Ulepszona platforma do hodowli całych zarodków umożliwia ciągły i solidny rozwój ex utero zarodków myszy po implantacji przez okres do sześciu dni, od etapów pregastrulacji do zaawansowanej organogenezy. W tym protokole szczegółowo opisujemy standardową procedurę udanej hodowli zarodków przy użyciu statycznych płytek i systemów obrotowych butelek.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Ex Utero Hodowla zarodków myszy od pregastrulacji do zaawansowanej organogenezy
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Metody hodowli zarodków ssaków po implantacji były na ogół nieefektywne i ograniczały się do krótkich okresów po wycięciu z macicy. Niedawno opracowano platformy do bardzo wytrzymałej i długotrwałej hodowli ex utero zarodków myszy od stadium cylindra jajowego do zaawansowanej organogenezy. Platformy te umożliwiają prawidłowy i wierny rozwój zarodków przed gastrulacją (E5.5) aż do etapu formowania kończyn tylnych (E11). W tych warunkach zarodki w późnym stadium gastrulacji (E7.5) są hodowane w butelkach rotacyjnych, podczas gdy hodowla rozszerzona od etapu pregastrulacji (E5.5 lub E6.5) wymaga połączenia kultur w butelce statycznej i rotacyjnej. Ponadto precyzyjna regulacja stężeniaO2 i CO2 , ciśnienia gazu, poziomu glukozy oraz stosowanie specjalnej pożywki do hodowli macicznej mają kluczowe znaczenie dla prawidłowego rozwoju zarodka. Tutaj przedstawiono szczegółowy protokół krok po kroku dotyczący rozszerzonej hodowli zarodków myszy ex utero. Zdolność do hodowli normalnych zarodków myszy ex utero od gastrulacji do organogenezy stanowi cenne narzędzie do charakteryzowania wpływu różnych zaburzeń eksperymentalnych podczas rozwoju embrionalnego.
Wprowadzenie
Wewnątrzmaciczny rozwój zarodka ssaków ograniczył badania wczesnych etapów rozwoju poimplantacyjnego1,2. Niedostępność rozwijającego się zarodka utrudnia zrozumienie kluczowych procesów rozwojowych zachodzących po zagnieżdżeniu się zarodka w macicy, takich jak ustalenie planu ciała zwierzęcia, określenie listków rozrodczych czy tworzenie tkanek i narządów. Co więcej, bardzo mały rozmiar wcześnie zagnieżdżonego zarodka utrudnia jego obserwację za pomocą obrazowania przyżyciowego w macicy przed E103. Brak możliwości obserwacji i manipulowania żywymi embrionami na tych etapach ogr....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z Wytycznymi Ochrony Zwierząt Instytutu Naukowego Weizmanna i zatwierdzone przez odpowiedni Instytut Weizmanna IACUC (#01390120-1, 01330120-2, 33520117-2). Zdrowe kobiety w ciąży zostały poproszone o wyrażenie świadomej zgody na pobranie krwi pępowinowej, zgodnie z aprobatą Komitetu Centrum Medycznego Rambam w Helsinkach (#RMB-0452-15). Zdrowych dorosłych poproszono o świadomą zgodę na pobranie krwi zgodnie z wytycznymi Komitetu Helsińskiego Instytutu Naukowego Weizmanna (#1566-3).
1. Przygotowanie mediów
- Przygotować pożywkę preparacyjną przy u....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Warunki hodowli w rotatorach opisane dla embrionów w stadium E7.5 (późna faza gastrulacji) wspierają stały i prawidłowy wzrost embrionów ze średnią wydajnością bliską 75% po 4 dniach hodowli (Rysunek 2 oraz Tabela 1). Wydajność rozwoju embrionów może się różnić w zależności od różnych tło genetycznych myszy, lecz pozostaje konsekwentnie wysoka (Rysunek 2C). Suplementacja HBS zamiast HCS daje wydajność na poziomie ~68% po 4 dniach hodowli ex .......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Przedstawiony w niniejszym dokumencie protokół hodowli może utrzymać prawidłowy i ciągły rozwój zarodka myszy ex utero przez okres do sześciu dni, od E5,5 do E11. Wcześniej zarodki na tych etapach rozwoju mogły rozwijać się normalnie w hodowli tylko przez krótkie okresy (do 48 godzin)15. Sprzężenie modułu regulacji gazu z inkubatorem do hodowli rolkowej w celu precyzyjnej kontroli stężenia tlenu i ciśnienia gazu hiperbarycznego ma kluczowe znaczenie dla prawidłowej hodowli zarodków myszy .......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
J.H.H. jest doradcą Biological Industries Ltd i złożył wniosek patentowy obejmujący opisane w niniejszym dokumencie warunki hodowli walcowej i statycznej (złożony przez J.H.H. i Weizmann Institute of Science). Inni autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.
Podziękowania
Ta praca została sfinansowana przez Pascala i Ilanę Mantoux; Europejska Rada ds. Badań Naukowych (ERC-CoG-2016 726497-Cellnaivety); Rada ds. Badań Medycznych Stewardess (FAMRI); Profesura Izraelskiego Funduszu Badań nad Rakiem (ICRF), BSF, Instytut Badań nad Komórkami Macierzystymi im. Helen i Martina Kimmelów, Nagroda Helen i Martina Kimmelów za Innowacyjne Badania; Izraelska Fundacja Naukowa (ISF), Minerva, Instytut Chemii Medycznej Shermana, Centrum Chorób Neurologicznych im. Nelli i Leona Benoziya, Centrum Badań nad Zaburzeniami Genetycznymi Davida i Feli Shapellów, Instytut Genetyki Medycznej Rodziny Kekst, Fundusz Badań nad Komórkami Macierzystymi im. dr Beth Ro....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 0,22 &mikro; m filtr o wielkości porów (250 ml) | JetBiofil | FCA-206-250 | |
| 0,22 &mikro; m strzykawka o wielkości porów filtr PVDF | Millipore | SLGV033RS | |
| 8-dołkowa i mikropłytki szklane dno/ibiTreat | iBidi | 80827/80826 | |
| Butelka z nakrętką adaptera do wlotu gazu | Arad Technologies | ||
| Korki (otwór) | B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering | BTC 06 | Służy do uszczelniania butelek do bębna |
| Korki (solidne) | B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering | BTC 07 | Służy do uszczelniania obracającego się bębna |
| Butelki hodowlane | B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering | BTC 03/BTC 04 | Butelki szklane (małe) BTC 03 lub butelki szklane (duże) BTC 04 |
| D(+)-glukoza Monohydrat | J.T. Baker | ||
| Nóż diamentowy | Fine Science Tools | 10100-30/45 | |
| Cyfrowy manometr | Shanghai Benxu Electronics Technology co., Ltd | BX-DPG80 | |
| DMEM | GIBCO | 11880 | |
| Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco | Branże biologiczne | 02-020-1A | |
| Surowica bydlęca płodu | Branże biologiczne | 04-013-1A | |
| Moduł regulacji gazu | Arad Technologies | HannaLab1 | |
| Glutamax | GIBCO | 35050061 | glutamina |
| Kleszcze Graefe | Fine Science Tools | 11052-10 | |
| HEPES | GIBCO | 15630056 | |
| Kleszcze mikrochirurgiczne (Dumont #5, #55) | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Pipety Pasteura (szkło) | Hilgenberg | 3150102 | |
| Pipety Pasteura (plastikowe) | Alexred | SO P12201 | |
| Penicylina/Streptomycyna | Branże biologiczne | 03-031-1B | |
| Szalki Petriego (60 mm i 100 mm) | Falcon | 351007/351029 | |
| Precyzyjny system inkubatora | B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering | BTC01 | Model BTC01 z zestawem bełkotki gazowej |
| Prokoagulantyczne sterylne probówki (5 ml) | Greiner Bio-One | #456005 | |
| Surowica hodowli całego zarodka szczura | ENVIGO Bioproducts | B-4520 | |
| Mikroskop stereoskopowy wyposażony w płytkę grzewczą | Nikon | SMZ18 | |
| Sterylne strzykawki (5, 10 ml) do filtracji surowicy | Solution | ||
| Nożyczki chirurgiczne | Fine Science Tools | 14094-11 |
Bibliografia
- New, D. A. Whole-embryo culture and the study of mammalian embryos during organogenesis. Biological Reviews of the Cambridge Philosophical Society. 53 (1), 81-122 (1978).
- Tam, P. P., Behringer, R. R. Mouse gastrulation: the....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
