Pomiar dynamiki wypukłości krawędzi komórki podczas rozprzestrzeniania się za pomocą mikroskopii żywych komórek

Summary

Ten protokół ma na celu zmierzenie parametrów dynamicznych (wypukłości, retrakcje, falbany) wypukłości na krawędzi komórek rozsiewających.

Abstract

Rozwój i homeostaza organizmów wielokomórkowych opiera się na skoordynowanej regulacji migracji komórek. Migracja komórek jest istotnym wydarzeniem w budowie i regeneracji tkanek i ma kluczowe znaczenie w rozwoju embrionalnym, odpowiedziach immunologicznych i gojeniu się ran. Rozregulowanie ruchliwości komórek przyczynia się do zaburzeń patologicznych, takich jak przewlekłe stany zapalne i przerzuty do raka. Migracja komórek, inwazja tkanek, aksony i rozrost dendrytów rozpoczynają się od wypukłości krawędzi komórki za pośrednictwem polimeryzacji aktyny. W tym miejscu opisujemy prostą, wydajną i oszczędzającą czas metodę obrazowania i analizy ilościowej dynamiki wypukłości krawędzi komórki podczas rozsiewania. Metoda ta mierzy dyskretne cechy dynamiki błony komórkowej, takie jak wypukłości, retrakcje i zmarszczki, i może być wykorzystana do oceny, w jaki sposób manipulacje kluczowymi regulatorami aktyny wpływają na wypukłości krawędzi komórki w różnych kontekstach.

Introduction

Migracja komórek jest krytycznym procesem, który kontroluje rozwój i funkcjonowanie wszystkich żywych organizmów. Migracja komórek zachodzi zarówno w stanach fizjologicznych, takich jak embriogeneza, gojenie się ran i odpowiedź immunologiczna, jak i w stanach patologicznych, takich jak przerzuty raka i choroba autoimmunologiczna. Pomimo różnic w typach komórek, które biorą udział w różnych zdarzeniach migracyjnych, wszystkie zdarzenia ruchliwości komórek mają podobne mechanizmy molekularne, które zostały zachowane w ewolucji od pierwotniaków do ssaków i obejmują wspólne mechanizmy kontroli cytoszkieletu, które mogą wyczuwać środowisko, reagować na sygnały i modulować zachowanie komórki w odpowiedzi¹.

Początkowym etapem migracji komórek może być tworzenie bardzo dynamicznych wypukłości na krawędzi czołowej komórki. Za blaszką można znaleźć blaszkę, która łączy aktynę ze kurczliwością za pośrednictwem miozyny II i pośredniczy w przyleganiu do podłoża leżącego poniżej. Lamelipodia są indukowane przez bodźce zewnątrzkomórkowe, takie jak czynniki wzrostu, cytokiny i receptory adhezyjne komórek, i są napędzane przez polimeryzację aktyny, która zapewnia siłę fizyczną, która popycha błonę plazmatyczną do przodu^2,3. Zaangażowanych jest w to wiele białek sygnałowych i strukturalnych; wśród nich są GTPazy Rho, które działają koordynacyjnie z innymi sygnałami, aktywując białka regulujące aktynę, takie jak kompleks Arp 2/3, białka z rodziny WASP oraz członkowie rodzin Formin i Spire w lamellipodiach^2,4,5.

Oprócz polimeryzacji aktyny, aktywność miozyny II jest niezbędna do generowania sił skurczu na blaszce blaszkowej i przedniej. Skurcze te, definiowane również jako retrakcja krawędzi komórki, mogą również wynikać z depolimeryzacji aktyny dendrytycznej na obrzeżach komórki i mają kluczowe znaczenie dla rozwoju blaszkowatej krawędzi natarcia i umożliwienia występowi wyczucia elastyczności macierzy zewnątrzkomórkowej i innych komórek oraz określenia kierunku migracji^6,7,8. Występy krawędzi komórek, które nie mogą przyczepić się do podłoża, tworzą falbany błony obwodowej, struktury przypominające arkusze, które pojawiają się na brzusznej powierzchni blaszek i blaszek i przesuwają się do tyłu w stosunku do kierunku migracji. Ponieważ blaszka nie przyczepia się do podłoża, pod nią tworzy się tylna blaszka i mechanicznie popycha pierwsze blaszki w kierunku górnej powierzchni brzusznej. Włókna aktyny w falbanie, które wcześniej były równoległe do podłoża, teraz stają się do niego prostopadłe, a falbana znajduje się teraz nad posuwającym się blaszką. Falbania, która porusza się do tyłu, wpada z powrotem do cytozolu i reprezentuje komórkowy mechanizm recyklingu aktyny lamellipodial^9,10.

Tutaj opisujemy test do pomiaru dynamiki wystania krawędzi komórki. Test wypukłości wykorzystuje poklatkową mikroskopię wideo do pomiaru dynamiki wypukłości pojedynczej komórki przez 10 minut podczas fazy rozprzestrzeniania się komórki. Dynamika wypukłości jest analizowana poprzez generowanie kimografów z tych filmów. Zasadniczo kimograf dostarcza szczegółowych danych ilościowych o poruszających się cząstkach na wykresie czasoprzestrzennym, aby uzyskać jakościowe zrozumienie dynamiki krawędzi komórki. Intensywność poruszającej się cząstki jest wykreślana dla wszystkich stosów obrazów na wykresie czasu w funkcji przestrzeni, gdzie oś X i oś Y reprezentują odpowiednio czas i odległość¹¹. Metoda ta wykorzystuje ręczną analizę kimografową z ImageJ w celu uzyskania szczegółowych danych ilościowych, umożliwiających pobieranie informacji z filmów i obrazów w przypadku niskiego stosunku sygnału do szumu i/lub wysokiej gęstości cech oraz analizę obrazów uzyskanych w mikroskopii świetlnej z kontrastem fazowym lub słabej jakości obrazu.

Opisany tutaj test dynamiki wypukłości krawędzi komórki jest szybką, prostą i opłacalną metodą. W związku z tym, a także dlatego, że wykazano, że jest bezpośrednio skorelowany z migracją komórek^11,12, może być stosowany jako wstępna metoda badania dynamiki cytoszkieletu zaangażowanej w ruchliwość komórek przed podjęciem decyzji o zastosowaniu metod wymagających większej ilości zasobów. Co więcej, umożliwia również ilościowy pomiar tego, w jaki sposób manipulacje genetyczne (nokaut, powalenie lub ratunek) białek cytoszkieletu wpływają na dynamikę cytoszkieletu przy użyciu prostej platformy. Test jest pouczającym modelem do badania dynamiki cytoszkieletu w kontekście migracji komórek i może być wykorzystany do wyjaśnienia mechanizmów i cząsteczek leżących u podstaw ruchliwości komórek.

Protocol

Wszystkie metody opisane w tym protokole zostały zatwierdzone przez instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania (IACUC) Uniwersytetu Bar-Ilan.

UWAGA: Graficzne przedstawienie krok po kroku procedury opisanej w tej sekcji pojawia się w Rysunek 1.

1. Hodowla komórkowa

UWAGA: Komórki użyte w protokole to mysie fibroblasty embrionalne (MEF), które zostały wygenerowane z zarodków E11.5-13.5 myszy C57BL/6 typu dzikiego. Podstawowe MEF-y zostały wygenerowane zgodnie z protokołem laboratoryjnym Jacks¹³. Komórki z pięciu różnych zarodków połączono ze sobą i unieśmiertelniono przez zakażenie wektorem retrowirusowym eksprymującym duży antygen T SV40, a następnie selekcję za pomocą 4 mM histydynolu przez 3 tygodnie.

1. Hodowla komórek na płytkach do hodowli tkankowej zawierających zmodyfikowane podłoże Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco zawierające 1 g/l glukozy, 1% glutaminy, 1% penicyliny-streptomycyny i 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) (patrz tabela materiałów), w nawilżanym inkubatorze z 5% CO₂ w temperaturze 37 °C.
2. Hoduj komórki do 90%-95% zbiegu i dziel w stosunku 1:5 co 2-3 dni.

2. Powłoka naczynia ze szklanym dnem

UWAGA: Powlekanie naczynia szklanym dnem powinno być wykonywane w kapturze do hodowli tkanek w sterylnych warunkach.

1. Dodać 2 ml roztworu 1N HCl na środek naczynia ze szklanym dnem (tabela materiałów) i inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej (RT).
   UWAGA: Ten etap ma na celu usunięcie pozostałości ze szkła, które mogą później przerwać obrazowanie.
2. Umyj naczynie ze szklanym dnem trzy razy po 2 ml 1x PBS (Tabela Materiałów).
3. Rozcieńczyć fibronektynę (patrz tabela materiałów) do 10 μg/ml w 1x PBS. Dodaj 200 μl rozcieńczonego roztworu fibronektyny do szklanego środka naczynia. Inkubować w temperaturze 37 °C (inkubator do hodowli tkankowych) przez 1 h.
   UWAGA: Alternatywnie, naczynie ze szklanym dnem można inkubować przez noc w temperaturze 4 °C na płaskiej powierzchni.
4. Podczas inkubacji powlekania fibronektyną przygotować 1% roztwór BSA (Tabela Materiałów) w 1x PBS, przefiltrować przez 0,2 μm i denaturować przez inkubację w temperaturze 70 °C przez 30 minut we wstępnie podgrzanej łaźni wodnej.
5. Umyj naczynie ze szklanym dnem trzy razy po 2 ml 1x PBS każde.
6. Dodać 2 ml denaturowanego roztworu BSA do szklanego środka i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C (inkubator do hodowli tkankowych).
   UWAGA: Alternatywnie, naczynie ze szklanym dnem można inkubować przez noc w temperaturze 4 °C na płaskiej powierzchni.
7. Umyj naczynie ze szklanym dnem 3 razy po 2 ml 1x PBS każdy.
   UWAGA: Inkubację naczyń ze szklanym dnem z fibronektyną należy przeprowadzać przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze 37 °C, aby odpowiednio pokryć powierzchnię. Krótszy czas inkubacji może nie powodować prawidłowego powlekania, w wyniku czego fenotyp komórki może nie być związany z aktywacją integryny. Warstwa BSA jest obojętna i nie wpływa na dynamikę wypukłości i ma na celu blokowanie wolnych potencjalnych miejsc dla adhezji komórek niezależnych od integryn. BSA musi zostać zdenaturowany przed powlekaniem, aby zapobiec indukowaniu apoptozy komórek, która może wpływać na dynamikę krawędzi komórki.

3. Przygotowanie komórek do obrazowania

1. Szesnaście do osiemnastu godzin przed eksperymentem nałóż komórki na płytkę, aby następnego dnia osiągnęły 70%-80% konfluencji. W przypadku MEF należy podawać płytkę 0,7 x 10⁶ komórek na 10 cm średnicy płytki do hodowli tkankowej na dzień przed wykonaniem eksperymentu.
   UWAGA: Aby eksperyment z wypukłością był udany, ważne jest, aby komórki były używane podczas ich logarytmicznej fazy wzrostu. Aby to osiągnąć, komórki powinny osiągnąć 70%-80% konfluencji w dniu eksperymentu. Większe zagęszczenie komórek spowoduje dłuższy czas rozprzestrzeniania się i/lub utrudnienie przyczepiania się podczas eksperymentu.
2. W dniu doświadczenia dodać 2 ml roztworu trypsyny (tabela materiałów) na płytkę do hodowli tkankowej o średnicy 10 cm i inkubować przez 2-3 minuty w inkubatorze do hodowli tkankowych, aż komórki się odłączą. Dezaktywuj trypsynę, dodając 5 ml kompletnej pożywki.
3. Policz komórki za pomocą hemocytometru i umieść 20 000 komórek w 2 ml kompletnej pożywki na naczyniu ze szklanym dnem pokrytym jak powyżej (sekcja 2).
   UWAGA: Liczba komórek do powlekania zależy od wielkości i rodzaju komórek. W przypadku większych lub bardziej rozproszonych komórek należy umieścić tylko 10 000 komórek, aby mieć wystarczającą liczbę komórek do obrazowania. Ważne jest, aby wybierać pojedyncze komórki, które się nie stykają, ponieważ kontakt między komórkami może zmienić wewnętrzne zachowania rozprzestrzeniania się komórek.
4. Inkubować szalki ze szklanym dnem z posianymi komórkami w inkubatorze do hodowli tkankowych przez 15 min.
   UWAGA: Na tym etapie komórki przylegają do substratu fibronektyny i rozprzestrzeniają się po nim. Podczas pomiaru wypukłości podczas rozsiewania komórek, komórki powinny mieć możliwość rozprzestrzeniania się przez 15 minut po posiewie i przed obrazowaniem. Obrazowanie można wykonać w oknie czasowym od 15 minut do ~1 godziny po posiewaniu, a w każdym razie przed rozpoczęciem migracji komórek.

4. Ustawienie mikroskopu i obrazowanie

UWAGA: Dostępne są różne systemy mikroskopii żywych komórek. Zastosowany tutaj system to mikroskop odwrócony Leica AF6000 wyposażony w CO₂ i jednostki grzewcze i jest podłączony do cyfrowej kamery CMOS ORCA-Flash 4.0 V2.

1. Włączyć urządzenie grzewcze co najmniej 1 godzinę przed obrazowaniem i ustawić je na 37 °C.
2. Włącz jednostkę CO₂ co najmniej 10 minut przed obrazowaniem i ustaw ją na 5% CO_{2 .}
3. Włącz mikroskop, kamerę i komputer.
4. Otwórz oprogramowanie do akwizycji mikroskopu (patrz Spis materiałów). Wybierz folder, w którym chcesz zapisać przechwycone obrazy, i wpisz nazwę pliku. Zapisz każdy film jako nowy plik.
5. Ustaw powiększenie na 40-krotnym suchym obiektywie, kontrast fazowy. Ustaw interwał czasowy na 5 s, całkowity czas trwania filmu 10 min.
6. Po 15 minutach inkubacji posianych komórek umieścić naczynie ze szklanym dnem z przylegającymi komórkami do adaptera i zamocować. Włóż adapter z naczynią do szczeliny w stoliku mikroskopu.
7. Zdejmij pokrywę naczynia i zamiast niej umieść pokrywkę CO₂. Otwórz zawór CO₂.
   UWAGA: Upewnij się, że pokrywa CO₂ jest czysta przed umieszczeniem jej na naczyniu ze szklanym dnem. Brudna okładka obniży jakość filmów. Wytrzyj spód pokrywy CO₂ niestrzępiącą się chusteczką nasączoną 70% etanolem, aby usunąć kurz i brud. Przetrzyj po raz drugi suchą, niestrzępiącą się chusteczką.
8. Wyświetl komórki i znajdź odpowiednią komórkę do obrazowania. Upewnij się, że komórka jest aktywna i rozpocznij pobieranie filmów.

5. Analiza obrazu

UWAGA: Analiza obrazu jest wykonywana za pomocą ImageJ (Tabela Materiałów) w następujący sposób:

1. Otwórz uzyskany film w programie ImageJ.
2. Korzystając z narzędzia Prosty na głównym pasku narzędzi, wykonaj osiem linii po 20 dowolnych jednostek, z których każda jest prostopadła do występów, w tym blaszki i krawędzi komórki, w układzie promieniowym co 45°, jak pokazano na Rysunek 2A.
3. Na głównym pasku narzędzi przejdź do opcji Image > Stacks > Reslice. W ten sposób otrzymamy obraz kimograficzny, który opisuje ruch pojedynczych punktów w błonie komórkowej (Rysunek 2B). Ta czynność powinna być wykonywana osobno dla każdego wiersza z ośmiu wierszy.
4. Wyodrębnij i ręcznie policz z odpowiednich obrazów kimografu liczbę wypukłości, cofnięć i zmarszczek w każdym z ośmiu obszarów komórki, oznaczonych liniami siatki. Liczby te reprezentują częstotliwość występowania wypukłości, cofnięć i marszczeń na 10 minut (Rysunek 2C, D).
   UWAGA: Falbany można odróżnić od innych struktur na podstawie ich ciemnego wyglądu w mikroskopii z kontrastem fazowym i ich ruchu dośrodkowego, który zaczyna się na krawędzi komórki, a kończy na granicy ciała komórki, co można zaobserwować na pozyskanych filmach. Warto zauważyć, że przy ilościowym określaniu wypukłości, retrakcji i częstotliwości falban, filmy powinny być obserwowane jako kontrola kwantyfikacji, a zwłaszcza definiowania falban.
5. Określ trwałość, odległość i prędkość wypukłości za pomocą analizy kymograficznej. Dla każdego z wygenerowanych kymogramów oś X reprezentuje odległość, a oś Y reprezentuje czas.
6. Aby zmierzyć odległość występu, wykonaj kroki 5.6.1-5.6.2.
   1. Narysuj prostopadłą linię od podstawy występu do najwyższego wierzchołka występu. Naciśnij M w ImageJ, aby zmierzyć długość linii w pikselach.
   2. Aby przekonwertować długość z pikseli na μm, upewnij się, że stosunek pikseli do μm jest znany.
      UWAGA: Stosunek μm do pikseli to fizyczna długość piksela w kamerze CCD / całkowite powiększenie. Rozmiar piksela jest charakterystyczny dla każdego typu aparatu. Na przykład w przypadku aparatu użytego w tym badaniu rozmiar piksela wynosi 6,5 μm x 6,5 μm, długość fizyczna to 6,5 μm, a powiększenie, którego użyliśmy, to 40x. Dlatego stosunek μm do pikseli naszego aparatu wynosi 0,1625 μm/piksel. W analizie, dla linii o długości 30 pikseli, odległość występu wynosiłaby 30 pikseli x 0,1625 μm/piksel = 4,875 μm (Rysunek 3).
7. Aby zmierzyć czas wysunięcia (trwałość; czas, przez jaki występ wystaje przed wycofaniem), wykonaj kroki 5.7.1-5.7.2.
   1. Narysuj poziomą linię od początku występu (od lewej do prawej) do obszaru najwyższego szczytu. Naciśnij M w ImageJ, aby zmierzyć długość linii w pikselach.
   2. Aby przekonwertować długość z pikseli na minuty, oblicz stosunek pikseli do minut. Ta wartość zależy od interwału między images.
      UWAGA: W tym przykładzie interwał między obrazami wynosi 5 s, stosunek min/piksel wynosi 0,0833, a długość linii poziomej wynosi 8 pikseli. W związku z tym czas wypukłości wynosi 8 pikseli x 0,0833 min/piksel = 0,6664 min.
8. Zmierz i oblicz czas wycofania podobnie jak czas wysunięcia dla linii narysowanej poziomo u podstawy występu, od miejsca, w którym znajduje się szczyt występu, do jego podstawy po prawej stronie (linia X2 w Rysunek 3).
9. Oblicz prędkość wystania, dzieląc odległość występu przez czas wysunięcia. Oblicz prędkość wciągania, dzieląc odległość występu przez czas chowania. W tym przykładzie prędkość wypukłości jest obliczana jako 4,875 μm/0,6664 min = 7,315 μm/min., a prędkość cofania jest identyczna, ponieważ linia reprezentująca czas ma tę samą długość.
   UWAGA: Porównując różne typy komórek, tj. komórki wykazujące ekspresję typu dzikiego i zmutowane konstrukty tego samego białka, konieczne jest przeprowadzenie zaślepionej analizy, aby nie wprowadzać stronniczości.

Results

W eksperymencie opisanym w Rysunek 2, unieśmiertelnione MEF-y zostały posiane na szklanych dnach wstępnie pokrytych fibronektyną, aby aktywować sygnalizację za pośrednictwem integryny, zablokowaną przez zdenaturowane BSA, w celu zablokowania wolnych potencjalnych miejsc adhezji komórek, która nie jest zależna od aktywacji integryny. Aby osiągnąć logarytmiczną fazę wzrostu przy 70%-80% zbiegu komórek w dniu eksperymentu, 0,7 x 10⁶ MEF posiewano na płytce do hodowli tkankowej o śred...

Discussion

Dynamika wypukłości krawędzi komórki, składająca się z wypukłości, retrakcji i zmarszczek, jest zarówno warunkiem wstępnym, jak i potencjalnym zdarzeniem ograniczającym szybkość ruchliwości komórek. W tym miejscu opisujemy szybką i prostą metodę pomiaru dynamiki wystających krawędzi komórek podczas rozsiewania. Metoda ta umożliwia obrazowanie w krótkim czasie, generuje znaczną ilość danych, nie wymaga znakowania fluorescencyjnego komórek ani drogiego sprzętu do mikroskopii fluorescencyjnej i może być stosowana jako wstęp...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Płytki do hodowli komórkowych 10 cm	Greiner	P7612-360EA
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)	Sigma-Aldrich	A7906
Dulbecco' s zmodyfikowane podłoże Eagle (DMEM)	Biological Industries, Izrael	01-055-1A	Pożywka zawiera wysoką glukozę (4,5 g/L D-glukozy)
Dulbecco' s sól fizjologiczna buforowana fosforanami (1xDPBS)	Biological Industries, Izrael	02-023-1A
Płodowa surowica bydlęca (FBS)	Biological Industries, Izrael	04-001-1A
do hodowli komórkowych	Sigma-Aldrich	F0895
Naczynia ze szklanym dnem	Cellvis	D35-20-1.5-N	Naczynie ze szklanym dnem 35 mm, rozmiar naczynia 35 mm, rozmiar studni 20 mm, szkło nakrywkowe #1.5 (0.16-0.19 mm).
Oprogramowanie ImageJ	NIH		Feely dostępne pod adresem: https://imagej.nih.gov/ij/download.html
LAS-AF Leica Application Suite 3.2			Oprogramowanie do akwizycji mikroskopu wyposażone w cyfrowy CMOS ORCA-Flash 4.0 V2
Leica AF6000	Leica		Odwrócony mikroskop jasnego pola (40x, NA 1.3 ) wyposażony w optykę z kontrastem fazowym, inkubator i jednostkę CO2 z oprogramowaniem do akwizycji LAS AF wyposażoną w Cyfrowa kamera CMOS ORCA-Flash 4.0 V2 .
Roztwór L-glutaminy	Biological Industries, Izrael	03-020-1B
ORCA-Flash 4.0 V2 cyfrowa kamera CMOS	Hamamatsu Photonics
Roztwór penicyliny i streptomycyny	Biological Industries, Izrael	03-031-1B
Trypsyna-EDTA roztwór B (0,25%), EDTA (0,05%)	Biological Industries, Izrael	03-052-1A