Method Article

Modelowanie miejsca aktywnego enzymu za pomocą darmowego oprogramowania do wizualizacji molekularnej

DOI:

10.3791/63170

⸱

December 25th, 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1The University of Texas at Austin, 2Mount Mary University, 3College of St. Benedict/St. John’s University, 4Wabash College

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kluczową umiejętnością w modelowaniu biomolekularnym jest wyświetlanie i opisywanie aktywnych miejsc w białkach. Technika ta została zademonstrowana przy użyciu czterech popularnych darmowych programów do wizualizacji makromolekularnej: iCn3D, Jmol, PyMOL i UCSF ChimeraX.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Umiejętności wizualizacji biomolekularnej są niezbędne do zrozumienia kluczowych pojęć w naukach biologicznych, takich jak relacje struktura-funkcja i interakcje molekularne. Różne programy pozwalają uczniowi manipulować strukturami 3D, a modelowanie biomolekularne sprzyja aktywnemu uczeniu się, buduje umiejętności obliczeniowe i wypełnia lukę między dwuwymiarowymi obrazami z podręczników a trzema wymiarami życia. Kluczową umiejętnością w tej dziedzinie jest modelowanie miejsca aktywnego białka, wyświetlanie części makrocząsteczki, które mogą wchodzić w interakcje z małą cząsteczką lub ligandem, w sposób pokazujący interakcje wiążące. W tym protokole opisujemy ten proces za pomocą czterech ogólnodostępnych programów do modelowania makromolekularnego: iCn3D, Jmol/JSmol, PyMOL i UCSF ChimeraX. Ten przewodnik jest przeznaczony dla studentów, którzy chcą nauczyć się podstaw konkretnego programu, a także dla instruktorów włączających modelowanie biomolekularne do swojego programu nauczania. Protokół umożliwia użytkownikowi modelowanie aktywnej witryny za pomocą określonego programu do wizualizacji lub próbkowanie kilku dostępnych bezpłatnych programów. Modelem wybranym do tego protokołu jest ludzka glukokinaza, izoforma enzymu heksokinazy, który katalizuje pierwszy etap glikolizy. Enzym jest związany z jednym z jego substratów, a także z niereaktywnym analogiem substratu, co pozwala użytkownikowi analizować interakcje w kompleksie katalitycznym.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zrozumienie reprezentacji świata molekularnego jest niezbędne, aby stać się ekspertem w dziedzinie nauk biomolekularnych1, ponieważ interpretacja takich obrazów jest kluczem do zrozumienia funkcji biologicznej2. Wprowadzenie ucznia do makromolekuł zwykle ma formę dwuwymiarowych podręcznikowych obrazów błon komórkowych, organelli, makrocząsteczek itp., ale rzeczywistość biologiczna jest taka, że są to struktury trójwymiarowe, a zrozumienie ich właściwości wymaga sposobów wizualizacji i wydobycia znaczenia z modeli 3D.

W związku z tym, rozwój biomolekularnych umiejętności wizualnych na kursach wyższych dziedzin molekularnych nauk przyrodniczych zyskał na znaczeniu, z wieloma artykułami informującymi o znaczeniu i trudnościach nauczania i oceny umiejętności wizualizacji1,3,4,5,6,7,8,9. Odpowiedzią na te artykuły był wzrost liczby interwencji w klasie, zazwyczaj w ciągu semestru w jednej instytucji, w której programy i modele wizualizacji molekularnej są wykorzystywane do zwalczania trudnych koncepcji2,10,11,12,13,14,15. Ponadto naukowcy starali się scharakteryzować, w jaki sposób uczniowie wykorzystują programy i/lub modele do wizualizacji biomolekularnej, aby podejść do określonego tematu16,17,18,19. Nasza własna grupa, BioMolViz, opisała ramy, które dzielą nadrzędne tematy w zakresie umiejętności wizualnych na cele edukacyjne i zadania, aby kierować takimi interwencjami20,21, i prowadzimy warsztaty, które szkolą wykładowców w zakresie korzystania z ram w odwrotnym projektowaniu ocen w celu pomiaru umiejętności wizualnych22.

W centrum całej tej pracy znajduje się kluczowa umiejętność: zdolność do manipulowania strukturami makromolekuł za pomocą programów do wizualizacji biomolekularnej. Narzędzia te zostały opracowane niezależnie przy użyciu różnych platform; Dlatego mogą być dość wyjątkowe w swoim działaniu i użytkowaniu. Wymaga to instrukcji specyficznych dla programu, a identyfikacja programu, z którym użytkownik czuje się komfortowo, jest ważna dla ułatwienia dalszej implementacji.

Poza podstawami manipulowania strukturami w 3D (obracanie, wybieranie i zmienianie modelu), głównym celem jest modelowanie miejsca aktywnego białka. Proces ten pozwala uczniowi rozwinąć swoje zrozumienie w trzech nadrzędnych tematach opisanych przez BioMolViz Framework: interakcje molekularne, ligandy / modyfikacje oraz relacje struktura-funkcja20,21.

Cztery popularne programy do wizualizacji biomolekularnej to: Jmol/JSmol23, iCn3D24, PyMOL25, oraz UCSF Chimera26,27. Zachęcamy tych, którzy są nowicjuszami w Chimera, do korzystania z UCSF ChimeraX, następnej generacji programu do wizualizacji molekularnej Chimera, który jest obecnie wspieraną wersją programu.

W tym protokole pokazujemy, jak używać każdego z tych czterech programów do modelowania miejsca aktywnego ludzkiej glukokinazy z powiązanym kompleksem analogowym substratu (PDB ID: 3FGU) oraz do wyświetlania pomiarów ilustrujących specyficzne interakcje wiązania28. Model przedstawia kompleks katalityczny enzymu. Aby uchwycić miejsce aktywne w stanie przed katalizą, niehydrolizowalny analog ATP został związany z miejscem aktywnym glukokinazy. Ten ester kwasu fosfoaminofosfonowego i adenylanu (ANP) zawiera wiązanie fosfor-azot zamiast zwykłego wiązania fosforowo-tlenowego w tej pozycji. W miejscu aktywnym znajduje się również glukoza (oznaczona w modelu jako BCG) i magnez (oznaczona jako MG). Dodatkowo w strukturze występuje jon potasu (K), wynikający z chlorku potasu zastosowanego w rozpuszczalniku krystalizacyjnym. Jon ten nie jest krytyczny dla funkcji biologicznych i znajduje się poza miejscem aktywnym.

Struktury molekularne ATP i ANP, schematy chemiczne, porównanie trifosforanów nukleotydów.
Rysunek 1: Struktury ATP/ANP. Struktura trifosforanu adenozyny (ATP) w porównaniu z estrem kwasu fosfoaminofosfonowego i adenylanu (ANP). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Protokół demonstruje wybór związanych ligandów kompleksu analogowego substratu oraz identyfikację reszt miejsca aktywnego w obrębie 5 A związanego kompleksu, który wychwytuje aminokwasy i cząsteczki wody zdolne do tworzenia istotnych oddziaływań molekularnych, w tym oddziaływań hydrofobowych i van der Waalsa.

Początkowo wyświetlany jest obraz zmanipulowany, aby pokazać większość białka w kreskówce, z resztami aminokwasów w miejscu aktywnym w pałeczce, aby pokazać odpowiednie atomy białka i podkreślić interakcje molekularne. Po kroku 3 protokołu dla każdego programu, te reprezentacje zostały zastosowane, a widok białka jest podobny we wszystkich programach (Rysunek 2). Na końcu protokołu kreskówka białka jest ukryta, aby uprościć widok i skupić się na miejscu aktywnym.

Wizualizacja struktury białek, modele 3D z wykorzystaniem ChimeraX, iCn3D, Jmol, PyMOL. Diagram do analizy.
Rysunek 2: Porównanie struktury między programami. Porównanie struktury 3FGU w każdym programie po kroku Dostosuj reprezentację (krok 2 lub 3 każdego protokołu). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Barwienie CPK jest stosowane do aminokwasów miejsca aktywnego i związanych ligandów29,30. Ten schemat kolorowania rozróżnia atomy różnych pierwiastków chemicznych w modelach molekularnych pokazanych w reprezentacjach liniowych, kijowych, kulkowych i patyczkowych oraz wypełniających przestrzeń. Wodór jest biały, azot jest niebieski, tlen jest czerwony, siarka jest żółta, a fosfor jest pomarańczowy w schemacie kolorystycznym CPK. Tradycyjnie do węgla używa się koloru czarnego, chociaż w nowoczesnym zastosowaniu barwienie węgla może się różnić.

Atomy wodoru nie są widoczne w strukturach krystalicznych, chociaż każdy z tych programów jest w stanie przewidzieć ich położenie. Dodanie atomów wodoru do dużej struktury makromolekularnej może zaciemnić widok, dlatego nie są one wyświetlane w tym protokole. W związku z tym wiązania wodorowe zostaną pokazane poprzez pomiar od środka dwóch heteroatomów (np. tlen do tlenu, tlen do azotu) w tych strukturach.

Przeglądy programów
Graficzne interfejsy użytkownika (GUI) do pobrania: PyMOL (wersja 2.4.1), ChimeraX (wersja 1.2.5) i Jmol (wersja 1.8.0_301) to narzędzia do modelowania molekularnego oparte na graficznym interfejsie użytkownika. Te trzy interfejsy zawierają wiersze poleceń do wprowadzania wpisanego kodu; wiele z tych samych funkcji jest dostępnych za pośrednictwem menu i przycisków w graficznym interfejsie użytkownika. Wspólną cechą wiersza poleceń tych programów jest to, że użytkownik może ładować i ponownie wykonywać poprzednie polecenia za pomocą strzałek w górę iw dół na klawiaturze.

Internetowe interfejsy użytkownika: iCn3D (I-see-in-3D) to przeglądarka oparta na WebGL do interaktywnego przeglądania trójwymiarowych struktur makromolekularnych i substancji chemicznych w sieci, bez potrzeby instalowania osobnej aplikacji. Nie używa wiersza poleceń, chociaż pełna wersja internetowa zawiera edytowalny dziennik poleceń. JSmol to wersja Jmol JavaScript lub HTML5 do użytku na stronie internetowej lub w oknie przeglądarki internetowej i jest bardzo podobna w działaniu do Jmol. JSmol może być używany do tworzenia samouczków online, w tym animacji.

Proteopedia31,32, FirstGlance in Jmol33, oraz interfejs sieciowy JSmol (JUDE) w Milwaukee School of Engineering Center for BioMolecular Modeling są przykładami takich środowisk projektowania online opartych na Jmol34. Proteopedia wiki jest narzędziem dydaktycznym, które pozwala użytkownikowi modelować strukturę makromolekuł i tworzyć strony zawierające te modele w website35. Narzędzie do tworzenia scen Proteopedia, zbudowane przy użyciu JSmol, integruje GUI z dodatkowymi funkcjami niedostępnymi w JMOL GUI.

Jmol i iCn3D są oparte na języku programowania Java; JSmol używa Javy lub HTML5, a PyMOL i ChimeraX są oparte na języku programowania Python. Każdy z tych programów ładuje pliki banku danych o białkach, które można pobrać z Banku Danych Białek RCSB pod 4-cyfrowym alfanumerycznym identyfikatorem PDB36,37. Najpopularniejszymi typami plików są pliki Protein Data Bank (PDB) zawierające rozszerzenie .pdb oraz Plik Informacji Krystalograficznej (CIF lub mmCIF) zawierający rozszerzenie .cif. CIF zastąpił PDB jako domyślny typ pliku dla Banku Danych Białek, ale oba formaty plików działają w tych programach. Mogą występować niewielkie różnice w sposobie wyświetlania sekwencji/struktury podczas korzystania z CIF, w przeciwieństwie do plików PDB; Pliki działają jednak podobnie i różnice nie będą tutaj szczegółowo omawiane. Baza danych Molecular Modeling Database (MMDB), produkt National Center for Biotechnology Information (NCBI), jest podzbiorem struktur PDB, z którymi powiązano informacje kategoryczne (np. cechy biologiczne, konserwatywne domeny białkowe)38. iCn3D, produkt NCBI, jest w stanie załadować pliki PDB zawierające dane MMDB.

Aby wyświetlić model, użytkownik może pobrać żądany plik z dedykowanej strony Banku Danych Białkowych dla struktury (np. https://www.rcsb.org/structure/3FGU), a następnie skorzystać z rozwijanego menu Plik programu, aby otworzyć strukturę. Wszystkie programy są również w stanie załadować plik struktury bezpośrednio przez interfejs, a ta metoda jest szczegółowo opisana w protokołach.

Interfejsy graficzne ChimeraX, Jmol i PyMOL zawierają jedno lub więcej okien konsoli, które można zmienić, przeciągając róg. iCn3D i JSmol są w całości zawarte w przeglądarce internetowej. Podczas korzystania z iCn3D użytkownik może być zmuszony do przewijania w wyskakujących okienkach, aby wyświetlić wszystkie elementy menu, w zależności od rozmiaru i rozdzielczości ekranu.

Opisane tutaj protokoły zapewniają prostą metodę wyświetlania miejsca aktywnego enzymu za pomocą każdego programu. Należy zauważyć, że istnieje wiele sposobów wykonania kroków w każdym programie. Na przykład w ChimeraX to samo zadanie można wykonać za pomocą menu rozwijanych, paska narzędzi u góry lub wiersza poleceń. Użytkowników zainteresowanych szczegółowym poznaniem konkretnego programu zachęcamy do zapoznania się z samouczkami online, podręcznikami i Wiki dostępnymi dla tych programów39,40,41,42,43,44,45,46.

Istniejące podręczniki i samouczki dla tych programów prezentują elementy tego protokołu jako odrębne zadania. Aby wyświetlić aktywną witrynę, użytkownik musi zsyntetyzować wymagane operacje z różnych podręczników i samouczków. Niniejszy manuskrypt rozszerza istniejące dostępne samouczki, prezentując liniowy protokół modelowania oznaczonego miejsca aktywnego z interakcjami molekularnymi, dostarczając użytkownikowi logiki modelowania miejsca aktywnego, którą można zastosować do innych modeli i programów.

Interfejs ChimeraX wyświetlający przeglądarkę struktur białek, pasek narzędzi, wiersz poleceń do modelowania molekularnego.
Rysunek 3: Graficzny interfejs użytkownika ChimeraX. Interfejs GUI ChimeraX z menu rozwijanymi, paskiem narzędzi, przeglądarką struktur i etykietami wiersza poleceń. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Równowaga statyczna; schemat ludzkiego kompleksu katalitycznego glukokinazy; przeglądarka struktury; wyskakujące okienko sekwencji.
Rysunek 4: Graficzny interfejs użytkownika iCn3D. Interfejs GUI iCn3D z rozwijanymi menu, paskiem narzędzi, przeglądarką struktur, dziennikiem poleceń, wyskakującymi menu wyboru zestawów oraz wyskakującymi menu sekwencji i adnotacji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Wizualizacja struktury molekularnej za pomocą Jmol, paska narzędzi i konsoli do wprowadzania i analizy poleceń.
Rysunek 5: Graficzny interfejs użytkownika Jmol. Interfejs GUI Jmol z zaznaczonymi menu rozwijanymi, paskiem narzędzi, przeglądarką struktury, menu podręcznym i konsolą/wierszem poleceń. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Interfejs oprogramowania PyMOL pokazujący strukturę białka, wiersz poleceń i interaktywne elementy sterujące.
Rysunek 6: Graficzny interfejs użytkownika PyMOL. Interfejs GUI PyMOL z menu rozwijanymi, przeglądarką struktury, panelem nazw/obiektów, menu sterowania myszą i etykietą wiersza poleceń. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Protokół dla każdego programu jest opisany w dziesięciu nadrzędnych krokach, (1) Wczytywanie struktury do programu, (2) Identyfikacja ligandów w miejscu aktywnym, (3) Dostosowywanie reprezentacji, (4) Wybieranie reszt w ciągu 5 A w celu zdefiniowania miejsca aktywnego, (5) Pokazywanie interakcji enzymu z ligandami miejsca aktywnego, (6) Wyświetlanie łańcuchów bocznych jako patyczków i pokazywanie/dostosowywanie cząsteczek wody w miejscu aktywnym, (7) Uproszczenie struktury, (8) Etykietowanie ligandów i łańcuchów bocznych z wiązaniami wodorowymi, (9) Zapisywanie renderingu w dowolnym momencie, aby wrócić do pracy nad nim lub udostępnić innym, (10) Zapisywanie obrazu do osadzenia lub wydrukowania. Kroki 1, 4 i 7-10 są identyczne dla każdego protokołu; Jednak ze względu na unikalne działanie każdego programu, niektóre protokoły są wydajniej wykonywane, gdy kroki 2/3 i 5/6 są zamienione.

1. Protokół UCSF ChimeraX

UWAGA: Sterowanie gładzikiem i myszą. Aby obrócić, kliknij i przeciągnij lub przeciągnij dwoma palcami (mysz: kliknij lewym przyciskiem myszy i przeciągnij). Aby powiększyć, rozsunąć palce i rozsunąć (Mac) lub Control + ruch dwoma palcami (PC) (mysz: kółko przewijania). Aby przetłumaczyć (tj. przesunąć całą strukturę) naciśnij opcję + kliknięcie i przeciągnięcie (Mac) lub shift + kliknięcie i przeciągnięcie (PC) (mysz: kliknij prawym przyciskiem myszy i przeciągnij). Aby ponownie wyśrodkować, użyj menu rozwijanych u góry interfejsu, aby kliknąć Akcje > Widok.

  1. Wczytywanie struktury do ChimeraX: W wierszu poleceń znajdującym się na dole GUI, który jest poprzedzony przez "Command:", wpisz:
    Otwórz 3fgu
    UWAGA: Po wprowadzeniu dowolnego wpisanego polecenia wiersza, naciśnij Return na klawiaturze, aby je wykonać.
  2. Identyfikacja ligandów w miejscu aktywnym: Upewnij się, że są dwie reprezentacje, wstążka z kreskówek i patyczki. Za pomocą myszy obróć/powiększ białko, aby jak najlepiej zobrazować ligandy wyświetlane w pobliżu środka białka, które są pokazane jako pałeczki. Najedź kursorem na ligand, aby wyświetlić jego nazwę.
  3. Dostosowywanie reprezentacji: Użyj poleceń w poniższych krokach, aby ponownie pokolorować białko i ligandy, zastosować barwienie CPK do atomów niewęglowych, a następnie usuń zaznaczenie zaznaczenia. Wybrane części cząsteczki zostają podświetlone na zielono.
    1. Użyj menu rozwijanych u góry interfejsu, aby zmienić kolorystykę: Kliknij Akcje > Kolor > Chabrowy. Następnie kliknij Wybierz > strukturę > ligand. Aby wybrać kolor, kliknij Akcje > Kolor > Szary. Aby zastosować kolorowanie CPK, kliknij Zaznacz > wszystko, a następnie kliknij Akcje > Kolor > Przez Heteroatom. Na koniec wyczyść zaznaczenie, klikając Wybierz > Wyczyść.
      UWAGA: Zaznaczenie można również wyczyścić, naciskając Control i klikając w czarne tło przeglądarki struktury lub w wierszu poleceń, wpisując: >~select. Domyślnie, dla większości struktur zawierających 1-4 łańcuchy, ChimeraX automatycznie pokaże cząsteczki wody i reszty aminokwasowe w promieniu 3,6 A ligandów i jonów.
    2. Użyj menu rozwijanego, aby ukryć aktualnie wyświetlane atomy, klikając Akcje > Atomy/Wiązania > Ukryj.
    3. Użyj menu rozwijanego, aby wyświetlić ligandy i jony Mg w aktywnym miejscu, klikając Wybierz > strukturę > Ligand. Następnie kliknij Akcje > Atomy/Obligacje > Pokaż. Następnie kliknij Wybierz > reszty > MG, a następnie Akcje > Atomy / Wiązania > Pokaż. Aby wyczyścić zaznaczenie, kliknij Wybierz > Wyczyść.
      UWAGA: Po dokonaniu wyboru za pomocą menu rozwijanego, krok 1.3.3 można wykonać, klikając przyciski >Ukryj i Pokaż na pasku narzędzi Atomy.
  4. Wybieranie reszt w obrębie 5 A w celu zdefiniowania miejsca aktywnego: W przeglądarce struktury, aby wybrać ligandy, naciśnij control + shift i kliknij myszą dowolny pojedynczy atom lub wiązanie w każdym z trzech ligandów, tj. BCG, ANP i Mg.
    1. Następnie naciskaj strzałki w górę na klawiaturze, aż wszystkie atomy trzech ligandów zostaną podświetlone zieloną poświatą. Zdefiniuj ten wybór do wykorzystania w przyszłości, klikając w menu rozwijanym Wybierz > Zdefiniuj selektor. W menu podręcznym wpisz:
      ligands, aby nazwać bieżące zaznaczenie, a następnie kliknij OK.
      UWAGA: Kliknięcie strzałki w górę zbyt wiele razy w kroku 1.4.1 spowoduje zaznaczenie całego białka. W takim przypadku klikaj przycisk strzałki w dół, aż zostaną wybrane tylko atomy trzech ligandów.
    2. Użyj menu rozwijanego, aby wybrać pozostałości w promieniu 5 A ligandów: Kliknij Wybierz > strefę. W wyskakującym okienku, które się pojawi, przełącz menu rozwijane Wybierz na Pozostałości i upewnij się, że górne pole jest zaznaczone (sprawdź odległość mniejszą niż (<) i ustaw na 5.0 A). Następnie kliknij OK. Podświetlone zostaną tylko pozostałości znajdujące się w odległości mniejszej niż 5 A.
      UWAGA: Kroki 1.4-1.4.2 można znacznie uprościć za pomocą wiersza poleceń, wpisując:
      nazwa ligandów mrożonych :BGC:MG:ANP
      Wybierz ligandy strefowe 5 Rozszerz prawdziwe reszty Prawda
  5. Wyświetlanie łańcuchów bocznych jako patyczków i pokazywanie/dostosowywanie cząsteczek wody w miejscu aktywnym: Użyj menu rozwijanego, aby wyświetlić zaznaczenie i środek, a następnie powiększ zaznaczenie, klikając Akcje > Atomy/Wiązania > Pokaż, aby je wyświetlić. Aby wyśrodkować zaznaczenie, kliknij Akcje > Widok. Następnie, aby wyczyścić zaznaczenie, kliknij Wybierz > Wyczyść lub kliknij w dowolnym miejscu pustego miejsca .
  6. Pokazanie interakcji enzymu z ligandami miejsca aktywnego: Skorzystaj z menu rozwijanych i kliknij Wybierz > selektory zdefiniowane przez użytkownika > ligandy. Następnie kliknij Narzędzia > Analiza konstrukcji > Wiązania H. W wyskakującym oknie upewnij się, że zaznaczona jest opcja Ogranicz według wyboru, menu rozwijane jest ustawione na Z zaznaczonym co najmniej jednym końcem i zaznaczone jest pole wyboru Wybierz atomy, a następnie kliknij OK. Aby wyczyścić zaznaczenie, kliknij Wybierz > Wyczyść.
    UWAGA: >Zaznacz pole Etykieta odległości, aby wyświetlić długości połączeń w Å; To jednak sprawia, że widok jest bardzo ruchliwy. Na koniec możesz zmienić kolor wiązań H, klikając pole Kolor i wybierając nowy kolor w wyskakującym okienku.
  7. Uproszczenie struktury: użyj górnego paska narzędzi kreskówki, aby ukryć kreskówkę lub kliknij menu rozwijane: Akcje > Kreskówka > Ukryj.
  8. Oznaczanie ligandów i łańcuchów bocznych związanych z wodorem: Użyj myszy, aby wybrać pozostałości, które są związane wodorem z ligandami (połączone liniami przerywanymi), jak w kroku 1.4. Następnie w menu rozwijanym kliknij Actions > Label > Residues > Name Combo. Następnie kliknij Wybierz > selektory zdefiniowane przez użytkownika > ligandy. Następnie kliknij Akcje > Oznacz > pozostałości > Wyłącz. Na koniec wyczyść zaznaczenie, klikając Zaznacz > Wyczyść.
  9. Zapisywanie renderingu w dowolnym momencie, aby powrócić do pracy nad nim lub udostępnić innym: w menu rozwijanym kliknij Plik > Zapisz. Wybierz lokalizację, wprowadź nazwę pliku i kliknij Zapisz.
    UWAGA: Upewnij się, że format jest ustawiony na: Sesja ChimeraX *.cxs.
  10. Zapisywanie obrazu do osadzenia lub wydrukowania: Najpierw użyj myszy, aby ustawić cząsteczkę zgodnie z potrzebami. Zmień kolor tła na biały, wpisując w wierszu poleceń:
    set bgColor biały
    Na koniec kliknij ikonę migawki na pasku narzędzi. Obraz zostanie zapisany na pulpicie.
    UWAGA: Kolor tła jest również dostępny w menu rozwijanym; na komputerze Mac kliknij UCSF ChimeraX > Preferencje; na komputerze kliknij Ulubione > Ustawienia > Tło.

2. Protokół iCn3D

UWAGA: Sterowanie gładzikiem i myszą: Aby obrócić, kliknij i przeciągnij (mysz: kliknij lewym przyciskiem myszy i przeciągnij). Aby powiększyć, rozsunąć palce i rozciągnąć (mysz: obracaj kółko przewijania). Aby przetłumaczyć (tj. przesunąć całą strukturę) kliknij i przeciągnij dwoma palcami (mysz: kliknij prawym przyciskiem myszy i przeciągnij). Aby ponownie wyśrodkować, najedź kursorem na Widok w górnym menu rozwijanym, a następnie kliknij Wyśrodkuj wybór.

  1. Wczytywanie struktury do iCn3D: Przejdź do iCn3D Web-based 3D Structure Viewer i wpisz 3FGU w polu Input MMDB lub PDB ID (Wprowadź MMDB lub PDB ID), aby załadować plik.
  2. Identyfikacja ligandów w aktywnym miejscu: Najedź kursorem na Analiza w menu rozwijanym, a następnie kliknij Sekwencje i Adnotacje. Sekwencje, w tym przypadku Białka i Substancje chemiczne/Jony/Woda, są pokazane w tabeli piętrowej. Przewiń w dół, aby zobaczyć wymienione ligandy ANP, BGC i Mg w miejscu aktywnym. W przeglądarce struktury najedź kursorem na ligandy w miejscu aktywnym (pokazane jako patyczki w środku kreskówki białka), aby wyświetlić ich nazwy.
  3. Regulacja reprezentacji: W przypadku tego protokołu nie są wymagane żadne wstępne korekty.
  4. Wybór reszt w ciągu 5 A w celu zdefiniowania miejsca aktywnego: Aby wybrać ligandy, użyj menu rozwijanego Wybierz i kliknij Wybierz w 3D. Upewnij się, że pozostałości są sprawdzone.
    1. Aby wybrać ligandy, przytrzymaj przycisk ALT na komputerze PC lub przycisk Option na komputerze Mac i kliknij pierwszy ligand (np. BCG) za pomocą myszy lub gładzika. Następnie naciśnij Control i kliknij ligandy ANP i MG, aby dodać je do zaznaczenia.
      UWAGA: Ligandy zostaną podświetlone na żółto, gdy zostaną wybrane.
    2. Zapisz ten wybór za pomocą menu rozwijanego: Kliknij Wybierz > Zapisz wybór i użyj klawiatury, aby wprowadzić nazwę w wyskakującym okienku (np. 3Ligands), a następnie kliknij Zapisz. Pojawi się teraz wyskakujące okienko Wybierz zestawy.
      UWAGA: Jeśli wybór jest nieprawidłowy, kliknij Wybierz > wyczyść zaznaczenie.
    3. Wybierz pozostałości w promieniu 5 A od ligandów: W menu rozwijanym kliknij Wybierz > według odległości. W wyświetlonym menu kontekstowym zmień drugą pozycję (Kula o promieniu) na 5 A, wpisując blok. Kliknij na słowo w polu Wyświetlacz, a następnie zamknij okno, klikając znak krzyżyka w prawym górnym rogu.
      UWAGA: W menu podręcznym, które pojawi się w kroku 2.4.3, pozostaw pierwszy zestaw z danymi wejściowymi "wybrane", a drugi zestaw jako "niezaznaczone". Zwróć uwagę, że atomy/struktury w obrębie 5 A stają się podświetlone żółtą poświatą po kliknięciu przycisku Wyświetlacz.
    4. Zapisz aktywną witrynę 5 Å za pomocą menu rozwijanego: Najedź kursorem na Select i kliknij Zapisz wybór, wprowadź nazwę w wyskakującym oknie za pomocą klawiatury (np. 5Ang) i kliknij Zapisz.
    5. Następnie utwórz nowe zaznaczenie, które łączy dwa zestawy (5Ang i 3Ligands): W wyskakującym menu Wybierz zestawy kliknij z wciśniętym Ctrl (PC) lub Command (Mac) 5Ang i 3Ligands. Kliknij Wybierz > Zapisz wybór, użyj klawiatury, aby wpisać nazwę (np. 5AFull), a następnie kliknij Zapisz.
  5. Pokazanie interakcji enzymu z ligandami w miejscu aktywnym, takimi jak wiązania wodorowe: Najedź kursorem na Analiza w menu rozwijanym i kliknij Oddziaływania. Pojawi się obszerne menu podręczne ze wszystkimi oddziaływaniami niekowalencyjnymi.
    1. Odznacz wszystko oprócz pól wyboru "Wiązania wodorowe" i "Most solny/jonowy". Kliknij na 3Ligands, aby wybrać pierwszy zestaw i 5Ang dla drugiego zestawu. Kliknij tekst w ramce, w którym znajduje się napis Interakcje z wyświetlaczem 3D. Zamknij okno, klikając znak krzyżyka w prawym górnym rogu.
      UWAGA: Kontakt/Interakcje przypuszczalnie reprezentują indukowaną oddziaływanie dipolowe indukowane dipolem, co często powoduje zajęcie wyświetlacza. W razie potrzeby zmień odległość dla dowolnego typu interakcji.
    2. Aby wyświetlić tylko wiązania wodorowe, kliknij 5Afull w wyskakującym oknie wyboru zestawów. Następnie najedź kursorem na Analiza w menu rozwijanym, a następnie kliknij Chem. Binding > Show.
  6. Wyświetlanie łańcuchów bocznych jako patyczków i pokazywanie/dostosowywanie cząsteczek wody w miejscu aktywnym: Użyj menu podręcznego wyboru zestawów i kliknij 5AFull. Następnie w menu rozwijanym kliknij Styl > Łańcuchy boczne > Kij. Aby zastosować kolorowanie CPK, kliknij Color > Atom. Na koniec kliknij Styl > Woda > Kule (jeśli wolisz większe cząsteczki wody).
  7. Uproszczenie struktury: W wyskakującym menu wyboru zestawów kliknij 5AFull. Następnie w menu rozwijanym kliknij Widok > Wybór widoku (aby zobaczyć tylko stronę z powiązaniami 5AFull). Następnie kliknij Style > Proteins > Stick (aby pokazać łańcuch białkowy jako kij zamiast wstążki).
    1. Aby pokolorować atomy węgla ligandów na kontrastowy kolor, kliknij Chemikalia w wyskakującym oknie Wybierz zestawy. Następnie w menu rozwijanym kliknij Widok > Wyświetl wybór. Następnie kliknij Wybierz > Wybierz w 3D (upewnij się, że zaznaczona jest opcja "atom"). Korzystając z elementów sterujących opisanych w kroku 2.4.1, użyj myszy i klawiatury, aby zaznaczyć wszystkie atomy węgla w BGC i ANP. Następnie w menu rozwijanym kliknij Kolor > Unicolor > Cyan > Cyan.
    2. Aby ponownie wyświetlić całą aktywną witrynę, użyj wyskakującego okna Wybierz zestawy i kliknij 5AFull. Następnie w menu rozwijanym kliknij Widok > Wyświetl wybór.
  8. Etykietowanie ligandów i łańcuchów bocznych z wiązaniami wodorowymi: Użyj wyskakującego okna wyboru zestawów, aby wybrać Interface_all, a następnie w menu rozwijanym kliknij Analiza > Etykietuj > na pozostałość i liczbę.
    UWAGA: Za każdym razem, gdy chcesz dodać etykietę, będziesz musiał ponownie wybrać opcję Na pozostałość i numer, nawet jeśli pozycja menu będzie już zaznaczona z poprzedniej etykiety.
  9. Zapisywanie renderingu w dowolnym momencie, aby powrócić do pracy nad nim lub udostępnić go innym: W menu rozwijanym kliknij Plik > Udostępnij łącze. Skopiuj krótki adres URL (na przykład: https://structure.ncbi.nlm.nih.gov/icn3d/share.html?r83NqCz41bu7cmcs8) i wklej go w przeglądarce.
  10. Zapisywanie obrazu do osadzenia lub wydrukowania: W menu rozwijanym kliknij Wybierz > Przełącz podświetlenie. Następnie kliknij Styl > tło > kolorze białym. Na koniec kliknij Plik > Zapisz pliki > obrazie iCn3D PNG i wybierz żądany rozmiar.

3. Protokół Jmol

UWAGA: Sterowanie gładzikiem i myszą: Aby obrócić, kliknij i przeciągnij (mysz: kliknij lewym przyciskiem myszy i przeciągnij). Aby powiększyć: przewiń w pionie dwoma palcami (mysz: shift + lewy przycisk myszy + przeciągnięcie w pionie). Aby przesunąć (tj. przesunąć całą strukturę) control + alt + kliknięcie i przeciągnięcie (PC), control + opcja + kliknięcie i przeciągnięcie (Mac). Aby ponownie wyśrodkować: shift + dwukrotne kliknięcie w pustym miejscu okna przeglądarki struktury.

  1. Wczytywanie struktury do Jmol: Użyj menu rozwijanego w górnej części graficznego interfejsu użytkownika, aby skonfigurować obszar roboczy ze strukturą, klikając Plik > konsoli. Następnie kliknij Plik, > Pobierz PDB. W wyskakującym okienku wpisz: 3fgu
    Następnie kliknij OK.
    UWAGA: Alternatywnie użyj konsoli Jmol, aby załadować strukturę, wpisując: load = 3fgu
    UWAGA: Po wprowadzeniu dowolnego wpisanego polecenia wiersza, naciśnij Return na klawiaturze, aby je wykonać.
  2. Dopasowywanie reprezentacji: Otwórz menu podręczne, klikając prawym przyciskiem myszy (lub Control + kliknięcie) w dowolnym miejscu okna przeglądarki struktury.
    1. Aby zmienić reprezentację białka na kreskówkową, w menu podręcznym kliknij Wybierz > zaznaczenie Halo. Następnie kliknij Wybierz > Białko > Wszystko. Na koniec kliknij Styl > schemat > Cartoon.
      UWAGA: Halo zaznaczenia umieszcza żółty kontur (poświatę) wokół wszystkich wybranych atomów.
    2. Użyj górnego menu rozwijanego, aby ukryć wody, klikając Wyświetl > Wybierz > Woda. Następnie kliknij Wyświetl > Atom > Brak, a na koniec kliknij Wyświetl > Wybierz > Brak.
  3. Identyfikacja ligandów w miejscu aktywnym: Użyj myszy, aby powiększyć miejsce aktywne, a następnie użyj poleceń w krokach podrzędnych, aby wyświetlić ligandy jako pałeczki.
    UWAGA: Nazwy ligandów pojawiają się w konsoli Jmol po załadowaniu pliku. Możesz również wyświetlić powiązane nazwy ligandów za pomocą menu podręcznego, klikając Select > Hetero > by HETATM.
    1. Najedź myszką na ligandy, aby wyświetlić ich nazwy. Aktywne miejsce znajduje się w pobliżu środka struktury; ligandy MG, BGC i ANP znajdują się w miejscu aktywnym.
    2. Wybierz ligandy BCG i ANP: Korzystając z konsoli Jmol, wpisz:
      wybierz BGC, ANP
    3. Aby wyświetlić ligandy BCG i ANP jako patyczki, użyj menu podręcznego i kliknij Styl > Schemat > patyczki.
  4. Wybieranie reszt w obrębie 5 A w celu zdefiniowania miejsca aktywnego: W konsoli Jmol wpisz następujące polecenie, aby wybrać atomy w promieniu 5 A od trzech ligandów:
    Wybierz w obrębie (5, (BGC,ANP,MG))
    1. Aby wybrać pełne reszty aminokwasowe, wpisz następujące polecenie w konsoli i naciśnij Enter
      Wybierz w(grupa, wybrane)
      UWAGA: Konsola Jmol to najlepszy sposób na wybranie pozostałości w zakresie 5 A.
  5. Wyświetlanie łańcuchów bocznych jako patyczków i pokazywanie/dostosowywanie cząsteczek wody w miejscu aktywnym: Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby wyświetlić menu podręczne, a następnie najedź kursorem na Styl > Schemat > Sticks.
    UWAGA: Krok 3.5 pokazuje aktywne łańcuchy boczne witryny w reprezentacji drążka. W strukturze nadal będą znajdować się puste halo, które reprezentują cząsteczki wody w miejscu aktywnym. >
    1. W konsoli Jmol ponownie wykonaj następujące polecenie:
      Wybierz w obrębie (5, (BGC,ANP,MG))<BR /> UWAGA: Aby ponownie wykonać polecenie, kliknij w konsoli, a następnie użyj strzałek na klawiaturze, aż pojawi się to polecenie, a następnie kliknij Enter, aby je ponownie wykonać.
    2. Aby wyświetlić atomy cząsteczki wody, usuń ligandy i białko z zaznaczenia, wpisując następujące dwa polecenia:
      Wybierz opcję Usuń białko grupy
      Wybierz Usuń grupę Hetero, a nie wodę
    3. Aby wyświetlić cząsteczki wody, kliknij menu rozwijane Wyświetlacz. Najedź kursorem na Atom i kliknij 20% van der Waals. Zielone jony magnezu będą nadal wyświetlane jako patyczki. Wyświetl jon magnezu w bardziej powszechnej reprezentacji sfery, wpisując następujące polecenia w konsoli Jmol:
      wybierz Mg
      Wypełnienie przestrzeni 50%
    4. Ponowne pokolorowanie ligandów w celu odróżnienia ich od białka: W konsoli Jmol wpisz następujące polecenie, aby wykonać polecenie, które ponownie pokoloruje ligandy w jaśniejszym schemacie kolorów:
      Wybierz (BGC,ANP) i Carbon; Kolor [211,211,211]
      Wybierz (BGC,ANP) i tlen; Kolor [255,185,185]
      Selekcja (BGC,ANP) i azot; kolor [150,210,255]
      Selekcja (BGC,ANP) i fosfor; Kolor [255,165,75]
      wybierz Mg; Kolor bladozielony
  6. Pokazanie interakcji enzymu z ligandami miejsca aktywnego: Korzystając z konsoli Jmol, wykonaj każdy wiersz następującego polecenia:
    Zdefiniuj ligbind (ANP, BGC, MG)
    Wybierz w obrębie (5, (BGC,ANP,MG))
    Wybierz Usuń grupę Hetero, a nie wodę
    1. Aby wyświetlić linie ilustrujące wiązania wodorowe, wpisz to polecenie w konsoli Jmol:
      Connect 3.3 (Ligbind i (tlen lub azot)) (wybrane i (tlen lub azot)) rozpórka żółta
      Następnie zmodyfikuj grubość linii, wpisując następujące polecenie w konsoli:
      Zaznacz wszystko; rozpórka 0.1; Nie zaznaczaj żadnych
  7. Uproszczenie struktury: Aby ukryć karykaturę białka i wyczyścić zaznaczenie, w konsoli Jmol wpisz:
    Zaznacz wszystko; Kreskówka wyłączona; Nie zaznaczaj żadnych
  8. Etykietowanie ligandów i łańcuchów bocznych wiązanych wodorem: W wyskakującym okienku kliknij Ustaw pobieranie > Wybierz atom. Kliknij atom w jednej z reszt związanych z wodorem. Numery aminokwasów i reszt pojawiają się w konsoli. Następnie użyj konsoli, aby wpisać etykietę, na przykład:
    etykieta Glu-256
  9. Zapisywanie renderingu w dowolnym momencie, aby wrócić do pracy nad nim lub udostępnić innym: W górnym menu kliknij ikonę kamery. Wpisz nazwę pliku i wybierz lokalizację do zapisania.
    UWAGA: Wyeksportowany plik JPEG (.jpg) zawiera zarówno informacje o obrazie, który pojawia się w oknie wyświetlacza w momencie eksportowania, jak i bieżący stan modelu. Aby ponownie załadować model, otwórz Jmol i przeciągnij zapisany plik JPEG do okna wyświetlania Jmol.
  10. Zapisywanie obrazu do osadzenia lub wydrukowania: W konsoli Jmol pokoloruj tło na białe, wpisując:
    tło białe
    Podobnie jak w kroku 3.9, kliknij ikonę aparatu i zapisz plik.

4. Protokół PyMOL

UWAGA: Sterowanie gładzikiem i myszą: Aby obrócić, kliknij i przeciągnij (mysz: kliknij lewym przyciskiem myszy i przeciągnij). Aby powiększyć, uszczypnąć i rozciągnąć (mysz: kliknij prawym przyciskiem myszy i przeciągnij). Aby przetłumaczyć (tj. przesunąć całą strukturę), control + kliknięcie i przeciągnięcie (mysz: polecenie + lewy przycisk myszy i przeciągnij). Aby ponownie wyśrodkować, przejdź do panelu obiektów po prawej stronie i kliknij A > Orientuj lub Środek.

  1. Wczytywanie struktury do PyMOL: W wierszu poleceń w górnej części GUI (poprzedzonym przez "PyMOL>") wpisz:
    >pobieranie 3FGU
    UWAGA: Po wprowadzeniu dowolnego wpisanego polecenia wiersza, naciśnij Return na klawiaturze, aby je wykonać.
  2. Dostosowywanie reprezentacji: W panelu nazw/obiektów po prawej stronie okna PyMOL, po prawej stronie "3FGU" kliknij H > Waters.
  3. Identyfikacja ligandów w miejscu aktywnym: Najpierw włącz przeglądarkę sekwencji, klikając górne menu rozwijane: Wyświetl sekwencję >.
    1. Przewiń szary pasek w prawo, aż znajdziesz nazwy ligandów (BCG, ANP, MG, K).
      UWAGA: Istnieją dwie reprezentacje, wstążka z kreskówek i patyczki; Ligandy są pokazane jako patyczki. Upewnij się, że tryb wyboru w elementach sterujących myszy w prawym dolnym panelu jest ustawiony na tryb wyświetlania pozostałości i 3 przycisków, klikając te nazwy, aby przełączać się między opcjami.
    2. Za pomocą myszy obracaj i powiększaj, aby ligandy były widoczne.
  4. Wybór reszt w obrębie 5A w celu zdefiniowania miejsca aktywnego: Aby wybrać ligandy w miejscu aktywnym, kliknij na każdy z nich (BCG, ANP, MG) w przeglądarce struktury. W panelu nazw/obiektów pojawi się nowy wybór; po prawej stronie tego nowego obiektu o nazwie "sele", kliknij przycisk A, a następnie kliknij Zmień nazwę w menu podręcznym.
    UWAGA: Aby usunąć niepożądane zaznaczenie, kliknij puste miejsce w przeglądarce struktury, aby odznaczyć.
    1. Za pomocą klawiatury usuń litery "sele", które pojawiają się w lewym górnym rogu okna przeglądarki struktur, a w ich miejsce wpisz:
      ligandy
      UWAGA: Kroki 4.4-4.4.1 można wykonać za pomocą wiersza poleceń; Rodzaj:
      ligandy sele, resn BGC+ANP+MG
    2. Użyj tego wyboru, aby zdefiniować obszar wokół ligandów, najpierw go duplikując, kliknij ligandy > A > Duplikuj. Następnie kliknij sel01 > A > Rename
      Za pomocą klawiatury usuń litery "se101" i wpisz:
      aktywny
    3. Zmodyfikuj ten wybór, aby pokazać pozostałości w granicach 5 A: W panelu nazw/obiektów kliknij na aktywny > A > Modyfikuj > Rozwiń > o 5 A, Pozostałości. Następnie, aby pokazać te pozostałości jako pałeczki, kliknij na aktywne > S > Licorice > Sticks. Na koniec kliknij puste miejsce w przeglądarce struktury, aby wyczyścić zaznaczenie.
      UWAGA: Krok 4.4.3 można wykonać za pomocą wiersza poleceń, wpisz:
      sele aktywny, byres all within 5 od ligands
      pokaż kije, aktywne
  5. Wyświetlanie łańcuchów bocznych jako patyczków i pokazywanie/dostosowywanie cząsteczek wody w miejscu aktywnym: W panelu nazw/obiektów kliknij na ligandy > A > Duplicate. Aby zmienić nazwę zaznaczenia, kliknij Sel02 > A > Zmień nazwę zaznaczenia. Usuń litery z menu zmiany nazwy, które pojawia się w prawym górnym rogu przeglądarki struktur, i wpisz:
    active_water
    1. Aby dostosować nowy wybór tak, aby zawierał cząsteczki wody w miejscu aktywnym, kliknij active_water > A > Modyfikuj > wokół > atomów w promieniu 4 angstremów. Aby zmodyfikować to dalej i ograniczyć do cząsteczek wody, kliknij active_water > A > Modyfikuj > Ogranicz > do rozpuszczalnika. Na koniec kliknij active_water > A > Preset > Ball and Stick.
      UWAGA: Graficzny interfejs użytkownika umożliwia wybór w zakresie 4 A; polecenia liniowe pozwalają na wybór bardziej odpowiedniej odległości 3,3 A dla cząsteczek wody wiążących wodór. Promienie van der Waalsa sfer nie mogą być ustawione w graficznym interfejsie użytkownika, ale wybór "kuli i drążka" jest bliski 0,5 Ω
      UWAGA: Kroki 4.5-4.5.1 można wykonać za pomocą wiersza poleceń, wpisując każdy wiersz następującego kodu:
      wybierz active_water, ((ligandy) około 3,3) i (resn HOH)
      Pokaż kule, active_water
      zmień active_water, vdw=0.5
      odbudować
  6. Pokazanie oddziaływań enzymu z ligandami miejsca aktywnego. Powiększ aktywną witrynę, klikając aktywną > A > Zoom. Aby znaleźć kontakty biegunowe między ligandami a miejscem aktywnym, kliknij na ligandy > A > Znajdź > Kontakty biegunowe > dowolnych atomów. Pokaż odległości jako etykiety, klikając ligands_polar_contacts > S > Etykiety.
  7. Uproszczenie struktury: Ukryj kreskówkę białka, która ukrywa część białka, która nie znajduje się w miejscu aktywnym, klikając 3FGU > H > Cartoon w panelu nazw/obiektów. Następnie ukryj etykiety długości wiązania wodorowego, klikając ligands_polar_contacts > H > Etykiety w panelu nazw/obiektów.
    1. Aby pokolorować ligandy w celu odróżnienia ich od białka, kliknij na ligandy > C > By Element > CHNOS i wybierz opcję, w której "C" oznacza cyjan (jasnoniebieski).
      UWAGA: Krok 4.7.1 można wykonać za pomocą wiersza poleceń. Rodzaj:
      Kolor cyjan, ligandy
      barwa atomowa, ligandy & !elem C
  8. Oznaczanie ligandów i łańcuchów bocznych z wiązaniami wodorowymi: W panelu nazw/obiektów, na przyciskach po prawej stronie dowolnej nazwy obiektu, kliknij aktywny > L > Pozostałości.
  9. Zapisywanie renderingu w dowolnym momencie, aby powrócić do pracy nad nim lub udostępnić go innym: W menu rozwijanym kliknij Plik > Zapisz sesję jako. Następnie wybierz lokalizację w wyskakującym okienku, wpisz nazwę pliku i kliknij Zapisz.
  10. Zapisywanie obrazu do osadzenia lub wydrukowania: Najpierw zmień tło na białe w menu rozwijanym, klikając Wyświetl > tło > białe. Wyeksportuj obraz jako nowy plik, klikając Plik > Eksportuj obraz jako > PNG.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pomyślnie wykonany protokół dla każdego z programów spowoduje, że model molekularny zostanie powiększony na miejscu aktywnym, z pozostałościami i ligandami miejsca aktywnego pokazanymi jako pałeczki, kreskówką białka ukrytą i ligandami wyświetlanymi w kontrastowym schemacie kolorów. Oddziałujące reszty aminokwasowe powinny być oznaczone ich identyfikatorami, a wiązania wodorowe i interakcje jonowe powinny być pokazane za pomocą linii. Obecność tych cech można określić poprzez oględziny modelu.

Aby ułatwić tę inspekcję i umożliwić użytkownikowi określenie, czy poprawnie wykonał kroki protokołu, udostępniliśmy animowane rysunki, które prezentują obraz struktury po każdym kroku. Dla ChimeraX, iCn3D, Jmol i PyMOL jest to zilustrowane odpowiednio na rysunkach 7-10.

Rysunek 7: Dane wyjściowe protokołu ChimeraX. Animowany rysunek ilustrujący kroki 1.1-1.8 protokołu ChimeraX. Kliknij tutaj, aby pobrać ten rysunek.

Rysunek 8: Wyjście protokołu iCn3D. Animowany rysunek ilustrujący kroki 2.1-2.8 protokołu iCn3D. Kliknij tutaj, aby pobrać ten rysunek.

Rysunek 9: Dane wyjściowe protokołu Jmol. Animowany rysunek ilustrujący kroki 3.1-3.8 protokołu Jmol. Kliknij tutaj, aby pobrać ten rysunek.

Rysunek 10: Dane wyjściowe protokołu PyMOL. Animowany rysunek ilustrujący kroki 4.1-4.8 protokołu PyMOL. Kliknij tutaj, aby pobrać ten rysunek.

Najczęstszym błędem, który może wpłynąć na wynik tych protokołów, jest błędny wybór, co powoduje, że część struktury jest wyświetlana w niepożądanym renderingu. Jest to zazwyczaj wynikiem błędnego kliknięcia na samej strukturze lub na jednym z przycisków menu wyświetlania. Przykładem nieoptymalnego wyniku może być model zawierający pozostałości poza miejscem aktywnym wyświetlany w postaci pałeczek. Użytkownik może rozpocząć analizę, czy wystąpił ten błąd, dokonując wizualnej kontroli pozostałości wyświetlanych jako patyczki i upewniając się, że znajdują się one w pobliżu ligandów w miejscu aktywnym. Zaawansowaną metodą oceny, czy wyświetlane pozostałości mieszczą się w zakresie 5A od ligandów miejsca aktywnego, jest użycie narzędzi pomiarowych wbudowanych w każdy program do pomiaru odległości między pobliskim ligandem a pozostałością miejsca aktywnego. Narzędzia pomiarowe wykraczają poza zakres tego manuskryptu; Zachęcamy jednak zainteresowanych użytkowników do zapoznania się z wieloma samouczkami online szczegółowo opisującymi ten rodzaj analizy.

Przedstawiamy konkretny przykład nieoptymalnego wykonania tego protokołu, wynikającego z błędnego kliknięcia na panel nazw/obiektów w PyMOL. Ten błąd wyświetla całe białko jako pałeczki, a nie tylko aktywne miejsce przy użyciu tej reprezentacji, jak pokazano na Rysunek 11.

Schemat struktury białka; Model 3D złożonego fałdowania białek, wizualizacja oddziaływań molekularnych.
Rysunek 11: Wynik negatywny. Przykład wyniku negatywnego. Błędne wybranie pełnej kreskówki w PyMOL i wyświetlanie patyczków. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Aby rozwiązać problem, użytkownik będzie musiał ukryć drążki dla całego modelu (oznaczone jako 3FGU w panelu nazw/obiektów), a następnie pokazać reprezentację drążka tylko dla wyboru o nazwie "aktywny", używając przycisków/poleceń ukrywania i pokazywania w PyMOL. Odzyskanie modelu po tego typu błędzie jest stosunkowo proste, gdy użytkownik jest w stanie utworzyć odpowiednie wybory dla różnych części modelu oraz skutecznie je wyświetlić i ukryć. Kuszące jest ponowne uruchomienie protokołu i wykonanie kroków innym razem; Zachęcamy jednak użytkownika, aby nie bał się zejść "poza scenariusz" i poeksperymentować z modelem. Z naszego doświadczenia wynika, że praca z błędami wyświetlania ułatwia postęp w zrozumieniu programu do modelowania.

Wyświetlanie obok siebie końcowego wyniku z pomyślnie wykonanego protokołu dla każdego programu jest pokazane w Rysunek 12. Widoki są zorientowane podobnie, aby umożliwić użytkownikowi porównanie wyglądu modeli stworzonych w różnych programach.

Diagramy oddziaływań białko-ligand ze strukturami molekularnymi i analizą wiązań wodorowych.
Rysunek 12: Końcowe porównanie struktury między programami. Porównanie struktury każdej aktywnej witryny renderowanej na końcu protokołu. A: ChimeraX, B: iCn3D, C: Jmol, D: PyMOL. Etykieta miejsca aktywnego PyMOL obejmuje wszystkie pozostałości miejsca aktywnego i ligandy. Pozostałe wyjścia mają oznaczone tylko łańcuchy boczne wiązane wodorem. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten przedstawia dziesięcioetapowy proces modelowania miejsca aktywnego enzymu, zastosowany w czterech popularnych programach do modelowania biomolekularnego. Krytycznymi etapami protokołu są: identyfikacja ligandów w miejscu aktywnym, wybór reszt w zakresie 5 A w celu zdefiniowania miejsca aktywnego oraz pokazanie interakcji enzymu z ligandami miejsca aktywnego. Rozróżnienie ligandów istotnych dla funkcji biologicznej ma zasadnicze znaczenie, ponieważ pozwala użytkownikowi zdefiniować reszty aminokwasowe w obrębie 5 A, które mogą odgrywać rolę w wiązaniu ligandów. Wreszcie, użycie programu do wyświetlania interakcji molekularnych pozwala użytkownikowi rozwinąć umiejętności niezbędne do zrozumienia interakcji molekularnych, które sprzyjają wiązaniu.

Ograniczeniem komputerowych protokołów modelowania molekularnego jest zależność od określonych poleceń i składni. Podczas gdy protokoły biochemiczne mogą być tolerancyjne na niewielkie zmiany w procedurze, badania komputerowe mogą dać bardzo różne produkty końcowe, jeśli procedura nie jest ściśle przestrzegana. Jest to szczególnie ważne w przypadku korzystania z interfejsów wiersza poleceń, w których do osiągnięcia określonego wyniku wymagana jest składnia specyficzna dla programu, a pozornie nieznaczna zmiana interpunkcji lub wielkich liter może spowodować niepowodzenie polecenia. Istnieją różne Wiki i podręczniki dla każdego programu, w których użytkownik może znaleźć i rozwiązać problemy z danymi wejściowymi wiersza poleceń; Użytkownik powinien zwrócić szczególną uwagę na szczegóły składni poleceń. Chociaż większość programów do wizualizacji molekularnej zawiera polecenia cofania, ze względu na złożoność interfejsów, polecenie cofania nie zawsze wiernie odwraca ostatni wykonany krok. Dlatego często zachęca się do zapisywania bieżącego stanu roboczego, zwłaszcza w przypadku nowych użytkowników.

Dalsze ograniczenia mogą wynikać z danych użytych do stworzenia samego modelu. Podczas gdy standardy zawarte w Banku Danych o Białkach zapewniają pewien poziom spójności, użytkownicy programów do wizualizacji molekularnej często napotykają nieoczekiwane efekty w renderowaniu białek. Po pierwsze, większość struktur określa się za pomocą krystalografii rentgenowskiej, która zapewnia pojedynczy model białka; jednak struktury NMR często składają się z wielu modeli, które można wizualizować pojedynczo. Po drugie, struktury wyznaczone na podstawie eksperymentów krystalograficznych lub kriogenicznej mikroskopii elektronowej mogą zawierać atomy, których położenia nie można wyjaśnić i pojawiają się jako luki w niektórych reprezentacjach białka. Struktury białkowe mogą mieć naprzemienne konformacje łańcuchów bocznych, które po wyświetleniu w renderowaniu patyczków wyglądają jak dwie grupy wystające z tego samego szkieletu aminokwasowego. Nawet krótkie odcinki szkieletu mogą mieć takie alternatywne konformacje, a czasami ligandy są nakładane w miejscu aktywnym w więcej niż jednej konformacji wiązania.

W przypadku struktury krystalicznej zdeponowane współrzędne 3D obejmują wszystkie składniki jednostki asymetrycznej, która dostarcza wystarczającej ilości informacji do odtworzenia powtarzającej się jednostki kryształu białka. Czasami struktura ta będzie zawierać dodatkowe łańcuchy białkowe w porównaniu z biologicznie aktywną formą białka (np. mutant hemoglobiny płodowej, PDB ID: 4MQK). I odwrotnie, niektóre programy mogą nie ładować automatycznie wszystkich łańcuchów biologicznie aktywnej jednostki. Na przykład główna proteaza SARS-CoV2 (PDB ID: 6Y2E) ładuje połowę biologicznie aktywnego dimeru (składającego się z dwóch łańcuchów białkowych) po pobraniu za pomocą poleceń opisanych w tym protokole w ChimeraX, PyMOL i Jmol. Chociaż niewielka modyfikacja polecenia spowoduje załadowanie biologicznie aktywnego dimera, to rozważanie może nie być proste dla początkującego użytkownika programu do modelowania. Innym problemem, który może się pojawić, jest identyfikacja samego miejsca aktywnego lub substratu. Eksperymenty krystalograficzne przeprowadza się przy użyciu różnych cząsteczek, które mogą być modelowane w ostateczną strukturę. Na przykład cząsteczki siarczanu mogą wiązać miejsca wiązania fosforanów w miejscu aktywnym lub mogą wiązać inne regiony, które nie są istotne dla mechanizmu. Cząsteczki te mogą zaciemniać prawidłową identyfikację samego miejsca aktywnego, a nawet mogą sugerować uczniowi, że są częścią mechanizmu.

Przypuszczalnie użytkownik będzie chciał zastosować tę procedurę do innych aktywnych/wiążących stron. Aby zastosować ten protokół w przyszłych pracach obejmujących analizę nowych miejsc aktywnych białek, użytkownik będzie musiał określić, które ze związanych ligandów są istotne dla ich funkcjonowania. Niektóre ligandy nie są związane z funkcją białka, a zamiast tego są wynikiem warunków rozpuszczalnika lub krystalizacji użytych do przeprowadzenia eksperymentu (np. jon potasu obecny w modelu 3FGU). Kluczowe ligandy powinny być zidentyfikowane poprzez zapoznanie się z oryginalnym manuskryptem. Wraz z praktyką i, w stosownych przypadkach, zrozumieniem składni poleceń wiersza, użytkownik będzie w stanie zastosować protokół dla żądanego programu do modelowania do dowolnego miejsca aktywnego enzymu oraz do modelowania innych makrocząsteczek według własnego wyboru.

Identyfikacja i analiza związanych substratów i ligandów ma kluczowe znaczenie dla wyjaśnienia mechanizmów molekularnych i wysiłków związanych z projektowaniem leków opartych na strukturze, które bezpośrednio doprowadziły do poprawy leczenia chorób, w tym zespołu nabytego niedoboru odporności (AIDS) i COVID-19 47,48,49,50,51,52 . Podczas gdy poszczególne programy do wizualizacji molekularnej oferują różne interfejsy i doświadczenia użytkownika, większość z nich oferuje porównywalne funkcje. Dla rozwoju umiejętności wizualizacji biomolekularnej ważne jest, aby studenci biochemii wyższego poziomu zapoznali się z wizualizacją struktury i narzędziami do generowania takich obrazów 4,20,53. Dzięki temu studenci mogą wyjść poza interpretację dwuwymiarowych obrazów w podręcznikach i artykułach w czasopismach i łatwiej opracowywać własne hipotezy na podstawie danych strukturalnych54, które przygotują rozwijających się naukowców do rozwiązywania przyszłych problemów zdrowia publicznego i lepszego zrozumienia procesów biochemicznych.

Podsumowując, protokół ten szczegółowo opisuje aktywne modelowanie lokalizacji przy użyciu czterech wiodących bezpłatnych programów do modelowania makromolekularnego. Nasza społeczność, BioMolViz, przyjmuje niespecyficzne dla oprogramowania podejście do modelowania biomolekularnego. W szczególności unikaliśmy krytyki lub porównywania funkcji programu, chociaż użytkownik próbkujący każdy program prawdopodobnie stwierdzi, że woli pewne aspekty modelowania makromolekularnego w jednym programie niż w innym. Zapraszamy czytelników do korzystania z BioMolViz Framework, który szczegółowo opisuje cele uczenia się oparte na wizualizacji biomolekularnej i zadania skierowane w tym protokole, oraz do zapoznania się z zasobami do nauczania i uczenia się wizualizacji biomolekularnej za pośrednictwem strony internetowej społeczności BioMolViz pod adresem http://biomolviz.org.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają żadnych istotnych lub istotnych interesów finansowych, które odnoszą się do badań opisanych w niniejszym artykule.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Finansowanie tej pracy zostało zapewnione przez National Science Foundation:

Poprawa grantu na studia licencjackie w zakresie STEM (Nagroda #1712268)

Sieci koordynacji badań na studiach licencjackich w zakresie biologii na studiach licencjackich (Nagroda # 1920270)

Jesteśmy wdzięczni doktorowi Karstenowi Theisowi, z Uniwersytetu Westfield, za pomocne dyskusje na temat Jmol.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
ChimeraX (wersja 1.2.5) https://www.rbvi.ucsf.edu/chimerax/
KomputerDowolny
iCn3D (tylko internetowy: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/icn3d/full.html)
Java (dla Jmol) https://java.com/en/download/
Jmol (wersja 1.8.0_301) http://jmol.sourceforge.net/
Mysz (opcjonalnie)Dowolna
wersja PyMOL (wersja 2.4.1 - edukacyjna): https://pymol.org/2 wersja tylko do użytku edukacyjnego: https://pymol.org/edu/?q=educational

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Loertscher, J., Green, D., Lewis, J. E., Lin, S., Minderhout, V. Identification of threshold concepts for biochemistry. CBE Life Sciences Education. 13 (3), 516-528 (2014).
  2. Jaswal, S. S., O’Hara, P. B., Williamson, P. L., Springer, A. L. Teaching structure: Student use of software tools for understanding macromolecular structure in an undergraduate biochemistry course: Teaching structure in undergraduate biochemistry. Biochemistry and Molecular Biology Education. 41 (5), 351-359 (2013).
  3. Tibell, L. A. E., Rundgren, C. -J. Educational challenges of molecular life science: Characteristics and implications for education and research. CBE Life Sciences Education. 9 (1), 25-33 (2010).
  4. Schönborn, K. J., Anderson, T. R. The importance of visual literacy in the education of biochemists. Biochemistry and Molecular Biology Education. 34 (2), 94-102 (2006).
  5. Anderson, T. R. Bridging the educational research-teaching practice gap: The importance of bridging the gap between science education research and its application in biochemistry teaching and learning: Barriers and strategies. Biochemistry and Molecular Biology Education. 35 (6), 465-470 (2007).
  6. Schönborn, K. J., Anderson, T. R. Bridging the educational research-teaching practice gap: Foundations for assessing and developing biochemistry students’ visual literacy. Biochemistry and Molecular Biology Education. 38 (5), 347-354 (2010).
  7. Bateman, R. C., Craig, P. A. Education corner: A proficiency rubric for biomacromolecular 3D literacy. PDB Newsletter. 45, 5-7 (2010).
  8. Mnguni, L., Schönborn, K., Anderson, T. Assessment of visualization skills in biochemistry students. South African Journal of Science. 112, 1-8 (2016).
  9. Craig, P. A., Michel, L. V., Bateman, R. C. A survey of educational uses of molecular visualization freeware. Biochemistry and Molecular Biology Education. 41 (3), 193-205 (2013).
  10. Loertscher, J., Villafañe, S. M., Lewis, J. E., Minderhout, V. Probing and improving student’s understanding of protein α-Helix structure using targeted assessment and classroom interventions in collaboration with a faculty community of practice. Biochemistry and Molecular Biology Education. 42 (3), 213-223 (2014).
  11. Abualia, M., et al. Connecting protein structure to intermolecular interactions: A computer modeling laboratory. Journal of Chemical Education. 93 (8), 1353-1363 (2016).
  12. Carvalho, I., Borges, A. D. L., Bernardes, L. S. C. Medicinal chemistry and molecular modeling: An integration to teach drug structure–activity relationship and the molecular basis of drug action. Journal of Chemical Education. 82 (4), 588(2005).
  13. Forbes-Lorman, R. M., et al. Physical models have gender-specific effects on student understanding of protein structure-function relationships. Biochemistry and Molecular Biology Education. 44 (4), 326-335 (2016).
  14. Terrell, C. R., Listenberger, L. L. Using molecular visualization to explore protein structure and function and enhance student facility with computational tools. Biochemistry and Molecular Biology Education. 45 (4), 318-328 (2017).
  15. Zhang, S., et al. Structure-based drug design of an inhibitor of the SARS-CoV-2 (COVID-19) main protease using free software: A tutorial for students and scientists. European Journal of Medicinal Chemistry. 113390, (2021).
  16. Roberts, J. R., Hagedorn, E., Dillenburg, P., Patrick, M., Herman, T. Physical models enhance molecular three-dimensional literacy in an introductory biochemistry course. Biochemistry and Molecular Biology Education. 33 (2), 105-110 (2005).
  17. Jenkinson, J., McGill, G. Visualizing protein interactions and dynamics: Evolving a visual language for molecular animation. CBE Life Sciences Education. 11 (1), 103-110 (2012).
  18. Bussey, T. J., Orgill, M. What do biochemistry students pay attention to in external representations of protein translation? The case of the Shine–Dalgarno sequence. Chemistry Education Research and Practice. 16 (4), 714-730 (2015).
  19. Harle, M., Towns, M. H. Students’ understanding of primary and secondary protein structure: Drawing secondary protein structure reveals student understanding better than simple recognition of structures. Biochemistry and Molecular Biology Education. 41 (6), 369-376 (2013).
  20. Dries, D. R., et al. An expanded framework for biomolecular visualization in the classroom: Learning goals and competencies. Biochemistry and Molecular Biology Education. 45 (1), 69-75 (2017).
  21. The BioMolViz Framework. BioMolViz. , Available from: http://biomolviz.org/framework (2021).
  22. Procko, K., et al. Meeting report: BioMolViz workshops for developing assessments of biomolecular visual literacy. Biochemistry and Molecular Biology Education. 49 (2), 278-286 (2021).
  23. Jmol: an open-source Java viewer for chemical structures. , Available from: http://www.jmol.org/ (2021).
  24. Wang, J., et al. iCn3D, a web-based 3D viewer for sharing 1D/2D/3D representations of biomolecular structures. Bioinformatics. 36 (1), 131-135 (2020).
  25. PyMOL . The PyMOL Molecular Graphics System. Version 2.0. , Schrödinger, LLC. (2021).
  26. Goddard, T. D., et al. UCSF ChimeraX: Meeting modern challenges in visualization and analysis. Protein Science. 27 (1), 14-25 (2018).
  27. Pettersen, E. F., et al. UCSF ChimeraX: Structure visualization for researchers, educators, and developers. Protein Science. 30 (1), 70-82 (2021).
  28. Petit, P., et al. The active conformation of human glucokinase is not altered by allosteric activators. Acta Crystallographica. Section D. 67 (11), 929-935 (2011).
  29. Corey, R. B., Pauling, L. Molecular models of amino acids, peptides and proteins. Review of Scientific Instruments. 24, 621-627 (1953).
  30. Koltun, W. L. Precision space-filling atomic models. Biopolymers. 3 (6), 665-679 (1965).
  31. Hodis, E., et al. Proteopedia - a scientific 'wiki' bridging the rift between three-dimensional structure and function of biomacromolecules. Genome Biology. 9 (8), 1-10 (2008).
  32. Prilusky, J., et al. Proteopedia: A status report on the collaborative, 3D web-encyclopedia of proteins and other biomolecules. Journal of Structural Biology. 175 (2), 244-252 (2011).
  33. Martz, E. FirstGlance in Jmol. , Available from: https://www.bioinformatics.org/firstglance/fgij/ (2021).
  34. Jmol User Design Environment (JUDE). MSOE Centerfor BioMolecular Modeling. , Available from: https://cbm.msoe.edu/modelingResources/jmolUserDesignEnvironment/#forward (2021).
  35. Castro, C. R., et al. A practical guide to teaching with Proteopedia. Biochemistry and Molecular Biology Education. 49 (5), 707-719 (2021).
  36. Berman, H. M., et al. The protein data bank. Nucleic Acids Research. 28, 235-242 (2000).
  37. The Protein Data Bank. , Available from: https://www.rcsb.org/ (2021).
  38. Wang, Y., et al. MMDB: 3D structure data in Entrez. Nucleic Acids Research. 28 (1), 243-245 (2000).
  39. iCn3D Help Page. , Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/icn3d/docs/icn3d_help.html (2021).
  40. MSOE Center for BioMolecular Modeling Jmol Training Guide. , Available from: https://cbm.msoe.edu/modelingResources/jmolTrainingGuide/started.html (2021).
  41. The Online Macromolecular Museum. , Available from: http://earth.callutheran.edu/Academic_Programs/Departments/BioDev/omm/exhibits.htm (2021).
  42. Jmol/JSmol Interactive Scripting Documentation. , Available from: https://chemapps.stolaf.edu/jmol/docs/ (2021).
  43. PyMOL Wiki. , Available from: https://pymolwiki.org/index.php/Main_Page (2021).
  44. PyMOL Advanced Scripting Workshop by Schrödinger. , Available from: https://pymol.org/tutorials/scripting/index.html (2021).
  45. UCSF ChimeraX User Guide. , Available from: https://www.cgl.ucsf.edu/chimerax/docs/user/index.html (2021).
  46. UCSF ChimeraX Tutorials. , Available from: https://www.rbvi.ucsf.edu/chimerax/tutorials.html (2021).
  47. Kuntz, I. D. Structure-based strategies for drug design and discovery. Science. 257 (5073), 1078-1082 (1992).
  48. Structure-based drug discovery: an overview. Hubbard, R. E. , (2006).
  49. Patrick, G. L. An introduction to medicinal chemistry, 6th ed. , Oxford University Press. (2017).
  50. Van Montfort, R. L., Workman, P. Structure-based drug design: aiming for a perfect fit. Essays in Biochemistry. 61 (5), 431-437 (2017).
  51. Holdgate, G. A., Meek, T. D., Grimley, R. L. Mechanistic enzymology in drug discovery: a fresh perspective. Nature Reviews. Drug Discovery. 17 (2), 115-132 (2018).
  52. Wang, M. Y., et al. SARS-CoV-2: structure, biology, and structure-based therapeutics development. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, (2020).
  53. White, B., Kim, S., Sherman, K., Weber, N. Evaluation of molecular visualization software for teaching protein structure differing outcomes from lecture and lab: Differing outcomes from lecture and lab. Biochemistry and Molecular Biology Education. 30 (2), 130-136 (2002).
  54. Canning, D. R., Cox, J. R. Teaching the structural nature of biological molecules: Molecular visualization in the classroom and in the hands of students. Chemistry Education Research and Practice. 2 (2), 109-122 (2001).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Enzyme Active SiteMolecular VisualizationBiomolecular ModelingProtein Ligand InteractionsGlucokinase ModelingFree Molecular SoftwareStructure Function RelationshipsHydrogen Bond Analysis3D Structure ManipulationMacromolecular Visualization

Related Articles