Artykuł metodologiczny

Skalowalna izolacja i oczyszczanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z Escherichia coli i innych bakterii

DOI:

10.3791/63155

⸱

13 października 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiovascular & Metabolic Sciences, Lerner Research Institute, Cleveland Clinic, 2University Hospitals Cleveland Medical Center, 3Case Western Reserve University, 4Center for Microbiome & Human Health, Cleveland Clinic, 5Electron Microscopy Core, Lerner Research Institute, Cleveland Clinic

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bakterie wydzielają nanometrowe pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) przenoszące bioaktywne cząsteczki biologiczne. Badania nad EV koncentrują się na zrozumieniu ich biogenezy, roli w interakcjach i chorobach między drobnoustrojami a gospodarzem-mikroorganizmem, a także na ich potencjalnych zastosowaniach terapeutycznych. Przedstawiono proces pracy do skalowalnej izolacji pojazdów elektrycznych od różnych bakterii, aby ułatwić standaryzację badań nad pojazdami elektrycznymi.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Różne gatunki bakterii wydzielają pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) o długości ~20-300 nm, składające się z lipidów, białek, kwasów nukleinowych, glikanów i innych cząsteczek pochodzących z komórek rodzicielskich. EV funkcjonują jako wektory komunikacji wewnątrz- i międzygatunkowej, przyczyniając się jednocześnie do interakcji między bakteriami a organizmami gospodarza w kontekście infekcji i kolonizacji. Biorąc pod uwagę mnogość funkcji przypisywanych EV w zdrowiu i chorobie, rośnie zainteresowanie izolowaniem EV do badań in vitro i in vivo. Postawiono hipotezę, że rozdzielenie EV na podstawie właściwości fizycznych, a mianowicie wielkości, ułatwiłoby izolację pęcherzyków z różnych kultur bakteryjnych.

Proces izolacji składa się z wirowania, filtracji, ultrafiltracji i chromatografii wykluczania wielkości (SEC) w celu izolacji EV z kultur bakteryjnych. Zastosowano etap filtracji o przepływie stycznym (TFF) napędzany pompą w celu zwiększenia skalowalności, umożliwiając izolację materiału z litrów początkowej hodowli komórkowej. Escherichia coli wykorzystano jako system modelowy eksprymujący nanolucyferazy związane z EV i niezwiązane z EV mCherry jako białka reporterowe. Nanolucyferaza została ukierunkowana na EV poprzez fuzję jej N-końca z cytolizyną A. Wczesne frakcje chromatograficzne zawierające EV o długości 20-100 nm z towarzyszącą cytolizyną A - nanoLuc różniły się od późniejszych frakcji zawierających wolne białka. Obecność nanolucyferazy związanej z EV została potwierdzona za pomocą znakowania immunozłotem i transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Ten przebieg izolacji EV ma zastosowanie do innych gatunków bakterii Gram-ujemnych i Gram-dodatnich związanych z ludzkimi jelitami. Podsumowując, połączenie wirowania, filtracji, ultrafiltracji/TFF i SEC umożliwia skalowalną izolację pojazdów elektrycznych od różnych gatunków bakterii. Zastosowanie ustandaryzowanego przepływu pracy izolacji ułatwi badania porównawcze mikrobiologicznych EV u różnych gatunków.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EVs) to nanometrowe, liposomowe struktury składające się z lipidów, białek, glikanów i kwasów nukleinowych, wydzielane zarówno przez komórki prokariotyczne, jak i eukariotyczne1. Od czasu wczesnych badań wizualizujących uwalnianie EV przez bakterie Gram-ujemne2, liczba funkcji biologicznych przypisywanych bakteryjnym EV (o średnicy 20-300 nm) stale rosła w ostatnich dziesięcioleciach. Ich funkcje obejmują przenoszenie oporności na antybiotyki3, tworzenie biofilmu4, quorum sensing5, oraz dostarczanie toksyn6. Rośnie również zainteresowanie wykorzystaniem bakteryjnych EV jako środków terapeutycznych, zwłaszcza w wakcynologii7 i terapii raka8.

Pomimo rosnącego zainteresowania badaniami nad pojazdami elektrycznymi, nadal istnieją techniczne wyzwania dotyczące metod izolacji. W szczególności istnieje zapotrzebowanie na metody izolacji, które są powtarzalne, skalowalne i kompatybilne z różnymi organizmami wytwarzającymi pojazdy elektryczne. Aby stworzyć ujednolicony zestaw zasad planowania i raportowania izolacji EV oraz metod badawczych, Międzynarodowe Towarzystwo Pęcherzyków Zewnątrzkomórkowych publikuje i aktualizuje dokument przedstawiający stanowisko MISEV9. Co więcej, konsorcjum EV-TRACK stworzyło otwartą platformę do raportowania szczegółowych metodologii izolacji pojazdów elektrycznych stosowanych w opublikowanych manuskryptach w celu zwiększenia przejrzystości10.

W tym protokole, poprzednie metodologie używane do izolacji EV z hodowli komórek ssaków zostały dostosowane11,12, aby umożliwić izolację EV z hodowli komórek bakteryjnych. Staraliśmy się zastosować metody, które umożliwiają izolację EV od różnych drobnoustrojów, które mogą być skalowalne, oraz zrównoważyć czystość EV i wydajność (jak omówiono w dokumencie przedstawiającym stanowisko MISEV9). Po usunięciu komórek bakteryjnych i zanieczyszczeń przez odwirowanie i filtrację, pożywka hodowlana jest zagęszczana przez ultrafiltrację urządzenia odśrodkowego (dla objętości do ~100 ml) lub TFF napędzaną pompą (dla większych objętości). Pojazdy elektryczne są następnie izolowane przez SEC za pomocą kolumn zoptymalizowanych pod kątem oczyszczania małych pojazdów elektrycznych.

figure-introduction-1
Rysunek 1: Przegląd schematu przepływu pracy z izolacją bakteryjnych pojazdów elektrycznych. Skróty: EV = pęcherzyk zewnątrzkomórkowy; TFF = filtracja o przepływie stycznym; SEC = chromatografia wykluczająca rozmiar; MWCO = granica masy cząsteczkowej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Mysi szczep komensalny Escherichia coli (tj. E. coli MP113) został użyty jako organizm modelowy i zmodyfikowany do ekspresji nanolucyferazy związanej z EV poprzez fuzję z cytolizyną A, jak wcześniej informowano14. Zastosowane tu metody pozwalają przetworzyć co najmniej do kilku litrów kultur bakteryjnych i skutecznie oddzielić białka związane z EV od niezwiązanych z EV. Wreszcie, metoda ta może być również stosowana w przypadku innych gatunków bakterii Gram-dodatnich i Gram-ujemnych. Wszystkie istotne dane ze zgłoszonych eksperymentów zostały przesłane do bazy wiedzy EV-TRACK (EV-TRACK ID: EV210211)10.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Upewnij się, że wszystkie prace z udziałem bakterii i rekombinowanego DNA są zgodne z najlepszymi praktykami dotyczącymi bezpieczeństwa biologicznego, odpowiednim dla poziomu zagrożenia bezpieczeństwa biologicznego każdego szczepu. Prace powinny być wykonywane zgodnie z lokalnymi, krajowymi i międzynarodowymi przepisami dotyczącymi bezpieczeństwa biologicznego.

1. Szczepy bakteryjne i warunki hodowli

UWAGA: Szczepy bakteryjne użyte w tym badaniu to Escherichia coli MP113, Akkermansia mucinophila, Bacteroides thetaiotaomicron, Bifidobacterium breve i Bifidobacterium dentium.

  1. W przypadku E. coli należy użyć sterylnej pętli do zaszczepienia pojedynczych kolonii w 250 do 1000 ml bulionu Luria-Bertani (LB) i inkubować tlenowo w inkubatorze z wytrząsaniem przy 300 obr./min i temperaturze 37 °C przez 48 godzin przed przetworzeniem kultury. W przypadku rekombinowanego szczepu MP1 E. coli zawierającego p114-mCherry-Clyluc (metoda uzupełniająca i rysunek uzupełniający S1), dodać chloramfenikol do agaru LB i bulionu w końcowym stężeniu 17 μg/ml.
  2. W przypadku A. mucinophila, B. thetaiotaomicron, B. breve i B. dentium smugi na płytkach agarowych do infuzji serca mózgu (BHI) i inkubować beztlenowo w komorze beztlenowej z winylu. Zaszczepić pojedyncze kolonie w 100 ml wstępnie zredukowanego bulionu BHI i inkubować beztlenowo przez 48 godzin.

2. Izolacja EV

  1. Klarowanie pożywki bakteryjnej przez odwirowanie i filtrację
    1. Przenieść kultury komórek bakteryjnych zaszczepione w kroku 1 do czystych butelek wirówek polipropylenowych o pojemności 250 ml lub 500 ml przez nalewanie. Odwirować butelki w rotorze o dużej pojemności i stałym kącie nachylenia w temperaturze 4 °C i 5 000 × g przez 15 minut. Przenieść supernatant do czystych butelek wirówkowych przez ostrożne nalewanie i ponownie odwirować przy 10 000 × g przez 15 min.
      UWAGA: Butelki należy ponownie użyć po oczyszczeniu i odkażeniu odpowiednim dla bezpieczeństwa biologicznego.
      1. Jeśli po drugim odwirowaniu obecne są duże granulki komórek bakteryjnych, powtórz wirowanie w czystej butelce, aby dalej usunąć komórki.
    2. Przenieść supernatant do urządzenia filtrującego o odpowiedniej wielkości z polieterosulfonu o odpowiedniej wielkości 0,22 μm przez nalewanie. Filtrować, podłączając urządzenie filtrujące do ściennego źródła podciśnienia. Jeśli szybkość filtracji znacznie spadnie, po prostu przenieś niefiltrowany materiał do nowego urządzenia. Przefiltrowane podłoże należy przechowywać przez noc w temperaturze 4 °C i w razie potrzeby kontynuować protokół następnego dnia.
      UWAGA: Powyższe wirowania zazwyczaj pozwalają na przetwarzanie ~2x wskazanej objętości kultury komórkowej przez każde urządzenie. Na przykład pojedyncze urządzenie filtrujące o pojemności 500 ml może przefiltrować ~1,000 ml wstępnie odwirowanej kultury. Urządzenia te zazwyczaj nie są ponownie używane. Stosowanie filtrów strzykawkowych na tym etapie nie jest zalecane bez optymalizacji, ponieważ w testowanych modelach odnotowano znaczne straty. Jest to potencjalny punkt zatrzymania.
    3. W tym momencie sprawdzić, czy komórki zdolne do życia zostały całkowicie usunięte, rozprowadzając porcję przefiltrowanego supernatantu na odpowiednich płytkach agarowych i upewnić się, że po inkubacji w optymalnych warunkach dla szczepu bakteryjnego nie ma żadnych kolonii. W przypadku wykrycia bakterii należy jeszcze bardziej zoptymalizować powyższą procedurę, wykonując dodatkowe wirowanie i/lub filtrację.
  2. Stężenie przefiltrowanego podłoża
    1. W przypadku pracy z objętościami znacznie >100 ml przejdź do kroku 2.2.2. W przypadku pracy z objętościami ~100 ml załadować 90 ml przefiltrowanej pożywki hodowlanej do zbiornika odśrodkowego urządzenia ultrafiltracyjnego o odpowiedniej pojemności 100 kDa (MWCO) za pomocą pipet serologicznych. Zawsze równoważyć za pomocą odpowiedniego urządzenia do ultrafiltracji i odwirowywać w obracającym się wirniku kubełkowym w temperaturze 4 °C i 2 000 × g w odstępach 15-30 minut, aż objętość pożywki w górnym zbiorniku zostanie stężona do <0,5 ml.
      1. Uzupełnij zbiornik pozostałą przefiltrowaną pożywką hodowlaną. W przypadku "doładowywania" usuń przepływ w dolnej części urządzenia i ponownie zrównoważ wszystkie urządzenia.
        UWAGA: Zaobserwowano, że maksymalna objętość przefiltrowanej pożywki hodowlanej, którą można zagęścić za pomocą tych urządzeń, jest <2-krotnie większa od zalecanej objętości.
      2. Jeżeli lepkość zagęszczonego podłoża w zbiorniku jest widocznie zwiększona (ciemny, lepki materiał), należy rozcieńczyć solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) i ponownie zagęścić przez odwirowanie w celu rozcieńczenia wszelkich białek innych niż EV mniejszych niż MWCO 100 kDa.
        UWAGA: Jest to potencjalny punkt zatrzymania.
      3. Przenieść skoncentrowaną pożywkę do probówki o niskiej zdolności wiązania białek, przechowywać w temperaturze 4 °C przez noc i w razie potrzeby kontynuować protokół następnego dnia.
    2. W przypadku pracy z objętościami znacznie >100 ml należy wybrać urządzenie TFF o odpowiedniej wielkości (100 kDa MWCO), aby pomieścić objętość do przetworzenia.
      UWAGA: Urządzenia filtrujące do przetwarzania od 100 ml do >1,000 ml są dostępne w handlu. Lokalna dostępność, koszt i kompatybilność z pompą i rurkami/połączeniami będą decydować o tym, które konkretne modele będą najbardziej przydatne. Przed koniecznością wyczyszczenia filtra przetworzono do 2 litrów pożywki hodowlanej za pomocą urządzenia wskazanego w >Tabeli Materiałów (patrz krok 2.3 poniżej, aby zapoznać się z protokołem czyszczenia).
      1. Zmontuj obwód filtracji z rurką #16 o niskim stopniu wiązania/niskiego wypłukiwania, adapterami 1/8 cala z króćcem węża do Luer, urządzeniem TFF i pompą perystaltyczną, jak pokazano na rysunku uzupełniającym S2.
        UWAGA: Wykonaj TFF w komorze bezpieczeństwa biologicznego, aby zminimalizować ryzyko zanieczyszczenia preparatu EV bakteriami środowiskowymi.
      2. W temperaturze pokojowej rozpocząć cyrkulację przefiltrowanego, kondycjonowanego podłoża z prędkością około 200 ml/min (minimum 100 ml/min). Określ odpowiednią prędkość obrotową odpowiadającą pożądanemu natężeniu przepływu, pompując 200 ml PBS do naczynia z podziałką. Podczas cyrkulacji przefiltrowanego, kondycjonowanego podłoża należy zebrać cząsteczki <100 kDa przechodzące przez membranę ultrafiltracyjną jako odpady w oddzielnym zbiorniku.
        UWAGA: W poniższym przykładzie założymy, że początkowa objętość kultury wynosi 2 litry.
      3. Kontynuuj cyrkulację kondycjonowanej pożywki, aż jej objętość zostanie zmniejszona do ~ 100-200 ml. W razie potrzeby przenieś się na mniejsze naczynia. Rozcieńczyć 2-krotnie PBS i kontynuować cyrkulację za pomocą pompy, zagęszczając do 75-100 ml. Rozcieńczyć 2-krotnie PBS i kontynuować krążenie do końcowej objętości 25 ml. Rozcieńczyć 2-krotnie PBS i kontynuować krążenie do <10 ml.
      4. Wyjmij rurkę zasilającą ze zbiornika próbki i kontynuuj pompowanie, aby oczyścić filtr i odzyskać maksymalną ilość próbki.
        UWAGA: Jest to potencjalny punkt zatrzymania.
      5. Przenieść zagęszczoną próbkę do stożkowej probówki i w razie potrzeby przechowywać przez noc w temperaturze 4 °C. Alternatywnie kontynuuj korzystanie z protokołu.
      6. Przenieść zagęszczoną próbkę do urządzenia do ultrafiltracji odśrodkowej MWCO o pojemności 15 ml i pojemności 100 kDa. Odwirować w obrotowym wirniku kubełkowym w temperaturze 4 °C i 2 000 × g w odstępach 15-30 minut, aż objętość pożywki w górnym zbiorniku zostanie zagęszczona do <2 ml.
        UWAGA: Jest to potencjalny punkt zatrzymania.
      7. Przenieść stężoną pożywkę do probówki o niskiej liczbie wiązającej białka i przechowywać w temperaturze 4 °C przez noc, kontynuując protokół następnego dnia, jeśli jest to pożądane.
  3. Czyszczenie urządzenia TFF (opcjonalnie)
    UWAGA: Szybkość filtracji maleje, gdy urządzenie TFF zaczyna się "zapychać" podczas procesu (zanieczyszczenie). W razie potrzeby urządzenie filtrujące można wyczyścić, aby ułatwić filtrację dodatkowych próbek w tym samym przebiegu oczyszczania. Chociaż teoretycznie jest to możliwe, oczyszczony filtr TFF nie został użyty do innego przebiegu oczyszczania, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego.
    1. Aby wyczyścić, usuń wszystkie rurki i nasadki z urządzenia TFF i spuść resztki płynu.
    2. Użyj pompy perystaltycznej i rurki, aby zalać zarówno wewnętrzną, jak i zewnętrzną komorę urządzenia TFF (tj. przez równoległe i prostopadłe porty w modelu wymienionym w Tabeli Materiałów) ~100 ml wody destylowanej. Usuń wszystkie rurki/nasadki i opróżnij urządzenie TFF.
    3. Zakryj zewnętrzne (prostopadłe, przesączone) porty i cyrkuluj 250 ml 20% etanolu w wodzie destylowanej o stężeniu >200 ml/min przez 10 minut przez komorę wewnętrzną. Odcedź, zalej wodą destylowaną i ponownie odcedź jak powyżej.
    4. Cyrkulować 250 ml 0,5 N świeżego roztworu NaOH przez 30 minut przez wewnętrzną komorę i ponownie opróżnić.
    5. Ponownie podłącz wszystkie rurki i nasadki do portów wlotowych, wylotowych i filtracyjnych, jak na rysunku uzupełniającym S2, i ponownie cyrkuluj roztwór 0,5 N NaOH, aż objętość NaOH > 1 ml /cm2 powierzchni filtra przeniknie przez membranę filtracyjną i zostanie zebrana jako filtrat/odpad.
    6. Wypłucz urządzenie TFF wodą destylowaną jak powyżej. Użyj urządzenia TFF natychmiast lub zalej je ~100 ml 20% etanolu i przechowuj przez noc w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: W przypadku przechowywania w etanolu należy go opróżnić, spłukać wodą, odcedzić i przepuścić 250 ml PBS przez urządzenie, aż objętość >1 ml/cm2 powierzchni filtra przeniknie przez membranę filtracyjną i zostanie zebrana jako filtrat/odpad w celu usunięcia pozostałości etanolu przed przetworzeniem próbki.
  4. Chromatografia wykluczająca wielkość (SEC)
    UWAGA: SEC stosuje się w celu zwiększenia czystości EV i usunięcia białka niepęcherzykowego.
    1. Użyj małej kolumny SEC (objętość złoża 10 ml) do izolacji EV od <100 ml materiału wyjściowego i większej kolumny (47 ml objętości złoża) do izolacji EV od >100 ml materiału wyjściowego.
      UWAGA: W poniższym przykładzie zostaną wyświetlone woluminy dla większej kolumny, z woluminami dla mniejszej kolumny w nawiasach.
    2. Doprowadź kolumnę SEC i PBS do temperatury pokojowej przez kilka godzin. Ustabilizuj kolumnę SEC w pozycji pionowej za pomocą standardowego stojaka laboratoryjnego i uchwytu. Alternatywnie można użyć komercyjnych stojaków na kolumny chromatograficzne
      3. .
    3. Przed podłączeniem do kolumny SEC należy uwodnić zbiornik próbki, pozwalając 5 ml PBS przepłynąć przez frytę do pojemnika na odpady. Odkręć korek wlotowy kolumny SEC, dodaj 2 ml PBS do zbiornika próbki i ostrożnie podłącz zbiornik do kolumny, gdy PBS kapie przez frytę (nie dotyczy małych kolumn SEC).
      UWAGA: Ten poprzedni krok zapobiega uwięzieniu pęcherzyków powietrza w górnej części kolumny SEC. Jeśli powietrze jest uwięzione, wyjmij zbiornik, postukaj w kolumnę, aby usunąć pęcherzyk powietrza i powtórz procedurę podłączania. W przypadku mniejszej kolumny wystarczy odkręcić górną część kolumny SEC i przymocować zbiornik na próbkę.
    4. Dodać 47 ml (10 ml) PBS do zbiornika próbki i odkręcić dno kolumny SEC. Pozwolić, aby cały załadowany bufor próbki przepłynął przez kolumnę w celu zrównoważenia. Odrzuć przepływ.
    5. Załadować maksymalnie 2 ml (0,5 ml) próbki do zbiornika próbki, odrzucić przepływ i pozwolić, aby próbka całkowicie weszła do kolumny.
    6. Natychmiast dodać PBS do zbiornika na próbkę lub leja o objętości 14,25 ml minus objętość próbki (3 ml minus objętość próbki dla małej kolumny). Pozwól, aby roztwór przepłynął przez kolumnę i odrzuć tę ilość równą objętości pustej kolumny.
      UWAGA: W przypadku typowej próbki o pojemności 2 ml ilość PBS, którą należy dodać do zbiornika na próbkę lub leja samowyładowczego, wyniesie 12.25 ml.
    7. Umieść mikroprobówkę o niskim poziomie wiązania o pojemności 2 ml bezpośrednio pod kolumną SEC. Natychmiast dodać 2 ml (0,5 ml) PBS do zbiornika próbki i pozwolić mu wejść do kolumny. Oznacz te pierwsze 2 ml (0,5 ml) przepływu jako frakcję 1. Kontynuuj dodawanie 2 ml (0,5 ml) na raz do zbiornika próbki, aby zebrać każdą kolejną frakcję.
      UWAGA: Większość bakteryjnych EV wymywa się w pierwszych 5 frakcjach. Podczas optymalizacji zebrano pierwsze 12 frakcji.
    8. Frakcje należy przechowywać w temperaturze 4 °C w przypadku krótkotrwałego przechowywania (dni) lub -80 °C w przypadku długotrwałego przechowywania.
    9. Czyszczenie i przechowywanie kolumn SEC wielokrotnego użytku
      UWAGA: Kolumny SEC opisane w tym protokole mogą być ponownie użyte do 5 razy według producenta. Jeśli natężenie przepływu kolumn SEC zmniejszy się po <5 użyciach, producent zaleca odwirowanie skoncentrowanych próbek przy 10 000 x g przez 10 minut w celu usunięcia wszelkich agregatów przed SEC. Następnie załaduj supernatant z tego wirowania do kolumny SEC w celu izolacji EV.
      1. Aby wyczyścić i przechowywać kolumnę SEC po każdym użyciu, dodaj 2 ml (0,5 ml) 0,5 M NaOH i pozwól mu całkowicie wejść do kolumny. Przepuścić 100 ml (20 ml) 20% etanolu przez kolumnę i przechowywać w temperaturze 4 °C do następnego użycia. Przed następnym użyciem należy zrównoważyć etanol do temperatury pokojowej jak powyżej i wymienić go na bufor PBS, przepuszczając przez kolumnę kolejne 150 ml (30 ml) PBS.
      2. Aby wyczyścić i natychmiast ponownie użyć kolumny SEC po każdym użyciu, dodaj 2 ml (0,5 ml) 0,5 M NaOH i pozwól mu całkowicie wejść do kolumny. Uruchom około 150 ml (30 ml) buforu PBS, aby zmyć NaOH. Gdy pH eluatu jest równe PBS (~7), można załadować nową próbkę.

3. Kontrola jakości przygotowania EV

  1. Badanie sterylności
    UWAGA: Ponieważ te EV pochodzą z kultur bakteryjnych, bardzo ważne jest zapewnienie sterylności przed dalszym użyciem.
    1. Uzyskać 100 μl (20 μl) frakcji, które mają być użyte w testach i zaszczepić 3 ml pożywki użytej do wzrostu bakterii źródłowych. Hodowla w odpowiednich optymalnych warunkach przez co najmniej 3 dni i obserwacja zmętnienia. Alternatywnie, nanieść próbki frakcji na płytki agarowe zawierające pożywkę używaną do hodowli bakterii wytwarzających i poszukać tworzenia kolonii.
      UWAGA: W przypadku wykrycia skażenia bakteryjnego nie zaleca się stosowania preparatu EV do eksperymentów. Zamiast tego należy powtórzyć izolację, zwracając uwagę na zminimalizowanie ryzyka skażenia bakteryjnego poprzez: a) przeprowadzenie wystarczającego odwirowania/filtracji kondycjonowanej pożywki do hodowli komórek bakteryjnych, b) użycie czystych butelek, przewodów, filtrów i kolumn chromatograficznych oraz c) zastosowanie odpowiednich technik aseptycznych.
  2. Kwantyfikacja białka
    UWAGA: Użyto zestawu do oznaczania ilościowego białek na bazie fluorescencji o wysokiej czułości (patrz tabela materiałów). Zestaw współpracuje z dopasowanym opatentowanym fluorymetrem przy długościach fal wzbudzenia/emisji 485/590 nm.
    1. Przynieś wszystkie odczynniki, wzorce i próbki do temperatury pokojowej.
    2. Przygotować główną mieszaninę odczynnika białkowego i buforu, dodając 1 μl odczynnika do 199 μl buforu dla każdej próbki i wzorca, które mają być oznaczone. Używając cienkościennych probówek do PCR o pojemności 0,5 ml, dodaj 10 μl wzorca + 190 μl mieszanki wzorcowej do każdej probówki wzorcowej.
      UWAGA: Aby zmieścić się w zakresie testu, ilość każdej frakcji, która ma być dodana do każdej probówki z próbką, zależy od oczekiwanej wydajności białka podczas oczyszczania. Zazwyczaj stosowano 5 μl każdej frakcji + 195 μl mieszanki wzorcowej. Ostateczna objętość próbki + mieszanki wzorcowej musi wynosić 200 μl.
    3. Wirować probówki testowe i inkubować przez co najmniej 15 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
    4. Zmierz wzorce na odpowiednim zastrzeżonym fluorymetrze (patrz Tabela materiałów), wybierając opcję Test białka za pomocą przycisków strzałek i naciskając przycisk GO, aby potwierdzić. Postępuj zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na ekranie, wkładając każdą standardową rurkę i naciskając GO.
    5. Włóż probówkę z próbką doświadczalną; naciśnij GO, aby przeczytać; i zanotuj wyświetlony wynik, który jest rzeczywistym stężeniem białka w mieszaninie buforu do testu/próbki. Aby uzyskać stężenie białka w próbce, za pomocą strzałek wybierz opcję Oblicz stężenie próbki, naciśnij GO i użyj strzałek, aby wybrać objętość próbki dodawaną do buforu testowego dla danej próbki. Naciśnij przycisk GO i zapisz stężenie białka w próbce. Powtórz ten krok dla każdej próbki, która ma być poddana analizie.
  3. Zliczanie cząstek i rozkład wielkości
    UWAGA: Mikrofluidyczne rezystancyjne wykrywanie impulsów (MRPS) zostało wykorzystane do ilościowego określenia stężenia EV i rozkładu wielkości.
    1. Rozcieńczyć próbki w PBS uzupełnionym 1% Tween-20, który został przefiltrowany przez filtr strzykawkowy 0,02 μm do stężenia białka około 0,1 μg/ml.
      UWAGA: Celem rozcieńczenia jest osiągnięcie oczekiwanego stężenia cząstek w zakresie 1010 cząstek/ml we frakcjach zawierających EV. Optymalne rozcieńczenie może wymagać empirycznego określenia. Oczekuje się, że w późniejszych ułamkach (poza frakcją 6) spodziewanych jest niewiele EV. W związku z tym stężenie cząstek prawdopodobnie wyniesie <10 10 cząstek/ml pomimo analizy w niskich rozcieńczeniach.
    2. Załaduj 3 μl każdej próbki do jednorazowego wkładu mikroprzepływowego za pomocą mikropipety, włóż wkład do przyrządu MRPS i naciśnij metalowy przycisk z niebieską podświetlaną obwódką.
    3. Kliknij przycisk Go! w oprogramowaniu do akwizycji i poczekaj, aż próbka zostanie przeanalizowana przez urządzenie. Rejestruj od 1 000 do 10 000 zdarzeń cząstek, aby zminimalizować techniczny błąd statystyczny analizy. W tym momencie kliknij pozycję Zatrzymaj i zakończ uruchamianie, aby zakończyć pobieranie próbki.
      UWAGA: Wraz z plikami z surowymi danymi urządzenie generuje arkusz kalkulacyjny podsumowujący z listą stężenia cząstek w próbce. Skorygować tę wartość zgodnie z wykonanym rozcieńczeniem próbki.
    4. Korzystając z oprogramowania analitycznego, załaduj surowe dane i wygeneruj niestandardowe wykresy rozkładu rozmiaru.

4. Przechowywanie pojazdów elektrycznych

  1. Podwielokrotność pojedynczych lub połączonych frakcji do 25-50% wielkości pojedynczej frakcji (w zależności od wielkości użytej kolumny) w probówkach o niskiej zawartości wiązania białka i przechowywanie w temperaturze -80 °C, aby uniknąć cykli zamrażania i rozmrażania.
    UWAGA: Różne zastosowania mogą wymagać mniejszych lub większych porcji w zależności od oczekiwanej ilości wykorzystanej w każdym eksperymencie. Będzie to musiało zostać ustalone empirycznie. Frakcje niezawierające EV mogą zostać odrzucone, jeśli nie mają zastosowania do celów badań.

5. Transmisyjna mikroskopia elektronowa

  1. Barwienie ujemne
    1. Dodać 5 μl próbki EV do siatki o oczkach 400 z miedzi pokrytej węglem i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Przemyć stronę próbki 5 kroplami 5 mM buforu Tris (pH 7,1), a następnie 5 kroplami wody destylowanej.
    2. Zabarwić stronę próbki 5 kroplami 2% octanu uranylu. Zetrzyj dodatkową ilość plamy bibułą filtracyjną i pozostaw siatkę do całkowitego wyschnięcia na kilka godzin lub na noc. Wizualizacja próbek za pomocą mikroskopu elektronowego działającego pod napięciem 80 kV.
  2. Znakowanie Immunogold
    1. Nałożyć 10 μl zawiesiny EV na siatkę formvar/carbon 400 i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Umyć siatkę w PBS trzy razy, a następnie zastosować 4% paraformaldehydu przez 10 minut w celu utrwalenia próbki. Umyj kratki pięć razy za pomocą PBS.
    2. Zablokować siatkę trzema przemycikami PBS zawierającego 0,1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA). Następnie nałóż 10 μl przeciwciała pierwszorzędowego przez 40 minut w temperaturze pokojowej (tutaj 1 μg/ml przeciwciała nluc). Ponownie trzykrotnie przemyć PBS zawierającym 0,1% BSA.
    3. Dodać 10 μl wtórnego przeciwciała znakowanego złotem do siatki i inkubować przez 40 minut w temperaturze pokojowej. Umyj kratki trzykrotnie za pomocą PBS.
      UWAGA: W tym przypadku zastosowano kozie przeciwciało anty-mysie sprzężone z nanocząstkami złota o długości 10 nm po rozcieńczeniu w stosunku 1:10 w buforze blokującym. Jeśli znakowanie złotem zasłania wizualizację EV, zamiast tego można zastosować przeciwciała wtórne z mniejszymi nanocząstkami złota (np. 5 nm).
    4. Po utrwaleniu siatki za pomocą 10 μl 2,5% aldehydu glutarowego przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Umyj trzy razy w PBS. Barwienie ujemne należy wykonać za pomocą 2% octanu uranylu (10 μl) przez 15 min. Zanurzyć próbki w 10 μl 0,5% octanu uranylu i 0,13% roztworu metylocelulozy na 10 minut.
    5. Pozostaw siatki próbek do wyschnięcia przez noc w temperaturze pokojowej przed obrazowaniem pod mikroskopem elektronowym.
    6. W oprogramowaniu do akwizycji mikroskopu określ empirycznie ekspozycję, aby uzyskać optymalną jakość obrazu (np. 0,80851 s w tej konkretnej konfiguracji) i dostosuj ją, wpisując tę wartość w polu opcji czasu ekspozycji. Wybierz opcję 80 kV i kliknij przycisk Rozpocznij akwizycję, aby przechwycić obraz.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby ocenić, które frakcje chromatograficzne SEC zostały wzbogacone dla EVs, kolumna SEC została załadowana 2 ml pożywki hodowlanej MP1 E. coli, która została zagęszczona 1000-krotnie przez TFF, a następnie zebrano sekwencyjne frakcje. Korzystając z MRPS, stwierdzono, że frakcje 1-6 zawierały najwięcej EV (Rysunek 2A). Kolejne frakcje zawierały bardzo mało EV, składając się zamiast białek wolnych od EV (Rysunek 2B). Pojazdy elektryczne miały przede wszystkim średnicę <10...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W powyższym protokole opisano metodę, która jest skalowalna i niezawodnie izoluje EV od różnych bakterii Gram-ujemnych/dodatnich i tlenowych/beztlenowych. Ma kilka potencjalnych punktów zatrzymania podczas całej procedury, chociaż lepiej unikać izolowania EV z kondycjonowanych pożywek bakteryjnych dłużej niż 48 godzin.

Po pierwsze, polega na hodowli bakterii w celu wytworzenia kondycjonowanej pożywki bakteryjnej. Stwierdzono, że wydłużenie czasu hodowli do co najmniej 48 godzin i zastosowanie ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badania opisane powyżej były wspierane przez grant szkoleniowy NIH TL1 TR002549-03. Dziękujemy doktorom Johnowi C. Tiltonowi i Zachary'emu Troyerowi (Case Western Reserve University) za ułatwienie dostępu do analizatora wielkości cząstek; Lew Brown (Spectradyne) za pomoc techniczną w analizie danych dotyczących rozkładu wielkości cząstek; Dr. Davidowi Putnamowi z Cornell University za dostarczenie plazmidu pClyA-GFP14; oraz dr Markowi Goulianowi z University of Pennsylvania za dostarczenie nam E. coli MP113.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Płaskie, cienkościenne probówki PCR 0,5 mlThermo Scientific3430ważne jest, aby używać cienkościennych probówek PCR, aby uzyskać dokładne odczyty z wodnym roztworem Qubit
16% paraformaldehydu (formaldehydu)Mikroskopia elektronowa nauki15700
250 ml Polipropylenowe butelki wirówkowe FiberliteThermoFisher010-1495
Butelki wirówki polipropylenowej Fiberlite 500 mlThermoFisher010-1493
65 mm Polipropylenowy adapter do butelek okrągłodennych/stożkowychBeckman Coulter392077Umożliwia Vivacell dopasowanie do rotora
Akkermansia mucinophilaATCC BAA-835
Amicon-15 (100 kDa MWCO)MilliporeSigmaUFC910024
Avanti J-20 Wirówka XPIBeckman CoulterNie jest już sprzedawana przez Beckman. Avanti J-26XP jest najbliższym współczesnym modelem.
Bacteroides thetaiotaomicron VPI 5482ATCC29148
Bifidobacterium breveNCIMBB8807
Bifidobacterium dentiumATCC27678
Napar z mózgu serca (BHI)bulion HimediaM2101Po autoklawowaniu do komory beztlenowej wprowadzono zarówno bulion BHI, jak i agar, uzupełniony menadionem (1 &mikro; g/L), hematyna (1,2 &mikro; g/l) i chlorowodorek L-cysteiny (0,05%). Następnie inkubowano je przez co najmniej 24 godziny w warunkach beztlenowych przed inokulacją szczepami bakterii beztlenowych.
Wkład mikroprzepływowy C-300Spectradyne
ChloramfenikolMP BiomedicalsICN19032105
Mikroskop elektronowyFEI firmaTecnai G2 SpiritBT
em>Escherichia coli HST08 (kompetentne komórki Stellera)Takara636763
Escherichia coli MP1Dr. Mark Goulian (prezent)bakterie komensalne pochodzące z jelit myszy
Adapter Fiberlite 500 ml do 250 mlThermoFisher010-0151-05używany z rotorem Fiberlite, aby umożliwić użycie butelek o pojemności 250 ml do mniejszych rozmiarów początkowej kultury bakteryjnej
Wirnik wirówki Fiberlite o stałym kącieThermoFisherF12-6x500-LEXpasuje do butelek 6 x 500 ml
Formvar Carbon Film 400 Mesh, miedźMikroskopia elektronowanauki FCF-400-CU
Aldehyd glutarowy (klasa EM, 10% roztwór wodny)Mikroskopia elektronowa nauki16100
HematinChemCruz207729BRoztwór podstawowy sporządzono w 0,2 M roztworze L-histydyny jako  1,2 mg/ml
Czytnik mikropłytek Infinite M Nano+TecanTo urządzenie zostało użyte do pomiaru fluorescencji mCherry
In-Fusion  HD Cloning PlusTakara638909Do klonowania frakcji PCR do wektorów liniowych
PCR JS-5.3 AllSpin Swinging-Bucket RotorBeckman Coulter368690
Lauria Bertani (LB) bulion, MillerDifco244620
Chlorowodorek L-cysteinyJ.T. Baker2071-05Należy go zważyć i dodać bezpośrednio do autoklawowanego podłoża BHI wewnątrz beztlenowego
Komora Masterflex Złączka, polipropylen, Prosta, żeńska Adapter Luer do węża, 1/8" ID; 25/PKcole-parmer - specjalneHV-30800-08adaptery przyłączeniowe do obwodu przewodów filtracyjnych
Złączka Masterflex, polipropylenowa, prosta, męska Przejściówka Luer na wąż z króćcem, 1/8" ID; 25/PKcole-parmer - specjalneHV-30800-24do obwodu
przewodów filtracyjnychAnalogowy napęd konsolowy Masterflex L/S, od 20 do 600 obr./minMasterflexHV-07555-00
Masterflex L/S Easy-Load Głowica do przewodów precyzyjnych, 4-rolkowa, obudowa PARA, rotor SSMasterflexEW-07514-10
Rurka do pompy precyzyjnej Masterflex L/S, PharmaPure, L/S 16; 25 stópCole PalmerEW-06435-16rurka o niskim stopniu wiązania/niskiego wypłukiwania
Menadione (witamina K3)MP102259Roztwór podstawowy został wykonany w etanolu jako 1 mg / ml
MIDIKROS 41,5 CM 100 K MPES 0,5 MM FLL X FLL 1 / PKUrządzenie RepligenD04-E100-05-NTFF, którego użyliśmy do przefiltrowania do 2 litrów supernatantu kultury E. coli
System oznaczania lucyferazy Nano-GloPromegaN1110Ten zestaw testowy służył do pomiaru luminescencji białka reporterowego nluc
NanoLuc (Nluc) Przeciwciało lucyferazy, klon 965808R& D SystemsMAB10026
mikrofluidyka nCS1 rezystancyjny czujnik impulsówSpectradyne
nCS1 Viewerspektradynydo rozkładu wielkości cząstek
OneTaq 2x Master Mix ze standardowym buforemNEBM0482Główna mieszanina polimerazy DNA używana do przeprowadzania rutynowych reakcji PCR w celu sprawdzenia kolonii
Białko LoBind, 2,0 mL, PCR czyste probówkiEppendorf30108450
Q5 High-Fidelity 2x Master MixNEBM0492Główna mieszanina polimerazy DNA służąca do przeprowadzania reakcji PCR potrzebnych do klonowania
qEV oryginalna, 35 nmIzonmaksymalna objętość ładowania 0,5 mL
qEV rackIzondo użytku z kolumnami SEC qEV-oryginalna qEV-2
, 35 nmIzonmaksymalna objętość załadunku 2 ml
fluorometru kubitowegoThermoFisherItem nie jest już dostępny. Najbliższym dostępnym produktem jest fluorometr Qubit 4.0 (kat. Nie. Q33238)
Zestaw do oznaczania białek kubitowychThermoFisherQ33211Zestaw do przechowywania w temperaturze pokojowej. Wzorce są przechowywane w temperaturze 4 stopni Celsjusza.
Wirówka Sorvall Lynx 4000ThermoFisher75006580
SpectraMax i3x Czytnik mikropłytekUrządzenia molekularne Tourządzenie służyło do pomiaru bioluminescencji nanolucyferazy
Stericup Quick-release-GP Sterylny system filtracji próżniowej (150, 250 lub 500 ml)MilliporeSigmaS2GPU01RE
S2GPU02RE
S2GPU05RE		Można użyć jednego lub wielu filtrów, aby dostosować się do objętości roboczych. Z naszego doświadczenia wynika, że możesz filtrować dwa razy więcej niż podana jest liczba podana w rozmiarze produktu.
Octan uranyluMikroskopia elektronowa nauki22400
Komora anaerobowa winylowaCoy Lab
Vivacell 100, 100 000 MWCO PESFiltry
Anotop 10 Plus (0,02 mikrona)MiliporeSigmaWHA68093002do filtrowania rozcieńczalnika MRPS
< nachylenia adaptery przyłączeniowe Oprogramowanie do analizy strzykawkowe Whatman

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Yanez-Mo, M., et al. Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27066(2015).
  2. Chatterjee, S. N., Das, J. Electron microscopic observations on the excretion of cell-wall material by Vibrio cholerae. Journal of General Microbiology. 49 (1), 1-11 (1967).
  3. Ciofu, O., Beveridge, T. J., Kadurugamuwa, J., Walther-Rasmussen, J., Hoiby, N. Chromosomal beta-lactamase is packaged into membrane vesicles and secreted from Pseudomonas aeruginosa. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 45 (1), 9-13 (2000).
  4. Yonezawa, H., et al. Outer membrane vesicles of Helicobacter pylori TK1402 are involved in biofilm formation. BMC Microbiology. 9, 197(2009).
  5. Mashburn, L. M., Whiteley, M. Membrane vesicles traffic signals and facilitate group activities in a prokaryote. Nature. 437 (7057), 422-425 (2005).
  6. Kato, S., Kowashi, Y., Demuth, D. R. Outer membrane-like vesicles secreted by Actinobacillus actinomycetemcomitans are enriched in leukotoxin. Microbial Pathogenesis. 32 (1), 1-13 (2002).
  7. Petousis-Harris, H., et al. Effectiveness of a group B outer membrane vesicle meningococcal vaccine against gonorrhoea in New Zealand: a retrospective case-control study. Lancet. 390 (10102), 1603-1610 (2017).
  8. Kim, O. Y., et al. Bacterial outer membrane vesicles suppress tumor by interferon-gamma-mediated antitumor response. Nature Communications. 8 (1), 626(2017).
  9. Thery, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
  10. Consortium, E. -T., et al. EV-TRACK: transparent reporting and centralizing knowledge in extracellular vesicle research. Nature Methods. 14 (3), 228-232 (2017).
  11. Watson, D. C., et al. Efficient production and enhanced tumor delivery of engineered extracellular vesicles. Biomaterials. 105, 195-205 (2016).
  12. Watson, D. C., et al. Scalable, cGMP-compatible purification of extracellular vesicles carrying bioactive human heterodimeric IL-15/lactadherin complexes. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1442088(2018).
  13. Lasaro, M., et al. Escherichia coli isolate for studying colonization of the mouse intestine and its application to two-component signaling knockouts. Journal of Bacteriology. 196 (9), 1723-1732 (2014).
  14. Kim, J. Y., et al. Engineered bacterial outer membrane vesicles with enhanced functionality. Journal of Molecular Biology. 380 (1), 51-66 (2008).
  15. Beveridge, T. J. Structures of gram-negative cell walls and their derived membrane vesicles. Journal of Bacteriology. 181 (16), 4725-4733 (1999).
  16. Reimer, S. L., et al. Comparative analysis of outer membrane vesicle isolation methods with an Escherichia coli tolA mutant reveals a hypervesiculating phenotype with outer-inner membrane vesicle content. Frontiers in Microbiology. 12, 628801(2021).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Extracellular VesiclesBacterial EVsEscherichia ColiEV IsolationSize Exclusion ChromatographyTangential Flow FiltrationTransmission Electron MicroscopyUltrafiltrationBacterial Cell CultureImmunogold Labeling

Powiązane artykuły