Wysokoprzepustowe sterowanie optyczne i rejestrowanie sygnału wapnia w kardiomiocytach pochodzących z iPSC do badań toksyczności i fenotypowych badań przesiewowych leków

Modele pochodzące z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) są uważane za obiecujące rozwiązanie dla celów 3R (Wymiana, Redukcja i Udoskonalenie) określonych dla badań na zwierzętach1^,2. Kardiomiocyty pochodzące z iPSC zostały wykorzystane do modelowania chorób i odkrywania leków, ponieważ podsumowują podstawowe aspekty ludzkiej biologii³. Obrazowanie wapniowe, zazwyczaj za pomocą barwników chemicznych, było używane do obserwacji aktywności komórkowej przed i po leczeniu farmakologicznym^4,5. Jednak chemiczne sondy wykrywające wapń na bazie barwników bezpośrednio hamują Na, K-ATPazę i zakłócają funkcje komórkowe⁶. W związku z tym śledzenie tych samych komórek przez wiele godzin lub dni było problematyczne, gdy stosowane były barwniki chemiczne. W tym przypadku szereg genetycznie kodowanych wskaźników wapnia (GECIs)^7,8,9,10 są wykorzystywane w szerokim spektrum pobudzenia/emisji i powinowactwa do wapnia, tworząc platformę do testowania toksyczności sercowej oferującą pomiary wielu organelli w czasie rzeczywistym przez dłuższy czas¹¹.

Aby dalej rozwijać koncepcję wysokoprzepustowych badań przesiewowych opartych na wapniu w modelu iPSC-CM poza poprzednio zademonstrowany kontekst akademicki, używając genetycznie kodowanych narzędzi do kontroli optycznej i obrazowania wapnia poprzez koekspresję przesuniętego ku czerwieni wskaźnika wapnia, R-GECO lub K-GECO za pomocą narzędzia optogenetycznego, ChR2^12,13, powstały gotowe zestawy wirusowe. Dzięki przeniesieniu obrazowania do urządzenia o wysokiej zawartości wyposażonego w system automikroprzepływowy, jednokanałowe pipetowanie dodatku związków jest nakładane na obrazowanie żywych komórek. Wreszcie, oba kluczowe aspekty ścieżki eksperymentalnej, przetwarzania i analizy obrazu zostały ulepszone i zautomatyzowane.

Kardiomiopatia niezagęszczona lewej komory (LVNC) pacjentów z kardiomiocytami pochodzącymi z iPSC (iPSC-CM) zostały dostarczone przez Narodowy Tajwański Szpital Uniwersytecki. Pobieranie próbek od pacjentów w celu przeprogramowania do iPSC i protokołów konserwacji¹⁴ do celów badawczych było zgodne z Deklaracją Helsińską WMA (zasady etyczne dla badań medycznych z udziałem ludzi) i zostało zatwierdzone przez Institutional Review Board: Research Ethics Committee Office at NTUH (#201612099RINC). Inne iPSC-CM uzyskano od dostawców komercyjnych. Korzystanie z instrumentów pochodnych iPSC nie wymaga szczególnych zezwoleń w naszej instytucji.

1. Przygotowanie kardiomiocytów pochodzących z iPSC

1. Przygotować płytkę wielodołkową przed wyjęciem iPSC-CM z chłodni w celu rozmrożenia. Pokryj każdą studzienkę 96-dołkowej mikropłytki 100 μl 50 μg/ml fibronektyny/0,2% roztworu żelatyny (patrz tabela materiałów), aby dokładnie pokryć wszystkie powierzchnie.
2. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę w nawilżanym inkubatorze.
3. Podgrzej podłoże (patrz Tabela materiałów) do temperatury pokojowej przez 30 minut przed rozmrożeniem komórek.
   UWAGA: Niniejszy protokół opisuje temperaturę pokojową jako 25 °C.
4. Przenieść iPSC-CM ze zbiornika magazynującego ciekły azot do łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
   UWAGA: iPS-CM są zwykle wysyłane na suchym lodzie ze źródeł akademickich lub komercyjnych. Po otrzymaniu są przenoszone do przechowywania ciekłego azotu do momentu użycia.
5. Wyjąć fiolkę przed całkowitym stopieniem się lodu i spryskać fiolkę 75% etanolem.
6. Przenieść fiolkę do komory bezpieczeństwa biologicznego klasy II i delikatnie przenieść zawartość do nowej stożkowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej 9 ml pożywki o temperaturze pokojowej.
7. Odwirować komórki przy 200 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.
8. Odrzucić supernatant pipetą i delikatnie zawiesić komórki w 1 ml pożywki z 10 μM inhibitorem ROCK (Y27632) (patrz tabela materiałów).
   UWAGA: Unikaj wielokrotnego pipetowania rozmrożonych komórek, aby zapewnić maksymalną regenerację komórek.
9. Usunąć roztwór powlekający ze studzienki i szybko dodać 50 μl pożywki z 10 μM inhibitora ROCK.
10. Potwierdź liczbę żywotnych komórek za pomocą metody wykluczania błękitu trypanowego za pomocą hemocytometru¹⁵.
11. Komórki płytkowe w powlekanej płytce 96-dołkowej o gęstości 100 000-150 000 komórek/cm², zgodnie z instrukcjami producenta¹⁶.
12. Po upływie 24 godzin upewnić się, że komórki przymocowane do powierzchni płytki stykają się z innymi ogniwami.
    UWAGA: Pojedyncze komórki słabo przeżywają w długotrwałej hodowli i zazwyczaj zachowują się bardziej zmiennie.
13. Wymieniaj wstępnie podgrzane podłoże konserwacyjne co 2 dni.
    UWAGA: W przypadku długotrwałego leczenia farmakologicznego, LVNC iPSC-CM zmieniano na pół pożywki zastępowane lekami małocząsteczkowymi lub bez nich co 2 dni.

2. Ekspresja genetycznie kodowanych wskaźników wapnia

1. Po posiewaniu komórek przez 72 godziny rozmrozić zestawy wirusowe GECI (patrz Tabela Materiałów) na lodzie.
2. Przygotuj 2x roztwór podstawowy zestawu wirusowego z pożywką konserwacyjną.
3. Przygotuj komórki do infekcji, dostosowując objętość podłoża do 100 μl na studzienkę. Dodać 100 μl wstępnie zmieszanego roztworu wirusa i inkubować przez 8-16 godzin w temperaturze 37 °C.
4. Po inkubacji zastąpić 200 μl wstępnie podgrzanej pożywki.
5. Wizualizacja ekspresji GECI 24 godziny po transdukcji za pomocą systemu obrazowania (patrz Tabela materiałów).
   UWAGA: Poziom ekspresji osiąga maksimum po 48-72 godzinach od transdukcji. Komórki można obrazować z 24-godzinnego punktu czasowego. Jednak sygnały uzyskane z GECI utrzymują się przez ponad miesiąc.
6. Utrzymuj komórki w nawilżanym inkubatorze przed wykonaniem testów funkcjonalnych.
7. Zakażone iPSC-CM (iPSC-CM pochodzące od pacjenta LVNC) za pomocą zestawu wirusowego ChR2-K-GECO (patrz tabela materiałów) w 25 dniu po różnicowaniu przy użyciu protokołu infekcji (kroki 2.1-2.6).

3. Barwienie wapnia za pomocą Fluo-4

1. Rozpuścić proszek Fluo-4 (patrz tabela materiałów) w DMSO jako roztwór podstawowy (5 mM).
2. Rozcieńczyć roztwór podstawowy do stężenia 10 μM Fluo-4 w buforze Tyrode'a.
   UWAGA: Bufor Tyrode'a składa się z 1,0 g/l wodorowęglanu sodu, 0,2 g/l chlorku wapnia, 0,1 g/l chlorku magnezu, 0,2 g/l chlorku potasu, 8,0 g/l chlorku sodu, 0,05 g/l fosforanu sodu jednozasadowego i 1,0 g/l D-glukozy.
3. Zastąp połowę pożywki 10 μM roztworu Fluo-4 (uzyskując końcowe stężenie 5 μM).
4. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
5. Umyj komórki wstępnie podgrzanym buforem Tyrode i zastąp je pożywką przed akwizycją obrazu.
6. Rozpocznij nagrywanie za pomocą protokołu pozyskiwania strumienia.
   UWAGA: Akwizycja strumieniowa to ciągłe pobieranie obrazów bez czasu interwału. Częstotliwość dudnienia iPSC-CM wynosi około 1 Hz, a ten protokół akwizycji strumienia służy do zbierania wzorców dudnienia.

4. Akwizycja obrazu i testy funkcjonalne do testów toksyczności i przesiewowych fenotypów

1. Włącz wszystkie urządzenia systemu obrazowania o wysokiej zawartości (patrz tabela materiałów).
2. Sprawdzić, czy temperatura komory osiąga 37 °C, przy 5% dodatku CO_{2 .} Utrzymuj system w równowadze przez 2 godziny przed akwizycją obrazu.
   UWAGA: Dryft termiczny jest poważnym problemem w przypadku długoterminowych obserwacji żywych komórek, 1 °C może zmienić płaszczyznę ogniskowej o ~1 μm, więc umożliwienie obiektywowi i stolikowi osiągnięcia temperatury docelowej jest niezbędne przed akwizycją obrazu.
3. Otwórz oprogramowanie do obrazowania (patrz Tabela materiałów) i wybierz ustawienie płytki dla płytki 96-dołkowej.
4. Umieść 96-dołkową płytkę bez pokrywy w komorze i załaduj ją pierścieniem uszczelniającym żywych komórek na górze.
   UWAGA: Pierścień uszczelniający żywej komórki jest adapterem do osiągnięcia równowagi środowiskowej.
5. Wybierz soczewkę obiektywu zanurzeniowego 20x (Rysunek 1 i Rysunek 2), 60x (Rysunek 3 i Rysunek 4) i 20x (Rysunek 5) zgodnie z wymaganą rozdzielczością przestrzenną.
6. Dostosuj ostrość, aby robić wyraźne obrazy przed eksperymentalną akwizycją.
7. Wybierz losowo 3-5 regionów na studzienkę do rejestracji aktywności wapnia.
   UWAGA: Każdy region musi zawierać co najmniej 20 komórek (n ≥ 20).
8. Wybierz odpowiednie filtry dla różnych wskaźników. FITC 475/536 dla mNG-GECO, mtGCEPIA3 i Oria1-G-GECO; Cy5 631/692 dla NIR-GECO2; ER 530/593 dla ER-LAR-GECO; Czerwień teksańska 560/624 dla K-GECO.
9. Ustaw odpowiednią moc diody elektroluminescencyjnej (LED) dla każdego używanego kanału obrazowania.
   UWAGA: Podczas optymalizacji mocy diody LED do akwizycji obrazowania za pomocą stosunku sygnału (wykryta intensywność obiektu) do szumu (wykryta intensywność tła), stosunek sygnału do szumu powinien być wyższy niż 2. W tym protokole 10% mocy diody LED dla TRITC i FITC; 20% dla Cy5 było typowe.
10. Ustaw czas ekspozycji kamery na maksymalnie 40 ms (25 Hz) i czas nagrywania 30 s dla akwizycji strumienia, aby obserwować stany przejściowe wapnia zgłaszane przez sondy mNG-GECO i K-GECO wyrażane w kardiomiocytach (Rysunek 1-3 i 5). Zwiększ moc diody LED, jeśli sygnał/szum wynosi <2 przy wyższych liczbach klatek na sekundę.
11. Do stymulacji optogenetycznej (Rysunek 2 i Rysunek 3C,D), zoptymalizuj moc (zwykle 5%-10%) i częstotliwość niebieskiego światła przy 1 Hz.
    UWAGA: Ogólnie rzecz biorąc, ludzki iPSC-CM bije spontanicznie około ~ 1 Hz, a operator musi poruszać się szybciej niż tempo spontaniczne.
12. Jeśli planowane są pomiary sekwencyjne (Rysunek 3) lub rozszerzone (Rysunek 4), należy za wszelką cenę unikać fototoksyczności. Może to oznaczać zmniejszenie intensywności mocy oświetlenia i kompensację tego poprzez wydłużenie czasu naświetlania kamery, na przykład do 100 ms za pomocą protokołu poklatkowego używanego do trzykanałowej obserwacji w czasie rzeczywistym subkomórkowych sygnałów Ca²⁺ (Rysunek 4).
13. Użyj protokołu asynchronicznego dozowania do dodawania kofeiny 10 mM za pomocą automatycznego systemu mikrofluidycznego (patrz tabela materiałów) (Rysunek 4).
    UWAGA: Protokół asynchronicznego dozowania umożliwia akwizycję obrazu podczas dodawania leków, takich jak kofeina, bez przerw między obrazami.
14. Rozpocznij pozyskiwanie.

5. Preparat drobnocząsteczkowy

1. Ponownie zawiesić E4031, dofetylid i werapamil w DMSO i rozcieńczyć je buforem Tyrode. Końcowe stężenie DMSO w pożywce wynosiło 0,1% (v/v).
2. Przygotować roztwory złożone o podwójnym (tj. 2x) pożądanym stężeniu roboczym i zrównoważyć w temperaturze 37 °C przed dodaniem.
   UWAGA: Minimalizacja wahań temperatury po dodaniu pożywki jest niezbędna, ponieważ kurczliwość jest zależna od temperatury, a efekt zmiany temperatury jest szybki.
3. Ułóż związki w odpowiednim miejscu docelowym.
4. Dodać 100 μl związków o podwójnej mocy (2x) za pomocą systemu automatycznej mikroprzepływowości (patrz tabela materiałów) do studzienek i rozpocząć akwizycję po pożądanym (zwykle 15 minut) okresie inkubacji.

6. Przetwarzanie i analiza obrazowania

1. Odizoluj obszar sygnału od tła, automatycznie wykrywając funkcję impulsu nad obrotem w czasie za pomocą oprogramowania.
2. Użyj oprogramowania do analizy pików wapnia (patrz tabela materiałów), aby przeanalizować częstotliwość dudnienia (BPM), sygnał szczytowy (amplituda), czas trwania stanu przejściowego wapnia 50% (CTD50), czas przejściowy wapnia 90% (CTD90), czas narastania i czas zaniku (Rysunek 1C).
   UWAGA: W tych ustawieniach fotowybielanie było widoczne przez pierwsze 10 sekund, a następnie sygnały są stabilizowane. W ten sposób pik wapnia analizowano od 11 do 30 s. W nagraniach trzykanałowych (Rysunek 4) kontur komórki jest obramowany ręcznie w celu pomiaru zmiany intensywności.

Obserwacja spontanicznych oscylacji wapnia w mNG-GECO10 wyrażonych przez kardiomiocyty pochodzące z iPSC (iPSC-CMs) z leczeniem farmakologicznym lub bez niego jest pokazana w Rysunek 1 i Animowane wideo 1. Ślady kinetyczne uzyskane za pomocą mNG-GECO pokazują, że małocząsteczkowe inhibitory kanałów jonowych, werapamil, dofetylid i E4031, wpływały na stany przejściowe wapnia (Rysunek 1B) zgodnie z oczekiwaniami. Typowy stan przejściowy wapnia pokazany w Rysunek 1C może być analizowany przez oprogramowanie do analizy pików wapnia w celu uzyskania sygnału piku (amplituda), czasu trwania przejściowego wapnia 50% (CTD50), czasu przejściowego wapnia 90% (CTD90), czasu narastania i czasu zaniku. Werapamil, bloker wapnia typu L17, całkowicie hamuje napływ wapnia do komórek zgodnie z oczekiwaniami (Rysunek 1B). Dofetylid i E4031 są inhibitorami kanału hERG18,19,20, wymienione jako eksperymentalne leki przeciwarytmiczne klasy III. Czas rozpadu wydłuża się zarówno w przypadku stosowania dofetylidu (p < 0,05), jak i E4031 (p < 0,001) w porównaniu z grupą otrzymującą podłoże. Zaobserwowano wydłużenie CTD50 (p < 0,01) i CTD90 (p < 0,001) po leczeniu E4031 w porównaniu z samym podłożem (Tabela 1), wyniki te są zgodne z odnotowanym wpływem na odstęp QT, klinicznie istotny pomiar repolaryzacji wyznaczony na podstawie elektrokardiogramu powierzchniowego przez długi czas między początkiem załamka Q a końcem załamka T, W poprzednich badaniach12,21.

Trudnością w ocenie CTD w spontanicznie bijących komórkach jest zmienność, jaką szybkość uderzeń narzuca CTD. Jest to szczególny problem w przypadku modelu iPSC-CM, w którym każda studzienka na płytce 96-dołkowej może mieć swoją własną szybkość dudnienia, mimo że wszystkie komórki pochodzą z tej samej fiolki macierzystej. Możliwe jest narzucenie szybkości dudnienia za pomocą stymulacji optycznej lub elektrycznej. Aby ocenić odpowiedź na dawkę-odpowiedź E4031 w standardowych warunkach stymulacji, ChR2 i K-GECO7 wyrażające iPSC-CM były sterowane optycznie za pomocą impulsów światła 1 Hz 470 nm i obserwowane za pomocą czerwonego sygnału K-GECO (Rysunek 2A i rysunek uzupełniający 1). Postępujące zmniejszanie amplitudy piku (p < 0,01) i wzrost czasu rozpadu (p < 0,05) stanów przejściowych wapnia występuje wraz ze wzrostem stężenia E4031 (Rysunek 2B1). Zależny od dawki efekt E4031 był najbardziej widoczny w przypadku zmniejszenia amplitudy piku (Rysunek 2B1, B2).

Chociaż krótkoterminowe badania trwające kilka minut są zazwyczaj używane do oceny kardiotoksyczności, istnieje martwe miejsce dla ocen toksyczności przewlekłej, które pokrywają się z ekspozycją pacjenta na leki przez tygodnie, miesiące lub lata. Korzystne byłoby zbadanie wpływu choroby lub toksyczności na przedziały czasowe odzwierciedlające czas trwania leczenia istotny dla praktyki klinicznej. Wykorzystaliśmy nasz w pełni optyczny system kontroli i detekcji do zbadania kardiomiocytów pochodzących z iPSC od pacjenta z niezagęszczeniem lewej komory (LVNC). iPSC-CM transdukowano za pomocą zestawu wirusowego K-GECO (kroki 2.2-2.6) po różnicowaniu w 25. dniu. Sygnał K-GECO był następnie śledzony co 1-2 tygodnie w tych samych odwiertach, z dodatkowymi terapiami farmakologicznymi lub bez nich. Zarówno spontaniczna aktywność wapnia (Rysunek 3A,3B), jak i dynamika wapnia w stymulacji optycznej (Rysunek 3C, D, krok 4.11) uzyskano przy użyciu systemu obrazowania o wysokiej zawartości (kroki 4.1-4.12) i przetworzono za pomocą oprogramowania do analizy piku wapnia (krok 6). Jak wykazano w Rysunek 3A,C, przezroczyste stany przejściowe wapnia pozostają widoczne miesiąc po transdukcji wirusa, z dodatkowym światłem używanym do stymulacji optycznej lub bez niego. W ramach tej pracy zidentyfikowano lek, który wydaje się zwiększać częstość uderzeń, regulować odstęp między skurczami i zwiększać przejściową amplitudę wapnia w modelu LVNC iPSC-CM (Rysunek 3A,B). Na podstawie tych danych należy wyciągnąć dwie ważne obserwacje. Po pierwsze, z perspektywy terapeutycznej, efekt leku wydaje się trwały w punktach czasowych 63 i 70 dnia. Po drugie, i ma to znaczenie dla dziedziny, w której na ogół bada się skumulowane skutki w krótkich oknach (<1 min) we wcześniejszych punktach czasowych (zwykle <50 dni); Modyfikujące fenotyp choroby efekty związku są widoczne dopiero po 60 dniu, co sugeruje, że może być łatwo zdyskontować leki, które mają powolne mechanizmy działania w standardowych protokołach badań przesiewowych.

Zmienność częstotliwości dudnień i wynikający z niej wpływ na czas trwania przejściowego wapnia, nie jest tylko problemem między studniami w danym momencie. Zmienia się również, gdy iPSC-CM są utrzymywane w kulturze, która zmienia się w czasie (Rysunek 3B). Aby narzucić spójność w sekwencyjnych eksperymentach, stymulacja optyczna 1 Hz może być stosowana z leczeniem farmakologicznym lub bez niego (Rysunek 3C,D). Tutaj, chociaż wyniki z dnia 63 pokazują zachęcające trendy w przejściowym wapniu o znacznie wyższej amplitudzie, krótszym CTD90 i krótszym czasie rozpadu; w ciągu 70 dni - i wskazując na potrzebę przewlekłej oceny podczas procesu badań przesiewowych leków w kierunku chorób rzadkich - wcześnie po wykryciu depolaryzacji (EAD). Wartość dodania protokołu stymulacji do fenotypowania choroby lub oceny małych cząsteczek można ocenić jakościowo, porównując wyniki przedstawione w Rysunek 3B,D dla szybkości dudnienia, amplitudy przejściowej wapnia, CTD90 i czasu rozpadu.

Zaletą GECI, w porównaniu do barwnika chemicznego, jest metodologia wizualizacji przejściowego wapnia jest możliwość ograniczenia sondy do określonego przedziału w komórce. Można to dodatkowo rozszerzyć, multipleksując wiele wariantów kolorów i/lub powinowactwa w pojedynczych komórkach. W związku z tym kilka GECI, w tym ER-LAR-GECO9, mtGCEPIA22,23 (lub Oria1-G-GECO) i NIR-GECO28,24 zostały opracowane do ekspresji pojedynczo lub w połączeniu w modelach komórkowych do pomiaru aktywności wapnia w czasie rzeczywistym powstającej odpowiednio w retikulum endoplazmatycznym / retikulum sarkoplazmatycznym (ER/SR), mitochondriach (lub kanale CRAC) i cytozolu. Można je łączyć w modelu iPSC-CM (Rysunek 4A,C) w celu zbadania interakcji między różnymi wewnątrzkomórkowymi magazynami wapnia. Na przykład 10 mM kofeiny można zastosować do opróżnienia zapasu wapnia SR. W tym przypadku spadek sygnału ER-LAR-GECO (wskazujący na utratę wapnia z SR) zbiegł się ze spadkiem sygnału NIR-GECO (wskazującym na wzrost stężenia wapnia w cytozolu) zgodnie z oczekiwaniami. To, w jaki sposób te wahania wpływają na inne przedziały wewnątrzkomórkowe, nie jest dobrze zbadane. Mimo to, włączenie zielonego mtGCEPIA3 ukierunkowanego na mitochondria pokazuje, że wychwyt wapnia zachodzi w mitochondriach w tych warunkach (Figura 4A,B).

Podobnie, wizualizację wzajemnych zależności między różnymi prądami wapnia można zobaczyć poprzez dołączenie sondy, Orai1-G-GECO25, aby ujawnić kanał Ca2+ aktywowany uwalnianiem wapnia (CRAC) (Rysunek 4C,D). W modelu iPSC-CM sygnał ten wzrasta wraz ze spontanicznym cytozolowym stanem przejściowym wapnia (Rysunek 4D1,D2). W związku z tym, leczenie kofeiną wywołuje duży przejściowy poziom wapnia zarówno w cytozolu, jak i z kanału Orai1.

Uznaje się, że większość przejściowych obrazowań wapnia w modelach kardiomiocytów została określona za pomocą barwników wapniowych26. Genetycznie zakodowany wskaźnik wapnia porównano z barwnikiem chemicznym w modelu kardiomiocytów pochodzącym z iPSC, aby umożliwić porównanie obok siebie różnych podejść do obrazowania wapnia. Ekspresję iPSC-CM K-GECO zobrazowano wraz z komórkami obciążonymi Fluo-4. Kardiomiocyty wykazujące ekspresję K-GECO wykazywały spójne zachowanie bicia w czasie (Rysunek 5A, C). Jednak obciążenie Fluo-4 wpłynęło zarówno na częstotliwość dudnień, jak i CTD w tym modelu (Rysunek 5B,C), co sugeruje, że sam Fluo-4 może wpływać na wyniki takich eksperymentów. Będzie to szczególnie ważne po długotrwałej ekspozycji na sondę obrazującą, co może wystąpić w formacie obrazowania wielościennego, jeśli obrazowanie well-by-well odbywa się z minutowym czasem przebywania na studzience.

Rysunek 1: Małocząsteczkowe inhibitory kanałów jonowych zastosowane do kardiomiocytów pochodzących z iPSC. (A-B) Zdjęcia poklatkowe iPSC-CM wyrażające mNG-GECO wykonane przy 25 Hz. Pasek skali = 50 μm. (B) Reprezentatywne oscylacje Ca2+ po dodaniu związku. Sygnały fluorescencyjne uzyskane z komórek wykazujących ekspresję mNG-GECO są przedstawiane jako stosunek fluorescencji F/F0, gdzie F0 definiuje się jako intensywność podstawową, a F jako intensywność wykrywaną w każdym punkcie czasowym. (C) Oprogramowanie do analizy piku wapnia może wyodrębnić parametry, w tym połowę maksymalnej szerokości (CTD50), 90% czas trwania stanu nieustalonego (CTD 90), czas narastania i czas zaniku. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Przykład dawka-odpowiedź z użyciem inhibitora hERG E4031 w optycznym systemie stymulacji. (A) Ślady stymulacji optycznej 10% niebieskim światłem w różnych stężeniach E4031. Obrazy poklatkowe kardiomiocytów pochodzących z iPSC wykazujących ekspresję K-GECO wykonane przy 25 Hz. (B1) Reprezentatywne ślady stanów przejściowych wapnia uzyskane przy różnych dawkach złożonych. Analiza piku i dawka-odpowiedź E4031 w amplitudzie (B2) i czasie rozpadu (B3). Niebieskie paski wskazują stymulację światłem pulsacyjnym 1 Hz 470 nm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Całkowicie optyczna platforma stosowana do długoterminowego badania fenotypowego leków w kardiomiocytach pochodzących od pacjentów LVNC. (A) Reprezentatywny ślad spontanicznej aktywności dudnienia w kardiomiocytach pochodzących od pacjenta (po różnicowaniu Dzień 70) z (czerwonym) lub bez (niebieskim) leczeniem farmakologicznym 5 μM. (B) Analiza pików spontanicznej aktywności dudnienia z leczeniem farmakologicznym 5 μM lub bez niego. (C) Ślady intensywności odpowiedzi na lek w stymulacji optycznej iPSC-CM pochodzącej od pacjenta przy 1 Hz. (D) Analiza pików kardiomiocytów pochodzących od pacjenta ze stymulacją optyczną 1 Hz. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Trójkanałowe subkomórkowe obrazowanie Ca2+ w modelu iPSC-CM. (A-B) iPSC-CM były transdukowane za pomocą subkomórkowych sond wapniowych dla cytoplazmy, NIR-GECO2 (czerwony), retikulum endoplazmatycznego ER-LAR-GECO (żółty) i mtGCEPIA3 (cyjan), mitochondrialny wskaźnik Ca2+. (B) Trójkanałowe obrazowanie poklatkowe wapnia przed i po leczeniu 10 mM kofeiną. (C-D) Uwidoczniono iPSC-CM transdukowane cytoplazmatycznymi, NIR-GECO2 (czerwonymi), retikulum endoplazmatycznym ER-LAR-GECO (żółty) i wskaźnikami kanału CRAC Orai1-G-GECO (cyjan). (D) Wykonano trzykanałowe poklatkowe obrazowanie wapnia. (D1) Spontaniczną aktywność między uderzeniami obserwowano w przypadku NIR-GECO2 i Orai1-G-GECO. (D2) Odpływ wapnia z ER (spadek sygnału ER-LAR-GECO) towarzyszył wzrostowi cytozolowego sygnału wapniowego po leczeniu kofeiną. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Porównanie genetycznie kodowanego wskaźnika wapnia (K-GECO) z chemicznym barwnikiem wrażliwym na wapń (Fluo-4) w iPSC-CMs. (A-B) Reprezentatywne ślady wapnia K-GECO (A) i Fluo-4 (B) są prezentowane w czasie. (C) Analiza stanów nieustalonych wapnia transdukowanej K-GECO lub iPSC-CM załadowanej fluo-4. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1: Wpływ dodatku związków na przejściowe parametry wapnia w modelu iPSC-CM. Wartości istotności są oznaczone symbolami *(p ≤ 0,05), **(p < 0,01) i ***(p < 0,001).

Animowany film 1: Spontaniczna aktywność wapnia została zaobserwowana przez mNG-GECO w kardiomiocytach pochodzących z iPSC tylko z nośnikiem. Dostępny jest pseudokolorowy film z obrazem w skali szarości. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Rysunek uzupełniający 1: Schematyczne przedstawienie wektora adenowirusowego. Obejmuje to rodopsynę kanałową ChR2 jako aktywator oraz czerwony fluorescencyjny wskaźnik wapnia K-GECO jako reporter wapnia do całkowicie optycznego testu. Światłoczuły kanał jonowy umożliwia depolaryzację pobudliwych komórek przez światło w niebiesko-zielonym zakresie widma widzialnego. W eksperymentach tych użyto światła o długości fali 470 nm. Przejściowe stany nieustalone wapnia w pobudliwych komórkach mogą być jednocześnie obrazowane przez K-GECO, który wymaga zielonego światła wzbudzenia, wytwarzając czerwone emisje. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

LumiSTAR złożył wniosek o ochronę patentową stosowania K-GECO, NIR-GECO i LAR-GECO.