Określanie roli genów ulegających ekspresji matki we wczesnym rozwoju za pomocą matczynych chrupek

Podsumowanie

Wczesny rozwój zależy od produktów dziedziczonych po matce, a rola wielu z tych produktów jest obecnie nieznana. W tym miejscu opisaliśmy protokół, który wykorzystuje CRISPR-Cas9 do identyfikacji fenotypów efektu matczynego w jednym pokoleniu.

Streszczenie

Wczesny rozwój zależy od puli czynników matczynych włączonych do dojrzałego oocytu podczas oogenezy, które spełniają wszystkie funkcje komórkowe niezbędne do rozwoju, aż do aktywacji genomu zygotycznego. Zazwyczaj genetyczne ukierunkowanie tych czynników matczynych wymaga dodatkowego pokolenia w celu zidentyfikowania fenotypów efektu matczynego, co utrudnia określenie roli genów o ekspresji matczynej podczas rozwoju. Odkrycie możliwości edycji biallelicznej CRISPR-Cas9 umożliwiło badania przesiewowe fenotypów embrionalnych w tkankach somatycznych wstrzykniętych zarodków lub "crispantów", pogłębiając zrozumienie roli, jaką geny wyrażane zygotycznie odgrywają w programach rozwojowych. W tym artykule opisano protokół, który jest rozszerzeniem metody crispant. W tej metodzie bialleliczny montaż komórek rozrodczych pozwala na wyizolowanie fenotypu efektu matczynego w jednym pokoleniu, czyli "matczynych chrupania". Multipleksowanie prowadzących RNA do jednego celu sprzyja wydajnej produkcji matczynych chrupków, podczas gdy analiza sekwencji matczynych chrupiących haploidów zapewnia prostą metodę potwierdzania zmian genetycznych, które wytwarzają fenotyp efektu matczynego. Stosowanie matczynych chrupek wspomaga szybką identyfikację niezbędnych genów ulegających ekspresji matczynej, ułatwiając w ten sposób zrozumienie wczesnego rozwoju.

Wprowadzenie

Pula produktów zdeponowanych przez matkę (np. RNA, białka i inne biomolekuły) jest niezbędna dla wszystkich wczesnych procesów komórkowych, dopóki nie zostanie aktywowany genom zygotyczny zarodka¹. Przedwczesne wyczerpanie tych produktów z oocytu jest zazwyczaj śmiertelne dla zarodka. Pomimo znaczenia tych genów w rozwoju, rola wielu genów ulegających ekspresji matczynej jest obecnie nieznana. Postęp w technologii edycji genów u danio pręgowanego, taki jak CRISPR-Cas9, umożliwia celowanie w geny o ekspresji matczynej^2,3,4. Jednak identyfikacja fenotypu efektu matczynego wymaga dodatkowego pokolenia w porównaniu z fenotypem zygotycznym, a zatem wymaga więcej zasobów. Ostatnio zdolność edycji biallelicznej CRISPR-Cas9 została wykorzystana do badań przesiewowych pod kątem fenotypów embrionalnych w tkankach somatycznych wstrzykniętych zarodków (F0), znanych jako "crispants"^5,6,7,8,9,10. Technika crispant pozwala na zasobooszczędne badania przesiewowe genów kandydujących w komórkach somatycznych, ułatwiając zrozumienie konkretnych aspektów rozwoju. Protokół opisany w tym artykule pozwala na identyfikację fenotypów efektu matczynego, czyli "matczynych chrupków", w jednym pokoleniu¹¹. Schemat ten można osiągnąć poprzez multipleksowanie przewodnikowych RNA do jednego genu i promowanie zdarzeń edycji biallelicznej w linii zarodkowej. Te matczyne zarodki chrupiące mogą być identyfikowane na podstawie ogólnych fenotypów morfologicznych i poddawane podstawowej charakterystyce, takiej jak etykietowanie granic komórkowych i wzorcowanie DNA¹¹. Połączona analiza obserwowalnego fenotypu i podstawowa charakterystyka molekularna indukowanych INDELs pozwala na przewidzenie roli docelowego genu we wczesnym rozwoju.

U danio pręgowanego, podczas pierwszych 24 godzin po zapłodnieniu (hpf), niewielka grupa komórek przekształca się w pierwotne komórki rozrodcze, prekursor linii zarodkowej^12,13,14,15. W lęgach złożonych przez samice F0 odsetek odzyskanych matczynych zarodków chrupkujących zależy od tego, ile komórek rozrodczych zawiera zdarzenie edycji biallelicznej w docelowym genie. Ogólnie rzecz biorąc, im wcześniej dojdzie do edycji zarodka, tym większe prawdopodobieństwo zaobserwowania mutacji CRISPR-Cas9 w linii zarodkowej. W większości przypadków fenotypy matczynych zarodków chrupkujących wynikają z utraty funkcji dwóch matczynych alleli obecnych w rozwijającym się oocycie. Gdy oocyt kończy mejozę, jeden z matczynych alleli jest wytłaczany z zarodka przez ciało biegunowe, podczas gdy drugi allel zostaje włączony do matczynego przedjądrza. Sekwencjonowanie wielu matczynych haploidów chrupkujących będzie reprezentować mieszaninę mutacji (insercji i/lub delecji (INDEL)) obecnych w linii zarodkowej, które przyczyniają się do fenotypu¹¹.

Poniższy protokół opisuje niezbędne kroki do stworzenia mutacji CRISPR-Cas9 w genach efektu matczynego i zidentyfikowania odpowiadającego im fenotypu przy użyciu metody matczynego crispantu (Rysunek 1). Sekcja pierwsza wyjaśni, jak skutecznie projektować i tworzyć przewodnikowe RNA, podczas gdy sekcje druga i trzecia zawierają kluczowe etapy tworzenia matczynych chrupek za pomocą mikroiniekcji. Po wstrzyknięciu mieszaniny CRISPR-Cas9 wstrzyknięte zarodki są badane pod kątem zmian somatycznych metodą PCR (sekcja czwarta). Gdy wstrzyknięte zarodki F0 rozwiną się i osiągną dojrzałość płciową, samice F0 są krzyżowane z samcami typu dzikiego, a ich potomstwo jest badane pod kątem fenotypów efektu matczynego (sekcja piąta). Sekcja szósta zawiera instrukcje dotyczące wytwarzania matczynych chrupiących haploidów, które można połączyć z sekwencjonowaniem Sangera w celu identyfikacji INDELs indukowanych przez CRISPR-Cas9. Ponadto Dyskusja zawiera modyfikacje, które można wprowadzić do protokołu, aby zwiększyć czułość i moc tej metody.

Protokół

W badaniach prowadzących do opracowania tego protokołu, wszystkie hodowle danio pręgowanych i eksperymenty zostały zatwierdzone przez University of Wisconsin-Madison Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC-M005268-R2).

1. Synteza przewodnikowych RNA

UWAGA: Zygotyczne chipsanty zostały stworzone przy użyciu pojedynczego przewodnika RNA lub multipleksowania wielu przewodników RNA do jednego celu^5,6,7,8,9,10. Multipleksowanie przewodnikowych RNA zwiększa odsetek zarodków wykazujących fenotyp zygotyczny chrupiący¹⁰. Ze względu na zwiększoną częstotliwość zarodków wykazujących fenotyp, matczyne chrupki są tworzone przez multipleksowanie czterech przewodnikowych RNA do jednego genu. Bardziej szczegółowy protokół dotyczący wykorzystania CHOPCHOP do projektowania przewodnikowych RNA oraz metody wyżarzania do syntezy przewodnikowych RNA dla danio pręgowanego można znaleźć gdzie indziej^{16,17,18,19,20}.

1. Aby zidentyfikować gen o ekspresji matczynej, który ma być celem, ustal poziomy transkryptu mRNA podczas rozwoju za pomocą bazy danych sekwencji RNA, która dostarcza informacji transkryptomu od zygoty do 5 dni²¹. Ogólnie rzecz biorąc, geny specyficzne dla matki są silnie eksprymowane we wczesnym zarodku i ulegają degradacji po aktywacji genomu zygotycznego²².
2. Po zidentyfikowaniu genu docelowego wykazującego ekspresję matczyną, określ pierwszą przewidywaną domenę białkową, korzystając z sekcji "domeny i cechy" dostępnej w przeglądarce genomu Ensembl²³. Użyj tej domeny jako regionu docelowego dla czterech przewodnikowych RNA.
3. Użyj programu do selekcji przewodnika RNA CHOPCHOP, aby zidentyfikować cztery docelowe miejsca przewodnika RNA w pierwszej domenie aktywnej. Zaprojektuj oligonukleotydy specyficzne dla genu, jak pokazano poniżej dla każdego miejsca docelowego. W oligonukleotydzie specyficznym dla genu sekcja N²⁰ odpowiada sekwencji docelowej pomniejszonej o miejsce PAM (NGG) z CHOPCHOP. Zamów te specyficzne dla genu oligonukleotydy i stały oligonukleotyd za pomocą standardowego oczyszczania odsalającego (patrz tabela materiałów).
   Oligonukleotyd specyficzny dla genu:
   5' TAATACGACTCACTATA- N²⁰ -GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG 3'
4. Aby utworzyć szablon przewodnika RNA dla każdego oligonukleotydu specyficznego dla genu, wyżarzaj go do stałego oligonukleotydu i wypełnij zwisy polimerazą T4-DNA, jak opisano wcześniej¹⁶. Po złożeniu czterech szablonów prowadzącego RNA, oczyść je i skoncentruj razem za pomocą zestawu do oczyszczania i koncentratora DNA zgodnie z instrukcjami producenta (patrz Tabela materiałów).
5. Zsyntetyzuj mieszaninę sgRNA z puli szablonu przewodnika RNA za pomocą zestawu do transkrypcji T7 in vitro (patrz tabela materiałów). Wykonaj transkrypcję in vitro zgodnie z instrukcjami producenta. Użycie reakcji połówkowych zestawu do transkrypcji T7 może obniżyć koszt reakcji.
6. Po syntezie RNA oczyść powstałą pulę sgRNA za pomocą protokołu etanolu/octanu amonu, jak opisano wcześniej^16,20,24. Po wyizolowaniu RNA należy go ponownie zawiesić w 20 μl wody wolnej od nukleaz. Jeśli do transkrypcji puli sgRNA użyto reakcji połówkowych zestawu transkrypcyjnego T7, oczyszczone RNA należy ponownie zawiesić w 10-15 μl wody wolnej od nukleaz.
7. Określ ilościowo ilość połączonych sgRNA, które zostały utworzone za pomocą spektrofotometru. Rozcieńczyć pulę sgRNA w wodzie wolnej od nukleaz do rozcieńczenia 1500 ng/μL ± 500 ng/μL. Zazwyczaj końcowa objętość roboczego rozcieńczenia waha się od 30-50 μL.
8. Po określeniu stężenia puli sgRNA sprawdź integralność sgRNA na 1% żelu agarozowym.
   1. Odleć 1% agarozy/0,5 μg/ml bromku etydyny/żelu TBE. Gdy żel zastygnie, umieść go w buforze do pracy TBE.
   2. Zmieszać 1 μl mieszaniny sgRNA i 1 μl buforu ładującego żel RNA (patrz tabela materiałów). Załaduj tę próbkę do żelu i uruchom żel pod napięciem 100 V przez 5 minut.
9. Wizualizuj pasma za pomocą światła ultrafioletowego (UV). Pula sgRNA powinna pojawić się jako pojedyncze pasmo. Jeśli zaobserwuje się rozmaz, prawdopodobnie nastąpiła degradacja RNA.
10. Przechowuj pulę sgRNA w jednorazowych podwielokrotnościach o pojemności 1 μl w probówkach paskowych do PCR bez nukleaz w zamrażarce o temperaturze -80 °C. W przypadku dużych objętości mieszaniny sgRNA (30 μl lub więcej), podwielokrotną połowę objętości należy przelać do probówek paskowych do PCR bez nukleaz, a drugą połowę przechowywać jako większą objętość w probówce mikrowirówkowej bez nukleaz. Rozmrozić i poddzielić w razie potrzeby.
11. Aby zapobiec degradacji RNA, należy upewnić się, że próbki w probówce mikrowirówki przechodzą nie więcej niż dwa cykle zamrażania i rozmrażania.

2. Przygotowanie odczynników i materiałów do mikroiniekcji

UWAGA: U danio pręgowanego wstrzyknięcie mRNA Cas9 może wytworzyć zygotyczne chrupki. Jednak badania wykazały, że białko Cas9 jest bardziej wydajne w tworzeniu INDEL w wstrzykiwanych zarodkach^16,25. Protokół ten wykorzystuje białko Cas9 do generowania matczynych chrupków, ponieważ białko to nie doświadcza takiego samego opóźnienia w aktywności, jak wstrzyknięte mRNA Cas9. Teoretycznie powinno to zwiększyć prawdopodobieństwo mutacji biallelicznej na wczesnym etapie rozwoju, co skutkuje zwiększonym prawdopodobieństwem wpływu na bardziej rozległy odcinek linii zarodkowej. Inne protokoły i zasoby szczegółowo opisujące, jak przygotować się do mikroiniekcji, można znaleźć gdzie indziej^24,26.

1. Kup lub wygeneruj białko Cas9 (patrz Tabela materiałów). Ponownie zawiesić białko Cas9 w wodzie wolnej od nukleaz, aby uzyskać roztwór o stężeniu 2 mg/ml i podwielokrotność 1 μl do probówek do mikrowirówek polipropylenowych wolnych od RNaz. Przechowuj je jako jednorazowe probówki w temperaturze -80 °C.
2. Po południu przed wstrzyknięciem należy za pomocą ściągacza do mikropipet pobrać szklaną kapilarnę i utworzyć igłę do wstrzykiwań. Przechowywać nieprzerwaną igłę w dołączonym uchwycie na igłę do rana w przypadku mikrowstrzyknięć.
3. Aby utworzyć płytkę do wstrzykiwań, wlej 20 ml 1,5% agarozy/sterylnego_H2O, aby wypełnić połowę szalki Petriego o wymiarach 100 mm x 15 mm i poczekaj, aż stwardnieje. Po związaniu roztworu agarozy dodaj 20 ml 1,5% agarozy/sterylnego_H2Odo szalki Petriego i umieść plastikową formę (patrz Tabela materiałów) w płynnej agarozie i pozwól jej stwardnieć.
4. Po stwardnieniu agarozy wyjmij plastikową formę i przechowuj płytkę wtryskową do góry nogami w lodówce do rana w dniu wstrzyknięcia. Pojedyncza płytka może być używana do wielu iniekcji, o ile studzienki zachowują swoją integralność.

3. Mikroiniekcja koktajlu CRISPR-Cas9 do jednokomórkowego zarodka danio pręgowanego w celu wytworzenia matczynych chrupków

UWAGA: Więcej materiałów na temat mikroiniekcji do zarodków danio pręgowanego można znaleźć gdzie indziej^24,26,27. Wstrzyknięcie mieszaniny CRISPR-Cas9 do rozwijającego się blastodysku jednokomórkowych zarodków może zwiększyć prawdopodobieństwo wytworzenia matczynych chrupków. Mieszaninę można również wstrzykiwać do woreczka żółtkowego do stadium 2-komórkowego. Jednak mieszaniny wstrzykiwane do żółtka zależą od strumienia ooplazmy, aby dotrzeć do blastodysku, więc CRISPR-Cas9 wstrzyknięty do żółtka może zmniejszyć wydajność cięcia CRISPR-Cas9²⁸.

1. Po południu przed mikroiniekcjami ustaw krzyżówki typu dzikiego w pudełkach godowych danio pręgowanego. Trzymaj zarówno samca, jak i samicę w tym samym zbiorniku, ale oddziel je przegrodą w pudełku godowym lub umieść samicę we wkładce do składania jaj.
2. Rano w dniu eksperymentu wyjmij jedną porcję białka Cas9 o stężeniu 2 mg/ml i jedną porcję z puli sgRNA. W probówce mikrowirówki polipropylenowej bez RNaz, która zawiera białko Cas9, zbierz mieszaninę iniekcyjną o pojemności 5 μl, która zawiera pulę sgRNA, 1 μl 0,5% roztworu czerwieni fenolowej i wodę wolną od nukleaz. Dążyć do końcowego stężenia 400 ng/μl białka Cas9 i 200 ng/μL połączonych sgRNA w wodzie wolnej od RNaz lub stosunku 2:1 białka Cas9 do sgRNA w wstrzykniętym zarodku. Ta mieszanina do wstrzykiwań może być przechowywana na lodzie do rana w dniu wstrzyknięcia.
3. Wyjąć płytkę wtryskową z lodówki i pozostawić ją do ogrzania do temperatury pokojowej (RT) przez co najmniej 20 minut.
4. Po złożeniu koktajlu do wstrzykiwań należy pozwolić samcowi i samicy na kojarzenie się w pary, np. poprzez usunięcie przegrody w pudełku do krycia lub umieszczenie samca w tej samej wkładce do składania jaj co samica, w zależności od przypadku.
5. Po złożeniu jaj przez ryby, ale przed zebraniem zarodków, należy odciąć końcówkę nieprzerwanej igły za pomocą nowej żyletki lub cienkich kleszczyków, aby utworzyć igłę, która ma otwór wystarczająco mały, aby uniknąć uszkodzenia zarodka, ale jest wystarczająco szeroka, aby nie została zatkana mieszanką do wstrzykiwań. Po przecięciu igły należy naładować igłę mieszaniną iniekcyjną za pomocą końcówki pipety do mikroładowarki umieszczonej w tylnej części kapilary (patrz tabele materiałów).
6. Po napełnieniu igły inkubuj igłę przez 5 minut w temperaturze pokojowej w celu złożenia kompleksów Cas9-sgRNA.
7. Włączyć mikrowstrzykiwacz i włożyć igłę do mikromanipulatora. Umieścić kroplę oleju mineralnego na szkiełku mikrometrycznym i skalibrować igłę, regulując ciśnienie wstrzykiwania, aż igła wyrzuci bolus o wartości 1 nL do oleju mineralnego.
   UWAGA: Podczas wstrzykiwania do oleju mineralnego bolus o pojemności 1 nl będzie miał średnicę około 0,125 mm (lub promień 0,062 mm), mierzoną za pomocą szkiełka mikrometrycznego.
8. Aby zsynchronizować zarodki, zbierz je po 10 minutach za pomocą plastikowego sitka i przepłucz na szalkę Petriego za pomocą 1x pożywki E3 (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl₂, 0,33 mM_MgSO4 i dodaj 20 μL 0,03 M błękitu metylenowego na 1 l 1x E3). Usunąć 10-15 zarodków i umieścić je na oddzielnej szalce Petriego, aby zachować je jako niewstrzyknięte grupy kontrolne.
9. Resztę rozwijających się zarodków przenieść do dołków płytki iniekcyjnej.
10. Wstrzyknąć 1 nl roztworu (w sumie 400 pg białka Cas9 i 200 pg sgRNA) do rozwijającego się blastodysku zarodka jednokomórkowego. Jeśli końcówka igły zostanie zatkana, użyj kleszczyków, aby odłamać końcówkę z powrotem i ponownie skalibrować igłę, aby wysunąć bolus o pojemności 1 nL. Upewnij się, że wszystkie zarodki zostały wstrzyknięte w ciągu pierwszych 40 minut rozwoju po zapłodnieniu.
11. Po zakończeniu wstrzyknięcia należy umieścić wstrzyknięte zarodki z powrotem na oznakowanej szalce Petriego, która zawiera 1x pożywkę E3 i pozwolić im rozwijać się przez cały dzień. Usuń wszystkie zarodki, które są niezapłodnione lub nie rozwijają się normalnie zgodnie z serią oceny stopnia zaawansowania danio pręgowanego²⁹.

4. Badania przesiewowe w kierunku somatycznych INDELs w zarodkach z wstrzyknięciem F0

UWAGA: Inne metody identyfikacji INDEL, takie jak test endonukleazy T7 I lub analiza topnienia w wysokiej rozdzielczości, mogą być używane przy określaniu, czy zarodki zawierają somatyczne INDELs ³⁰.

1. Następnego dnia po wstrzyknięciu należy usunąć wadliwe i zlizowane zarodki z szalki Petriego i zastąpić pożywkę 1x E3, aby utrzymać zdrowie zarodka.
2. Po oczyszczeniu naczynia należy pobrać sześć zdrowych zarodków, którym wstrzyknięto zarodki i dwa zarodki kontrolne z niewstrzykniętej płytki. Umieść każdy zarodek indywidualnie w jednym dołku probówki paskowej do PCR i oznacz górną część probówek.
3. Aby wyekstrahować genomowe DNA poszczególnych zarodków, należy usunąć nadmiar pożywki E3 z dołków probówki paskowej i dodać 100 μl 50 mM NaOH na studzienkę.
4. Inkubować zarodki w temperaturze 95 °C przez 20 minut. Następnie schłodzić próbki do temperatury 4 °C, dodać 10 μl 1 M Tris HCL (pH 7,5) i wirować je przez 5 do 10 s. Wyekstrahowane DNA może być przechowywane w temperaturze -20 °C przez co najmniej 6 miesięcy bez znaczącej degradacji DNA.
5. Zaprojektuj unikalne startery przesiewowe dla każdego miejsca prowadzącego, aby amplifikować fragment DNA o długości 100-110 pz, który zawiera miejsce docelowe CRISPR-Cas9. Jeśli to możliwe, umieść miejsce docelowe w środku amplifikowanego fragmentu, co pozwoli na identyfikację większych delecji.
6. Dla każdego z czterech docelowych miejsc przewodnich należy ustawić osiem reakcji PCR o pojemności 25 μl, używając 5 μl przygotowanego genomowego DNA pojedynczego zarodka, mieszanki PCR i starterów przesiewowych specyficznych dla przewodnika w celu identyfikacji mutacji somatycznych w miejscu docelowym (Tabela 1).
7. Odlewać 2,5% agarozy/0,5 μg/ml bromku etydyny/żelu TBE za pomocą grzebieni, które tworzą studzienki o szerokości około 0,625 cm. Ten szeroki grzebień pozwala na lepszą rozdzielczość podczas wykrywania zmian wielkości sekwencji genomowej. Po zestaleniu się żelu należy go umieścić w komorze elektroforetycznej, która zawiera bufor do pracy TBE.
8. Dodać 5 μl barwnika 6x ładującego do produktu PCR i załadować 25 μl tej mieszaniny do żelu. Upewnij się, że wstrzyknięta i kontrolna próbka znajdują się w tym samym rzędzie żelu. Po załadowaniu wszystkich próbek dodać 5 μl bromku etydyny na 1 l buforu do pracy TBE do dodatniego końca pudełka żelowego.
9. Uruchom żel pod napięciem 120 V, aż prążki DNA rozwiążą się lub DNA zbliży się do końca pasa. Jeśli Cas9 wytworzył INDELs w miejscu docelowym, rozmaz jest zwykle obserwowany w wstrzykniętych próbkach, ale nie w kontrolach.
10. Jeśli rozmazy zostaną zaobserwowane w co najmniej trzech z czterech miejsc prowadzenia w zarodkach, którym wstrzyknięto cztery prowadzące RNA, wyhoduj zarodki, którym wstrzyknięto rodzeństwo.
11. Za każdym razem, gdy wstrzyknięte próbki nie zawierają rozmazów w wymaganej liczbie miejsc przewodnika, zaprojektuj nowe przewodniki RNA, aby zastąpić te, które nie działały, i utwórz nową pulę przewodników RNA, która obejmuje te, które działały i nowo zaprojektowane. Wstrzyknąć i przetestować nową pulę dla somatycznych INDEL, jak opisano powyżej.

5. Identyfikacja fenotypów efektu matczynego w zarodkach matki chrupiących

UWAGA: Gdy wstrzyknięte samice F0 osiągną dojrzałość płciową, ich komórki linii rozrodczej mają potencjał do wytworzenia mieszanki matczynych zarodków chrupiących i dzikich zarodków. Mimo że ta mieszanka pozwala na wewnętrzną kontrolę zapłodnienia i czasu rozwoju, nadal korzystne jest ustawienie krzyżówki typu dzikiego jako kontroli zewnętrznej w przypadku, gdy lęg samicy F0 zawiera tylko matczyne zarodki chrupiące.

1. Po południu przed eksperymentem należy ustawić wstrzyknięte samice F0 przeciwko samcom typu dzikiego i kontrolować krzyżówki typu dzikiego w standardowych skrzynkach godowych danio pręgowanego. Umieść zarówno samca, jak i samicę w tym samym zbiorniku, ale oddziel je przegrodą do krycia lub umieść samicę we wkładce do składania jaj.
2. Rankiem w dniu eksperymentu pozwól samcowi i samicy rozpocząć krycie, np. usuwając przegrodę z pudełka godowego lub umieszczając samca w tej samej wkładce do składania jaj co samica.
3. Zbieraj zarodki co 10 minut, przenosząc wkładkę do składania jaj do nowego dna zbiornika godowego, który zawiera świeżą wodę systemową i oznacz zbiornik znacznikiem identyfikującym pojedynczą samicę F0. Weź stary zbiornik godowy i przelej wodę przez sitko do herbaty, aby zebrać zarodki z jednego pojedynczego 10-minutowego lęgu.
4. Po zebraniu zarodków z pojedynczego 10-minutowego lęgu w sitku, przenieś je na szalkę Petriego zawierającą 1x pożywkę E3. Oznaczyć szalkę Petriego datą pobrania i informacjami o rybach.
5. Pod mikroskopem preparacyjnym ze źródłem światła przechodzącego obserwuj zarodki w trakcie rozwoju co godzinę przez pierwsze 6-8 godzin i codziennie przez kolejne 5 dni.
6. Zidentyfikuj potencjalne matczyne zarodki chrupiące na podstawie poważnych zmian morfologicznych w ich rozwoju w porównaniu z dopasowanymi w czasie kontrolami typu dzikiego²⁹.
7. Przenieś potencjalne matczyne zarodki chrupiące na szalkę Petriego, która zawiera 1x pożywkę E3 i test na fenotyp morfologiczny przy 24 hpf i żywotności (np. Nadęcie pęcherza pławnego) po 5 dniach od zapłodnienia.

6. Sekwencjonowanie alleli u matczynych chrupiących haploidów

UWAGA: Matczyne haploidy zawierają pojedynczy allel w docelowym locus, co pozwala na identyfikację INDEL w docelowym genie za pomocą sekwencjonowania Sangera. Zarodki matczynych chrupiących haploidów można również analizować za pomocą testów sekwencjonowania nowej generacji. Oczekuje się, że zarodki, które wykazują matczyny fenotyp chrupiący, mogą zawierać zmianę w co najmniej jednym z czterech miejsc docelowych (patrz Dyskusja).

1. Po południu przed eksperymentem stwórz pary godowe samic F0, o których wiadomo, że produkują matczyne zarodki chrupiące, skrzyżowane z samcami typu dzikiego. Trzymaj samce typu dzikiego fizycznie oddzielone od samic za pomocą przegrody do puli godowej lub umieść samicę we wkładce do składania jaj.
2. Rankiem w dniu eksperymentu usuń fizyczną przegrodę lub umieść zarówno samce, jak i samice we wkładce do składania jaj, aby rozpocząć krycie. Przy pierwszych oznakach składania jaj przerwij rozmnażanie, oddzielając samca i samice F0. Trzymaj każdą oddzieloną samicę F0 w oddzielnych pudełkach do krycia.
3. Przygotuj roztwór nasienia poddany działaniu promieniowania UV, używając jąder od jednego samca typu dzikiego na każde 100 μl roztworu Hanka (Tabela 2), wystarczający do zapłodnienia wytłaczanych jaj od jednej samicy, jak opisano wcześniej³¹.
4. Ręcznie wyciśnij dojrzałe komórki jajowe od wstępnie wybranych samic F0 i przeprowadź zapłodnienie in vitro (IVF) przy użyciu nasienia ³¹.
5. Po zapłodnieniu in vitro pozwól haploidalnym zarodkom rozwinąć się do momentu zaobserwowania fenotypu chrupkości matki i umieść te zarodki na innej szalce Petriego.
6. Po zidentyfikowaniu matczynych, chrupiących haploidalnych zarodków, pozwól im rozwijać się przez co najmniej 6 godzin po zapłodnieniu.
7. Aby wyekstrahować genomowe DNA z co najmniej dziesięciu matczynych zarodków haploidalnych, należy umieścić pojedynczy haploidalny zarodek w pojedynczym dołku probówki paskowej do PCR, usunąć nadmiar pożywki E3 z dołka i dodać 50 μl 50 mM NaOH.
8. Inkubować zarodki w temperaturze 95 °C przez 20 minut. Następnie schłodzić próbki do temperatury 4 °C, dodać 5 μl 1 M Tris HCL (pH 7,5) i wirować przez 5-10 s. Wyekstrahowane DNA można przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do 6 miesięcy.
9. Aby zidentyfikować, które miejsca przewodnika zawierają INDEL, zaprojektuj startery sekwencjonowania w celu amplifikacji fragmentu DNA, który obejmuje wszystkie cztery miejsca docelowe CRISPR-Cas9. Te startery sekwencjonowania pozwalają na identyfikację INDEL, które obejmują wiele miejsc prowadzących.
10. Przygotuj dwie reakcje PCR po 25 μl na zarodek, używając 5 μl przygotowanego genomowego DNA i starterów sekwencjonowania.
11. Po zakończeniu PCR należy oczyścić i skoncentrować dwie próbki za pomocą zestawu do oczyszczania i koncentratora DNA (patrz tabela materiałów). Następnie prześlij fragment DNA do sekwencjonowania Sangera przy użyciu zarówno starterów sekwencjonowania do przodu, jak i do tyłu.
12. Po zsekwencjonowaniu haploidalnego fragmentu preparatu matczynego należy go wyrównać z sekwencją typu dzikiego i zidentyfikować INDELs w miejscach docelowych za pomocą programu do wyrównywania sekwencji.

Wyniki

Eksperymentalne podejście opisane w tym protokole pozwala na identyfikację fenotypów efektu matczynego w szybki, efektywny sposób (Rysunek 1).

Generowanie matczynych chrupków:
Projektując cztery przewodnikowe RNA tak, aby były ukierunkowane na pojedynczy potencjalny gen efektu matczynego, należy zwrócić szczególną uwagę na to, gdzie przewodnikowe RNA będą wiązać się z DNA. Ogólnie rzecz biorąc, wszystkie powinny być zgrupowane razem z minimalnym...

Dyskusja

Protokół przedstawiony w tym manuskrypcie pozwala na identyfikację i pierwszorzędową charakterystykę molekularną fenotypu efektu matczynego w jednym pokoleniu, a nie w wielu pokoleniach wymaganych zarówno dla technik genetycznych do przodu, jak i do tyłu. Obecnie rola wielu genów ulegających ekspresji matczynej jest nieznana. Ten brak wiedzy jest częściowo spowodowany dodatkowym pokoleniem wymaganym do wizualizacji fenotypu podczas identyfikacji genów efektu matczynego. W przeszłości szybką identyfikację genów efektu mat...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
1 M Tris-HCl (pH 8,4)	Invirogen	15568025	Do mieszanki PCR
1,5 ml probówek Eppendorf	Any Maker
10 mM dNTP	Thermo Fischer Scientific	18427013	Synteza gRNA
100 BP drabinka	Dowolny producent		Do elektroforezy żelowej
100% etanol wolny od RNAzy	Dowolny producent
100% RNAzy wolny etanol	Any Maker
100ml Zlewka	Dowolna maszyna		do IVF
5 M Ammonium Accetate	Thermo Fischer Scientific	Znaleziony w zestawie transkrypcyjnym MEGAshortscript T7	Synteza gRNA
70%			etanolu Synteza gRNA (70 ml etanolu + 30 ml   wody wolnej od nukleaz)
Borosil 1,0 mm OD x 0,5 mm ID	FHC INC	27-30-1	do mikroiniekcji
Bulk Pharma Wodorowęglan sodu 35 funtów	Bulk Reef Supply	255	Zaopatrzenie ryb
CaCl2	MiliporeSigma	C7902
Cas9 Białko z NLS	PNABio	CP01
ChopChop			https://chopchop.cbu.uib.no/
Stały oligonukleotyd	Zintegrowane DNA Technologie (IDT)		AAAAGCACCGACTCGGTGCCAC TTTTTCAAGTTGATAACGGACTA GCCTTATTTTAACTTGCTATTTC TAGCTCTAAAAC
Depresyjna szklana płyta	Thermo Fischer Scientific	13-748B	do IVF
Kleszcze preparacyjne	Dumont	SS	do IVF
Nożyczki preparacyjne	Fine Science Tools	14091-09	Do IVF
Steroskop preparacyjny (ze źródłem światła przechodzącego)	Dowolny producent		do IVF
DNA Clean & Koncentrator -5	Zymo Research	D4014	Synteza gRNA
DNA Gel Loading Dye (6x)	Dowolny producent		Do elektroforezy żelowej
EconoTaq DNA Polymerase	Lucigen	30032-1	Do PCR mix
Elektrofereza Zasilacz	Dowolny producent		Do elektroforezy żelowej
Ensemble			https://useast.ensembl.org/index.html
Eppendorf  Końcówki do mikroładowarek Femtojet do mikrowtryskiwaczy Femtojet	Thermo Fischer Scientific	E5242956003	do mikroiniekcji
Etanol (200 proof, bez nukleazy)	Any Maker
FemtoJet 4i	Eppendorf	5252000021	do mikroiniekcji
Sieć rybacka	Any Maker		Zaopatrzenie ryb
Mrożone krewetki solankowe	Solanka Krewetki bezpośrednie		Zaopatrzenie w ryby
Ogólna uniwersalna agaroza	Dowolna producentka		Do elektroforezy żelowej
Specyficzne dla genów oligonukleotydy	Zintegrowane technologie DNA (IDT)		TAATACGACTCACTATA- N20 -GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG
	Rękawice Any Maker
Wiadro na lód	Dowolny producent
Natychmiastowa sól oceaniczna	Dowolny producent		Zaopatrzenie w ryby
Invitrogen UltraPure Ethidium Bromde, 10 mg/mL	Thermo Fischer Scientific	15-585-011
KCl	MiliporeSigma	P5405
KH2PO4	MiliporeSigma	7778-77-0
Kimwipes	Thermo Fischer Scientific	06-666
Męski i Samica danio
MEGAshortscript T7 Zestaw do transkrypcji	Thermo Fischer Scientific	AM1354	Synteza gRNA
Błękit metylenowy	Thermo Fischer Scientific	AC414240250	dla E3
MgCl2	MiliporeSigma	7791-18-6	Do mieszanki PCR
MgSO2· 7H2O	MiliporeSigma	M2773
Plastikowa forma do mikroiniekcji	Świat Precyzyjne instrumenty	Z-Molds	do mikroiniekcji
Mikromanipulator	Dowolny producent	mikropipet do mikroiniekcji
Ściągacz do mikropipet	Sutter	P-87	do mikroiniekcji
Końcówki do mikropipeterów z filtrami (wszystkie rozmiary)	Any Maker
Końcówki do mikropipet bez filtrów (wszystkie rozmiary)	Any Maker
Microwave	Any Maker
Mineral Oil	MiliporeSigma	m5904-5ml	do mikroiniekcji
MS-222 (Tricaine-D)	Any Maker		zatwierdzony przez FDA
Na2 HPO4	MiliporeSigma	S3264
NaCl	MiliporeSigma	S5886
NaHC03	MiliporeSigma	S5761
Nanodrop	Any Maker
NaOH	MiliporeSigma	567530
Nieprzywierające, wolne od RNaz probówki do mikrofuge, 1,5 ml	Ambion	AM12450	Synteza
wody wolnej od nukleaz	Dowolny producent
Ręcznik papierowy	Dowolny producent
Pipety Pastro	Dowolny producent
Probówki paskowe PCR	Dowolny producent
Płytki Petriego o średnicy 100 mm	Dowolny producent Roztwór
czerwieni fenolowej	MiliporeSigma	P0290	do mikroiniekcji
Plastikowe pestale	VWR	47747-358	Do
plastikowej łyżki	Dowolny producent		Do IVF
Premium Grade Solanka Krewetki	Krewetki Bezpośrednie		Drobnokomórkowe
RNA Gel Loading Dye		znalezione w zestawie do transkrypcji MEGAshortscript T7	Do elektroforezy żelowej
RNAse AWAY	Thermo Fischer Scientific	21-402-178
Skala	dowolnego producenta
Sharpie	dowolnego producenta
Szpatułka	Dowolny producent
Sterylny H2O	Dowolny ekspres		do mieszanki PCR
Polimeraza DNA T4	NEB	M0203	Synteza taśmy gRNA
	Dowolny producent
TBE (Tris-Boran-EDTA) 10x	Dowolna maszyna		Do elektroforezy żelowej
Tea Stainer	Amazon	IMU-71133W	Zaopatrzenie ryb
Grzebień Thermo Scientific Owl 12-zębny, grubość 1,0/1,5 mm, dwustronny do B2	Thermo Fischer Scientific	B2-12	do elektroforezy żelowej
Thermo Scientific  Owl EasyCast B2 Mini żelowe systemy elektroforezy	Thermo Fischer Scientific	09-528-110B	Do elektroforezy żelowej
Termocykler	Dowolny producent
Termocykler	Dowolny producent
Lampa UV		UVP Model XX-15 (nr kat. UVP18006201)
okularów ochronnych UVF UVF	Dowolny producent
butelki do mycia	Thermo Fischer Scientific	S39015	Zaopatrzenie ryb
Pudełka godowe danio pręgowanego	Aqua Schwarz	SpawningBox1	Zaopatrzenie ryb
1,5 ml Probówki Eppendorf	Fisher Scientific	05-402-11
10 dNTP trzonowych Drabina
100 BP	Thermo Fischer Scientific	15628019
100% etanol wolny od RNAzy	dowolny producent
5m Ammonium Accetate	Thermo Fischer Scientific
70% etanolu			70ml etanolu i 30 ml wody wolnej od nukleaz
Akcesoria do poziomego pudełka żelowego	Fisher Scientific		0,625 mm
Agaroza	dowolny producent
CaCl2	Sigma	10043-52-4
CaCl2, dwuwodny	Sigma	10035-04-8	E3 Średnia
rurka kapilarna	Cole-Parmer	UX-03010-68	do igieł iniekcyjnych
Cas9 Protein	Thermo Fischer Scientific	A36496
ChopChop	https://chopchop.cbu.uib.no/
Komputer	dowolny producent
Sekcja Forcepts	dowolny producent
Mikroskop preparacyjny	dowolny producent
Nożyczki preparacyjne	dowolny producent
DNA Clean & Koncentrator -5	Zymo Research	D4014
Barwnik ładujący żel DNA (6X)	Thermo Fischer Scientific	R0611
EconoTaq Polimeraza DNA	Lucigen	30032-1
Ensemble	https://useast.ensembl.org/index.html
Eppendorf Microloader PipetTips	Fischer Scientific	10289651	20 mikrolitrów
Etanol (200 proof, bez nukleaz)	dowolny producent
Bromek etydyny	Thermo Fischer Scientific	15585011
Sieć na ryby	dowolnego producenta		drobna siatka
Mrożone krewetki solankowe	LiveAquaria	CD-12018	pokarm dla ryb
Grzebień żelowy (0,625 mm)	dowolny producent
System elektroferezy żelowej	dowolny producent
z oligonukleotydami specyficznymi dla genów	(IDT)
Szklana igła kapilarna	Grainger	21TZ99	https://www.grainger.com/product/21TZ99?ef_id=Cj0KCQjw8Ia GBhCHARIsAGIRRYpqsyA3-LUXbpZVq7thnRbroBqQTbrZ_a88 VVcI964LtOC6SFLz4ZYaAhZzEAL w_wcB:G:s& s_kwcid=AL!2966!3! 264955916096!!! g!438976 780705!& gucid=N:N:PS:Płatny :GGL:CSM-2295:4P7A1P:20501 231& gclid=Cj0KCQjw8IaGBh CHARIsAGIRRYpqsyA3-LUXbp ZVq7thnRbroBqQTbrZ_a88VVcI 964LtOC6SFLz4ZYaAhZzEALw _wcB& gclsrc=aw.ds
Naczynia szklane	dowolny producent
Rękawice	dowolnego producenta
Końcowe Rozwiązanie			Hanka Połącz 9,9 ml Premiksu Hanka z 0,1 ml Bulionu HS #6
Hank's Premix			połącz następujące elementy w kolejności: (1) 10,0 ml HS #1, (2) 1,0 ml HS#2, (3) 1,0 ml HS#4, (4) 86 ml ddH2O, (5) 1,0 ml HS#5. Przechowuj wszystkie solotiony HS w 4C
			Hanksa
		Hanksa	https://www.jove.com/pdf-materials/51708/jove-materials-51708-production-of-haploid-zebrafish-embryos-by-in-vitro-fertilization
Podstawowy roztwór Hanka #1			8,0 g NaCl, 0,4 g KCl w 100 ml ddH2O
Roztwór podstawowy Hanka #2			0,358 g Na2HPO4 bezwodny; 0,60 g K2H2PO4 w 100 ml ddH2O
Roztwór podstawowy Hanka #4			0,72 g CaCl2 w 50 ml ddH2O
Roztwór podstawowy Hanka #5			1,23 g MgSO47H2O w 50 ml ddH20
Roztwór podstawowy Hanka #6			0,35 g NaHCO3 w 10,0 ml ddH20; Zrób świeży dzień użytkowania
HCl	Sigma	7647-01-0
Wiadro na lód	dowolny producent
Natychmiastowa sól oceaniczna	dowolna maszyna		do wody dla ryb
Zestaw do transkrypcji in vitro Mega Short Script	Thermo Fischer Scientific	AM1354
Invitrogen™ UltraPure&handel; Woda destylowana bez DNaz/RNaz	Fisher Scientific	10-977-023
KCl	Sigma	7447-40-7	E3 Medium
KH2PO4	Sigma	7778-77-0
Kimwipes	Fisher Scientific	06-666
Samce i samice danio
Mega Short Script T7 Zestaw do transkrypcji	Thermo Fischer Scientific	AM1354
błękit metylenowy	Fisher Scientific	AC414240250	E3 Medium
MgSO2-7H2O	Sigma	M2773
Mikroimikromanipulator
Plastikowa forma do mikroiniekcji	Świat Precision	Instruments Z-Molds
Mikrowtryskiwacz
Suwak	mikroigłowy
Mikropipeter (1-10) z końcówkami,	każdy producent		Filtrowane końcówki P10
Mikropipeter (20-200) z końcówkami	dowolnego producenta
Mikropipeter (100-1000) z końcówkami	dowolnego producenta
Szkiełko
Kuchenka mikrofalowa	dowolnego producenta
MiliQ Woda	dowolna Maker
Olej mineralny	Sigma-Aldrich	M5904-5ml
Na2HPO4	Sigma
NaCl	Sigma	S9888
NaHC02	Sigma	223441
Nanodrop
NaOH	Sigma	567530
Wąska szpatułka	dowolny producent
Ściągacz do igieł	Sutter	P-97
	dowolnego producenta
Pipety Pastro	Fisher Scientific	13-678-20A
Miejsce prowadzenia startera PCR	Zintegrowane technologie DNA (IDT)
Startery PCR prowadnica flankująca miejsce cięcia RNA	Zintegrowane technologie DNA (IDT)		Standard odsalany
Probówki paskowe do PCR	Thermo Fischer Scientific	AB0771W
szalki Petriego	Fisher Scientific	FB0875714	10 cm średnica 100mm x 15mm
Fenol Red	Fisher Science	S25464	https://www.fishersci.com/shop/products/phenol-red-indicator-solution-0-02-w-v-2/S25464
Końcówki do pipet	dowolnego producenta		Końcówki 10ul, 200ul i 1000ul
Plastikowe pestki	Fisher Scientific	12-141-364
Plastikowa łyżka	dowolnego producenta
Przewodnik po podkładach Zintegrowane	technologie DNA (IDT)
Żyletka	Uline	H-595B
Żel RNA Ładowanie barwnika	w megakrótkim zestawie skryptów (zestaw do transkrypcji in vitro)
RNAzyj od	Fishera	21-402-178
Probówki do mikrowirówek polipropylenowych bez RNA	Thermo Fischer Scientific	AM12400	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/AM12400#/AM12400
Woda wolna od RNAzy	Fisher Scientific	10-977-023
Skala	dowolnego producenta
Sharpie	dowolny producent
Wodorowęglan sodu (komórka testowane pod kątem kultur)	Sigma	S5761	woda rybna
Bromek sodu Solotion	Sigma	E1510
Oprogramowanie do sekwencjonowania Sangera Analiza
Spektrofotometr
Sterlie H2O	dowolnej marki
T4 DNA Polimeraza	NEB	M0203S	https://www.neb.com/products/m0203-t4-dna-polymerase#Product%20Information
Taśma	dowolnej marki
TBE (Tris-Borate-EDTA) 10X	Thermo Fischer Scientific	B52	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/B52#/B52
Tea Stainer	amazon	IMU-71133W	dostępny w większości sklepów kuchennych
Termocykler
Pipeta transferowa	Uline	S-24320
Transilluminator
Tricaine	fisher scientific	NC0872873
Tris HCl 7.5	Thermo Fischer Scientific	15567027
Uniwersalny podkład	Zintegrowane technologie DNA (IDT)		AAAAGCACCGACTCGGTGCCAC TTTTTCAAGTTGATAACGGACTAG CCTTATTTTAACTTGCTATTTCTA GCTCTAAAAC
Lampa UV	UVP
UVP dowolnego producenta
Butelka do mycia	fisher scientific	S39015
Pudełka godowe danio pręgowanego	dowolny producent
Przepis na	bufor PCRDodać 171,12 ml sterylnego H20; 0,393 ml 1M MgCl2; 2,616 ml 1 mln MgCl2; 2,618 ml 1M Tris-HCl (pH 8,4) 13,092 ml 1M KCl; 0,262 ml 1% żelatyny. Autoklaw przez 20 minut, a następnie schłodź solotion na lodzie. Następnie dodaj 3,468 ml 100 mg/ml BSA; 0,262 ml dATP (100 mM), 0,262 ml dCTP (100 mM); 0,262 ml dGTP (100 mM);   0,262 ml dTTP (100 ml). Alliquote do sterylnych probówek eppendorfa