Wczesny rozwój zależy od produktów dziedziczonych po matce, a rola wielu z tych produktów jest obecnie nieznana. W tym miejscu opisaliśmy protokół, który wykorzystuje CRISPR-Cas9 do identyfikacji fenotypów efektu matczynego w jednym pokoleniu.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Określanie roli genów ulegających ekspresji matki we wczesnym rozwoju za pomocą matczynych chrupek
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Wczesny rozwój zależy od puli czynników matczynych włączonych do dojrzałego oocytu podczas oogenezy, które spełniają wszystkie funkcje komórkowe niezbędne do rozwoju, aż do aktywacji genomu zygotycznego. Zazwyczaj genetyczne ukierunkowanie tych czynników matczynych wymaga dodatkowego pokolenia w celu zidentyfikowania fenotypów efektu matczynego, co utrudnia określenie roli genów o ekspresji matczynej podczas rozwoju. Odkrycie możliwości edycji biallelicznej CRISPR-Cas9 umożliwiło badania przesiewowe fenotypów embrionalnych w tkankach somatycznych wstrzykniętych zarodków lub "crispantów", pogłębiając zrozumienie roli, jaką geny wyrażane zygotycznie odgrywają w programach rozwojowych. W tym artykule opisano protokół, który jest rozszerzeniem metody crispant. W tej metodzie bialleliczny montaż komórek rozrodczych pozwala na wyizolowanie fenotypu efektu matczynego w jednym pokoleniu, czyli "matczynych chrupania". Multipleksowanie prowadzących RNA do jednego celu sprzyja wydajnej produkcji matczynych chrupków, podczas gdy analiza sekwencji matczynych chrupiących haploidów zapewnia prostą metodę potwierdzania zmian genetycznych, które wytwarzają fenotyp efektu matczynego. Stosowanie matczynych chrupek wspomaga szybką identyfikację niezbędnych genów ulegających ekspresji matczynej, ułatwiając w ten sposób zrozumienie wczesnego rozwoju.
Wprowadzenie
Pula produktów zdeponowanych przez matkę (np. RNA, białka i inne biomolekuły) jest niezbędna dla wszystkich wczesnych procesów komórkowych, dopóki nie zostanie aktywowany genom zygotyczny zarodka1. Przedwczesne wyczerpanie tych produktów z oocytu jest zazwyczaj śmiertelne dla zarodka. Pomimo znaczenia tych genów w rozwoju, rola wielu genów ulegających ekspresji matczynej jest obecnie nieznana. Postęp w technologii edycji genów u danio pręgowanego, taki jak CRISPR-Cas9, umożliwia celowanie w geny o ekspresji matczynej2,3,4. Jednak identyfikacja fenotypu efektu matczynego wymaga dodatkowego pokolenia w porównaniu z fenotypem zygotycznym, a zatem wymaga więcej zasobów. Ostatnio zdolność edycji biallelicznej CRISPR-Cas9 została wykorzystana do badań przesiewowych pod kątem fenotypów embrionalnych w tkankach somatycznych wstrzykniętych zarodków (F0), znanych jako "crispants"5,6,7,8,9,10. Technika crispant pozwala na zasobooszczędne badania przesiewowe genów kandydujących w komórkach somatycznych, ułatwiając zrozumienie konkretnych aspektów rozwoju. Protokół opisany w tym artykule pozwala na identyfikację fenotypów efektu matczynego, czyli "matczynych chrupków", w jednym pokoleniu11. Schemat ten można osiągnąć poprzez multipleksowanie przewodnikowych RNA do jednego genu i promowanie zdarzeń edycji biallelicznej w linii zarodkowej. Te matczyne zarodki chrupiące mogą być identyfikowane na podstawie ogólnych fenotypów morfologicznych i poddawane podstawowej charakterystyce, takiej jak etykietowanie granic komórkowych i wzorcowanie DNA11. Połączona analiza obserwowalnego fenotypu i podstawowa charakterystyka molekularna indukowanych INDELs pozwala na przewidzenie roli docelowego genu we wczesnym rozwoju.
U danio pręgowanego, podczas pierwszych 24 godzin po zapłodnieniu (hpf), niewielka grupa komórek przekształca się w pierwotne komórki rozrodcze, prekursor linii zarodkowej12,13,14,15. W lęgach złożonych przez samice F0 odsetek odzyskanych matczynych zarodków chrupkujących zależy od tego, ile komórek rozrodczych zawiera zdarzenie edycji biallelicznej w docelowym genie. Ogólnie rzecz biorąc, im wcześniej dojdzie do edycji zarodka, tym większe prawdopodobieństwo zaobserwowania mutacji CRISPR-Cas9 w linii zarodkowej. W większości przypadków fenotypy matczynych zarodków chrupkujących wynikają z utraty funkcji dwóch matczynych alleli obecnych w rozwijającym się oocycie. Gdy oocyt kończy mejozę, jeden z matczynych alleli jest wytłaczany z zarodka przez ciało biegunowe, podczas gdy drugi allel zostaje włączony do matczynego przedjądrza. Sekwencjonowanie wielu matczynych haploidów chrupkujących będzie reprezentować mieszaninę mutacji (insercji i/lub delecji (INDEL)) obecnych w linii zarodkowej, które przyczyniają się do fenotypu11.
Poniższy protokół opisuje niezbędne kroki do stworzenia mutacji CRISPR-Cas9 w genach efektu matczynego i zidentyfikowania odpowiadającego im fenotypu przy użyciu metody matczynego crispantu (Rysunek 1). Sekcja pierwsza wyjaśni, jak skutecznie projektować i tworzyć przewodnikowe RNA, podczas gdy sekcje druga i trzecia zawierają kluczowe etapy tworzenia matczynych chrupek za pomocą mikroiniekcji. Po wstrzyknięciu mieszaniny CRISPR-Cas9 wstrzyknięte zarodki są badane pod kątem zmian somatycznych metodą PCR (sekcja czwarta). Gdy wstrzyknięte zarodki F0 rozwiną się i osiągną dojrzałość płciową, samice F0 są krzyżowane z samcami typu dzikiego, a ich potomstwo jest badane pod kątem fenotypów efektu matczynego (sekcja piąta). Sekcja szósta zawiera instrukcje dotyczące wytwarzania matczynych chrupiących haploidów, które można połączyć z sekwencjonowaniem Sangera w celu identyfikacji INDELs indukowanych przez CRISPR-Cas9. Ponadto Dyskusja zawiera modyfikacje, które można wprowadzić do protokołu, aby zwiększyć czułość i moc tej metody.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
W badaniach prowadzących do opracowania tego protokołu, wszystkie hodowle danio pręgowanych i eksperymenty zostały zatwierdzone przez University of Wisconsin-Madison Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC-M005268-R2).
1. Synteza przewodnikowych RNA
UWAGA: Zygotyczne chipsanty zostały stworzone przy użyciu pojedynczego przewodnika RNA lub multipleksowania wielu przewodników RNA do jednego celu5,6,7,8,9,10. Multipleksowanie przewodnikowych RNA zwiększa odsetek zarodków wykazujących fenotyp zygotyczny chrupiący10. Ze względu na zwiększoną częstotliwość zarodków wykazujących fenotyp, matczyne chrupki są tworzone przez multipleksowanie czterech przewodnikowych RNA do jednego genu. Bardziej szczegółowy protokół dotyczący wykorzystania CHOPCHOP do projektowania przewodnikowych RNA oraz metody wyżarzania do syntezy przewodnikowych RNA dla danio pręgowanego można znaleźć gdzie indziej16,17,18,19,20.
- Aby zidentyfikować gen o ekspresji matczynej, który ma być celem, ustal poziomy transkryptu mRNA podczas rozwoju za pomocą bazy danych sekwencji RNA, która dostarcza informacji transkryptomu od zygoty do 5 dni21. Ogólnie rzecz biorąc, geny specyficzne dla matki są silnie eksprymowane we wczesnym zarodku i ulegają degradacji po aktywacji genomu zygotycznego22.
- Po zidentyfikowaniu genu docelowego wykazującego ekspresję matczyną, określ pierwszą przewidywaną domenę białkową, korzystając z sekcji "domeny i cechy" dostępnej w przeglądarce genomu Ensembl23. Użyj tej domeny jako regionu docelowego dla czterech przewodnikowych RNA.
- Użyj programu do selekcji przewodnika RNA CHOPCHOP, aby zidentyfikować cztery docelowe miejsca przewodnika RNA w pierwszej domenie aktywnej. Zaprojektuj oligonukleotydy specyficzne dla genu, jak pokazano poniżej dla każdego miejsca docelowego. W oligonukleotydzie specyficznym dla genu sekcja N20 odpowiada sekwencji docelowej pomniejszonej o miejsce PAM (NGG) z CHOPCHOP. Zamów te specyficzne dla genu oligonukleotydy i stały oligonukleotyd za pomocą standardowego oczyszczania odsalającego (patrz tabela materiałów).
Oligonukleotyd specyficzny dla genu:
5' TAATACGACTCACTATA- N20 -GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG 3' - Aby utworzyć szablon przewodnika RNA dla każdego oligonukleotydu specyficznego dla genu, wyżarzaj go do stałego oligonukleotydu i wypełnij zwisy polimerazą T4-DNA, jak opisano wcześniej16. Po złożeniu czterech szablonów prowadzącego RNA, oczyść je i skoncentruj razem za pomocą zestawu do oczyszczania i koncentratora DNA zgodnie z instrukcjami producenta (patrz Tabela materiałów).
- Zsyntetyzuj mieszaninę sgRNA z puli szablonu przewodnika RNA za pomocą zestawu do transkrypcji T7 in vitro (patrz tabela materiałów). Wykonaj transkrypcję in vitro zgodnie z instrukcjami producenta. Użycie reakcji połówkowych zestawu do transkrypcji T7 może obniżyć koszt reakcji.
- Po syntezie RNA oczyść powstałą pulę sgRNA za pomocą protokołu etanolu/octanu amonu, jak opisano wcześniej16,20,24. Po wyizolowaniu RNA należy go ponownie zawiesić w 20 μl wody wolnej od nukleaz. Jeśli do transkrypcji puli sgRNA użyto reakcji połówkowych zestawu transkrypcyjnego T7, oczyszczone RNA należy ponownie zawiesić w 10-15 μl wody wolnej od nukleaz.
- Określ ilościowo ilość połączonych sgRNA, które zostały utworzone za pomocą spektrofotometru. Rozcieńczyć pulę sgRNA w wodzie wolnej od nukleaz do rozcieńczenia 1500 ng/μL ± 500 ng/μL. Zazwyczaj końcowa objętość roboczego rozcieńczenia waha się od 30-50 μL.
- Po określeniu stężenia puli sgRNA sprawdź integralność sgRNA na 1% żelu agarozowym.
- Odleć 1% agarozy/0,5 μg/ml bromku etydyny/żelu TBE. Gdy żel zastygnie, umieść go w buforze do pracy TBE.
- Zmieszać 1 μl mieszaniny sgRNA i 1 μl buforu ładującego żel RNA (patrz tabela materiałów). Załaduj tę próbkę do żelu i uruchom żel pod napięciem 100 V przez 5 minut.
- Wizualizuj pasma za pomocą światła ultrafioletowego (UV). Pula sgRNA powinna pojawić się jako pojedyncze pasmo. Jeśli zaobserwuje się rozmaz, prawdopodobnie nastąpiła degradacja RNA.
- Przechowuj pulę sgRNA w jednorazowych podwielokrotnościach o pojemności 1 μl w probówkach paskowych do PCR bez nukleaz w zamrażarce o temperaturze -80 °C. W przypadku dużych objętości mieszaniny sgRNA (30 μl lub więcej), podwielokrotną połowę objętości należy przelać do probówek paskowych do PCR bez nukleaz, a drugą połowę przechowywać jako większą objętość w probówce mikrowirówkowej bez nukleaz. Rozmrozić i poddzielić w razie potrzeby.
- Aby zapobiec degradacji RNA, należy upewnić się, że próbki w probówce mikrowirówki przechodzą nie więcej niż dwa cykle zamrażania i rozmrażania.
2. Przygotowanie odczynników i materiałów do mikroiniekcji
UWAGA: U danio pręgowanego wstrzyknięcie mRNA Cas9 może wytworzyć zygotyczne chrupki. Jednak badania wykazały, że białko Cas9 jest bardziej wydajne w tworzeniu INDEL w wstrzykiwanych zarodkach16,25. Protokół ten wykorzystuje białko Cas9 do generowania matczynych chrupków, ponieważ białko to nie doświadcza takiego samego opóźnienia w aktywności, jak wstrzyknięte mRNA Cas9. Teoretycznie powinno to zwiększyć prawdopodobieństwo mutacji biallelicznej na wczesnym etapie rozwoju, co skutkuje zwiększonym prawdopodobieństwem wpływu na bardziej rozległy odcinek linii zarodkowej. Inne protokoły i zasoby szczegółowo opisujące, jak przygotować się do mikroiniekcji, można znaleźć gdzie indziej24,26.
- Kup lub wygeneruj białko Cas9 (patrz Tabela materiałów). Ponownie zawiesić białko Cas9 w wodzie wolnej od nukleaz, aby uzyskać roztwór o stężeniu 2 mg/ml i podwielokrotność 1 μl do probówek do mikrowirówek polipropylenowych wolnych od RNaz. Przechowuj je jako jednorazowe probówki w temperaturze -80 °C.
- Po południu przed wstrzyknięciem należy za pomocą ściągacza do mikropipet pobrać szklaną kapilarnę i utworzyć igłę do wstrzykiwań. Przechowywać nieprzerwaną igłę w dołączonym uchwycie na igłę do rana w przypadku mikrowstrzyknięć.
- Aby utworzyć płytkę do wstrzykiwań, wlej 20 ml 1,5% agarozy/sterylnegoH2O, aby wypełnić połowę szalki Petriego o wymiarach 100 mm x 15 mm i poczekaj, aż stwardnieje. Po związaniu roztworu agarozy dodaj 20 ml 1,5% agarozy/sterylnegoH2Odo szalki Petriego i umieść plastikową formę (patrz Tabela materiałów) w płynnej agarozie i pozwól jej stwardnieć.
- Po stwardnieniu agarozy wyjmij plastikową formę i przechowuj płytkę wtryskową do góry nogami w lodówce do rana w dniu wstrzyknięcia. Pojedyncza płytka może być używana do wielu iniekcji, o ile studzienki zachowują swoją integralność.
3. Mikroiniekcja koktajlu CRISPR-Cas9 do jednokomórkowego zarodka danio pręgowanego w celu wytworzenia matczynych chrupków
UWAGA: Więcej materiałów na temat mikroiniekcji do zarodków danio pręgowanego można znaleźć gdzie indziej24,26,27. Wstrzyknięcie mieszaniny CRISPR-Cas9 do rozwijającego się blastodysku jednokomórkowych zarodków może zwiększyć prawdopodobieństwo wytworzenia matczynych chrupków. Mieszaninę można również wstrzykiwać do woreczka żółtkowego do stadium 2-komórkowego. Jednak mieszaniny wstrzykiwane do żółtka zależą od strumienia ooplazmy, aby dotrzeć do blastodysku, więc CRISPR-Cas9 wstrzyknięty do żółtka może zmniejszyć wydajność cięcia CRISPR-Cas928.
- Po południu przed mikroiniekcjami ustaw krzyżówki typu dzikiego w pudełkach godowych danio pręgowanego. Trzymaj zarówno samca, jak i samicę w tym samym zbiorniku, ale oddziel je przegrodą w pudełku godowym lub umieść samicę we wkładce do składania jaj.
- Rano w dniu eksperymentu wyjmij jedną porcję białka Cas9 o stężeniu 2 mg/ml i jedną porcję z puli sgRNA. W probówce mikrowirówki polipropylenowej bez RNaz, która zawiera białko Cas9, zbierz mieszaninę iniekcyjną o pojemności 5 μl, która zawiera pulę sgRNA, 1 μl 0,5% roztworu czerwieni fenolowej i wodę wolną od nukleaz. Dążyć do końcowego stężenia 400 ng/μl białka Cas9 i 200 ng/μL połączonych sgRNA w wodzie wolnej od RNaz lub stosunku 2:1 białka Cas9 do sgRNA w wstrzykniętym zarodku. Ta mieszanina do wstrzykiwań może być przechowywana na lodzie do rana w dniu wstrzyknięcia.
- Wyjąć płytkę wtryskową z lodówki i pozostawić ją do ogrzania do temperatury pokojowej (RT) przez co najmniej 20 minut.
- Po złożeniu koktajlu do wstrzykiwań należy pozwolić samcowi i samicy na kojarzenie się w pary, np. poprzez usunięcie przegrody w pudełku do krycia lub umieszczenie samca w tej samej wkładce do składania jaj co samica, w zależności od przypadku.
- Po złożeniu jaj przez ryby, ale przed zebraniem zarodków, należy odciąć końcówkę nieprzerwanej igły za pomocą nowej żyletki lub cienkich kleszczyków, aby utworzyć igłę, która ma otwór wystarczająco mały, aby uniknąć uszkodzenia zarodka, ale jest wystarczająco szeroka, aby nie została zatkana mieszanką do wstrzykiwań. Po przecięciu igły należy naładować igłę mieszaniną iniekcyjną za pomocą końcówki pipety do mikroładowarki umieszczonej w tylnej części kapilary (patrz tabele materiałów).
- Po napełnieniu igły inkubuj igłę przez 5 minut w temperaturze pokojowej w celu złożenia kompleksów Cas9-sgRNA.
- Włączyć mikrowstrzykiwacz i włożyć igłę do mikromanipulatora. Umieścić kroplę oleju mineralnego na szkiełku mikrometrycznym i skalibrować igłę, regulując ciśnienie wstrzykiwania, aż igła wyrzuci bolus o wartości 1 nL do oleju mineralnego.
UWAGA: Podczas wstrzykiwania do oleju mineralnego bolus o pojemności 1 nl będzie miał średnicę około 0,125 mm (lub promień 0,062 mm), mierzoną za pomocą szkiełka mikrometrycznego. - Aby zsynchronizować zarodki, zbierz je po 10 minutach za pomocą plastikowego sitka i przepłucz na szalkę Petriego za pomocą 1x pożywki E3 (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mMMgSO4 i dodaj 20 μL 0,03 M błękitu metylenowego na 1 l 1x E3). Usunąć 10-15 zarodków i umieścić je na oddzielnej szalce Petriego, aby zachować je jako niewstrzyknięte grupy kontrolne.
- Resztę rozwijających się zarodków przenieść do dołków płytki iniekcyjnej.
- Wstrzyknąć 1 nl roztworu (w sumie 400 pg białka Cas9 i 200 pg sgRNA) do rozwijającego się blastodysku zarodka jednokomórkowego. Jeśli końcówka igły zostanie zatkana, użyj kleszczyków, aby odłamać końcówkę z powrotem i ponownie skalibrować igłę, aby wysunąć bolus o pojemności 1 nL. Upewnij się, że wszystkie zarodki zostały wstrzyknięte w ciągu pierwszych 40 minut rozwoju po zapłodnieniu.
- Po zakończeniu wstrzyknięcia należy umieścić wstrzyknięte zarodki z powrotem na oznakowanej szalce Petriego, która zawiera 1x pożywkę E3 i pozwolić im rozwijać się przez cały dzień. Usuń wszystkie zarodki, które są niezapłodnione lub nie rozwijają się normalnie zgodnie z serią oceny stopnia zaawansowania danio pręgowanego29.
4. Badania przesiewowe w kierunku somatycznych INDELs w zarodkach z wstrzyknięciem F0
UWAGA: Inne metody identyfikacji INDEL, takie jak test endonukleazy T7 I lub analiza topnienia w wysokiej rozdzielczości, mogą być używane przy określaniu, czy zarodki zawierają somatyczne INDELs 30.
- Następnego dnia po wstrzyknięciu należy usunąć wadliwe i zlizowane zarodki z szalki Petriego i zastąpić pożywkę 1x E3, aby utrzymać zdrowie zarodka.
- Po oczyszczeniu naczynia należy pobrać sześć zdrowych zarodków, którym wstrzyknięto zarodki i dwa zarodki kontrolne z niewstrzykniętej płytki. Umieść każdy zarodek indywidualnie w jednym dołku probówki paskowej do PCR i oznacz górną część probówek.
- Aby wyekstrahować genomowe DNA poszczególnych zarodków, należy usunąć nadmiar pożywki E3 z dołków probówki paskowej i dodać 100 μl 50 mM NaOH na studzienkę.
- Inkubować zarodki w temperaturze 95 °C przez 20 minut. Następnie schłodzić próbki do temperatury 4 °C, dodać 10 μl 1 M Tris HCL (pH 7,5) i wirować je przez 5 do 10 s. Wyekstrahowane DNA może być przechowywane w temperaturze -20 °C przez co najmniej 6 miesięcy bez znaczącej degradacji DNA.
- Zaprojektuj unikalne startery przesiewowe dla każdego miejsca prowadzącego, aby amplifikować fragment DNA o długości 100-110 pz, który zawiera miejsce docelowe CRISPR-Cas9. Jeśli to możliwe, umieść miejsce docelowe w środku amplifikowanego fragmentu, co pozwoli na identyfikację większych delecji.
- Dla każdego z czterech docelowych miejsc przewodnich należy ustawić osiem reakcji PCR o pojemności 25 μl, używając 5 μl przygotowanego genomowego DNA pojedynczego zarodka, mieszanki PCR i starterów przesiewowych specyficznych dla przewodnika w celu identyfikacji mutacji somatycznych w miejscu docelowym (Tabela 1).
- Odlewać 2,5% agarozy/0,5 μg/ml bromku etydyny/żelu TBE za pomocą grzebieni, które tworzą studzienki o szerokości około 0,625 cm. Ten szeroki grzebień pozwala na lepszą rozdzielczość podczas wykrywania zmian wielkości sekwencji genomowej. Po zestaleniu się żelu należy go umieścić w komorze elektroforetycznej, która zawiera bufor do pracy TBE.
- Dodać 5 μl barwnika 6x ładującego do produktu PCR i załadować 25 μl tej mieszaniny do żelu. Upewnij się, że wstrzyknięta i kontrolna próbka znajdują się w tym samym rzędzie żelu. Po załadowaniu wszystkich próbek dodać 5 μl bromku etydyny na 1 l buforu do pracy TBE do dodatniego końca pudełka żelowego.
- Uruchom żel pod napięciem 120 V, aż prążki DNA rozwiążą się lub DNA zbliży się do końca pasa. Jeśli Cas9 wytworzył INDELs w miejscu docelowym, rozmaz jest zwykle obserwowany w wstrzykniętych próbkach, ale nie w kontrolach.
- Jeśli rozmazy zostaną zaobserwowane w co najmniej trzech z czterech miejsc prowadzenia w zarodkach, którym wstrzyknięto cztery prowadzące RNA, wyhoduj zarodki, którym wstrzyknięto rodzeństwo.
- Za każdym razem, gdy wstrzyknięte próbki nie zawierają rozmazów w wymaganej liczbie miejsc przewodnika, zaprojektuj nowe przewodniki RNA, aby zastąpić te, które nie działały, i utwórz nową pulę przewodników RNA, która obejmuje te, które działały i nowo zaprojektowane. Wstrzyknąć i przetestować nową pulę dla somatycznych INDEL, jak opisano powyżej.
5. Identyfikacja fenotypów efektu matczynego w zarodkach matki chrupiących
UWAGA: Gdy wstrzyknięte samice F0 osiągną dojrzałość płciową, ich komórki linii rozrodczej mają potencjał do wytworzenia mieszanki matczynych zarodków chrupiących i dzikich zarodków. Mimo że ta mieszanka pozwala na wewnętrzną kontrolę zapłodnienia i czasu rozwoju, nadal korzystne jest ustawienie krzyżówki typu dzikiego jako kontroli zewnętrznej w przypadku, gdy lęg samicy F0 zawiera tylko matczyne zarodki chrupiące.
- Po południu przed eksperymentem należy ustawić wstrzyknięte samice F0 przeciwko samcom typu dzikiego i kontrolować krzyżówki typu dzikiego w standardowych skrzynkach godowych danio pręgowanego. Umieść zarówno samca, jak i samicę w tym samym zbiorniku, ale oddziel je przegrodą do krycia lub umieść samicę we wkładce do składania jaj.
- Rankiem w dniu eksperymentu pozwól samcowi i samicy rozpocząć krycie, np. usuwając przegrodę z pudełka godowego lub umieszczając samca w tej samej wkładce do składania jaj co samica.
- Zbieraj zarodki co 10 minut, przenosząc wkładkę do składania jaj do nowego dna zbiornika godowego, który zawiera świeżą wodę systemową i oznacz zbiornik znacznikiem identyfikującym pojedynczą samicę F0. Weź stary zbiornik godowy i przelej wodę przez sitko do herbaty, aby zebrać zarodki z jednego pojedynczego 10-minutowego lęgu.
- Po zebraniu zarodków z pojedynczego 10-minutowego lęgu w sitku, przenieś je na szalkę Petriego zawierającą 1x pożywkę E3. Oznaczyć szalkę Petriego datą pobrania i informacjami o rybach.
- Pod mikroskopem preparacyjnym ze źródłem światła przechodzącego obserwuj zarodki w trakcie rozwoju co godzinę przez pierwsze 6-8 godzin i codziennie przez kolejne 5 dni.
- Zidentyfikuj potencjalne matczyne zarodki chrupiące na podstawie poważnych zmian morfologicznych w ich rozwoju w porównaniu z dopasowanymi w czasie kontrolami typu dzikiego29.
- Przenieś potencjalne matczyne zarodki chrupiące na szalkę Petriego, która zawiera 1x pożywkę E3 i test na fenotyp morfologiczny przy 24 hpf i żywotności (np. Nadęcie pęcherza pławnego) po 5 dniach od zapłodnienia.
6. Sekwencjonowanie alleli u matczynych chrupiących haploidów
UWAGA: Matczyne haploidy zawierają pojedynczy allel w docelowym locus, co pozwala na identyfikację INDEL w docelowym genie za pomocą sekwencjonowania Sangera. Zarodki matczynych chrupiących haploidów można również analizować za pomocą testów sekwencjonowania nowej generacji. Oczekuje się, że zarodki, które wykazują matczyny fenotyp chrupiący, mogą zawierać zmianę w co najmniej jednym z czterech miejsc docelowych (patrz Dyskusja).
- Po południu przed eksperymentem stwórz pary godowe samic F0, o których wiadomo, że produkują matczyne zarodki chrupiące, skrzyżowane z samcami typu dzikiego. Trzymaj samce typu dzikiego fizycznie oddzielone od samic za pomocą przegrody do puli godowej lub umieść samicę we wkładce do składania jaj.
- Rankiem w dniu eksperymentu usuń fizyczną przegrodę lub umieść zarówno samce, jak i samice we wkładce do składania jaj, aby rozpocząć krycie. Przy pierwszych oznakach składania jaj przerwij rozmnażanie, oddzielając samca i samice F0. Trzymaj każdą oddzieloną samicę F0 w oddzielnych pudełkach do krycia.
- Przygotuj roztwór nasienia poddany działaniu promieniowania UV, używając jąder od jednego samca typu dzikiego na każde 100 μl roztworu Hanka (Tabela 2), wystarczający do zapłodnienia wytłaczanych jaj od jednej samicy, jak opisano wcześniej31.
- Ręcznie wyciśnij dojrzałe komórki jajowe od wstępnie wybranych samic F0 i przeprowadź zapłodnienie in vitro (IVF) przy użyciu nasienia 31.
- Po zapłodnieniu in vitro pozwól haploidalnym zarodkom rozwinąć się do momentu zaobserwowania fenotypu chrupkości matki i umieść te zarodki na innej szalce Petriego.
- Po zidentyfikowaniu matczynych, chrupiących haploidalnych zarodków, pozwól im rozwijać się przez co najmniej 6 godzin po zapłodnieniu.
- Aby wyekstrahować genomowe DNA z co najmniej dziesięciu matczynych zarodków haploidalnych, należy umieścić pojedynczy haploidalny zarodek w pojedynczym dołku probówki paskowej do PCR, usunąć nadmiar pożywki E3 z dołka i dodać 50 μl 50 mM NaOH.
- Inkubować zarodki w temperaturze 95 °C przez 20 minut. Następnie schłodzić próbki do temperatury 4 °C, dodać 5 μl 1 M Tris HCL (pH 7,5) i wirować przez 5-10 s. Wyekstrahowane DNA można przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do 6 miesięcy.
- Aby zidentyfikować, które miejsca przewodnika zawierają INDEL, zaprojektuj startery sekwencjonowania w celu amplifikacji fragmentu DNA, który obejmuje wszystkie cztery miejsca docelowe CRISPR-Cas9. Te startery sekwencjonowania pozwalają na identyfikację INDEL, które obejmują wiele miejsc prowadzących.
- Przygotuj dwie reakcje PCR po 25 μl na zarodek, używając 5 μl przygotowanego genomowego DNA i starterów sekwencjonowania.
- Po zakończeniu PCR należy oczyścić i skoncentrować dwie próbki za pomocą zestawu do oczyszczania i koncentratora DNA (patrz tabela materiałów). Następnie prześlij fragment DNA do sekwencjonowania Sangera przy użyciu zarówno starterów sekwencjonowania do przodu, jak i do tyłu.
- Po zsekwencjonowaniu haploidalnego fragmentu preparatu matczynego należy go wyrównać z sekwencją typu dzikiego i zidentyfikować INDELs w miejscach docelowych za pomocą programu do wyrównywania sekwencji.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Podejście eksperymentalne opisane w niniejszym protokole pozwala na szybką i efektywną pod względem zasobów identyfikację fenotypów efektu macierzyńskiego (Rysunek 1).
Generowanie macierzystych crispantów:
Projektując cztery gRNA nakierowane na jeden kandydujący gen efektu macierzyńskiego, szczególną uwagę należy zwrócić na miejsca wiązania gRNA z DNA. Zasadniczo powinny one być zgrupowane razem, z minimalnymi lub brakiem obszarów nakładania s...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Protokół przedstawiony w tym manuskrypcie pozwala na identyfikację i pierwszorzędową charakterystykę molekularną fenotypu efektu matczynego w jednym pokoleniu, a nie w wielu pokoleniach wymaganych zarówno dla technik genetycznych do przodu, jak i do tyłu. Obecnie rola wielu genów ulegających ekspresji matczynej jest nieznana. Ten brak wiedzy jest częściowo spowodowany dodatkowym pokoleniem wymaganym do wizualizacji fenotypu podczas identyfikacji genów efektu matczynego. W przeszłości szybką identyfikację genów efektu mat...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.
Podziękowania
Dziękujemy byłym i obecnym pracownikom laboratorium hodowli zwierząt Pelegri za ich troskę o obiekt wodny. Jesteśmy również wdzięczni za komentarze i wgląd w rękopis autorstwa Ryana Treveny i Diane Hanson. Finansowanie zostało zapewnione z grantu NIH dla F.P. (GM065303)
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 1 M Tris-HCl (pH 8,4) | Invirogen | 15568025 | Do mieszanki PCR |
| 1,5 ml probówek Eppendorf | Any Maker | ||
| 10 mM dNTP | Thermo Fischer Scientific | 18427013 | Synteza gRNA |
| 100 BP drabinka | Dowolny producent | Do elektroforezy żelowej | |
| 100% etanol wolny od RNAzy | Dowolny producent | ||
| 100% RNAzy wolny etanol | Any Maker | ||
| 100ml Zlewka | Dowolna maszyna | do IVF | |
| 5 M Ammonium Accetate | Thermo Fischer Scientific | Znaleziony w zestawie transkrypcyjnym MEGAshortscript T7 | Synteza gRNA |
| 70% | etanolu Synteza gRNA (70 ml etanolu + 30 ml wody wolnej od nukleaz) | ||
| Borosil 1,0 mm OD x 0,5 mm ID | FHC INC | 27-30-1 | do mikroiniekcji |
| Bulk Pharma Wodorowęglan sodu 35 funtów | Bulk Reef Supply | 255 | Zaopatrzenie ryb |
| CaCl2 | MiliporeSigma | C7902 | |
| Cas9 Białko z NLS | PNABio | CP01 | |
| ChopChop | https://chopchop.cbu.uib.no/ | ||
| Stały oligonukleotyd | Zintegrowane DNA Technologie (IDT) | AAAAGCACCGACTCGGTGCCAC TTTTTCAAGTTGATAACGGACTA GCCTTATTTTAACTTGCTATTTC TAGCTCTAAAAC | |
| Depresyjna szklana płyta | Thermo Fischer Scientific | 13-748B | do IVF |
| Kleszcze preparacyjne | Dumont | SS | do IVF |
| Nożyczki preparacyjne | Fine Science Tools | 14091-09 | Do IVF |
| Steroskop preparacyjny (ze źródłem światła przechodzącego) | Dowolny producent | do IVF | |
| DNA Clean & Koncentrator -5 | Zymo Research | D4014 | Synteza gRNA |
| DNA Gel Loading Dye (6x) | Dowolny producent | Do elektroforezy żelowej | |
| EconoTaq DNA Polymerase | Lucigen | 30032-1 | Do PCR mix |
| Elektrofereza Zasilacz | Dowolny producent | Do elektroforezy żelowej | |
| Ensemble | https://useast.ensembl.org/index.html | ||
| Eppendorf Końcówki do mikroładowarek Femtojet do mikrowtryskiwaczy Femtojet | Thermo Fischer Scientific | E5242956003 | do mikroiniekcji |
| Etanol (200 proof, bez nukleazy) | Any Maker | ||
| FemtoJet 4i | Eppendorf | 5252000021 | do mikroiniekcji |
| Sieć rybacka | Any Maker | Zaopatrzenie ryb | |
| Mrożone krewetki solankowe | Solanka Krewetki bezpośrednie | Zaopatrzenie w ryby | |
| Ogólna uniwersalna agaroza | Dowolna producentka | Do elektroforezy żelowej | |
| Specyficzne dla genów oligonukleotydy | Zintegrowane technologie DNA (IDT) | TAATACGACTCACTATA- N20 -GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG | |
| Rękawice Any Maker | |||
| Wiadro na lód | Dowolny producent | ||
| Natychmiastowa sól oceaniczna | Dowolny producent | Zaopatrzenie w ryby | |
| Invitrogen UltraPure Ethidium Bromde, 10 mg/mL | Thermo Fischer Scientific | 15-585-011 | |
| KCl | MiliporeSigma | P5405 | |
| KH2PO4 | MiliporeSigma | 7778-77-0 | |
| Kimwipes | Thermo Fischer Scientific | 06-666 | |
| Męski i Samica danio | |||
| MEGAshortscript T7 Zestaw do transkrypcji | Thermo Fischer Scientific | AM1354 | Synteza gRNA |
| Błękit metylenowy | Thermo Fischer Scientific | AC414240250 | dla E3 |
| MgCl2 | MiliporeSigma | 7791-18-6 | Do mieszanki PCR |
| MgSO2· 7H2O | MiliporeSigma | M2773 | |
| Plastikowa forma do mikroiniekcji | Świat Precyzyjne instrumenty | Z-Molds | do mikroiniekcji |
| Mikromanipulator | Dowolny producent | mikropipet do mikroiniekcji | |
| Ściągacz do mikropipet | Sutter | P-87 | do mikroiniekcji |
| Końcówki do mikropipeterów z filtrami (wszystkie rozmiary) | Any Maker | ||
| Końcówki do mikropipet bez filtrów (wszystkie rozmiary) | Any Maker | ||
| Microwave | Any Maker | ||
| Mineral Oil | MiliporeSigma | m5904-5ml | do mikroiniekcji |
| MS-222 (Tricaine-D) | Any Maker | zatwierdzony przez FDA | |
| Na2 HPO4 | MiliporeSigma | S3264 | |
| NaCl | MiliporeSigma | S5886 | |
| NaHC03 | MiliporeSigma | S5761 | |
| Nanodrop | Any Maker | ||
| NaOH | MiliporeSigma | 567530 | |
| Nieprzywierające, wolne od RNaz probówki do mikrofuge, 1,5 ml | Ambion | AM12450 | Synteza |
| wody wolnej od nukleaz | Dowolny producent | ||
| Ręcznik papierowy | Dowolny producent | ||
| Pipety Pastro | Dowolny producent | ||
| Probówki paskowe PCR | Dowolny producent | ||
| Płytki Petriego o średnicy 100 mm | Dowolny producent Roztwór | ||
| czerwieni fenolowej | MiliporeSigma | P0290 | do mikroiniekcji |
| Plastikowe pestale | VWR | 47747-358 | Do |
| plastikowej łyżki | Dowolny producent | Do IVF | |
| Premium Grade Solanka Krewetki | Krewetki Bezpośrednie | Drobnokomórkowe | |
| RNA Gel Loading Dye | znalezione w zestawie do transkrypcji MEGAshortscript T7 | Do elektroforezy żelowej | |
| RNAse AWAY | Thermo Fischer Scientific | 21-402-178 | |
| Skala | dowolnego producenta | ||
| Sharpie | dowolnego producenta | ||
| Szpatułka | Dowolny producent | ||
| Sterylny H2O | Dowolny ekspres | do mieszanki PCR | |
| Polimeraza DNA T4 | NEB | M0203 | Synteza taśmy gRNA |
| Dowolny producent | |||
| TBE (Tris-Boran-EDTA) 10x | Dowolna maszyna | Do elektroforezy żelowej | |
| Tea Stainer | Amazon | IMU-71133W | Zaopatrzenie ryb |
| Grzebień Thermo Scientific Owl 12-zębny, grubość 1,0/1,5 mm, dwustronny do B2 | Thermo Fischer Scientific | B2-12 | do elektroforezy żelowej |
| Thermo Scientific Owl EasyCast B2 Mini żelowe systemy elektroforezy | Thermo Fischer Scientific | 09-528-110B | Do elektroforezy żelowej |
| Termocykler | Dowolny producent | ||
| Termocykler | Dowolny producent | ||
| Lampa UV | UVP Model XX-15 (nr kat. UVP18006201) | ||
| okularów ochronnych UVF UVF | Dowolny producent | ||
| butelki do mycia | Thermo Fischer Scientific | S39015 | Zaopatrzenie ryb |
| Pudełka godowe danio pręgowanego | Aqua Schwarz | SpawningBox1 | Zaopatrzenie ryb |
| 1,5 ml Probówki Eppendorf | Fisher Scientific | 05-402-11 | |
| 10 dNTP trzonowych Drabina | |||
| 100 BP | Thermo Fischer Scientific | 15628019 | |
| 100% etanol wolny od RNAzy | dowolny producent | ||
| 5m Ammonium Accetate | Thermo Fischer Scientific | ||
| 70% etanolu | 70ml etanolu i 30 ml wody wolnej od nukleaz | ||
| Akcesoria do poziomego pudełka żelowego | Fisher Scientific | 0,625 mm | |
| Agaroza | dowolny producent | ||
| CaCl2 | Sigma | 10043-52-4 | |
| CaCl2, dwuwodny | Sigma | 10035-04-8 | E3 Średnia |
| rurka kapilarna | Cole-Parmer | UX-03010-68 | do igieł iniekcyjnych |
| Cas9 Protein | Thermo Fischer Scientific | A36496 | |
| ChopChop | https://chopchop.cbu.uib.no/ | ||
| Komputer | dowolny producent | ||
| Sekcja Forcepts | dowolny producent | ||
| Mikroskop preparacyjny | dowolny producent | ||
| Nożyczki preparacyjne | dowolny producent | ||
| DNA Clean & Koncentrator -5 | Zymo Research | D4014 | |
| Barwnik ładujący żel DNA (6X) | Thermo Fischer Scientific | R0611 | |
| EconoTaq Polimeraza DNA | Lucigen | 30032-1 | |
| Ensemble | https://useast.ensembl.org/index.html | ||
| Eppendorf Microloader PipetTips | Fischer Scientific | 10289651 | 20 mikrolitrów |
| Etanol (200 proof, bez nukleaz) | dowolny producent | ||
| Bromek etydyny | Thermo Fischer Scientific | 15585011 | |
| Sieć na ryby | dowolnego producenta | drobna siatka | |
| Mrożone krewetki solankowe | LiveAquaria | CD-12018 | pokarm dla ryb |
| Grzebień żelowy (0,625 mm) | dowolny producent | ||
| System elektroferezy żelowej | dowolny producent | ||
| z oligonukleotydami specyficznymi dla genów | (IDT) | ||
| Szklana igła kapilarna | Grainger | 21TZ99 | https://www.grainger.com/product/21TZ99?ef_id=Cj0KCQjw8Ia GBhCHARIsAGIRRYpqsyA3-LUXbpZVq7thnRbroBqQTbrZ_a88 VVcI964LtOC6SFLz4ZYaAhZzEAL w_wcB:G:s& s_kwcid=AL!2966!3! 264955916096!!! g!438976 780705!& gucid=N:N:PS:Płatny :GGL:CSM-2295:4P7A1P:20501 231& gclid=Cj0KCQjw8IaGBh CHARIsAGIRRYpqsyA3-LUXbp ZVq7thnRbroBqQTbrZ_a88VVcI 964LtOC6SFLz4ZYaAhZzEALw _wcB& gclsrc=aw.ds |
| Naczynia szklane | dowolny producent | ||
| Rękawice | dowolnego producenta | ||
| Końcowe Rozwiązanie | Hanka Połącz 9,9 ml Premiksu Hanka z 0,1 ml Bulionu HS #6 | ||
| Hank's Premix | połącz następujące elementy w kolejności: (1) 10,0 ml HS #1, (2) 1,0 ml HS#2, (3) 1,0 ml HS#4, (4) 86 ml ddH2O, (5) 1,0 ml HS#5. Przechowuj wszystkie solotiony HS w 4C | ||
| Hanksa | |||
| Hanksa | https://www.jove.com/pdf-materials/51708/jove-materials-51708-production-of-haploid-zebrafish-embryos-by-in-vitro-fertilization | ||
| Podstawowy roztwór Hanka #1 | 8,0 g NaCl, 0,4 g KCl w 100 ml ddH2O | ||
| Roztwór podstawowy Hanka #2 | 0,358 g Na2HPO4 bezwodny; 0,60 g K2H2PO4 w 100 ml ddH2O | ||
| Roztwór podstawowy Hanka #4 | 0,72 g CaCl2 w 50 ml ddH2O | ||
| Roztwór podstawowy Hanka #5 | 1,23 g MgSO47H2O w 50 ml ddH20 | ||
| Roztwór podstawowy Hanka #6 | 0,35 g NaHCO3 w 10,0 ml ddH20; Zrób świeży dzień użytkowania | ||
| HCl | Sigma | 7647-01-0 | |
| Wiadro na lód | dowolny producent | ||
| Natychmiastowa sól oceaniczna | dowolna maszyna | do wody dla ryb | |
| Zestaw do transkrypcji in vitro Mega Short Script | Thermo Fischer Scientific | AM1354 | |
| Invitrogen™ UltraPure&handel; Woda destylowana bez DNaz/RNaz | Fisher Scientific | 10-977-023 | |
| KCl | Sigma | 7447-40-7 | E3 Medium |
| KH2PO4 | Sigma | 7778-77-0 | |
| Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666 | |
| Samce i samice danio | |||
| Mega Short Script T7 Zestaw do transkrypcji | Thermo Fischer Scientific | AM1354 | |
| błękit metylenowy | Fisher Scientific | AC414240250 | E3 Medium |
| MgSO2-7H2O | Sigma | M2773 | |
| Mikroimikromanipulator | |||
| Plastikowa forma do mikroiniekcji | Świat Precision | Instruments Z-Molds | |
| Mikrowtryskiwacz | |||
| Suwak | mikroigłowy | ||
| Mikropipeter (1-10) z końcówkami, | każdy producent | Filtrowane końcówki P10 | |
| Mikropipeter (20-200) z końcówkami | dowolnego producenta | ||
| Mikropipeter (100-1000) z końcówkami | dowolnego producenta | ||
| Szkiełko | |||
| Kuchenka mikrofalowa | dowolnego producenta | ||
| MiliQ Woda | dowolna Maker | ||
| Olej mineralny | Sigma-Aldrich | M5904-5ml | |
| Na2HPO4 | Sigma | ||
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| NaHC02 | Sigma | 223441 | |
| Nanodrop | |||
| NaOH | Sigma | 567530 | |
| Wąska szpatułka | dowolny producent | ||
| Ściągacz do igieł | Sutter | P-97 | |
| dowolnego producenta | |||
| Pipety Pastro | Fisher Scientific | 13-678-20A | |
| Miejsce prowadzenia startera PCR | Zintegrowane technologie DNA (IDT) | ||
| Startery PCR prowadnica flankująca miejsce cięcia RNA | Zintegrowane technologie DNA (IDT) | Standard odsalany | |
| Probówki paskowe do PCR | Thermo Fischer Scientific | AB0771W | |
| szalki Petriego | Fisher Scientific | FB0875714 | 10 cm średnica 100mm x 15mm |
| Fenol Red | Fisher Science | S25464 | https://www.fishersci.com/shop/products/phenol-red-indicator-solution-0-02-w-v-2/S25464 |
| Końcówki do pipet | dowolnego producenta | Końcówki 10ul, 200ul i 1000ul | |
| Plastikowe pestki | Fisher Scientific | 12-141-364 | |
| Plastikowa łyżka | dowolnego producenta | ||
| Przewodnik po podkładach Zintegrowane | technologie DNA (IDT) | ||
| Żyletka | Uline | H-595B | |
| Żel RNA Ładowanie barwnika | w megakrótkim zestawie skryptów (zestaw do transkrypcji in vitro) | ||
| RNAzyj od | Fishera | 21-402-178 | |
| Probówki do mikrowirówek polipropylenowych bez RNA | Thermo Fischer Scientific | AM12400 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/AM12400#/AM12400 |
| Woda wolna od RNAzy | Fisher Scientific | 10-977-023 | |
| Skala | dowolnego producenta | ||
| Sharpie | dowolny producent | ||
| Wodorowęglan sodu (komórka testowane pod kątem kultur) | Sigma | S5761 | woda rybna |
| Bromek sodu Solotion | Sigma | E1510 | |
| Oprogramowanie do sekwencjonowania Sangera Analiza | |||
| Spektrofotometr | |||
| Sterlie H2O | dowolnej marki | ||
| T4 DNA Polimeraza | NEB | M0203S | https://www.neb.com/products/m0203-t4-dna-polymerase#Product%20Information |
| Taśma | dowolnej marki | ||
| TBE (Tris-Borate-EDTA) 10X | Thermo Fischer Scientific | B52 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/B52#/B52 |
| Tea Stainer | amazon | IMU-71133W | dostępny w większości sklepów kuchennych |
| Termocykler | |||
| Pipeta transferowa | Uline | S-24320 | |
| Transilluminator | |||
| Tricaine | fisher scientific | NC0872873 | |
| Tris HCl 7.5 | Thermo Fischer Scientific | 15567027 | |
| Uniwersalny podkład | Zintegrowane technologie DNA (IDT) | AAAAGCACCGACTCGGTGCCAC TTTTTCAAGTTGATAACGGACTAG CCTTATTTTAACTTGCTATTTCTA GCTCTAAAAC | |
| Lampa UV | UVP | ||
| UVP dowolnego producenta | |||
| Butelka do mycia | fisher scientific | S39015 | |
| Pudełka godowe danio pręgowanego | dowolny producent | ||
| Przepis na | bufor PCRDodać 171,12 ml sterylnego H20; 0,393 ml 1M MgCl2; 2,616 ml 1 mln MgCl2; 2,618 ml 1M Tris-HCl (pH 8,4) 13,092 ml 1M KCl; 0,262 ml 1% żelatyny. Autoklaw przez 20 minut, a następnie schłodź solotion na lodzie. Następnie dodaj 3,468 ml 100 mg/ml BSA; 0,262 ml dATP (100 mM), 0,262 ml dCTP (100 mM); 0,262 ml dGTP (100 mM); 0,262 ml dTTP (100 ml). Alliquote do sterylnych probówek eppendorfa |
Bibliografia
- Pelegri, F. Maternal factors in zebrafish development. Developmental Dynamics. 228 (3), 535-554 (2003).
- Campbell, P. D., Heim, A. E., Smith, M. Z., Marlow, F. L. Kinesin-1 interacts with Bucky ball to form germ cells and is required to pattern the zebrafish body axis. Development. 142 (17), Cambridge, England. 2996-3008 (2015).
- Eno, C., Solanki, B., Pelegri, F. aura (mid1ip1l) regulates the cytoskeleton at the zebrafish egg-to-embryo transition. Development. 143 (9), Cambridge, England. 1585-1599 (2016).
- He, W. -X., et al. Oocyte-specific maternal Slbp2 is required for replication-dependent histone storage and early nuclear cleavage in zebrafish oogenesis and embryogenesis. RNA. 24 (12), RNA. New York, N.Y. 1738-1748 (2018).
- Burger, A., et al. Maximizing mutagenesis with solubilized CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein complexes. Development. 143 (11), Cambridge, England. 2025-2037 (2016).
- Jao, L. -E., Wente, S. R., Chen, W. Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (34), 13904-13909 (2013).
- Shah, A. N., Davey, C. F., Whitebirch, A. C., Miller, A. C., Moens, C. B. Rapid reverse genetic screening using CRISPR in zebrafish. Nature Methods. 12 (6), 535-540 (2015).
- Shankaran, S. S., Dahlem, T. J., Bisgrove, B. W., Yost, H. J., Tristani-Firouzi, M. CRISPR/Cas9-directed gene editing for the generation of loss-of-function mutants in high-throughput zebrafish F0 screens. Current Protocols in Molecular Biology. 119 (1), 1-22 (2017).
- Trubiroha, A., et al. A Rapid CRISPR/Cas-based mutagenesis assay in zebrafish for identification of genes involved in thyroid morphogenesis and function. Scientific Reports. 8 (1), 5647(2018).
- Wu, R. S., Lam, I. I., Clay, H., Duong, D. N., Deo, R. C., Coughlin, S. R. A Rapid method for directed gene knockout for screening in G0 zebrafish. Developmental Cell. 46 (1), 112-125 (2018).
- Moravec, C. E., Voit, G. C., Otterlee, J., Pelegri, F. Identification of maternal-effect genes in zebrafish using maternal crispants. Development. 148 (19), Cambridge, England. 199536(2021).
- Braat, A. K., Zandbergen, T., van de Water, S., Goos, H. J., Zivkovic, D. Characterization of zebrafish primordial germ cells: morphology and early distribution of vasa RNA. Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 216 (2), 153-167 (1999).
- Eno, C., Hansen, C. L., Pelegri, F. Aggregation, segregation, and dispersal of homotypic germ plasm RNPs in the early zebrafish embryo. Developmental Dynamics. 248 (4), 306-318 (2019).
- Knaut, H., Steinbeisser, H., Schwarz, H., Nüsslein-Volhard, C. An evolutionary conserved region in the vasa 3'UTR targets RNA translation to the germ cells in the zebrafish. Current biology: CB. 12 (6), 454-466 (2002).
- Yoon, C., Kawakami, K., Hopkins, N. Zebrafish vasa homologue RNA is localized to the cleavage planes of 2- and 4-cell-stage embryos and is expressed in the primordial germ cells. Development. 124 (16), Cambridge, England. 3157-3165 (1997).
- Gagnon, J. A., et al. Efficient mutagenesis by Cas9 protein-mediated oligonucleotide insertion and large-scale assessment of single-guide RNAs. PLoS ONE. 9 (5), 98186(2014).
- Labun, K., Montague, T. G., Gagnon, J. A., Thyme, S. B., Valen, E. CHOPCHOP v2: a web tool for the next generation of CRISPR genome engineering. Nucleic Acids Research. 44, 272-276 (2016).
- Labun, K., Montague, T. G., Krause, M., Torres Cleuren, Y. N., Tjeldnes, H., Valen, E. CHOPCHOP v3: expanding the CRISPR web toolbox beyond genome editing. Nucleic Acids Research. 47, 171-174 (2019).
- Montague, T. G., Cruz, J. M., Gagnon, J. A., Church, G. M., Valen, E. CHOPCHOP: a CRISPR/Cas9 and TALEN web tool for genome editing. Nucleic Acids Research. 42, 401-407 (2014).
- Moravec, C. E., Pelegri, F. J. An accessible protocol for the generation of CRISPR-Cas9 knockouts using INDELs in zebrafish. Methods in Molecular Biology. 1920, Clifton, N.J. 377-392 (2019).
- White, R. J., et al. A high-resolution mRNA expression time course of embryonic development in zebrafish. eLife. 6, 30860(2017).
- Aanes, H., et al. Zebrafish mRNA sequencing deciphers novelties in transcriptome dynamics during maternal to zygotic transition. Genome Research. 21 (8), 1328-1338 (2011).
- Aken, B. L., et al. The Ensembl gene annotation system. Database: The Journal of Biological Databases and Curation. 2016, (2016).
- Sorlien, E. L., Witucki, M. A., Ogas, J. Efficient production and identification of CRISPR/Cas9-generated gene knockouts in the model system Danio rerio. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), e56969(2018).
- Kotani, H., Taimatsu, K., Ohga, R., Ota, S., Kawahara, A. efficient multiple genome modifications induced by the crRNAs, tracrRNA and Cas9 protein complex in zebrafish. PloS One. 10 (5), 0128319(2015).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (25), e1115(2009).
- Xu, Q. Microinjection into zebrafish embryos. Methods in Molecular Biology. 127, Clifton, N.J. 125-132 (1999).
- Biology Mouse,, Zebrafish,, Chick, JoVE. Biology: Mouse, Zebrafish, and Chick. Zebrafish Microinjection Techniques. JoVE Science Education Database. , Cambridge, MA. (2021).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 203 (3), 253-310 (1995).
- D'Agostino, Y., et al. A rapid and cheap methodology for CRISPR/Cas9 zebrafish mutant screening. Molecular Biotechnology. 58 (1), 73-78 (2016).
- Baars, D. L., Takle, K. A., Heier, J., Pelegri, F. Ploidy manipulation of zebrafish embryos with Heat Shock 2 treatment. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (118), e54492(2016).
- Nair, S., Lindeman, R. E., Pelegri, F. In vitro oocyte culture-based manipulation of zebrafish maternal genes. Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 242 (1), 44-52 (2013).
- Kushawah, G., et al. CRISPR-Cas13d induces efficient mRNA knockdown in animal embryos. Developmental Cell. 54 (6), 805-817 (2020).
- Kroeger, P. T., Poureetezadi, S. J., McKee, R., Jou, J., Miceli, R., Wingert, R. A. Production of haploid zebrafish embryos by in vitro fertilization. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (89), e51708(2014).
- Xiao, T., Roeser, T., Staub, W., Baier, H. A GFP-based genetic screen reveals mutations that disrupt the architecture of the zebrafish retinotectal projection. Development. 132 (13), Cambridge, England. 2955-2967 (2005).
- Riemer, S., Bontems, F., Krishnakumar, P., Gömann, J., Dosch, R. A functional Bucky ball-GFP transgene visualizes germ plasm in living zebrafish. Gene Expression Patterns: GEP. 18 (1-2), 44-52 (2015).
- Moreno-Mateos, M. A., et al. CRISPRscan: designing highly efficient sgRNAs for CRISPR-Cas9 targeting in vivo. Nature Methods. 12 (10), 982-988 (2015).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
