórek, klasyfikując je w czasie jako będące w stanie tlenowym, spoczynkowym, glikolitycznym lub energetycznym25,26.

Analiza tempa produkcji ATP w czasie rzeczywistym: Metoda ta pozwala na jednoczesny pomiar komórkowej produkcji ATP pochodzącej z glikolizy oraz oddychania mitochondrialnego. Analiza ta ilościowo mierzy przesunięcia metaboliczne między tymi dwiema ścieżkami energetycznymi i dostarcza danych na temat tempa produkcji ATP mitochondrialnego i glikolitycznego w czasie. W badaniu uzyskuje się podstawowe dane OCR i ECAR, a następnie oblicza tempo produkcji ATP mitochondrialnego poprzez wstrzyknięcie oligomycyny A oraz tempo produkcji ATP glikolitycznego poprzez wstrzyknięcie mieszaniny rotenonu i antymycyny A (całkowite zahamowanie funkcji mitochondriów), co prowadzi do zakwaszenia mitochondrialnego17,27.

Test stresu mitochondriów komórkowych (lub test stresu mito komórkowego): Metoda ta służy do pomiaru funkcji mitochondriów poprzez oddychanie powiązane z ATP, kwantyfikacji bioenergetyki komórkowej, identyfikacji dysfunkcji mitochondriów oraz pomiaru odpowiedzi komórek na stres. W ramach jednego testu można uzyskać różne parametry, w tym bazową i rezerwową pojemność oddechową, oddychanie powiązane z ATP, oddychanie maksymalne oraz niemitochondrialne zużycie tlenu. Analiza ta obejmuje sekwencyjne wstrzykiwanie oligomycyny A, FCCP (odsprzęgacza mitochondriów) oraz mieszaniny inhibitorów rotenonu/antymycyny A w celu efektywnego zbadania ich wpływu na funkcje mitochondriów28.

Test elastyczności wykorzystania paliw mitochondrialnych (Flexibility mito fuel flex test): Metoda ta mierzy tempo oddychania mitochondrialnego poprzez utlenianie trzech głównych paliw mitochondrialnych w obecności i przy braku ich inhibitorów. Sekwencyjne hamowanie utleniania glukozy, glutaminy oraz kwasów tłuszczowych pomaga w pomiarze zależności, wydajności i elastyczności komórek, a także zależności komórek od różnych szlaków komórkowych w celu zaspokojenia zapotrzebowania energetycznego. Gdy mitochondria nie są w stanie zaspokoić zapotrzebowania zablokowanego szlaku za pomocą utleniania innych paliw, komórki wchodzą w stan zależności. Wydajność komórek oblicza się poprzez zahamowanie dwóch pozostałych alternatywnych szlaków, a następnie zahamowanie szlaku badanego. Elastyczność komórek pozwala zrozumieć zdolność mitochondriów do kompensacji i zaspokojenia zapotrzebowania na paliwo w zablokowanym szlaku. Oblicza się ją poprzez odjęcie wartości zależności komórek od ich wydajności. Do skutecznego obliczenia parametrów testu stosuje się trzy różne inhibitory, oddzielnie lub w mieszaninach po dwa. Kwas 2-cyjano-3-(1-fenylo-1H-indol-3-yl)-2-propenowy (UK5099) hamuje utlenianie glukozy poprzez blokowanie transportera pirogronianu w glikolizie. Bis-2-(5-fenyloacetamido-1,3,4-tiadiazol-2-yl) (BPTES) siarczek etylu hamuje szlak utleniania glutaminy, a etomoksyra hamuje utlenianie długołańcuchowych kwasów tłuszczowych29.

Proces różnicowania hodowli BMSC do osteoblastów w czasie rzeczywistym w analizie strumienia z użyciem obrazowania mikropłytek.
Rycina 1: Schematyczne przedstawienie metodologii hodowli i przygotowania osteoblastów do analizy. Mysie BMSC są izolowane z kości długich, hodowane i wysiewane na płytki 96-dołkowe z gęstością 25,000 komórek/dołek. Hodowlę tych komórek w specyficznym medium dla osteoblastów rozpoczyna się po osiągnięciu 80%-100% konfluencji, aby zainicjować ich różnicowanie. Analizy są przeprowadzane na różnych etapach różnicowania. Płytki kartridżowe są nawilżane na jeden dzień przed analizą. W dniu analizy do portów kartridży sensorowych wstrzykuje się różne inhibitory, zgodnie z wymaganiami analizy, a do 96-dołkowej płytki kalibracyjnej dodaje się bufor kalibracyjny. Po kalibracji przeprowadza się analizę metabolicznego strumienia komórkowego w czasie rzeczywistym, a następnie wykonuje obrazowanie mikropłytki z hodowlą komórkową za pomocą obrazownika mikropłytek, aby znormalizować dane z analizatora metabolicznego strumienia komórkowego w czasie rzeczywistym względem liczby komórek. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi i za zgodą Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (Institutional Animal Care and Use Committee) w Vanderbilt University Medical Center.

1. Przygotowanie odczynników i konfiguracja testu

  1. Izolacja i hodowla mezenchymalnych komórek szpiku kostnego (patrz również poprzedni artykuł30).
    1. Przygotować kompletną pożywkę αMEM (minimum essential media z modyfikacją alfa), uzupełniając pożywkę αMEM o 10% FBS (płodowa surowica bydlęca), 100 U/mL penicyliny oraz 100 µg/mL streptomycyny.
    2. Przygotować probówkę do pobierania szpiku, przycinając koniec probówki do mikrowirówki o pojemności 0.6 mL w taki sposób, aby komórki mogły przez nią przejść, a następnie umieścić ją w probówce do mikrowirówki o pojemności 1.5 mL zawierającej 100 µL kompletnej pożywki αMEM.
    3. Uśmiercić myszy za pomocą CO2 w następujący sposób: umieścić zwierzę w komorze z CO2 na 2-3 min lub do momentu ustania oddechu. Odczekać co najmniej 1 min po utracie przytomności przez zwierzę, a następnie wyjąć myszy z komory i przeprowadzić zwichnięcie szyi.
    4. Za pomocą sterylnej pęsety i nożyczek rozciąć dolną część brzucha uśmierconych myszy, wykonując niewielkie nacięcie. Wyizolować kości długie (kość udową, piszczelową oraz grzebień biodrowy) myszy.
    5. Przyciąć kości długie, aby usunąć wszystkie tkanki miękkie. Po oczyszczeniu kości odciąć około 1-2 mm z końców dystalnych i proksymalnych, aby stworzyć otwór umożliwiający wypłukanie szpiku.
      UWAGA: Otwór ten powinien być niewielki, aby uniknąć utraty szpiku, jednocześnie umożliwiając jego wypłukanie.
    6. Umieścić kości w probówce zbiorczej zawierającej 100 µL 1x sterylnego PBS (bufor fosforanowy), aby wyizolować całkowity szpik kostny.
    7. Wypłukać szpik poprzez wirowanie przy 10,000 x g przez 15-20 s w temperaturze pokojowej. Komórki szpiku osiądą w postaci pelletu na dnie probówki.
    8. Powtarzać wirowanie do momentu, aż jam szpikowych będą białe i pozbawione większości elementów szpiku. Resuspendować zmieszaną populację szpiku kostnego, delikatnie pipetując ciecz w górę i w dół.
    9. Hodować komórki od jednego zwierzęcia (obie kości udowe i piszczelowe) w kolbie hodowlanej o powierzchni 75 cm2 w 10 mL pożywki hodowlanej i inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze do hodowli komórkowych z 5% CO2. W przypadku łączenia komórek od 2-3 zwierząt zaleca się użycie kolby hodowlanej o powierzchni 150 cm2.
    10. Po 24-48 h inkubacji zmieszanej populacji odpisać nieprzylegającą populację komórek hematopoetycznych zawieszoną w pożywce i przemyć przylegające komórki 1x PBS.
  2. Wysiew komórek BMSC i różnicowanie osteoblastów
    1. Trypsynizować przylegające komórki, dodając odpowiednią ilość 0,25% trypsyny-EDTA (około 3-4 mL), aby lekko zakryć powierzchnię kolby, a następnie inkubować przez 3 min w temperaturze 37 °C.
    2. Dodać do kolby z trypsyną 6-7 mL kompletnej pożywki αMEM, aby resuspendować przylegające BMSC poprzez ostrożne pipetowanie w górę i w dół. Przenieść zawiesinę BMSC do stożkowej probówki wirówkowej.
    3. Pobrać 50 µL zawiesiny BMSC i dodać do niej 50 µL błękitu trypanu (rozcieńczenie 1:1). Policzyć całkowitą liczbę żywych komórek, które nie wchłonęły barwnika, pipetując 10 µL tej mieszaniny na komorę countingową (hemocytometr) i obserwując ją pod mikroskopem. Nie liczyć martwych lub niezdrowych komórek, które są zabarwione na niebiesko (<10% komórek).
    4. Na podstawie liczby komórek obliczyć objętość zawiesiny komórkowej w kompletnej pożywce αMEM potrzebną do uzyskania końcowego stężenia 2.4 x 106 komórek/mL przy całkowitej objętości co najmniej 10 mL na płytkę.

Ustawienie płytki do analizy Seahorse w celu pomiaru tempa oddychania komórkowego oraz identyfikacja kodem kreskowym.
Rysunek 2: Mikropłytka do hodowli komórek, zaprojektowana specjalnie do analizatora. (A) Zaznaczono cztery dołki do korekcji tła: A1, A12, H1, H12. Dołki te zawierają wyłącznie medium analityczne bez komórek. (B) Kod kreskowy z boku płytki, służący do skanowania płytki za pomocą czytnika obrazu i analizatora. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

  1. Odwiruj komórki w probówce stożkowej przy 1,000 x g przez 5 min i resuspenduj je do pożądanego stężenia końcowego 2.4 x 106 komórek/mL.
  2. Przenieś zawiesinę komórkową do zbiornika i za pomocą pipety wielokanałowej ostrożnie resuspenduj komórki, aby zapewnić uzyskanie homogenicznej mieszaniny.
  3. Wysiej 2.5 x 104 komórek na dołek w 96-dołkowej mikropłytce hodowlanej w 80 µL kompletnego αMEM. Nie wysiewaj komórek do dołków służących do korekcji tła (A1, A12, H1, H12); do tych czterech dołków dodaj jedynie pożywkę.
    UWAGA: BMSCs do analiz są wysiewane w 96-dołkowej mikropłytce hodowlanej przeznaczonej do analizatora, stosowanej wraz z kartridżami sensorowymi. Powierzchnia tych płytek różni się od powierzchni standardowej płytki 96-dołkowej. Powierzchnia każdego dołka w płytce wynosi 0.106 cm2, co stanowi około 40% powierzchni typowej płytki 96-dołkowej. Optymalna gęstość wysiewu komórek jest dobierana w zależności od typu komórek. Zazwyczaj analizator może wykryć od 0.5-4 x 104 komórek na dołek. Osteoblasty muszą być w kontakcie, aby efektywnie różnicować; w tym celu wybrano wysiew od 2.0 x 104-3.0 x 104 BMSCs/dołek w 80 µL kompletnego αMEM.
  4. Delikatnie potrząśnij płytką, aby zapewnić równomierny rozkład komórek w dołkach, i inkubuj w 37 °C, 5% CO2. Po 48 h sprawdź wzrost komórek oraz stopień ich konfluencji pod mikroskopem. W razie potrzeby wymień pożywkę hodowlaną.
  5. W zależności od celu analizy, gdy BMSCs osiągną 60%-80% konfluencji (zazwyczaj po 48-72 h), zainicjuj różnicowanie osteoblastów poprzez zmianę pożywki hodowlanej na pożywkę do różnicowania osteoblastów (kompletne αMEM uzupełnione o 5 mM β-glycerol phosphate i 50 µg/mL kwasu L-askorbinowego).
  6. Jeśli analizowane mają być nieróżnicowane komórki zrębu (Dzień 0), utrzymuj komórki w kompletnym αMEM.
  7. Wymieniaj pożywkę do różnicowania osteoblastów co drugi dzień i obserwuj komórki pod mikroskopem, aby upewnić się, że są zdrowe aż do dnia analizy. Zaleca się, aby na 24 h przed planowaną analizą wymienić pożywkę i zachować spójny harmonogram jej wymiany.
    UWAGA: Pożywkę wymieniaj ostrożnie, lekko przechylając płytki pod kątem; zapobiega to przypadkowemu dotknięciu dołków końcówkami pipety i naruszeniu monowarstwy komórek.

2. Przygotowanie kartridża z sensorem do kalibracji przepływu zewnątrzkomórkowego

  1. Nawilż wkłady z czujnikami z zestawu do analizy zewnątrzkomórkowej przed dniem przeprowadzenia badania. Wyjmij wkłady z czujnikami (zielona płytka) i umieść czujniki dnem do góry.
  2. Za pomocą pipety wielokanałowej dodaj 200 µL H2O do każdego dołka płytki pomocniczej. Ostrożnie umieść wkłady z czujnikami z powrotem na płytce pomocniczej i inkubuj płytkę przez noc w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Producent zaleca inkubację wkładów z czujnikami w inkubatorze bez CO2 w temperaturze 37 °C przez noc. Może jednak dojść do znacznego odparowania z wkładów z czujnikami. W takim przypadku wkłady z czujnikami można inkubować w temperaturze pokojowej. Płytki te należy inkubować przez minimum 4 h i maksymalnie 72 h.
  3. W dniu badania usuń H2O z płytki pomocniczej i dodaj 200 µL kalibratora. Inkubuj płytkę pomocniczą przez co najmniej 1 h przed rozpoczęciem analizy.

3. Przygotowanie pożywek do analizatora strumienia metabolicznego komórek w czasie rzeczywistym

  1. Do przeprowadzenia analizy z użyciem BMSCs zaleca się stosowanie pożywki DMEM bez czerwieni fenolowej z uprzednio dostosowanym pH 7.4.
  2. Przygotować 80 mL pożywki do analizy, uzupełniając pożywkę DMEM o 1 mM pirogronianu sodu, 2 mM glutaminy, 10 mM glukozy, 200 nM insuliny oraz 50-200 µM kwasu oleinowego w BSA.
  3. Inkubować kompletną pożywkę do analizy w kąpieli wodnej w temperaturze 37 °C.

4. Przygotowanie związków do wkładów czujnikowych

  1. Rozmrozić oligomycynę A, rotenon i antymycynę A na lodzie. Przed użyciem wymieszać związki poprzez pipetowanie w górę i w dół w celu ich rozpuszczenia.
  2. Do każdej probówki dodać 3 mL przygotowanego medium do analizy, a następnie dodać odpowiedni związek – probówka A: 26,4 µL oligomycyny A o stężeniu 2,5 mM; probówka B: 3,1 µL rotenonu o stężeniu 12,67 mM + 4,1 µL antymycyny A o stężeniu 9,4 mM + 30 µL barwnika Hoechst.
  3. Wprowadzić inhibitory w stężeniu 10x do odpowiedniego portu. Wymagane końcowe stężenia roztworów do iniekcji to 2 µM oligomycyny A, 1 µM rotenonu i 4,1 µM antymycyny A.
    UWAGA: Hoechst jest dodawany do ostatniego portu iniekcyjnego w celu fluorescencyjnego barwienia jąder dla potrzeb obrazowania i normalizacji. Stężenia te mogą być optymalizowane w zależności od typu komórek.
  4. Do komórek w 180 µL medium do analizy wprowadzić 20 µL tych związków.

5. Przygotowanie mikropłytki do hodowli komórkowej do analizy

  1. Wyjmij mikroplate z hodowlą komórek z inkubatora 37 °C i obejrzy komórki pod mikroskopem.
  2. Wyjmij medium analityczne z kąpieli wodnej.
  3. Delikatnie przemyj komórki 200 µL medium analitycznego dwa razy, a następnie dodaj 200 µL medium analitycznego do każdego dołka.
    UWAGA: Po dodaniu końcowego medium analitycznego do komórek, czas do umieszczenia płytek w analizatorze jest kluczowy. W związku z tym nie rozpoczynaj wymiany medium, dopóki kolejne kroki nie zostaną wykonane w ciągu 1 h.
  4. Sprawdź komórki pod mikroskopem, aby upewnić się, że pozostają one przytwierdzone do dołków.
  5. Upewnij się, że komórki w dołkach D5 i E8 tworzą spójną monowarstwę i nie zostały wypłukane podczas etapu przemywania. Oprogramowanie do obrazowania komórek wykorzystuje te dwa dołki do ustawienia autofokusa i autoekspozycji.
    UWAGA: Producent zaleca inkubację płytki w inkubatorze 37 °C bez CO2 przez 1 h; ten krok można pominąć, jeśli preferowane jest obrazowanie zautomatyzowane. Na przykład imager mikroplatek utrzymuje te same warunki w zamkniętej komorze, a komórki mogą być obrazowane w polu jasnym.

6. Przygotowanie testu i obrazowanie

Interfejs oprogramowania do analizy danych metabolizmu komórkowego wyświetlający opcje szablonów dla procesów metabolicznych.
Rysunek 3: Oprogramowanie sterujące. Oprogramowanie weryfikuje połączenie z urządzeniem oraz ustawienie temperatury na 37 °C. Pliki szablonów dla różnych analiz, które można przeprowadzić za pomocą analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego, można wybrać w celu dalszej konfiguracji testu w zależności od celów eksperymentalnych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

  1. Otwórz oprogramowanie komputerowe na komputerze znajdującym się obok urządzenia.
  2. Sprawdź status połączenia w lewym dolnym rogu oprogramowania sterującego.
  3. Przejdź do sekcji Templates i wybierz plik szablonu XF ATP Rate Assay lub odpowiedni szablon analizy.
  4. Wybierz Group Definitions w górnej części ekranu i zdefiniuj grupy.
  5. Wybierz Plate Map Layout i przypisz studzienki zgodnie z zdefiniowanymi grupami.
  6. Zweryfikuj protokół urządzenia, upewnij się, że dodane związki są prawidłowo wymienione, i wprowadź informacje o projekcie do późniejszego odniesienia.
  7. Kliknij Run Assay; spowoduje to wyświetlenie prośby o wybranie miejsca zapisu pliku z wynikami.
  8. Wybierz lokalizację zapisu pliku z wynikami.
  9. Zapisz plik, podając datę analizy, i kliknij Start Run.
  10. Umieść kasetę z czujnikami oraz płytkę serwisową na tacy i kliknij I'm Ready, aby rozpocząć kalibrację.
  11. Przed rozpoczęciem kalibracji upewnij się, że pokrywa kasety została zdjęta, a kaseta z czujnikami jest umieszczona w prawidłowej orientacji na płytce serwisowej. Ten etap potrwa 10-20 min, a po jego zakończeniu oprogramowanie wyświetli okno dialogowe Load Cell Plate.

7. Uzyskanie obrazów w polu jasnym

UWAGA: Ten krok jest opcjonalny. Jeśli nie ma dostępnego sprzętu obrazującego, należy przejść do kroku 8.

Układ obrazowania komórek, schemat skanera fluorescencyjnego/w polu jasnym, wyświetlanie danych o liczbie komórek, 37°C.
Rycina 4: Oprogramowanie do obrazowania komórek komunikuje się z czytnikiem obrazującym za pośrednictwem komputera. Komórki w mikropłytce mogą być obrazowane przed i po analizie, a liczba komórek w studni jest wyznaczana po analizie w celu normalizacji danych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

  1. Uruchom oprogramowanie do obrazowania komórek na komputerze.
  2. Upewnij się, że system obrazowania mikropłytek jest włączony, a porty są podłączone do komputera.
  3. Sprawdź pasek stanu w lewym dolnym rogu ekranu, aby upewnić się, że temperatura jest ustawiona na 37 °C, a status połączenia jest podświetlony na zielono jako gotowy.
  4. Zeskanuj kod kreskowy płytki, aby rozpocząć proces obrazowania.
  5. Nadaj nazwę płytce z komórkami i kliknij Save (Pod tą nazwą zostaną zapisane zarówno obrazy w świetle przechodzącym, jak i obrazy fluorescencyjne). Kliknij Perform Brightfield Scan.
  6. Na następnym ekranie, w menu płytki i skanowania (plate and scan menu), wyświetlone zostaną opcje obrazowania. Przed przeprowadzeniem analizy wybierz Start Brightfield Scan.
  7. Umieść mikropłytkę z kulturą komórek wraz z pokrywą na uchwycie tacki i wyrównaj dołek A1 z oznaczeniem A1 Mark. Kliknij Close Tray.
  8. Pojawi się następny ekran — akwizycja obrazu w świetle przechodzącym (brightfield image acquisition) z mapą płytki. Kliknij Scan All Wells, co zainicjuje proces inicjalizacji systemu, a następnie skanowanie trwające od 30 do 35 min.
  9. Po zakończeniu skanowania w świetle przechodzącym wyjmij mikropłytkę z kulturą komórek i umieść ją w analizatorze w celu przeprowadzenia analizy.

8. Przeprowadzenie analizy

  1. Po zakończeniu kalibracji oprogramowanie wyświetla okno dialogowe Load Cell Plate.
  2. Kliknij Open Tray, aby zastąpić tackę serwisową mikropłytką do hodowli komórek. Upewnij się, że pokrywa została zdjęta, a studzienka A1 płytki jest skierowana w odpowiednią stronę.
  3. Następnie kliknij Load Cell Plate, aby rozpocząć analizę. Wkład z sensorem pozostanie wewnątrz analizatora na czas wstrzykiwań podczas analizy.
  4. Odczekaj, aż analiza się rozpocznie i zostanie wyświetlony szacowany czas jej zakończenia.
  5. Po zakończeniu analizy oprogramowanie wyświetla okno dialogowe Unload Sensor Cartridge. Kliknij Eject i wyjmij mikropłytkę do hodowli komórek z analizatora.
  6. Ostrożnie wyjmij wkład z sensorem i załóż pokrywę płytki z komórkami. Komórki są gotowe do obrazowania fluorescencyjnego i liczenia komórek.
  7. Po wyjęciu płytki z komórkami i wkładu z sensorem pojawi się okno dialogowe Assay Complete.
  8. Kliknij View Results, aby otworzyć plik z wynikami analizy i natychmiast znormalizować dane, lub kliknij Home.

9. Pozyskanie obrazów fluorescencyjnych i normalizacja

UWAGA: Ten krok jest opcjonalną, lecz preferowaną metodą normalizacji BMSCs oraz osteoblastów. W przypadku braku sprzętu do obrazowania należy zastosować inną metodę normalizacji, taką jak izolacja i kwantyfikacja białka lub DNA.

Badanie mikroskopowe pokazujące tworzenie kropel i wzór fluorescencji na obrazach w mikroskali.
Rycina 5: Reprezentatywne obrazy z oprogramowania do obrazowania wykorzystanego do normalizacji danych z testu. (A) Złożony obraz w polu jasnym pokazujący konfluencję komórek w całym dołku. (B) Złożony obraz fluorescencyjny pokazujący jądra osteoblastów barwione Hoechstem, wykorzystane do zliczania komórek w celu normalizacji wyników testu. Są to osteoblasty po 7 dniach różnicowania. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

  1. Po zakończeniu analizy należy zeskanować kod kreskowy płytki za pomocą ręcznego czytnika kodów kreskowych. Jeśli płytka została już zobrazowana, nie będzie wymagała nadania nowej nazwy.
  2. Należy wybrać opcję Fluorescence & Cell Count, umieścić płytkę z komórkami w uchwycie tacy i kliknąć Close Tray.
  3. W oknie akwizycji obrazu należy wybrać Scan All Wells, aby rozpocząć obrazowanie. Obrazowanie fluorescencyjne całej płytki trwa około 15-20 min. Należy zwrócić uwagę na zielony znacznik potwierdzający zakończenie skanowania.
  4. Należy przejrzeć obrazy fluorescencyjne oraz liczbę komórek w aplikacji do obrazowania i obrazowania komórkowego, klikając losowo w kilka studzienek.
    UWAGA: W prawym dolnym rogu ekranu znajduje się opcja wyświetlania policzonych komórek. Opcja ta pokazuje obraz z maską, wyróżniający policzone obiekty.
  5. Po zakończeniu obrazowania fluorescencyjnego należy wyeksportować obrazy do dalszych analiz.
  6. Po zakończeniu obrazowania i liczenia komórek należy otworzyć plik Results i kliknąć Normalize. Ekran normalizacji wyświetli układ płytki oraz opcję importu liczby komórek.
  7. Należy kliknąć Import, a następnie wybrać Apply, aby oprogramowanie stacjonarne automatycznie znormalizowało analizę na podstawie liczby komórek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wykresy potencjału energetycznego komórek przedstawiające szybkość produkcji ATP, oddychanie mitochondrialne oraz dane ECAR i OCR.
Rysunek 6: Reprezentatywne wykresy dla rutynowo wykonywanych analiz w celu zrozumienia profilu bioenergetycznego komórek grupy kontrolnej w porównaniu z grupą badaną wraz z odpowiednimi błędam...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Analizator strumienia metabolicznego komórek w czasie rzeczywistym może być używany do badania energetyki komórkowej w różnych warunkach. Protokół ilustruje skuteczną izolację BMSC, hodowlę komórek na odpowiednich płytkach do hodowli komórkowych oraz ich różnicowanie do dojrzałych osteoblastów, które można wykorzystać do różnych testów przy użyciu analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego. Ponadto szczegółowo wyjaśniono krytyczne etapy badania strumienia metabolicznego komórek w czasie rzeczywistym, w tym hydratację wkł...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Narodowy Instytut Zdrowia (NIH), Narodowy Instytut Zapalenia Stawów oraz Chorób Układu Mięśniowo-Szkieletowego i Skóry (NIAMS) Grant AR072123 oraz National Institute on Aging (NIA) Grant AG069795 (do ERR).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,25% Trypsyna EDTASigma-AldrichT4049
Kwas 2-cyjano-3-(1-fenylo-1H-indol-3-ylo)-2-propenowySigma - AldrichPZ0160UK5099
Antymycyna ASigma - AldrichA8674
Kwas askorbinowySigma-AldrichA4544-100G
Siarczek bis-2-(5-fenyloacetamido-1,3,4-tiadiazol-2-ylo)etyluSigma - AldrichSML0601BPTES
4-(trifluorometoksy)fenylohydrazon cyjanku karbonyluSigma - AldrichC2920FCCP
Cytation 5BioTekN/AMicroplate
Hydrolat soli sodowej EtomoxirSigma - AldrichE1905
Hoechst 33342 Roztwór (20 mM)Thermo Scientific62249
InsulinaSigma - AldrichI6634
Kwas oleinowy-Albumina z surowicy bydlęcejSigma - AldrichO3008
Oligomycyna A - 5 mgSigma - Aldrich75351
RotenonSigma - AldrichR8875-1G
Seahorse XF 1.0 M Roztwór glukozyAgilent Technologies103577-100
Seahorse XF 100mM Pirogronian RozwiązanieAgilent Technologies103578-100
Seahorse XF 200mM Roztwór glutaminyAgilent Technologies103579-100
Seahorse XF Pożywka DMEMAgilent Technologies103575-100Pożywka do oznaczania DMEM o napięciu 5 mM HEPES, pH 7,4, bez czerwieni fenolowej, wodorowęglanu sodu, glukozy, pirogronianu i L-glutaminy
Analizator Seahorse XFe96Agilent TechnologiesS7800BAnalizator strumienia metabolicznego w czasie rzeczywistym
Seahorse XFe96 FluxPakAgilent Technologies102416-100Zawiera wkłady z czujnikiem XFe96, mikropłytki do hodowli komórkowych i roztwór Seahorse XF Calibrant
Oprogramowanie do obrazowania komórek 1.1.0.11Agilent Technologies - Oprogramowanie BioTek
Wave 2.6.1Agilent Technologies
β-fosforan gliceroluSigma-AldrichG9422-50G
Czytnik obrazowania

Bibliografia

  1. Rodan, G. A. Bone homeostasis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (23), 13361-13362 (1998).
  2. Nakahama, K. I. Cellular communications in bone homeostasis and repair. Cellular and Molecular Life Sciences. 67 (23), 4001-4009 (2010).
  3. Kim, J. M., Lin, C., Stavre, Z., Greenblatt, M. B., Shim, J. H. Osteoblast-osteoclast communication and bone homeostasis. Cells. 9 (9), 2073(2020).
  4. Gao, J., et al. SIRT3/SOD2 maintains osteoblast differentiation and bone formation by regulating mitochondrial stress. Cell Death and Differentiation. 25 (2), 229-240 (2018).
  5. Baron, R. Molecular mechanisms of bone resorption by the osteoclast. The Anatomical Record. 224 (2), 317-324 (1989).
  6. Tian, L., Rosen, C. J., Guntur, A. R. Mitochondrial Function and Metabolism of Cultured Skeletal Cells. Methods in Molecular Biology. 2230, Clifton, N.J. 437-447 (2021).
  7. Zanotelli, M. R., et al. Regulation of ATP utilization during metastatic cell migration by collagen architecture. Molecular Biology of the Cell. 29 (1), 1-9 (2018).
  8. Gonzales, S., Wang, C., Levene, H., Cheung, H. S., Huang, C. Y. C. ATP promotes extracellular matrix biosynthesis of intervertebral disc cells. Cell and Tissue Research. 359 (2), 635-642 (2015).
  9. Kruse, N. J., Bornstein, P. The metabolic requirements for transcellular movement and secretion of collagen. Journal of Biological Chemistry. 250 (13), 4841-4847 (1975).
  10. Rendina-Ruedy, E., Guntur, A. R., Rosen, C. J. Intracellular lipid droplets support osteoblast function. Adipocyte. 6 (3), 250-258 (2017).
  11. Sinnott-Armstrong, N., et al. A regulatory variant at 3q21.1 confers an increased pleiotropic risk for hyperglycemia and altered bone mineral density. Cell Metabolism. 33 (3), 615-628 (2021).
  12. Esen, E., Lee, S. Y., Wice, B. M., Long, F. PTH promotes bone anabolism by stimulating aerobic glycolysis via IGF signaling. Journal of Bone and Mineral Research. 30 (11), 1959-1968 (2015).
  13. Borle, A. B., Nichols, N., Nichols, G. Metabolic studies of bone in vitro: I. Normal bone. Journal of Biological Chemistry. 235, 1206-1210 (1960).
  14. Borle, A. B., Nichols, N., Nichols, G. Metabolic studies of bone in vitro: II. The metabolic patterns of accretion and resorption. Journal of Biological Chemistry. 235, 1211-1214 (1960).
  15. Adamek, G., Felix, R., Guenther, H. L., Fleisch, H. Fatty acid oxidation in bone tissue and bone cells in culture. Characterization and hormonal influences. The Biochemical Journal. 248 (1), 129-137 (1987).
  16. Frey, J. L., et al. Wnt-Lrp5 signaling regulates fatty acid metabolism in the osteoblast. Molecular and Cellular Biology. 35 (11), 1979-1991 (2015).
  17. Romero, N., Rogers, G., Neilson, A., Dranka, B. P. Quantifying cellular ATP production rate using agilent seahorse XF technology. , (2018).
  18. vander Windt, G., Chang, C., Pearce, E. Measuring bioenergetics in T cells using a Seahorse Extracellular Flux Analyzer. Current Protocols in Immunology. 113, 1(2016).
  19. Traba, J., Miozzo, P., Akkaya, B., Pierce, S. K., Akkaya, M. An optimized protocol to analyze glycolysis and mitochondrial respiration in lymphocytes. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (117), e54918(2016).
  20. Noel, P., et al. Preparation and metabolic assay of 3-dimensional spheroid co-cultures of pancreatic cancer cells and fibroblasts. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (126), e56081(2017).
  21. Nicholls, D., et al. Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (46), e2511(2010).
  22. Sakamuri, S. S. V. P., et al. Measurement of respiratory function in isolated cardiac mitochondria using Seahorse XFe24 Analyzer: applications for aging research. GeroScience. 40 (3), 347-356 (2018).
  23. What are the advantages of using Seahorse XF technology. , Available from: https://www.agilent.com/en/support/cell-analysis/advantages-of-using-xf-tech (2018).
  24. Horan, M. P., Pichaud, N., Ballard, J. W. O. Review: Quantifying mitochondrial dysfunction in complex diseases of aging. Journals of Gerontology - Series A Biological Sciences and Medical Sciences. 67 (10), 1022-1035 (2012).
  25. XF cell energy phenotype test. , Available from: https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-assay-kits-reagents-cell-assay-media/seahorse-xf-cell-energy-phenotype-test-kit-740884 (2021).
  26. Leung, D. T. H., Chu, S. Measurement of oxidative stress: Mitochondrial function using the seahorse system. Methods in Molecular Biology. 1710, Clifton, N.J. 285-293 (2018).
  27. XF ATP rate assay. , Available from: https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-assay-kits-reagents-cell-assay-media/seahorse-xf-cell-energy-phenotype-test-kit-740889 (2021).
  28. XF cell mito stress test. , Available from: https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-assay-kits-reagents-cell-assay-media/seahorse-xf-cell-energy-phenotype-test-kit-740885 (2021).
  29. XF cell mito fuel flex test. , Available from: https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-assay-kits-reagents-cell-assay-media/seahorse-xf-cell-energy-phenotype-test-kit-740888 (2021).
  30. Maridas, D. E., Rendina-Ruedy, E., Le, P. T., Rosen, C. J. Isolation, culture, and differentiation of bone marrow stromal cells and osteoclast progenitors from mice. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), e56750(2018).
  31. Wei, J., et al. Glucose uptake and Runx2 synergize to orchestrate osteoblast differentiation and bone formation. Cell. 161 (7), 1576-1591 (2015).
  32. Zoch, M. L., Abou, D. S., Clemens, T. L., Thorek, D. L. J., Riddle, R. C. In vivo radiometric analysis of glucose uptake and distribution in mouse bone. Bone Research. 4, 16004(2016).
  33. Divakaruni, A. S., Paradyse, A., Ferrick, D. A., Murphy, A. N., Jastroch, M. Analysis and interpretation of microplate-based oxygen consumption and pH data. Methods in Enzymology. 547, 309-354 (2014).
  34. Kam, Y., Jastromb, N., Clayton, J., Held, P., Dranka, B. Normalization of agilent seahorse XF data by in-situ cell counting using a BioTek cytation 5 application note. , (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Szybkość produkcji ATPkomórki zrębowe szpiku kostnegoróżnicowanie osteoblastówoddychanie mitochondrialneszybkość glikolizyenergetyka komórkowaXF ATP Rate Assayobrazowanie fluorescencyjne
Wykorzystanie analizatora strumienia metabolicznego komórek w czasie rzeczywistym do monitorowania bioenergetyki osteoblastów
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.