Artykuł metodologiczny

Wysokoprzepustowe sterowanie optyczne i rejestrowanie sygnału wapnia w kardiomiocytach pochodzących z iPSC do badań toksyczności i fenotypowych badań przesiewowych leków

4.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63175

⸱

31 marca 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1LumiSTAR Biotechnology, Inc., 2NEXEL Co., Ltd., 3Institute of Pharmacology, College of Medicine, National Taiwan University, 4Manchester Heart Centre, Manchester Royal Infirmary, Manchester University NHS Foundation Trust, 5Division of Cardiovascular Sciences, Manchester Academic Health Sciences Centre, University of Manchester, 6Division of Cell Matrix Biology and Regenerative Medicine, University of Manchester

W tym artykule

Podsumowanie

Obecny protokół opisuje całkowicie optyczną kontrolę i obserwację wyzwalanej aktywności komórkowej w kardiomiocytach pochodzących z iPSC (iPSC-CMs) dla wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków i testów toksyczności. Pokazano wieloparametryczną kwantyfikację wzorców fenotypowych w czasie i przestrzeni. Wykazano długoterminowe działanie leków w ciągu godzin lub sekwencyjne pomiary w ciągu kilku dni.

Streszczenie

Ważne jest zrozumienie, jak działają pobudliwe komórki w zdrowiu i chorobie oraz jak to zachowanie może być zmienione przez małe cząsteczki lub manipulację genetyczną. Genetycznie kodowane wskaźniki wapnia (GECI) z wieloma oknami emisyjnymi mogą być łączone (np. do jednoczesnej obserwacji odrębnych zdarzeń subkomórkowych) lub stosowane w rozszerzonych zastosowaniach z innymi zależnymi od światła aktywatorami w komórkach pobudliwych (np. Łącząc genetycznie kodowaną kontrolę optogenetyczną ze spektralnie kompatybilnymi wskaźnikami wapnia). Takie podejścia zostały zastosowane w neuronach pierwotnych lub pochodzących z komórek macierzystych, kardiomiocytach i komórkach beta trzustki. Jednak zwiększenie przepustowości lub czasu trwania obserwacji takich podejść było wyzwaniem ze względu na ograniczenia instrumentów, oprogramowania analitycznego, wydajności wskaźników i wydajności dostarczania genów. W tym przypadku wysokowydajny zielony GECI, mNeonGreen-GECO (mNG-GECO) i przesunięty ku czerwieni GECI, K-GECO, są połączone z kontrolą optogenetyczną, aby uzyskać pełną kontrolę optyczną i wizualizację aktywności komórkowej w formacie obrazowania o wysokiej przepustowości przy użyciu systemu obrazowania o wysokiej zawartości. Przedstawiono zastosowania demonstrujące badania kardiotoksyczności i fenotypowe badania przesiewowe leków za pomocą zdrowych i pochodzących od pacjenta iPSC-CM. Ponadto w modelu iPSC-CM wykazano również wieloparametryczne oceny wykorzystujące kombinacje wariantów wskaźnika powinowactwa spektralnego i wapniowego (NIR-GECO, LAR-GECO i mtGCEPIA lub Orai1-G-GECO), które są ograniczone do różnych przedziałów komórkowych.

Wprowadzenie

Modele pochodzące z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) są uważane za obiecujące rozwiązanie dla celów 3R (Wymiana, Redukcja i Udoskonalenie) określonych dla badań na zwierzętach1,2. Kardiomiocyty pochodzące z iPSC zostały wykorzystane do modelowania chorób i odkrywania leków, ponieważ podsumowują podstawowe aspekty ludzkiej biologii3. Obrazowanie wapniowe, zazwyczaj za pomocą barwników chemicznych, było używane do obserwacji aktywności komórkowej przed i po leczeniu farmakologicznym4,5. Jednak chemiczne sondy wykrywające wapń na bazie barwników bezpośrednio hamują Na, K-ATPazę i zakłócają funkcje komórkowe6. W związku z tym śledzenie tych samych komórek przez wiele godzin lub dni było problematyczne, gdy stosowane były barwniki chemiczne. W tym przypadku szereg genetycznie kodowanych wskaźników wapnia (GECIs)7,8,9,10 są wykorzystywane w szerokim spektrum pobudzenia/emisji i powinowactwa do wapnia, tworząc platformę do testowania toksyczności sercowej oferującą pomiary wielu organelli w czasie rzeczywistym przez dłuższy czas11.

Aby dalej rozwijać koncepcję wysokoprzepustowych badań przesiewowych opartych na wapniu w modelu iPSC-CM poza poprzednio zademonstrowany kontekst akademicki, używając genetycznie kodowanych narzędzi do kontroli optycznej i obrazowania wapnia poprzez koekspresję przesuniętego ku czerwieni wskaźnika wapnia, R-GECO lub K-GECO za pomocą narzędzia optogenetycznego, ChR212,13, powstały gotowe zestawy wirusowe. Dzięki przeniesieniu obrazowania do urządzenia o wysokiej zawartości wyposażonego w system automikroprzepływowy, jednokanałowe pipetowanie dodatku związków jest nakładane na obrazowanie żywych komórek. Wreszcie, oba kluczowe aspekty ścieżki eksperymentalnej, przetwarzania i analizy obrazu zostały ulepszone i zautomatyzowane.

Protokół

Kardiomiopatia niezagęszczona lewej komory (LVNC) pacjentów z kardiomiocytami pochodzącymi z iPSC (iPSC-CM) zostały dostarczone przez Narodowy Tajwański Szpital Uniwersytecki. Pobieranie próbek od pacjentów w celu przeprogramowania do iPSC i protokołów konserwacji14 do celów badawczych było zgodne z Deklaracją Helsińską WMA (zasady etyczne dla badań medycznych z udziałem ludzi) i zostało zatwierdzone przez Institutional Review Board: Research Ethics Committee Office at NTUH (#201612099RINC). Inne iPSC-CM uzyskano od dostawców komercyjnych. Korzystanie z instrumentów pochodnych iPSC nie wymaga szczególnych zezwoleń w naszej instytucji.

1. Przygotowanie kardiomiocytów pochodzących z iPSC

  1. Przygotować płytkę wielodołkową przed wyjęciem iPSC-CM z chłodni w celu rozmrożenia. Pokryj każdą studzienkę 96-dołkowej mikropłytki 100 μl 50 μg/ml fibronektyny/0,2% roztworu żelatyny (patrz tabela materiałów), aby dokładnie pokryć wszystkie powierzchnie.
  2. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę w nawilżanym inkubatorze.
  3. Podgrzej podłoże (patrz Tabela materiałów) do temperatury pokojowej przez 30 minut przed rozmrożeniem komórek.
    UWAGA: Niniejszy protokół opisuje temperaturę pokojową jako 25 °C.
  4. Przenieść iPSC-CM ze zbiornika magazynującego ciekły azot do łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
    UWAGA: iPS-CM są zwykle wysyłane na suchym lodzie ze źródeł akademickich lub komercyjnych. Po otrzymaniu są przenoszone do przechowywania ciekłego azotu do momentu użycia.
  5. Wyjąć fiolkę przed całkowitym stopieniem się lodu i spryskać fiolkę 75% etanolem.
  6. Przenieść fiolkę do komory bezpieczeństwa biologicznego klasy II i delikatnie przenieść zawartość do nowej stożkowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej 9 ml pożywki o temperaturze pokojowej.
  7. Odwirować komórki przy 200 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.
  8. Odrzucić supernatant pipetą i delikatnie zawiesić komórki w 1 ml pożywki z 10 μM inhibitorem ROCK (Y27632) (patrz tabela materiałów).
    UWAGA: Unikaj wielokrotnego pipetowania rozmrożonych komórek, aby zapewnić maksymalną regenerację komórek.
  9. Usunąć roztwór powlekający ze studzienki i szybko dodać 50 μl pożywki z 10 μM inhibitora ROCK.
  10. Potwierdź liczbę żywotnych komórek za pomocą metody wykluczania błękitu trypanowego za pomocą hemocytometru15.
  11. Komórki płytkowe w powlekanej płytce 96-dołkowej o gęstości 100 000-150 000 komórek/cm2, zgodnie z instrukcjami producenta16.
  12. Po upływie 24 godzin upewnić się, że komórki przymocowane do powierzchni płytki stykają się z innymi ogniwami.
    UWAGA: Pojedyncze komórki słabo przeżywają w długotrwałej hodowli i zazwyczaj zachowują się bardziej zmiennie.
  13. Wymieniaj wstępnie podgrzane podłoże konserwacyjne co 2 dni.
    UWAGA: W przypadku długotrwałego leczenia farmakologicznego, LVNC iPSC-CM zmieniano na pół pożywki zastępowane lekami małocząsteczkowymi lub bez nich co 2 dni.

2. Ekspresja genetycznie kodowanych wskaźników wapnia

  1. Po posiewaniu komórek przez 72 godziny rozmrozić zestawy wirusowe GECI (patrz Tabela Materiałów) na lodzie.
  2. Przygotuj 2x roztwór podstawowy zestawu wirusowego z pożywką konserwacyjną.
  3. Przygotuj komórki do infekcji, dostosowując objętość podłoża do 100 μl na studzienkę. Dodać 100 μl wstępnie zmieszanego roztworu wirusa i inkubować przez 8-16 godzin w temperaturze 37 °C.
  4. Po inkubacji zastąpić 200 μl wstępnie podgrzanej pożywki.
  5. Wizualizacja ekspresji GECI 24 godziny po transdukcji za pomocą systemu obrazowania (patrz Tabela materiałów).
    UWAGA: Poziom ekspresji osiąga maksimum po 48-72 godzinach od transdukcji. Komórki można obrazować z 24-godzinnego punktu czasowego. Jednak sygnały uzyskane z GECI utrzymują się przez ponad miesiąc.
  6. Utrzymuj komórki w nawilżanym inkubatorze przed wykonaniem testów funkcjonalnych.
  7. Zakażone iPSC-CM (iPSC-CM pochodzące od pacjenta LVNC) za pomocą zestawu wirusowego ChR2-K-GECO (patrz tabela materiałów) w 25 dniu po różnicowaniu przy użyciu protokołu infekcji (kroki 2.1-2.6).

3. Barwienie wapnia za pomocą Fluo-4

  1. Rozpuścić proszek Fluo-4 (patrz tabela materiałów) w DMSO jako roztwór podstawowy (5 mM).
  2. Rozcieńczyć roztwór podstawowy do stężenia 10 μM Fluo-4 w buforze Tyrode'a.
    UWAGA: Bufor Tyrode'a składa się z 1,0 g/l wodorowęglanu sodu, 0,2 g/l chlorku wapnia, 0,1 g/l chlorku magnezu, 0,2 g/l chlorku potasu, 8,0 g/l chlorku sodu, 0,05 g/l fosforanu sodu jednozasadowego i 1,0 g/l D-glukozy.
  3. Zastąp połowę pożywki 10 μM roztworu Fluo-4 (uzyskując końcowe stężenie 5 μM).
  4. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
  5. Umyj komórki wstępnie podgrzanym buforem Tyrode i zastąp je pożywką przed akwizycją obrazu.
  6. Rozpocznij nagrywanie za pomocą protokołu pozyskiwania strumienia.
    UWAGA: Akwizycja strumieniowa to ciągłe pobieranie obrazów bez czasu interwału. Częstotliwość dudnienia iPSC-CM wynosi około 1 Hz, a ten protokół akwizycji strumienia służy do zbierania wzorców dudnienia.

4. Akwizycja obrazu i testy funkcjonalne do testów toksyczności i przesiewowych fenotypów

  1. Włącz wszystkie urządzenia systemu obrazowania o wysokiej zawartości (patrz tabela materiałów).
  2. Sprawdzić, czy temperatura komory osiąga 37 °C, przy 5% dodatku CO2 . Utrzymuj system w równowadze przez 2 godziny przed akwizycją obrazu.
    UWAGA: Dryft termiczny jest poważnym problemem w przypadku długoterminowych obserwacji żywych komórek, 1 °C może zmienić płaszczyznę ogniskowej o ~1 μm, więc umożliwienie obiektywowi i stolikowi osiągnięcia temperatury docelowej jest niezbędne przed akwizycją obrazu.
  3. Otwórz oprogramowanie do obrazowania (patrz Tabela materiałów) i wybierz ustawienie płytki dla płytki 96-dołkowej.
  4. Umieść 96-dołkową płytkę bez pokrywy w komorze i załaduj ją pierścieniem uszczelniającym żywych komórek na górze.
    UWAGA: Pierścień uszczelniający żywej komórki jest adapterem do osiągnięcia równowagi środowiskowej.
  5. Wybierz soczewkę obiektywu zanurzeniowego 20x (Rysunek 1 i Rysunek 2), 60x (Rysunek 3 i Rysunek 4) i 20x (Rysunek 5) zgodnie z wymaganą rozdzielczością przestrzenną.
  6. Dostosuj ostrość, aby robić wyraźne obrazy przed eksperymentalną akwizycją.
  7. Wybierz losowo 3-5 regionów na studzienkę do rejestracji aktywności wapnia.
    UWAGA: Każdy region musi zawierać co najmniej 20 komórek (n ≥ 20).
  8. Wybierz odpowiednie filtry dla różnych wskaźników. FITC 475/536 dla mNG-GECO, mtGCEPIA3 i Oria1-G-GECO; Cy5 631/692 dla NIR-GECO2; ER 530/593 dla ER-LAR-GECO; Czerwień teksańska 560/624 dla K-GECO.
  9. Ustaw odpowiednią moc diody elektroluminescencyjnej (LED) dla każdego używanego kanału obrazowania.
    UWAGA: Podczas optymalizacji mocy diody LED do akwizycji obrazowania za pomocą stosunku sygnału (wykryta intensywność obiektu) do szumu (wykryta intensywność tła), stosunek sygnału do szumu powinien być wyższy niż 2. W tym protokole 10% mocy diody LED dla TRITC i FITC; 20% dla Cy5 było typowe.
  10. Ustaw czas ekspozycji kamery na maksymalnie 40 ms (25 Hz) i czas nagrywania 30 s dla akwizycji strumienia, aby obserwować stany przejściowe wapnia zgłaszane przez sondy mNG-GECO i K-GECO wyrażane w kardiomiocytach (Rysunek 1-3 i 5). Zwiększ moc diody LED, jeśli sygnał/szum wynosi <2 przy wyższych liczbach klatek na sekundę.
  11. Do stymulacji optogenetycznej (Rysunek 2 i Rysunek 3C,D), zoptymalizuj moc (zwykle 5%-10%) i częstotliwość niebieskiego światła przy 1 Hz.
    UWAGA: Ogólnie rzecz biorąc, ludzki iPSC-CM bije spontanicznie około ~ 1 Hz, a operator musi poruszać się szybciej niż tempo spontaniczne.
  12. Jeśli planowane są pomiary sekwencyjne (Rysunek 3) lub rozszerzone (Rysunek 4), należy za wszelką cenę unikać fototoksyczności. Może to oznaczać zmniejszenie intensywności mocy oświetlenia i kompensację tego poprzez wydłużenie czasu naświetlania kamery, na przykład do 100 ms za pomocą protokołu poklatkowego używanego do trzykanałowej obserwacji w czasie rzeczywistym subkomórkowych sygnałów Ca2+ (Rysunek 4).
  13. Użyj protokołu asynchronicznego dozowania do dodawania kofeiny 10 mM za pomocą automatycznego systemu mikrofluidycznego (patrz tabela materiałów) (Rysunek 4).
    UWAGA: Protokół asynchronicznego dozowania umożliwia akwizycję obrazu podczas dodawania leków, takich jak kofeina, bez przerw między obrazami.
  14. Rozpocznij pozyskiwanie.

5. Preparat drobnocząsteczkowy

  1. Ponownie zawiesić E4031, dofetylid i werapamil w DMSO i rozcieńczyć je buforem Tyrode. Końcowe stężenie DMSO w pożywce wynosiło 0,1% (v/v).
  2. Przygotować roztwory złożone o podwójnym (tj. 2x) pożądanym stężeniu roboczym i zrównoważyć w temperaturze 37 °C przed dodaniem.
    UWAGA: Minimalizacja wahań temperatury po dodaniu pożywki jest niezbędna, ponieważ kurczliwość jest zależna od temperatury, a efekt zmiany temperatury jest szybki.
  3. Ułóż związki w odpowiednim miejscu docelowym.
  4. Dodać 100 μl związków o podwójnej mocy (2x) za pomocą systemu automatycznej mikroprzepływowości (patrz tabela materiałów) do studzienek i rozpocząć akwizycję po pożądanym (zwykle 15 minut) okresie inkubacji.

6. Przetwarzanie i analiza obrazowania

  1. Odizoluj obszar sygnału od tła, automatycznie wykrywając funkcję impulsu nad obrotem w czasie za pomocą oprogramowania.
  2. Użyj oprogramowania do analizy pików wapnia (patrz tabela materiałów), aby przeanalizować częstotliwość dudnienia (BPM), sygnał szczytowy (amplituda), czas trwania stanu przejściowego wapnia 50% (CTD50), czas przejściowy wapnia 90% (CTD90), czas narastania i czas zaniku (Rysunek 1C).
    UWAGA: W tych ustawieniach fotowybielanie było widoczne przez pierwsze 10 sekund, a następnie sygnały są stabilizowane. W ten sposób pik wapnia analizowano od 11 do 30 s. W nagraniach trzykanałowych (Rysunek 4) kontur komórki jest obramowany ręcznie w celu pomiaru zmiany intensywności.

Wyniki

Obserwacja spontanicznych oscylacji wapnia w mNG-GECO10 ekspresywnych w kardiomiocytach pochodzących z iPSC (iPSC-CMs), z zastosowaniem leków lub bez, została przedstawiona na Rysunku 1 oraz w Animowanym Filmie 1. Krzywe kinetyczne uzyskane z mNG-GECO wykazują, że małocząsteczkowe inhibitory kanałów jonowych: werapamil, dofetylid i E4031 wpłynęły na przejściowe zmiany stężeń wapnia (Rysunek 1B) zgodnie z oczekiwaniami. Typowy przejściowy sygnał wapniowy pokazany na Rysunku 1C może zostać przeanalizowany za pomocą oprogramowania do analizy szczytów wapniowych w celu wyznaczenia sygnału szczytowego (amplitudy), czasu trwania przejścia wapniowego 50% (CTD50), czasu trwania przejścia wapniowego 90% (CTD90), czasu narastania oraz czasu zaniku. Werapamil, bloker kanałów wapniowych typu L17, całkowicie hamuje napływ wapnia do komórek, zgodnie z oczekiwaniami (Rysunek 1B). Dofetylid i E4031 są inhibitorami kanałów hERG18,19,20, sklasyfikowanymi jako eksperymentalne leki antyarytmiczne klasy III. Czas zaniku jest wydłużony zarówno przy zastosowaniu dofetylidu (p < 0,05), jak i E4031 (p < 0,001) w porównaniu z grupą kontrolną (nośnikiem). W przypadku zastosowania E4031 zaobserwowano wydłużenie CTD50 (p < 0,01) oraz CTD90 (p < 0,001) w porównaniu z samym nośnikiem (Tabela 1); wyniki te są zgodne z opisanymi w poprzednich badaniach12,21 efektami wpływającymi na odstęp QT, czyli klinicznie istotny pomiar repolaryzacji wyznaczany z powierzchniowego elektrokardiogramu jako czas między początkiem załamka Q a końcem załamka T.

Trudnością w ocenie CTD w komórkach wykazujących spontaniczną aktywność rytmiczną jest zmienność rytmu uderzeń, która wpływa na CTD. Jest to szczególny problem w przypadku modelu iPSC-CM, w którym każda studzienka płytki 96-dołkowej może charakteryzować się innym rytmem uderzeń, mimo że wszystkie komórki pochodzą z tej samej fiolki macierzystej. Możliwe jest narzucenie określonego rytmu uderzeń poprzez stymulację optyczną lub elektryczną. Aby ocenić zależność dawka-odpowiedź dla E4031 w zestandaryzowanych warunkach stymulacji, zastosowano ChR2 oraz K-GECO7 ekspresjonujące iPSC-CMs były kontrolowane optycznie przy użyciu impulsów światła o długości fali 470 nm i częstotliwości 1 Hz oraz obserwowane przy użyciu czerwonego sygnału K-GECO (Rysunek 2A i Rycina uzupełniająca 1). Stopniowe zmniejszenia amplitudy piku (p < 0,01) oraz wydłużenie czasu zaniku (p < 0,05) przejściowych zmian stężenia wapnia występują przy zwiększających się stężeniach E4031 (Rycina 2B1). Efekt zależny od dawki E4031 był najbardziej widoczny w przypadku redukcji amplitudy szczytu (Rycina 2B1,B2).

Choć do oceny kardiotoksyczności zazwyczaj stosuje się krótkotrwałe badania trwające kilka minut, istnieje luka w ocenie toksyczności przewlekłej, która odpowiada ekspozycji pacjentów na leki w ciągu tygodni, miesięcy lub lat. Korzystne byłoby badanie efektów choroby lub toksyczności w odstępach czasu odzwierciedlających czas trwania leczenia istotny w praktyce klinicznej. Wykorzystaliśmy nasz system optycznego sterowania i detekcji do badania kardiomiocytów pochodzących z iPSC od pacjenta z niekompaktowaniem lewej komory (LVNC). iPSC-CMy zostały transdukowane zestawem wirusowym K-GECO (krok 2.2-2.6) w 25. dniu po dyferencjacji. Następnie sygnał K-GECO śledzono co 1-2 tygodnie w tych samych dołkach, z dodatkową aplikacją leków lub bez niej. Zarówno spontaniczną aktywność wapniową (Rycyna 3A,3B), jak i dynamikę wapniową podczas stymulacji optycznej (Rycyna 3C,D, krok 4.11) uzyskano za pomocą systemu obrazowania wysokoprzepustowego High-Content Imaging System (krok 4.1-4.12) i przetworzono za pomocą oprogramowania do analizy peaków wapniowych (krok 6). Jak pokazano na Rycynie 3A,C, wyraźne przejścia wapniowe pozostają widoczne miesiąc po transdukcji wirusowej, niezależnie od zastosowania dodatkowego światła do stymulacji optycznej. W niniejszej pracy zidentyfikowano lek, który wydaje się zwiększać częstość skurczów, regulować odstępy między skurczami oraz zwiększać amplitudę przejścia wapniowego w modelu LVNC iPSC-CM (Rycyna 3A,B). Z tych danych płyną dwie ważne obserwacje. Po pierwsze, z perspektywy terapeutycznej, efekt działania leku wydaje się trwały w punktach czasowych 63. i 70. dnia. Po drugie, co jest istotne dla dziedziny, która zazwyczaj bada efekty związków w krótkich oknach czasowych (<1 min) we wcześniejszych punktach czasowych (zazwyczaj <50 dni); efekty modyfikujące fenotyp choroby wywołane przez związek są widoczne dopiero po 60. dniu, co sugeruje, że w standardowych protokołach przesiewowych można łatwo przeoczyć leki o powolnym mechanizmie działania.

Zmienność częstotliwości uderzeń oraz wynikający z niej wpływ na czas trwania przejściowego stanu wapnia nie jest jedynie problemem różnic między poszczególnymi studzienkami w danym punkcie czasowym. Zmienia się ona również w miarę utrzymywania iPSC-CM w kulturze, co w obrębie jednej studzienki różni się w czasie (Rysunek 3B). Aby zapewnić spójność w kolejnych eksperymentach, można zastosować optyczne stymulowanie z częstotliwością 1 Hz, z podaniem leku lub bez (Rysunek 3C,D). Chociaż wyniki z 63. dnia wykazują obiecujące trendy w przejściowym stanie wapnia z istotnie wyższą amplitudą, krótszym CTD90 i krótszym czasem zaniku, to w 70. dniu – co wskazuje na konieczność przeprowadzania przewlekłych ocen podczas procesu przesiewowego leków w chorobach rzadkich – wykrywane są wczesne polidepolaryzacje (EAD). Wartość dodania protokołu stymulacji do fenotypowania chorób lub oceny małych cząsteczek można jakościowo ocenić poprzez porównanie wyników przedstawionych na Rysunku 3B,D w odniesieniu do częstości uderzeń, amplitudy przejściowego stanu wapnia, CTD90 oraz czasu zaniku.

Zaletą metodyki opartej na GECI w porównaniu do barwników chemicznych w wizualizacji przejściowych zmian stężenia wapnia jest możliwość ograniczenia zasięgu sondy do konkretnego przedziału wewnątrzkomórkowego. Możliwość tę można rozszerzyć poprzez multipleksowanie wariantów o różnych kolorach i/lub powinowactwach w pojedynczych komórkach. W związku z tym opracowano kilka wskaźników GECI, w tym ER-LAR-GECO9, mtGCEPIA22,23 (lub Oria1-G-GECO) oraz NIR-GECO28,24, przeznaczone do ekspresji pojedynczo lub w kombinacjach w modelach komórkowych do pomiaru aktywności wapniowej w czasie rzeczywistym, występującej odpowiednio w siateczce śródplazmatycznej / siateczce sarkoplazmatycznej (ER/SR), mitochondriach (lub kanale CRAC) oraz cytozolu. Można je łączyć w modelu iPSC-CM (Rysunek 4A,C), aby badać interakcje między różnymi wewnątrzkomórkowymi magazynami wapnia. Na przykład traktowanie 10 mM kofeiną może zostać wykorzystane do opróżnienia magazynu wapnia w SR. W tym przypadku spadek sygnału ER-LAR-GECO (wskazujący na utratę wapnia z SR) przebiegał równolegle do wzrostu sygnału NIR-GECO (wskazującego na wzrost stężenia wapnia w cytozolu), zgodnie z oczekiwaniami. Słabo zbadano, w jaki sposób inne przedziały wewnątrzkomórkowe reagują na te wahania. Niemniej jednak, zastosowanie zielonego, celowanego w mitochondria wskaźnika mtGCEPIA3 pokazuje, że w tych warunkach w mitochondriach zachodzi pobieranie wapnia (Rysunek 4A,B).

Podobnie, oddziaływanie między różnymi prądami wapniowymi można zwizualizować poprzez zastosowanie sondy Orai1-G-GECO25, aby ukazać prąd Ca2+ kanału aktywowanego uwalnianiem wapnia (CRAC) (Rycina 4C,D). W modelu iPSC-CM sygnał ten wzrasta wraz ze spontanicznym przejściowym wzrostem stężenia wapnia w cytozolu (Rycina 4D1,D2). Zgodnie z tym, podanie kofeiny wywołuje silny wzrost stężenia wapnia zarówno w cytozolu, jak i w kanale Orai1.

Przyjmuje się, że większość obrazowania przejściowego stężenia wapnia w modelach kardiomiocytów przeprowadzano z wykorzystaniem barwników wapniowych26. W celu umożliwienia bezpośredniego porównania różnych metod obrazowania wapnia, w modelu kardiomiocytów pochodzących z iPSC porównano genetycznie kodowany wskaźnik wapnia z barwnikiem chemicznym. Obrazowano iPSC-CMs wykazujące ekspresję K-GECO obok komórek załadowanych Fluo-4. Kardiomiocyty wykazujące ekspresję K-GECO wykazywały spójny rytm skurczów w czasie (Rysunek 5A,C). Jednak ładowanie Fluo-4 wpłynęło zarówno na częstotliwość skurczów, jak i na CTD w tym modelu (Rysunek 5B,C), co sugeruje, że sam Fluo-4 może wpływać na wyniki takich eksperymentów. Będzie to szczególnie widoczne po długotrwałej ekspozycji na sondę obrazującą, co może wystąpić w formacie obrazowania wielodołkowego, jeżeli obrazowanie poszczególnych dołków wiąże się z niewielkim czasem przebywania w każdym z nich.

Obrazowanie i analiza wapnia: mikroskopia fluorescencyjna, wykresy przebiegu czasowego, wpływ leków na przejściowe stężenia wapnia.
Rysunek 1: Małe cząsteczkowe inhibitory kanałów jonowych zastosowane w kardiomiocytach pochodzących z iPSC. (A-B) Obrazy time-lapse z iPSC-CM wykazujących ekspresję mNG-GECO wykonane przy 25 Hz. Pasek skali = 50 µm. (B) Reprezentatywne oscylacje Ca2+ po dodaniu związku. Sygnały fluorescencyjne otrzymane z komórek wykazujących ekspresję mNG-GECO przedstawiono jako stosunek fluorescencji F/F0, gdzie F0 definiuje intensywność podstawową, a F intensywność wykrytą w każdym punkcie czasowym. (C) Oprogramowanie do analizy szczytów wapniowych pozwala na wyodrębnienie parametrów, takich jak szerokość połowy maksymalnej (CTD50), czas trwania 90% przejścia (CTD 90), czas narastania oraz czas zaniku. Aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

Analiza zależności dawka-odpowiedź dla E4031, wykresy F/F0 w funkcji czasu, dane o zależności dawka-odpowiedź, wykresy amplitudy i czasu zaniku.
Rysunek 2: Przykład zależności dawka-odpowiedź z użyciem inhibitora hERG E4031 w systemie stymulacji optycznej. (A) Przebiegi stymulacji optycznej niebieskim światłem (10%) przy różnych stężeniach E4031. Obrazy time-lapse kardiomiocytów pochodzących z iPSC wykazujących ekspresję K-GECO, rejestrowane z częstotliwością 25 Hz. (B1) Reprezentatywne przebiegi przejściowych zmian poziomu wapnia uzyskane przy różnych dawkach związku. Analiza szczytowa oraz zależność dawka-odpowiedź dla E4031 w odniesieniu do amplitudy (B2) oraz czasu zaniku (B3). Niebieskie słupki oznaczają stymulację impulsową światłem 470 nm z częstotliwością 1 Hz. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Analiza aktywności kardiomiocytów; efekt leku; wykres; dane pacjenta z LVNC; częstość skurczów; stymulacja optyczna.
Rysunek 3: Platforma w pełni optyczna zastosowana do długoterminowego przesiewu fenotypowego leków w kardiomiocytach pochodzących od pacjenta z LVNC. (A) Reprezentatywny zapis aktywności spontanicznych skurczów w kardiomiocytach pochodzących od pacjenta (70. dzień po różnicowaniu) z (czerwony) lub bez (niebieski) podania leku w stężeniu 5 µM. (B) Analiza szczytów aktywności spontanicznych skurczów z lub bez podania leku w stężeniu 5 µM. (C) Zapisy intensywności odpowiedzi na lek w iPSC-CM pochodzących od pacjenta przy stymulacji optycznej 1 Hz. (D) Analiza szczytów kardiomiocytów pochodzących od pacjenta przy stymulacji optycznej 1 Hz. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Analiza aktywności jonów wapnia; mikroskopia fluorescencyjna (cytosol, ER/SR), wykresy stymulacji kofeiną.
Rysunek 4: Trójekanałowe obrazowanie podkomórkowe Ca2+ w modelu iPSC-CM. (A-B) iPSC-CM zostały przetransdukowane podkomórkowymi sondami wapniowymi dla cytoplazmy, NIR-GECO2 (czerwona), retikulum endoplazmatycznego ER-LAR-GECO (żółta) oraz mtGCEPIA3 (cyjan), wskaźnikiem Ca2+ mitochondrialnego. (B) Trójekanałowe obrazowanie wapnia w czasie (time-lapse) przed i po zastosowaniu 10 mM kofeiny. (C-D) Wizualizacja iPSC-CM przetransdukowanych wskaźnikami cytoplazmatycznym NIR-GECO2 (czerwony), retikulum endoplazmatycznego ER-LAR-GECO (żółty) oraz kanałów CRAC Orai1-G-GECO (cyjan). (D) Wykonano trójekanałowe obrazowanie wapnia w czasie. (D1) Obserwowano spontaniczną aktywność z uderzenia na uderzenie z zastosowaniem NIR-GECO2 oraz Orai1-G-GECO. (D2) Odpływ wapnia z ER (spadek sygnału ER-LAR-GECO) towarzyszył wzrostowi sygnału wapnia cytozolowego po zastosowaniu kofeiny. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Wykresy analizy sygnału wapnia, K-GECO vs. Fluo4, dane z lapse czasu, częstotliwość, CTD90, czas zaniku.
Rycina 5: Porównanie genetycznie kodowanego wskaźnika wapnia (K-GECO) z chemicznym barwnikiem wrażliwym na wapń (Fluo-4) w iPSC-CMs. (A-B) Przedstawiono reprezentatywne przebiegi zmian stężenia wapnia dla K-GECO (A) oraz Fluo-4 (B) w czasie. (C) Analiza przejściowych zmian stężenia wapnia w iPSC-CM transdukowanych K-GECO lub obciążonych Fluo-4. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

BPMCTD50 (s)CTD90 (s)Amplituda (F/F0)Czas narastaniaCzas rozpadu (s)
Kontrola (0,1% DMSO)112.3657+/-10.950.25+/-0.040.41+/-0.011.99+/-0.020.07+/-0.010.28+/-0.01
Werapamil (1 uM)0-----
Dofetylid (5 nM)103.42+/-9.87**0.23+/-0.030.46+/-0.031.91+/-0.030.07+/-0.010.35+/-0.02*
E4031 (30 nM)75.73+/-12.08***0.37+/-0.04**0.58+/-0.08***1.55+/-0.02**0.11+/-0.04***0.35+/-0.07**

Tabela 1: Wpływ dodania związku na parametry przejściowego poziomu wapnia w modelu iPSC-CM. Wartości istotności są oznaczone jako *(p ≤ 0,05), **(p < 0,01) oraz ***(p < 0,001).

Animowany film 1: Spontaniczna aktywność wapniowa obserwowana za pomocą mNG-GECO w kardiomiocytach pochodzących z iPSC z samym nośnikiem. Przedstawiono film w pseudokolorach wykonany na podstawie obrazu w skali szarości. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Rycina uzupełniająca 1: Schematyczny opis wektora adenowirusowego. Zawiera on kanałorodopsynę ChR2 jako aktuator oraz czerwony fluorescencyjny wskaźnik wapnia K-GECO jako reporter wapnia do analizy w pełni optycznej. Światłoczuły kanał jonowy umożliwia depolaryzację komórek pobudliwych za pomocą światła z zakresu niebiesko-zielonego widma widzialnego. W przeprowadzonych eksperymentach zastosowano światło o długości fali 470 nm. Przejściowe zmiany poziomu wapnia w komórkach pobudliwych mogą być jednocześnie obrazowane przez K-GECO, co wymaga zielonego światła wzbudzenia, generującego emisję w kolorze czerwonym. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Aby skutecznie przeprowadzić wysokoprzepustowe badania przesiewowe, sygnały muszą być równomiernie rozłożone w naczyniu hodowlanym, co gwarantuje, że losowo wybrane obszary zainteresowania (ROI) mogą być stosowane automatycznie podczas akwizycji obrazu. Chociaż chemiczne wskaźniki wapnia z łatwością spełniają ten wymóg, sondy kodowane genetycznie historycznie wytwarzały plamy, a nie arkusze sygnału ograniczające ich użycie. Zastosowanie systemu transdukcji wirusa zapewnia wysokie poziomy ekspresji27,28 i równoważne poziomy ekspresji wielu wskaźników wśród komórek docelowych w porównaniu z konwencjonalnymi metodami transfekcji. Różne typy komórek mogą wymagać różnych promotorów, a wybór systemu dostarczania genów może wymagać odpowiedniej zmiany 29,30,31. W heterogenicznych modelach komórkowych wydajność transdukcji i ekspresji może być różna w określonych typach komórek. Z jednej strony może to ograniczać zastosowanie do konkretnych komórek, ale zjawisko to można wykorzystać do rozróżnienia poszczególnych komórek w systemie kohodowli32.

Głównym efektem tego podejścia jest uwolnienie się od relacji jeden do jednego między eksperymentatorem a próbką poprzez automatyzację. W standardowym eksperymencie wielodołkowym, polegającym na zbieraniu danych w czterech pozycjach w jednym dołku, szacujemy, że zebranie 30-sekundowych filmów z płytki 96-dołkowej zajmuje około 15 godzin przy użyciu mikroskopu. W systemie automatycznym trwa to ~4 godziny. Co więcej, ręczna analiza danych trwa znacznie dłużej niż ich pozyskiwanie. Zastosowany tutaj system analizy jest około 200 razy szybszy niż jego ręczny odpowiednik. Rezultatem netto jest usprawniony przepływ pracy oraz duża oszczędność kosztów i czasu.

W przeciwieństwie do pierwotnych kardiomiocytów obciążonych barwnikami wapniowymi, które przeżywają w ciągu kilku godzin, GECI ulegające ekspresji w iPSC-CM za pośrednictwem systemów dostarczania wirusa mogą dać sygnał w modelu eksperymentalnym, który żyje przez kilka miesięcy. Modele te mogą być utrzymywane w formacie wielodołkowym i jednocześnie śledzone w celu analizy seryjnej w systemach obrazowania o wysokiej zawartości opracowanych do badań przesiewowych małych cząsteczek. W ten sposób powstaje prosta platforma eksperymentalna dla ludzi do testowania działania leku w czasie bliższym czasom doświadczanym przez pacjentów (tygodnie lub miesiące), a nie w minutach zwykle stosowanych w testach toksykologicznych.

System można rozbudować w celu zapewnienia pomiarów wieloparametrowych poprzez włączenie GECI o różnych właściwościach emisji od zielonego do bliskiej podczerwieni. Takie eksperymenty wymagają odpowiedniego światła wzbudzającego i zestawów filtrów w projekcie eksperymentalnym, aby utrzymać sygnały oddzielnie. Szerokie zastosowanie w kontekście badań przesiewowych leków wymaga nie tylko wydawania leków, ale także solidnych i wydajnych platform analitycznych. Chociaż opisany tutaj model koncentruje się na wykorzystaniu wielu dynamicznych wskaźników wapnia, można go zmodyfikować w celu uzyskania strukturalnych markerów formy lub funkcji komórki. Są one zazwyczaj łatwiejsze do wizualizacji, ponieważ wykazują niewielką zmienność między uderzeniami w porównaniu ze stukrotną zmiennością wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia. Podejście to może być szczególnie cenne w przypadku chorób rzadkich, w których produkt pośredni iPSC pochodzący od pacjentów może zawierać wszystkie czynniki genetyczne i modyfikatory danego stanu, które można zachować w skalowalnym modelu komórkowym, ułatwiając odkrywanie leków w różnych chorobach w oparciu o fenotypy komórkowe, które można uwidocznić niezależnie od leżącego u podstaw mechanizmu biologicznego, który może być trudny do wyjaśnienia.

Oświadczenia

LumiSTAR złożył wniosek o ochronę patentową stosowania K-GECO, NIR-GECO i LAR-GECO.

Podziękowania

Dziękujemy Prof. Robertowi Campbellowi z Uniwersytetu Tokijskiego za podzielenie się materiałem i cenną dyskusję; Dr. Chia-Lin Ho z Molecular Device za wsparcie techniczne.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
96-dołkowa płytkaPerkin Elmer6055302
automatyczny system mikroprzepływowyUrządzenieUrządzenie posiada pipeter jednokanałowy, który może być używany do automatycznego dodawania związku
KofeinaSigma-AldrichC0750
Cardiosight-S l Kardiomiocyty pochodzące z iPSCNEXELC-002
DimetylosulfotlenekMillipore Sigma1096780100
DofetilideSigma-AldrichPZ0016
E4031Tocris1808
Zestaw wirusowy ER-LAR-GECOLumiSTARAA001aPrzesunięty ku czerwieni GECI zapakowany w wektor adenowirusowy
FibronektynaSigma-AldrichF1141
Fluo-4 AMInvitrogenF14201Wapń chemiczny wrażliwy barwnik
ŻelatynaSigma-AldrichG1890
ImageXpress Micro Konfokalny system obrazowania o wysokiej zawartościmolekularne
iPSC-CMs Środek do konserwacjiNEXELCMS-002iPSC-CMs Medium (Cardiosight-S medium) + Suplement Cardiosight-S
iPSC-CMs Medium (Cardiosight-S medium)NEXELCMS-002
K-GECO zestaw wirusowyLumiSTARAA005aPrzesunięty ku czerwieni GECI zapakowany w wektor adenowirusowy
Oprogramowanie LumiCALLumiSTARLUCS01aOprogramowanie do analizy piku wapnia w kardiomiocytach
Zestaw wirusowy mNG-GECOLumiSTARAL008aJaśniejsza zielona GECI zapakowana w wektor lenti-wirusowy
zestaw wirusowy mt-GCEPIA3LumiSTARAL011aGECI targgeting na mitochondriach upakowany w wektor wirusowy
lenti-GECO Zestaw wirusowy NIR-GECOLumiSTARAV004aBliska podczerwień GECI zapakowany w wektor wirusowy
Zestaw wirusowy Orai1-GGECOLumiSTARAL010aGECI targgeting na Orai1 zapakowany w wektor wirusowy lenti-Sole
Tyrode'aSigma-AldrichT2145
Chlorowodorek werapamiluSigma-AldrichV4629
Y-27632 dichlorowodorekTocris1254
molekularne Urządzenie

Bibliografia

  1. O'Connor, M. D. The 3R principle: Advancing clinical application of human pluripotent stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 4 (2), 21(2013).
  2. Ebert, A. D., Liang, P., Wu, J. C. Induced pluripotent stem cells as a disease modeling and drug screening platform. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 60 (4), 408-416 (2012).
  3. Ovics, P., et al. Drug development and the use of induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for disease modeling and drug toxicity screening. International Journal of Molecular Sciences. 21 (19), 7320(2020).
  4. Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Zheng, W., Lechleiter, J. D. Chemical calcium indicators. Methods. 46 (3), 143-151 (2008).
  5. Takahashi, A., Camacho, P., Lechleiter, J. D., Herman, B. Measurement of intracellular calcium. Physiological Reviews. 79 (4), 1089-1125 (1999).
  6. Smith, N. A., et al. Fluorescent Ca(2+) indicators directly inhibit the Na,K-ATPase and disrupt cellular functions. Science Signaling. 11 (515), (2018).
  7. Shen, Y., et al. A genetically encoded Ca2+ indicator based on circularly permutated sea anemone red fluorescent protein eqFP578. BMC Biology. 16 (1), 9(2018).
  8. Qian, Y., et al. A genetically encoded near-infrared fluorescent calcium ion indicator. Nature Methods. 16 (2), 171-174 (2019).
  9. Wu, J., et al. Red fluorescent genetically encoded Ca2+ indicators for use in mitochondria and endoplasmic reticulum. Biochemical Journal. 464 (1), 13-22 (2014).
  10. Zarowny, L., et al. and high-performance genetically encoded Ca2+ indicator based on mneongreen fluorescent protein. ACS Sensors. 5 (7), 1959-1968 (2020).
  11. Potekhina, E. S., et al. Drug screening with genetically encoded fluorescent sensors: today and tomorrow. International Journal of Molecular Sciences. 22 (1), 148(2021).
  12. Chang, Y. -F., et al. Non-invasive phenotyping and drug testing in single cardiomyocytes or beta-cells by calcium imaging and optogenetics. PLoS One. 12 (4), 0174181(2017).
  13. Chang, Y. -F., Arai, Y., Nagai, T. Optogenetic activation during detector "dead time" enables compatible real-time fluorescence imaging. Neuroscience Research. 73 (4), 341-347 (2012).
  14. Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).
  15. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. 111, 1-3 (2015).
  16. Jang, Y., et al. Modulating cardiomyocyte and fibroblast interaction using layer-by-layer deposition facilitates synchronisation of cardiac macro tissues. Soft Matter. 16 (2), 428-434 (2020).
  17. Leonard, R. G., Talbert, R. L. Calcium-channel blocking agents. Clinical Pharmacology. 1 (1), 17-33 (1982).
  18. Sanguinetti, M. C., Jurkiewicz, N. K. Two components of cardiac delayed rectifier K+ current. Differential sensitivity to block by class III antiarrhythmic agents. The Journal of General Physiology. 96 (1), 195-215 (1990).
  19. Lees-Miller, J. P., Duan, Y., Teng, G. Q., Duff, H. J. Molecular determinant of high-affinity dofetilide binding to HERG1 expressed in Xenopus oocytes: Involvement of S6 sites. Molecular Pharmacology. 57 (2), 367-374 (2000).
  20. Kamiya, K., Niwa, R., Mitcheson, J. S., Sanguinetti, M. C. Molecular determinants of HERG channel block. Molecular Pharmacology. 69 (5), 1709-1716 (2006).
  21. Fukushima, H., et al. Specific induction and long-term maintenance of high purity ventricular cardiomyocytes from human induced pluripotent stem cells. PLoS One. 15 (11), 0241287(2020).
  22. Suzuki, J., Kanemaru, K., Iino, M. Genetically encoded fluorescent indicators for organellar calcium imaging. Biophysical Journal. 111 (6), 1119-1131 (2016).
  23. Suzuki, J., et al. Imaging intraorganellar Ca2+ at subcellular resolution using CEPIA. Nature Communications. 5, 4153(2014).
  24. Qian, Y., et al. Improved genetically encoded near-infrared fluorescent calcium ion indicators for in vivo imaging. PLoS Biology. 18 (11), 3000965(2020).
  25. Dynes, J. L., Amcheslavsky, A., Cahalan, M. D. Genetically targeted single-channel optical recording reveals multiple Orai1 gating states and oscillations in calcium influx. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (2), 440-445 (2016).
  26. Broyles, C. N., Robinson, P., Daniels, M. J. Fluorescent, bioluminescent, and optogenetic approaches to study excitable physiology in the single cardiomyocyte. Cells. 7 (6), 51(2018).
  27. Cao, F., et al. Comparison of gene-transfer efficiency in human embryonic stem cells. Molecular Imaging and Biology. 12 (1), 15-24 (2010).
  28. Ma, Y., Ramezani, A., Lewis, R., Hawley, R. G., Thomson, J. A. High-level sustained transgene expression in human embryonic stem cells using lentiviral vectors. Stem Cells. 21 (1), 111-117 (2003).
  29. Haery, L., et al. Adeno-associated virus technologies and methods for targeted neuronal manipulation. Frontiers in Neuroanatomy. 13, 93(2019).
  30. Nieuwenhuis, B., et al. Optimization of adeno-associated viral vector-mediated transduction of the corticospinal tract: Comparison of four promoters. Gene Therapy. 28 (1), 56-74 (2021).
  31. Smith, R. L., et al. Characterization of promoter function and cell-type-specific expression from viral vectors in the nervous system. Journal of Virology. 74 (23), 11254-11261 (2000).
  32. Fang, Y., et al. Safety and efficacy of an immune cell-specific chimeric promoter in regulating anti-PD-1 antibody expression in. CAR T cells. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 19, 14-23 (2020).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Rejestracja sygna u wapniowegokardiomiocyty iPSCobrazowanie wysokoprzepustowekontrola optogenetycznagenetycznie kodowane wska niki wapniatestowanie kardiotoksyczno cianaliza przej ciowych zmian st enia wapniasystem obrazowania wysokotre ciowegotest w p ytce wielodo kowej

Powiązane artykuły