Artykuł metodologiczny

Drosophila melanogaster (Drosophila melanogaster) Protokół wstrzyknięcia larw

DOI:

10.3791/63144

⸱

19 października 2021

 ,  , 
1Infection and Innate Immunity Laboratory, Department of Biological Sciences, Institute for Biomedical Sciences, The George Washington University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dorosłe muchy Drosophila melanogaster były szeroko wykorzystywane jako organizmy modelowe do badania mechanizmów molekularnych leżących u podstaw wrodzonych odpowiedzi immunologicznych gospodarza i strategii infekcji mikrobiologicznej. Aby promować stadium larwy D. melanogaster jako dodatkowy lub alternatywny system modelowy, opisano technikę iniekcji larw.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wykorzystanie niekonwencjonalnych modeli do badania odporności wrodzonej i zjadliwości patogenów stanowi cenną alternatywę dla modeli ssaków, które mogą być kosztowne i rodzić problemy etyczne. Niekonwencjonalne modele są notorycznie tanie, łatwe w obsłudze i kulturze oraz nie zajmują dużo miejsca. Są genetycznie podatne i posiadają kompletne sekwencje genomu, a ich stosowanie nie wiąże się z żadnymi względami etycznymi. Muszka owocowa Drosophila melanogaster, na przykład, dostarczyła wielu informacji na temat różnych badań nad zachowaniem, rozwojem, metabolizmem i odpornością. Mówiąc dokładniej, dorosłe muchy i larwy D. melanogaster posiadają kilka wrodzonych reakcji obronnych, które są wspólne dla kręgowców. Mechanizmy regulujące odpowiedź immunologiczną zostały w większości ujawnione dzięki badaniom genetycznym i molekularnym w modelu D. melanogaster. W tym celu opracowano nowatorską technikę wstrzykiwania larw, która przyczyni się do dalszych badań nad wrodzonymi procesami immunologicznymi u larw D. melanogaster i zbadania patogenezy szerokiego zakresu infekcji bakteryjnych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Drosophila melanogaster jest ogromnie wykorzystywana w badaniach biologicznych i biomedycznych od kilkudziesięciu lat, ponieważ wyrafinowany wachlarz narzędzi genetycznych i molekularnych stale ewoluował do analizy szerokiego zakresu badań1,2,3,4. Ewolucyjnie zachowane aspekty rozwoju, homeostazy i odporności wrodzonej u D. melanogaster sprawiły, że jest to cenny organizm modelowy do badania różnych chorób ludzi i owadów5,6. Warto zauważyć, że fundamentalna rola modelu D. melanogaster w badaniu odporności została w dużej mierze zilustrowana w badaniach nad dorosłymi muchami. Jednak badania nad larwami D. melanogaster również przyczyniły się do obecnej wiedzy i dotyczyły głównie komórkowych odpowiedzi immunologicznych, w szczególności infekcji osami i nicieniami, które występują przez naskórek owada7,8,9,10. Larwy Drosophila melanogaster posiadają trzy różne typy komórek krwi, zwane zbiorczo hemocytami: plazmatocyty, komórki kryształowe i lamellocyty11,12,13. Komórki te mogą wytwarzać szereg odpowiedzi immunologicznych, gdy larwy D. melanogaster są zakażone patogenami, takimi jak bakterie, grzyby, wirusy i pasożyty14,15,16. Komórkowe odpowiedzi immunologiczne obejmują bezpośrednie pochłanianie (fagocytozę) małych cząsteczek lub bakterii, melanizację, enkapsulację większych patogenów, takich jak jaja pasożytnicze, oraz produkcję reaktywnych form tlenu (ROS) i syntaz tlenku azotu (NOS)17,18,19.

Przeciwnie, opublikowano mniej badań na temat wykorzystania modelu larwalnego D. melanogaster do analizy humoralnej odpowiedzi immunologicznej. Wynika to głównie z zastosowania testów żywieniowych w kierunku zakażenia jamy ustnej larw D. melanogaster i kilku wyzwań związanych z larwami mikroiniekcji, w tym precyzyjnego obchodzenia się z larwami i prawidłowego użycia mikroigły, zwłaszcza podczas penetracji20,21. W związku z tym ograniczona wiedza na temat infekcji larwalnych i trudności techniczne (tj. wysoka śmiertelność) często utrudniały stosowanie modelu larwalnego D. melanogaster. Model larwalny będzie miał potencjał do zidentyfikowania nowych mechanizmów molekularnych, które dostarczą dalszych informacji na temat interakcji gospodarz-patogen oraz indukcji specyficznych wrodzonych odpowiedzi immunologicznych gospodarza przeciwko infekcjom patogennym.

Tutaj szczegółowo opisano prosty i skuteczny protokół, który może być użyty do wstrzykiwania larw D. melanogaster z różnymi patogenami, takimi jak bakterie. W szczególności larwy D. melanogaster są wykorzystywane do wstrzykiwań z ludzkim patogenem Photorhabdus asymbiotica i niepatogennymi bakteriami Escherichia coli. Metoda ta może być stosowana do manipulacji i analizy odpowiedzi immunologicznej D. melanogaster na różne infekcje bakteryjne.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Hodowla much

UWAGA: Cykl życia D. melanogaster dzieli się na cztery etapy: zarodek, larwa, poczwarka i dorosły. Czas generacji przy optymalnych warunkach chowu w laboratorium (~25 °C, 60% wilgotności i wystarczająca ilość pokarmu) wynosi około 10 dni od zapłodnienia jaja do zamkniętego dorosłego osobnika. Samice składają ~100 zarodków dziennie, a embriogeneza trwa około 24 h22. Larwy przechodzą trzy etapy rozwojowe (stadium rozwojowe; L1-L3) w ciągu ~4 dni (L1 i L2: 24 h, a L3: 48 h). Pierwsze larwy w stadium rozwojowym zaczynają żerować natychmiast na powierzchni podłoża. Larwy w drugim stadium zagrzebują się w pożywce, podczas gdy larwy w trzecim stadium opuszczają pożywkę i wędrują po ściankach fiolek, szukając miejsca do przepoczwarzenia się przez 24-48 godzin. Linia D. melanogaster używana w tym protokole to Oregon R (FBsn0000276).

  1. Dodaj suchą karmę zawierającą dietę na bazie mąki kukurydzianej i soi do wąskiej fiolki z polistyrenu (25 mm x 95 mm) do objętości od 1/5 do 2/5. Następnie dodaj 9 ml wody i pozostaw fiolkę na 1 minutę, aż dieta będzie całkowicie nawodniona.
  2. Dodaj około 10 granulek suchych drożdży piekarskich do fiolki i umieść mieszaninę co najmniej 20 nowo pojawiających się samców i samic dorosłych much.
  3. Inkubować fiolkę w temperaturze 25 °C w czasie 12:12 godziny w jasnym: ciemnym cyklu fotoperiodycznym.
  4. Aby zapewnić postęp w cyklu życia, codziennie sprawdzaj fiolki muchowe i zapisuj początkowe etapy rozwoju.

2. Selekcja larw do infekcji

  1. Wybierz larwy cienkim pędzlem (najlepsza jest sierść wielbłąda), gdy osiągną wędrujące trzecie stadium rozwojowe w dniu, w którym zostanie przeprowadzona infekcja (Ryc. 1).
  2. Przemyj wybrane larwy roztworem Ringera (100 mM NaCl, 1,8 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 5 mM HEPES pH 6,9) na małej szalce Petriego (60 mm x 15 mm) po wyjęciu z oryginalnej fiolki23.
  3. Umieść larwy na bibule filtracyjnej (średnica 150 mm), która jest lekko zwilżona około 5 ml roztworu Ringera na szalce Petriego (100 mm x 15 mm) (Rysunek 2A).
  4. W razie potrzeby dodawaj ~1 ml roztworu Ringera do bibuły filtracyjnej, aby uniknąć wysuszenia i wysuszenia larw.

3. Preparat bakteryjny

  1. Hodowla bakterii P. asymbiotica na podłożu agarowym Luria Bertani (LB) w temperaturze 28 °C przez 48 godzin.
  2. Użyj szafki poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2, aby przenieść pojedynczą kolonię P. asymbiotica w celu zaszczepienia płynnej kultury w 10 ml pożywki LB.
  3. Inkubować płynną kulturę P. asymbiotica przez noc w temperaturze 28 °C w wytrząsarce obrotowej ustawionej na 220 obr./min.
  4. Hodować bakterie E. coli w podobny sposób, ale początkowy wzrost przeprowadzić na podłożu agarowym i inkubacji kultur płynnych w temperaturze 37 °C przez noc.
  5. Odwirowywać każdą nocną hodowlę bakterii przez 3 minuty w temperaturze 13 000 x g i temperaturze 4 °C.
  6. Wyrzucić supernatant i przemyć powstałe granulki bakteryjne trzykrotnie 10 ml sterylnego PBS.
  7. Ponownie odwirować granulki przez 3 minuty w temperaturze 13 000 x g i temperaturze 4 °C.
  8. Rozcieńczyć każdą osadkę sterylnym PBS, aby dostosować stężenie bakterii do gęstości optycznej (600 nm) 0,25 dla P. asymbiotica i 0,015 dla E. coli, co odpowiada 100-300 jednostkom tworzącym kolonie na larwę każdego preparatu bakteryjnego, za pomocą spektrofotometru.

4. Przygotowanie wtryskiwacza

  1. Przygotuj kapilary za pomocą szklanych kapilar 3,5" i ściągacza do mikropipet. Ustaw instrument w następujący sposób: ciepło: 580; uciąg: 143; prędkość: 25; opóźnienie: 1; Ciśnienie: 500.
  2. Użyj prostych, ząbkowanych, średnio punktowych kleszczyków, aby otworzyć szklaną kapilarnę w stopniu, który pozwoli na dostarczenie eksperymentalnych zabiegów, powodując minimalne uszkodzenie larw (Rysunek 2B). Aby zoptymalizować tę procedurę podczas ćwiczenia iniekcji, użyj roztworu błękitu trypanowego (rozcieńczyć bulion 0,4% z PBS do 0,2%), aby łatwo śledzić wyciek podczas wstrzykiwania i przeżywalność larw niebieskich.
  3. Napełnij kapilarę olejem mineralnym za pomocą plastikowej, jednorazowej strzykawki o pojemności 20 ml z igłą podskórną (22 G, długość 25 mm).
  4. Ustaw wtryskiwacz nanolitrowy i wyrzuć olej z kapilary ( Rysunek 2C).
  5. Wypełnij kapilę pożądanym preparatem bakteryjnym do wstrzykiwań. Weź roztwór z kropli (~20 μL) umieszczonej na parafilmie. W tym protokole wstrzyknięto 50,2 nL dwóch zapasów bakterii.

5. Wstrzyknięcie larw

  1. Znieczulenie larw D. melanogaster należy przeprowadzić za pomocą dwutlenku węgla na ~2 minuty przed zabiegiem.
  2. Delikatnie przenieść znieczulone larwy na bibułę filtracyjną zwilżoną roztworem Ringera w ramach przygotowań do wstrzyknięcia pod mikroskopem stereoskopowym. W tym momencie larwy będą ospałe lub pasywne.
  3. Aby wstrzyknąć larwy, należy mocno docisnąć grzbietową stronę tylnego końca (przetchlinki tchawicy są widoczne na tylnym końcu, w przeciwieństwie do czarnych aparatów gębowych na przednim końcu) za pomocą kleszczy (Ryc. 2D).
  4. Wbić igłę poziomo w kierunku tylnego końca larwy, w pobliżu naskórka. Udane wstrzyknięcie nie spowoduje wycieku wstrzykniętego roztworu z larw (Rysunek 3).
  5. Usuń kleszcze, które były używane do wywierania nacisku na ogon larw przed wyjęciem igły. Jeśli nie zostaną najpierw usunięte, kleszcze mogą wypchnąć hemolimfę i/lub jelito z larw z miejsca rany.
  6. Zainfekować odpowiednią liczbę larw do przeprowadzanego badania. W tym konkretnym protokole wstrzyknięto 20 larw dla każdego warunku eksperymentalnego.
  7. Za pomocą kleszczy delikatnie przenieś wstrzyknięte larwy na oddzielną wilgotną bibułę filtracyjną na szalce Petriego (10 larw na szalkę) lub fiolce z pokarmem (w zależności od celu eksperymentu), aby umożliwić wyzdrowienie.
  8. Umieścić szalki Petriego lub fiolki z żywnością w inkubatorze w temperaturze 25 °C. Jeśli larwy są trzymane na szalce Petriego, należy w razie potrzeby dodać roztwór Ringera, aby zapobiec wysuszeniu.

6. Rejestrowanie przeżycia/śmiertelności

  1. Zapisz liczbę martwych i żywych larw D. melanogaster zgodnie z ustalonymi punktami czasowymi doświadczenia. Żywe larwy będą nadal rozwijać się w poczwarki i dorosłe
    2. osobniki.
  2. Użyj programów statystycznych, takich jak Prism, aby wprowadzić surowe dane dotyczące przeżycia/śmiertelności, przeanalizować je za pomocą testu logarytmicznego (Mantela-Coxa) i przedstawić wyniki w postaci liczb.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przy prawidłowym wykonaniu, zastrzyki larw D. melanogaster wykazują efekt specyficzny dla bakterii. Dane dotyczące przeżycia zebrano w kilku punktach czasowych po zakażeniach P. asymbiotica (szczep ATCC43943), E. coli (szczep K12) i PBS (Ryc. 4). Podczas gdy larwy D. melanogaster są podatne na P. asymbiotica, który szybko zagraża przeżywalności, larwy, którym wstrzyknięto E. coli lub kontrole PBS, wykazują przedłużone przeżycie24<...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Drosophila melanogaster jest jednym z najcenniejszych, eksperymentalnie manipulowanych modeli wykorzystywanych do badań odporności wrodzonej i patogenezy różnych infekcji bakteryjnych. Wynika to z jego prostego i szybkiego cyklu życia, prostej konserwacji w laboratorium, dobrze ugruntowanej genetyki ewolucyjnej i różnorodnego zestawu narzędzi genetycznych. Poprzednie metody wstrzykiwania larw D. melanogaster, takie jak użycie hybrydowego urządzenia mikroprzepływowego lub mikromanipulatora Narishige, wym...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy członkom Wydziału Nauk Biologicznych Uniwersytetu George'a Washingtona (GWU) za krytyczną lekturę manuskryptu. GT było wspierane przez letnie stypendium Harlana od GWU. Wszystkie figury graficzne zostały wykonane przy użyciu BioRender.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Fly Food B (Bloomington Recipe)LabExpress7001-NVFood B, w wąskich fiolkach, 100 fiolek/taca
100 x 15, Mono szalki Petriego w pełni sztaplowaneVWR25384-342Średnica 100 x 15 mm
60 x 15, Mono szalki Petriego W pełni sztaplowaneVWR25384-092Średnica 60 x 15 mm
Kapilary szklaneVWR53440-186
Jakościowa bibuła filtracyjna klasy 1 klasy standardowej, okrągVWR28450-150Średnica 150 mm
Kultura laboratoryjna Klasa II Typ A2 Szafa bezpieczeństwa biologicznegoESCOLA2-4A2-E
LB AgarFisher ScientificBP1425-500LB proszek młynarski agarowy 500 g
LB BulionFisher ScientificBP1426-500LB młynek do bulionu w proszku 500 g
OlejmineralnyAlfa Aesar, Thermo Fisher Scientific31911-A1
NanoDrop 2000/2000C SpektrofotometrThermo Fisher ScientificND-2000C
Nanoject III Programowalny wtryskiwacz nanolitrowyDrummond3-000-207
Wąskie fiolki Drosophila, polistyrenGenesee Scientific32-109
Igły, podskórneVWR89219-31622 G,
Ściągacz do mikropipet nowej generacjiWorld Precision InstrumentsSU-P1000
PBSVWR97062-732Bufor PBS Tabletki biotech grade 200tab
PrismGraphPadwersja 8
Strzykawki - plastikowe, jednorazoweVWR76124-65220 ml
Trypan BlueSigma-AldrichT8154
25 mm

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Takehana, A., et al. Overexpression of a pattern-recognition receptor, peptidoglycan-recognition protein-LE, activates imd/relish-mediated antibacterial defense and the prophenoloxidase cascade in Drosophila larvae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (21), 13705-13710 (2002).
  2. Senger, K., Harris, K., Levine, M. GATA factors participate in tissue-specific immune responses in Drosophila larvae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (43), 15957-15962 (2006).
  3. Kenmoku, H., Hori, A., Kuraishi, T., Kurata, S. A novel mode of induction of the humoral innate immune response in Drosophila larvae. Disease Models & Mech.anisms. 10, 271-281 (2017).
  4. Kenney, E., Hawdon, J. M., O'Halloran, D., Eleftherianos, I. Heterorhabditis bacteriophora excreted-secreted products enable infection by Photorhabdus luminescens through suppression of the Imd pathway. Frontiers in Immunology. 10, 2372(2019).
  5. Cherry, S., Silverman, N. Host-pathogen interactions in Drosophila: New tricks from an old friend. Nature Immunology. 7 (9), 911-917 (2006).
  6. Younes, S., Al-Sulaiti, A., Nasser, E., Najjar, H., Kamareddine, L. Drosophila as a model organism in host-pathogen interaction studies. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 214(2020).
  7. Kenney, E., Hawdon, J. M., O'Halloran, D. M., Eleftherianos, I. Secreted virulence factors from Heterorhabditis bacteriophora highlight its utility as a model parasite among Clade V nematodes. International Journal for Parasitology. 51 (5), 321-325 (2021).
  8. Castillo, J. C., Reynolds, S. E., Eleftherianos, I. Insect immune responses to nematode parasites. Trends in Parasitology. 27 (12), 537-547 (2011).
  9. Leitão, A. B., Bian, X., Day, J. P., Pitton, S., Demir, E., Jiggins, F. M. Independent effects on cellular and humoral immune responses underlie genotype-by-genotype interactions between Drosophila and parasitoids. PLoS Pathogens. 15 (10), 1008084(2019).
  10. Ramroop, J. R., Heavner, M. E., Razzak, Z. H., Govind, S. A. Parasitoid wasp of Drosophila employs preemptive and reactive strategies to deplete its host's blood cells. PLoS Pathogens. 17 (5), 1009615(2021).
  11. Vlisidou, I., Wood, W. Drosophila blood cells and their role in immune responses. The FEBS Journal. 282 (8), 1368-1382 (2015).
  12. Harnish, J. M., Link, N., Yamamoto, S. Drosophila as a model for infectious diseases. International Journal of Molecular Sciences. 22 (5), 2724(2017).
  13. Lemaitre, B., Hoffmann, J. The host defense of Drosophila melanogaster. Annual Reviews of Immunology. 25, 697-743 (2007).
  14. Garriga, A., Mastore, M., Morton, A., Pino, F. G., Brivio, M. F. Immune response of Drosophila suzukii larvae to infection with the nematobacterial complex Steinernema carpocapsae-Xenorhabdus nematophila. Insects. 11 (4), 210(2020).
  15. Trienens, M., Kraaijeveld, K., Wertheim, B. Defensive repertoire of Drosophila larvae in response to toxic fungi. Molecular Ecology. 26 (19), 5043-5057 (2017).
  16. Tafesh-Edwards, G., Eleftherianos, I. Drosophila immunity against natural and nonnatural viral pathogens. Virology. 540, 165-171 (2020).
  17. Gold, K. S., Brückner, K. Macrophages and cellular immunity in Drosophila melanogaster. Seminars in Immunology. 27 (6), 357-368 (2015).
  18. Dudzic, J. P., Kondo, S., Ueda, R., Bergman, C. M., Lemaitre, B. Drosophila innate immunity: regional and functional specialization of prophenoloxidases. BMC Biology. 13, 81(2015).
  19. Honti, V., Csordás, G., Kurucz, É, Márkus, R., Andó, I. The cell-mediated immunity of Drosophilamelanogaster: hemocyte lineages, immune compartments, microanatomy and regulation. Developmental and Comparative Immunology. 42 (1), 47-56 (2014).
  20. Siva-Jothy, J. A., Prakash, A., Vasanthakrishnan, R. B., Monteith, K. M., Vale, P. F. Oral bacterial infection and shedding in Drosophila melanogaster. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (135), e57676(2021).
  21. Zabihihesari, A., Hilliker, A. J., Rezai, P. Localized microinjection of intact Drosophila melanogaster larva to investigate the effect of serotonin on heart rate. Lab on a Chip. 20 (2), 343-355 (2020).
  22. Flatt, T. Life-history evolution and the genetics of fitness components in Drosophila melanogaster. Genetics. 214 (1), 3-48 (2020).
  23. Ciche, T. A., Sternberg, P. W. Postembryonic RNAi in Heterorhabditis bacteriophora: a nematode insect parasite and host for insect pathogenic symbionts. BMC Developmental Biology. 7, 101(2007).
  24. Joyce, S. A., Watson, R. J., Clarke, D. J. The regulation of pathogenicity and mutualism in Photorhabdus. Current Opinion in Microbiology. 9 (2), 127-132 (2006).
  25. Yang, G., Waterfield, N. R. The role of TcdB and TccC subunits in secretion of the Photorhabdus Tcd toxin complex. PLoS Pathogens. 9 (10), 1003644(2013).
  26. Shokal, U., et al. Effects of co-occurring Wolbachia and Spiroplasma endosymbionts on the Drosophila immune response against insect pathogenic and non-pathogenic bacteria. BMC Microbiology. 16, 16(2016).
  27. Tomoyasu, Y., Denell, R. E. Larval RNAi in Tribolium (Coleoptera) for analyzing adult development. Development Genes and Evolution. 214 (11), 575-578 (2004).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Iniekcja larw Drosophilaodporno wrodzonawirulencja patogen wtechnika mikroiniekcjimodel muszki owocowejzaka enie bakteryjnelarwy trzeciego stadiumroztw r Ringerawyciek hemolimfyszalka Petriego

Powiązane artykuły