Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Ex Utero Hodowla zarodków myszy od pregastrulacji do zaawansowanej organogenezy

7.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63160

⸱

19 października 2021

 , 
1Department of Molecular Genetics, Weizmann Institute of Science

W tym artykule

Podsumowanie

Ulepszona platforma do hodowli całych zarodków umożliwia ciągły i solidny rozwój ex utero zarodków myszy po implantacji przez okres do sześciu dni, od etapów pregastrulacji do zaawansowanej organogenezy. W tym protokole szczegółowo opisujemy standardową procedurę udanej hodowli zarodków przy użyciu statycznych płytek i systemów obrotowych butelek.

Streszczenie

Metody hodowli zarodków ssaków po implantacji były na ogół nieefektywne i ograniczały się do krótkich okresów po wycięciu z macicy. Niedawno opracowano platformy do bardzo wytrzymałej i długotrwałej hodowli ex utero zarodków myszy od stadium cylindra jajowego do zaawansowanej organogenezy. Platformy te umożliwiają prawidłowy i wierny rozwój zarodków przed gastrulacją (E5.5) aż do etapu formowania kończyn tylnych (E11). W tych warunkach zarodki w późnym stadium gastrulacji (E7.5) są hodowane w butelkach rotacyjnych, podczas gdy hodowla rozszerzona od etapu pregastrulacji (E5.5 lub E6.5) wymaga połączenia kultur w butelce statycznej i rotacyjnej. Ponadto precyzyjna regulacja stężeniaO2 i CO2 , ciśnienia gazu, poziomu glukozy oraz stosowanie specjalnej pożywki do hodowli macicznej mają kluczowe znaczenie dla prawidłowego rozwoju zarodka. Tutaj przedstawiono szczegółowy protokół krok po kroku dotyczący rozszerzonej hodowli zarodków myszy ex utero. Zdolność do hodowli normalnych zarodków myszy ex utero od gastrulacji do organogenezy stanowi cenne narzędzie do charakteryzowania wpływu różnych zaburzeń eksperymentalnych podczas rozwoju embrionalnego.

Wprowadzenie

Wewnątrzmaciczny rozwój zarodka ssaków ograniczył badania wczesnych etapów rozwoju poimplantacyjnego1,2. Niedostępność rozwijającego się zarodka utrudnia zrozumienie kluczowych procesów rozwojowych zachodzących po zagnieżdżeniu się zarodka w macicy, takich jak ustalenie planu ciała zwierzęcia, określenie listków rozrodczych czy tworzenie tkanek i narządów. Co więcej, bardzo mały rozmiar wcześnie zagnieżdżonego zarodka utrudnia jego obserwację za pomocą obrazowania przyżyciowego w macicy przed E103. Brak możliwości obserwacji i manipulowania żywymi embrionami na tych etapach ograniczył badania nad wczesną embriogenezą po implantacji do migawek podczas rozwoju.

Protokoły hodowli in vitro preimplantacyjnych zarodków ssaków są dobrze znane, niezawodne i regularnie wykorzystywane4. Niemniej jednak próby ustanowienia systemów hodowli ex utero zdolnych do wspierania prawidłowego wzrostu zarodków ssaków po implantacji zakończyły się ograniczonym sukcesem5. Od ponad stu lat proponowane są różne techniki hodowli, głównie poprzez hodowlę zarodków na konwencjonalnych płytkach statycznych6,7,8 lub butelki obrotowe (kultury rolkowe)5,9,10. Platformy te okazały się pomocne w poszerzaniu wiedzy na temat rozwoju ssaków po implantacji11,12, mimo że są wysoce nieefektywne dla normalnej przeżywalności zarodka i ograniczone do krótkich okresów. Zarodki zaczęły wykazywać opóźnienie rozwoju i anomalie morfologiczne już po 24-48 godzinach od rozpoczęcia hodowli.

To badanie dostarcza szczegółowego opisu tworzenia systemu hodowli zarodków ex utero, który umożliwia ciągły rozwój od etapu pregastrulacji do zaawansowanego etapu organogenezy przez okres do sześciu dni rozwoju poimplantacyjnego13. W artykule opisano ulepszony protokół hodowli rolkowej, który wspiera wzrost zarodków E7.5 (stadium płytki nerwowej i fałdy na głowie) do etapu tworzenia kończyn tylnych (~E11) oraz rozszerzony protokół hodowli z E5.5/E6.5 poprzez połączenie hodowli na płytkach statycznych i platformach hodowlanych rolkowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z Wytycznymi Ochrony Zwierząt Instytutu Naukowego Weizmanna i zatwierdzone przez odpowiedni Instytut Weizmanna IACUC (#01390120-1, 01330120-2, 33520117-2). Zdrowe kobiety w ciąży zostały poproszone o wyrażenie świadomej zgody na pobranie krwi pępowinowej, zgodnie z aprobatą Komitetu Centrum Medycznego Rambam w Helsinkach (#RMB-0452-15). Zdrowych dorosłych poproszono o świadomą zgodę na pobranie krwi zgodnie z wytycznymi Komitetu Helsińskiego Instytutu Naukowego Weizmanna (#1566-3).

1. Przygotowanie mediów

  1. Przygotować pożywkę preparacyjną przy użyciu 500 ml zmodyfikowanej pożywki Dulbecco's Eagle Medium (DMEM) bez czerwieni fenolowej i L-glutaminy, uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą, 5 ml penicyliny/streptomycyny i wysterylizować filtrem za pomocą filtra 0,22 μm.
    UWAGA: Pożywkę preparacyjną należy przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 1 miesiąca.
  2. Pożywkę do hodowli zarodków (EUCM) należy przygotowywać świeżo każdego dnia hodowli macicy w kapturze biologicznym, używając 25% pożywki embrionalnej oraz 50% surowicy szczurzej i 25% ludzkiej surowicy krwi pępowinowej (HCS) lub surowicy krwi dorosłej ludzkiej (HBS).
  3. Aby przygotować pożywkę embrionalną, dodaj 5 ml glutaminy, 5 ml HEPES i 5 ml penicyliny/streptomycyny w 500 ml DMEM bez czerwieni fenolowej i L-glutaminy. Przygotować 10-15 ml porcji i przechowywać je w temperaturze 4 °C przez okres do dwóch miesięcy.
    UWAGA: Podwój stężenie antybiotyku, jeśli wystąpi jakiekolwiek zanieczyszczenie.
  4. Inaktywuj termicznie surowicę szczura w temperaturze 56 °C przez 30-45 minut i przefiltruj przez filtr z polifluorku winylidenu 0,22 μm. Stosować surowicę do posiewu w tym samym dniu inaktywacji. Rozmrozić HCS lub HBS i natychmiast użyć go do eksperymentów.
    UWAGA: Komercyjna surowica szczurów zapewnia spójne wyniki (co najmniej 4 partie zostały przetestowane bez wyraźnych zmian). Alternatywnie, wysokiej jakości surowicę szczurów można uzyskać we własnym zakresie, jak opisano wcześniej8,14. Jeśli HCS nie jest dostępny, zastąp go HBS zbieranym we własnym zakresie. Surowicę szczurzą, HCS i HBS można ponownie zamrozić i przechowywać w temperaturze -20 °C do użycia w innym dniu. Rozmrozić i połączyć ponownie zamrożone serum z większą objętością świeżo rozmrożonej surowicy i nie zamrażać go ponownie.

2. Pobieranie ludzkiej surowicy krwi pępowinowej i ludzkiej surowicy krwi dorosłej

  1. W celu wyizolowania HCS należy pobrać krew pępowinową od zdrowych kobiet w ciąży w dniu planowanego porodu przez cesarskie cięcie.
    1. Natychmiast po porodzie należy dwukrotnie zacisnąć pępowinę w odległości 5-7 cm od pępka i przeciąć między zaciskami.
    2. Ręcznie pobieraj krew za pomocą igły o dużej średnicy 14 G i strzykawki o pojemności 50 ml bezpośrednio z żyły pępowinowej, podczas gdy łożysko pozostaje na miejscu, aby uniknąć śladów hemolizy.
      UWAGA: Krew należy pobrać po usunięciu niemowlęcia z pola operacji i pobraniu krwi pępowinowej do badań klinicznych.
  2. Dozuj pobraną krew do 5 ml sterylnych probówek prokoagulantu i natychmiast przenieś je do 4 °C na 15 minut, aby umożliwić pełną krzepnięcie. Odwirować skrzepnięte probówki o masie 2 500 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
  3. Wyrzuć probówki wykazujące oznaki hemolizy (różowo-czerwona surowica). Zebrać surowicę (koloru żółtego) za pomocą pipety o pojemności 5 ml i przefiltrować przez filtr 0,22 μm. Natychmiast dezaktywuj serum na gorąco w łaźni wodnej o temperaturze 56 °C przez 45 minut.
  4. Przygotować 1-1,5 ml porcji inaktywowanej surowicy i przechowywać je w temperaturze -80 °C przez okres do sześciu miesięcy. W razie potrzeby wyślij w temperaturze -70 °C przy użyciu suchego lodu.
  5. W przypadku pobierania surowicy krwi u dorosłych ludzi należy pobrać krew od zdrowych osób dorosłych i natychmiast wyizolować surowicę zgodnie z tym samym protokołem, który opisano dla surowicy krwi pępowinowej. Przechowywać HBS w postaci inaktywowanych termicznie i przefiltrowanych porcji w temperaturze -80 °C przez okres do sześciu miesięcy.
    UWAGA: Surowica pępowinowa dla człowieka i surowica dla dorosłego człowieka przygotowana świeżo na miejscu dały lepsze wyniki niż surowica dostępna na rynku. Pobrać HCS od zdrowych kobiet w wieku powyżej 18 lat i poniżej 40 roku życia, które mają zostać podjęte przez cesarskie cięcie. Wyklucz kobiety, które rodziły naturalnie, oraz kobiety z jakąkolwiek przewlekłą chorobą lub aktywnymi schorzeniami, w tym cukrzycą ciążową lub nadciśnieniem.

3. Hodowla zarodków metodą ex utero od E7.5 do E11

  1. Konfiguracja inkubatora do hodowli walcowych i reduktora gazu
    1. Hodowla zarodków E7.5 lub bardziej zaawansowanych przy użyciu systemu inkubatora do hodowli rolkowych. Włączyć rotator i urządzenie grzewcze w temperaturze 37 °C na co najmniej 1 godzinę przed rozbieraniem zarodków. Dodaj autoklawowaną wodę do butli wlotowej gazu i probówki wylotowej.
      UWAGA: Umieść termometr w pobliżu obracającego się bębna i często sprawdzaj stabilność temperatury wewnątrz inkubatora. Otwórz inkubator tak szybko, jak to możliwe, ponieważ wydłużony czas otwarcia spowoduje wzrost temperatury i wpłynie na rozwój zarodka. W razie potrzeby dodaj więcej autoklawowanej wody do butli wlotowej gazu i probówki wylotowej, aby utrzymać je na poziomie co najmniej połowy pojemności podczas hodowli. Chroń zarodki wewnątrz inkubatora przed światłem, przykrywając inkubator szmatką.
    2. Włącz moduł regulatora gazu, naciskając wyłącznik główny, a następnie włączając sterowniki tlenu/azotu i CO2 (Rysunek 1A). Ustaw wartości tlenu i CO2 na 5% za pomocą odpowiednich sterowników. Otwórz regulator gazu i ustaw ciśnienie gazu na ~6,5-7 funtów na cal kwadratowy (psi), przesuwając przełącznik napięcia w przetworniku ciśnienia (Rysunek 1B). Potwierdź wartość ciśnienia gazu za pomocą cyfrowego manometru.
    3. Monitoruj przepływ gazu, sprawdzając ilość pęcherzyków powstających wewnątrz wylotowej probówki wypełnionej wodą umieszczonej wewnątrz precyzyjnego inkubatora. Ustaw odpowiednią szybkość pęcherzyków, zamykając/otwierając zawór przepływu gazu na pokrywie butelki z wodą. Upewnij się, że przepływ gazu pozwala na tworzenie się pęcherzyków z szybkością 2-4 pęcherzyków na sekundę lub ustaw przepływ pęcherzyków w pierwszym punkcie, w którym bulgotanie wydostaje się do rurki wylotowej wypełnionej wodą.
    4. Napełnij butelki hodowlane 2 ml pożywki hodowlanej i podłącz je do wydrążonego obrotowego bębna w celu wstępnego wyrównania przez 1 godzinę. Użyj wydrążonych silikonowych korków, aby uszczelnić butelki do bębna. Utrzymuj zamknięte puste przestrzenie w obracającym się bębnie za pomocą solidnych zatyczek.
      UWAGA: Brak pęcherzyków w rurce wylotowej (brak gazu przepływającego przez układ) lub wyjątkowo wysoki przepływ gazu może wpływać na rozwój zarodka. W przypadku braku przepływu pęcherzyków do probówki wylotowej, sprawdź, czy wszystkie silikonowe korki są prawidłowo umieszczone w obracającym się bębnie i uszczelniającym system, a także sprawdź, czy butelka z wodą jest prawidłowo zamknięta, a wszystkie rurki są prawidłowo podłączone. Brak bulgotania dostającego się do butelki z wodą może wskazywać na awarię regulatora gazu.
  2. Sekcja zarodków myszy od ciężarnych myszy
    1. Wstępnie wyrównać podłoże preparacyjne w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez co najmniej 1 godzinę. Pozostawić pokrywę lekko uchyloną, aby umożliwić wymianę gazową.
    2. Poświęć ciężarną samicę przez zwichnięcie szyjki macicy, oczyść brzuch samicy 70% etanolem i przetnij skórę i ścianę brzucha nożyczkami. Zlokalizuj jeden koniec macicy i przetnij na przecięciu między jajnikiem a macicą. Następnie przeciąć wzdłuż macicy aż do drugiego końca i przenieść ją na 100-milimetrową szalkę Petriego wypełnioną solą fizjologiczną buforowaną fosforanami Dulbecco o temperaturze pokojowej (DPBS).
      UWAGA: Zaleca się stosowanie naturalnie krytych samic bez hormonów.
    3. Szybko umyj conceptusy w DPBS i pokrój na pary, aby ułatwić obchodzenie się z zarodkami. Przenieść wszystkie pary pojęć na wstępnie zrównoważoną pożywkę do rozwarstwiania na szalce Petriego o średnicy 60 mm i pokroić na pojedyncze pojęcia.
    4. Usuń ścianę macicy z konceptów, rozrywając tkankę macicy za pomocą pary grubych kleszczy. Użyj cienkich kleszczy mikrochirurgicznych, aby przeciąć końcówkę decidua w kształcie gruszki. Włóż kleszcze obok zarodka równolegle do jego długiej osi i otwórz kleszcze, aby podzielić decidua na połowy.
    5. Na koniec pozostaw nienaruszony stożek ektołożyskowy przymocowany do cylindra jajowego, chwytając zarodek z decidua i odrywając woreczek żółtkowy ciemieniowy z zarodka za pomocą cienkich kleszczy.
      UWAGA: Aby uniknąć wpływu na zarodek, należy przeprowadzić sekcje pod mikroskopem wyposażonym w płytkę grzewczą w temperaturze 37 °C w ciągu maksymalnie 30-40 minut. Analizuj jeden miot zarodków na raz.
    6. Natychmiast po rozbiorze należy przenieść zarodki na nową płytkę wypełnioną zrównoważonym podłożem do preparacji za pomocą szklanej pipety Pasteura, aby zapobiec przywieraniu zarodków do resztek tkanki.
    7. Wybierz te zarodki w stadium płytki nerwowej/wczesnego fałdu głowy, które nie wykazują uszkodzeń w epiblastach i przenieś 5-6 zarodków w butelce do wstępnie zbalansowanych szklanych butelek hodowlanych.
      UWAGA: Aby przygotować szklaną pipetę Pasteura, przytnij otwór pipety do odpowiedniego rozmiaru, aby zmieścił się w zarodkach za pomocą noża do szkła, i przechowuj go w etanolu, aby uniknąć zanieczyszczenia. Umyj szklaną pipetę PBS przed transferem zarodków. Podczas przenoszenia zarodków do butelki hodowlanej należy upewnić się, że przenoszona jest jak najmniejsza objętość podłoża do preparacji, aby uniknąć rozcieńczenia EUCM.
    8. Umieścić butelki w systemie hodowli rotacyjnej w temperaturze 37 °C, w atmosferze 5%O2 i 5% CO2 .
    9. Każdego dnia hodowli wyjmuj butelki pojedynczo z inkubatora, aby ocenić rozwój zarodka pod mikroskopem stereoskopowym. Upewnij się, że podczas wyjmowania butelki zamknąłeś pusty otwór w bębnie solidną zatyczką. Odetnij końcówkę sterylnej plastikowej pipety Pasteura, aby dopasować ją do wielkości zarodka i przenieś zarodki na szalkę Petriego, aby ułatwić obserwację. Upewnij się, że zarodki są zawsze pokryte pożywką.
      UWAGA: Zminimalizuj czas, przez jaki zarodki znajdują się poza inkubatorem, aby uniknąć szkodliwych skutków dla zarodków spowodowanych spadkiem temperatury ciała. Z zarodkami należy obchodzić się ostrożnie, aby uniknąć pęknięcia naczyń krwionośnych woreczka żółtkowego, co wpływa na przeżycie zarodka.
    10. W 1. dniu hodowli (co odpowiada E8,5) przenieść grupy 3 zarodków do nowej butelki z 2 ml świeżego i wstępnie zrównoważonego EUCM zawierającego dodatkowe 3 mg/ml D-glukozy i mieszaninę gazów 13%O2, 5% CO2 .
    11. Po 48 godzinach (co odpowiada E9,5) przenieść grupy dwóch zarodków do nowej butelki ze świeżo podgrzanym EUCM plus 3,5 mg/ml glukozy w atmosferze gazowej 18%O2 i 5% CO2 .
    12. Po 72 godzinach hodowli (co odpowiada E10,5) przenieś każdy zarodek do osobnej butelki zawierającej 1,5-2 ml świeżej pożywki uzupełnionej 4 mg/ml glukozy i dopływem gazu 21%O2 i 5% CO2,
      UWAGA: Zarodki osiągają maksymalny wzrost około północy 4. dnia hodowli.
    13. Za pomocą cienkich kleszczyków usuń woreczek żółtkowy i owodnię oraz odłącz pępowinę w celu prawidłowej obserwacji morfologii zarodka. Wyłącz moduł regulacji gazu i inkubator precyzyjny.
      UWAGA: Wstępnie zrównoważyć pożywkę hodowlaną przez 1 godzinę przez inkubację w szklanej butelce w kulturze walcowej w odpowiedniej atmosferze gazowej zgodnie ze stadium zarodka. Po każdym użyciu wyczyść butelki hodowlane i wszystkie szklane naczynia inkubatora, wykonując trzy płukania bieżącą wodą destylowaną, a następnie mycie przez noc zanurzoną w 70% etanolu. Umyj ponownie trzy razy bieżącą wodą destylowaną, pozostaw butelki do wyschnięcia na noc i wysterylizuj w autoklawie. Podobnie, regularnie sterylizuj w autoklawie silikonowe zatyczki. Dokładnie wyczyść wszystkie narzędzia do preparowania 70% etanolem i wysterylizuj je na sucho.

4. Rozszerzona hodowla zarodków z E5.5/E6.5 do E11

  1. Hodowla pregastrulacji (E5.5) i wczesnej gastrulacji (E6.5) zarodków do wczesnego stadium somitu (E8.5) na płytkach statycznych.
  2. Wstępnie równoważyć pożywkę preparacyjną przez 1 godzinę w inkubatorze z 5% CO2 w temperaturze 37 °C.
    UWAGA: Aby umożliwić wymianę gazu, nie zamykaj całkowicie pokrywy rurki.
  3. Przygotować płytki hodowlane, dodając 250 μl świeżo przygotowanego EUCM do każdej studzienki. Umieścić płytki w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C w celu wstępnego wyrównania.
    UWAGA: Chociaż płytki 8-dołkowe dobrze nadają się do wzrostu zarodków, hodowlę można przeprowadzić na dowolnej innej płytce, dostosowując objętość pożywki do wielkości płytki.
  4. Wypreparować zarodki cylindryczne z jaja jajowego z macicy zgodnie z techniką opisaną dla E7.5. Usunąć woreczek żółtkowy ciemieniowy zarodka i pozostawić nienaruszony stożek ektołożyskowy przymocowany do cylindra jaja.
  5. Przenieść pojedyncze zarodki do każdego dołka na płytce 8-dołkowej za pomocą mikropipety i umieścić płytkę w inkubatorze z 5% CO2 w temperaturze 37 °C.
  6. Zobrazuj zarodki pod mikroskopem stereoskopowym i wybierz do hodowli tylko te z dobrze uformowaną jamą owodniową, bez widocznych uszkodzeń i bez błony Reicherta.
    UWAGA: Użyj końcówek do pipet o pojemności 20 μl do transferu zarodków E5.5 i końcówek o pojemności 200 μl do transferu zarodków E6.5. W przypadku kultur rozpoczynających się od E6,5, HCS można zastąpić świeżo pobranym HBS.
  7. Usunąć połowę pożywki i dodać 250 μl świeżo przygotowanej, wstępnie podgrzanej pożywki po 24 godzinach hodowli, upewniając się, że zarodki są zawsze zanurzone w pożywce. W przypadku kultur rozpoczynających się od E5.5, po dwóch dniach hodowli (co odpowiada E7.5), usunąć 200 μl i dodać 250 μl nowego EUCM.
    UWAGA: Podczas hodowli statycznej zarodki mogą przyczepiać się do płytki (głównie w przypadku stosowania plastikowych płytek), co poważnie zagroży rozwojowi zarodka. Przyczepianie zarodka do płytki jest częstsze w pierwszym dniu hodowli zarodków E5,5. Aby zapobiec przyczepieniu się, ostrożnie odepchnij zarodki od powierzchni płytki za pomocą cienkich, sterylnych kleszczyków. Sprawdzić, czy tylko stożek ektołożyskowy pozostał przymocowany do powierzchni płytki.
  8. Przenieść zarodki do hodowli rolkowej we wczesnym stadium somitów (4-7 somitów; po trzech dniach hodowli w przypadku zarodków eksplantowanych w E5,5 i dwóch dniach w przypadku hodowli rozpoczętych w stadium E6,5), zgodnie z tymi samymi wskazaniami, które opisano wcześniej dla zarodków w stadium E8,5.
    UWAGA: Przeniesienie zarodków do hodowli rolkowej w stadiach somitowych innych niż wskazane powyżej skutkuje niepowodzeniem dalszego rozwoju. W przeciwieństwie do hodowli ex utero E7,5 możliwe jest utrzymanie zarodków w stałej atmosferze o stężeniu 21% tlenu i 5%CO2, zapewniając nieco wyższą efektywność rozwoju zarodka niż atmosfery o dynamicznym stężeniu tlenu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Warunki hodowli w rotatorach opisane dla embrionów w stadium E7.5 (późna faza gastrulacji) wspierają stały i prawidłowy wzrost embrionów ze średnią wydajnością bliską 75% po 4 dniach hodowli (Rysunek 2 oraz Tabela 1). Wydajność rozwoju embrionów może się różnić w zależności od różnych tło genetycznych myszy, lecz pozostaje konsekwentnie wysoka (Rysunek 2C). Suplementacja HBS zamiast HCS daje wydajność na poziomie ~68% po 4 dniach hodowli ex ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Przedstawiony w niniejszym dokumencie protokół hodowli może utrzymać prawidłowy i ciągły rozwój zarodka myszy ex utero przez okres do sześciu dni, od E5,5 do E11. Wcześniej zarodki na tych etapach rozwoju mogły rozwijać się normalnie w hodowli tylko przez krótkie okresy (do 48 godzin)15. Sprzężenie modułu regulacji gazu z inkubatorem do hodowli rolkowej w celu precyzyjnej kontroli stężenia tlenu i ciśnienia gazu hiperbarycznego ma kluczowe znaczenie dla prawidłowej hodowli zarodków myszy ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

J.H.H. jest doradcą Biological Industries Ltd i złożył wniosek patentowy obejmujący opisane w niniejszym dokumencie warunki hodowli walcowej i statycznej (złożony przez J.H.H. i Weizmann Institute of Science). Inni autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Podziękowania

Ta praca została sfinansowana przez Pascala i Ilanę Mantoux; Europejska Rada ds. Badań Naukowych (ERC-CoG-2016 726497-Cellnaivety); Rada ds. Badań Medycznych Stewardess (FAMRI); Profesura Izraelskiego Funduszu Badań nad Rakiem (ICRF), BSF, Instytut Badań nad Komórkami Macierzystymi im. Helen i Martina Kimmelów, Nagroda Helen i Martina Kimmelów za Innowacyjne Badania; Izraelska Fundacja Naukowa (ISF), Minerva, Instytut Chemii Medycznej Shermana, Centrum Chorób Neurologicznych im. Nelli i Leona Benoziya, Centrum Badań nad Zaburzeniami Genetycznymi Davida i Feli Shapellów, Instytut Genetyki Medycznej Rodziny Kekst, Fundusz Badań nad Komórkami Macierzystymi im. dr Beth Rom-Rymer, Fundacja Edmonda de Rothschilda, Fundacja Charytatywna Zantker, Posiadłość Zvia Zeroni.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,22 &mikro; m filtr o wielkości porów (250 ml)JetBiofilFCA-206-250
0,22 &mikro; m strzykawka o wielkości porów filtr PVDFMilliporeSLGV033RS
8-dołkowa i mikropłytki szklane dno/ibiTreatiBidi80827/80826
Butelka z nakrętką adaptera do wlotu gazuArad Technologies
Korki (otwór)B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision EngineeringBTC 06Służy do uszczelniania butelek do bębna
Korki (solidne)B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision EngineeringBTC 07Służy do uszczelniania obracającego się bębna
Butelki hodowlaneB.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision EngineeringBTC 03/BTC 04Butelki szklane (małe) BTC 03 lub butelki szklane (duże) BTC 04
D(+)-glukoza MonohydratJ.T. Baker
Nóż diamentowyFine Science Tools10100-30/45
Cyfrowy manometrShanghai Benxu Electronics Technology co., LtdBX-DPG80
DMEMGIBCO11880
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem DulbeccoBranże biologiczne02-020-1A
Surowica bydlęca płoduBranże biologiczne04-013-1A
Moduł regulacji gazuArad TechnologiesHannaLab1
GlutamaxGIBCO35050061glutamina
Kleszcze GraefeFine Science Tools11052-10
HEPESGIBCO15630056
Kleszcze mikrochirurgiczne (Dumont #5, #55)Fine Science Tools11255-20
Pipety Pasteura (szkło)Hilgenberg3150102
Pipety Pasteura (plastikowe)AlexredSO P12201
Penicylina/StreptomycynaBranże biologiczne03-031-1B
Szalki Petriego (60 mm i 100 mm)Falcon351007/351029
Precyzyjny system inkubatoraB.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision EngineeringBTC01Model BTC01 z zestawem bełkotki gazowej
Prokoagulantyczne sterylne probówki (5 ml)Greiner Bio-One#456005
Surowica hodowli całego zarodka szczuraENVIGO BioproductsB-4520
Mikroskop stereoskopowy wyposażony w płytkę grzewcząNikonSMZ18
Sterylne strzykawki (5, 10 ml) do filtracji surowicySolution
Nożyczki chirurgiczneFine Science Tools14094-11

Bibliografia

  1. New, D. A. Whole-embryo culture and the study of mammalian embryos during organogenesis. Biological Reviews of the Cambridge Philosophical Society. 53 (1), 81-122 (1978).
  2. Tam, P. P., Behringer, R. R. Mouse gastrulation: the formation of a mammalian body plan. Mechanisms of Development. 68 (1-2), 3-25 (1997).
  3. Huang, Q., et al. Intravital imaging of mouse embryos. Science. 368 (6487), 181-186 (2020).
  4. White, M. D., et al. Long-lived binding of Sox2 to DNA predicts cell fate in the four-cell mouse embryo. Cell. 165 (1), 75-87 (2016).
  5. Tam, P. P. Postimplantation mouse development: whole embryo culture and micro-manipulation. International Journal of Developmental Biology. 42 (7), 895-902 (1998).
  6. Nicholas, J. S., Rudnick, D. The development of rat embryos in tissue culture. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 20 (12), 656-658 (1934).
  7. New, D. A., Stein, K. F. Cultivation of mouse embryos in vitro. Nature. 199, 297-299 (1963).
  8. Rivera-Pérez, J. A., Jones, V., Tam, P. P. L. Culture of whole mouse embryos at early postimplantation to organogenesis stages: developmental staging and methods. Methods in Enzymology. 476, 185-203 (2010).
  9. New, D. A. T., Coppola, P. T., Terry, S. Culture of explanted rat embryos in rotating tubes. Journal of Reproduction and Fertility. 35 (1), 135-138 (1973).
  10. Cockroft, D. L. A comparative and historical review of culture methods for vertebrates. International Journal of Developmental Biology. 41 (12), 127-137 (1997).
  11. Parameswaran, M., Tam, P. P. L. Regionalisation of cell fate and morphogenetic movement of the mesoderm during mouse gastrulation. Developmental Genetics. 17 (1), 16-28 (1995).
  12. Beddington, R. S. Induction of a second neural axis by the mouse node. Development. 120 (3), 613-620 (1994).
  13. Aguilera-Castrejon, A., et al. Ex utero mouse embryogenesis from pre-gastrulation to late organogenesis. Nature. 593 (7857), 119-124 (2021).
  14. Takahashi, M., Makino, S., Kikkawa, T., Osumi, N. Preparation of rat serum suitable for mammalian whole embryo culture. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (90), e51969(2014).
  15. Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K. V., Nagy, A. Isolation, culture and manipulation of postimplantation embryos. Manipulating the Mouse Embryo: a Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. 149-193 (2014).
  16. Takahashi, M., Nomura, T., Osumi, N. Transferring genes into cultured mammalian embryos by electroporation. Development, Growth and Differentiation. 50 (6), 485-497 (2008).
  17. Mathieu, J., Ruohola-Baker, H. Metabolic remodeling during the loss and acquisition of pluripotency. Development. 144 (4), 541-551 (2017).
  18. Sturm, K., Tam, P. P. L. Isolation and culture of whole postimplantation embryos and germ layer derivatives. Methods in Enzymology. 225, 164-190 (1993).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Kultura zarodków myszysekcja zarodkahodowla w butelkach obrotowychhodowla statyczna na płytkachrozwój embrionalnyetap gastrulacjipożywka hodowlanamanipulacje zarodkiem
Ex Utero Hodowla zarodków myszy od pregastrulacji do zaawansowanej organogenezy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.