Artykuł metodologiczny

Identyfikacja źródła wydzielanych białek w nerkach za pomocą wstrzyknięcia Brefeldin A

DOI:

10.3791/63178

⸱

10 listopada 2021

 ,  ,  , 
1Division of Nephrology and Hypertension, Department of Medicine, Vanderbilt University Medical Center

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Identyfikacja typu komórki odpowiedzialnej za wydzielanie cytokin jest niezbędna do zrozumienia patobiologii choroby nerek. W tym miejscu opisujemy metodę ilościowego barwienia tkanki nerkowej pod kątem cytokin wytwarzanych przez komórki nabłonka nerki lub śródmiąższu przy użyciu brefeldyny A, inhibitora wydzielania i markerów specyficznych dla typu komórkowego.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przewlekła choroba nerek (PChN) jest jedną z dziesięciu głównych przyczyn zgonów w USA. Ostre uszkodzenie nerek (AKI), choć często możliwe do wyleczenia, predysponuje pacjentów do PChN w późniejszym życiu. Komórki nabłonka nerek zostały zidentyfikowane jako kluczowe węzły sygnalizacyjne zarówno w AKI, jak i PChN, dzięki czemu komórki mogą określać przebieg choroby poprzez wydzielanie cytokin i innych białek. Szczególnie w przypadku PChN kilka linii dowodów wykazało, że nieprzystosowanie naprawione komórki kanalików napędzają postęp choroby poprzez wydzielanie transformującego czynnika wzrostu beta (TGF-β), czynnika wzrostu tkanki łącznej (CTGF) i innych cytokin profibrotycznych. Jednak identyfikacja źródła i względnej liczby wydzielanych białek z różnych typów komórek in vivo pozostaje wyzwaniem.

Ten artykuł opisuje technikę wykorzystującą brefeldynę A (BFA) do zapobiegania wydzielaniu cytokin, umożliwiając barwienie cytokin w tkance nerkowej przy użyciu standardowych technik immunofluorescencyjnych. BFA hamuje transport retikulum endoplazmatycznego (ER) do aparatu Golgiego, który jest niezbędny do wydzielania cytokin i innych białek. Wstrzyknięcie BFA na 6 godzin przed uśmierceniem prowadzi do nagromadzenia TGF-β, PDGF i CTGF wewnątrz komórek kanalików proksymalnych (PTC) w mysim modelu cisplatyny AKI i TGF-β w mysim modelu PChN z kwasem arystolochowym (AA). Analiza wykazała, że BFA + cisplatyna lub BFA + AA znacznie zwiększyły TGF-β-dodatni sygnał w porównaniu z BFA + solą fizjologiczną, cisplatyną lub samym AA. Dane te sugerują, że BFA może być używany do identyfikacji typu komórki produkującej określone cytokin i ilościowego określania względnych ilości i/lub różnych typów wytwarzanych cytokin.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Szacuje się, że >10% światowej populacji cierpi na jakąś formę choroby nerek1. Definiowany przez szybki początek, AKI jest w dużej mierze uleczalny; jednak epizod AKI może predysponować pacjentów do rozwoju PChN w późniejszym życiu2,3. W przeciwieństwie do AKI, PChN charakteryzuje się postępującym zwłóknieniem i pogorszeniem czynności nerek, co prowadzi do schyłkowej niewydolności nerek wymagającej terapii nerkozastępczej. Większość urazów nerek jest ukierunkowana na wyspecjalizowane komórki nabłonkowe, takie jak podocyty lub komórki kanalików proksymalnych, które tworzą nephron4,5. Po urazie komórki nabłonka, które przeżyły, pomagają koordynować odpowiedź naprawczą poprzez wydzielanie cytokin i innych białek. W ten sposób komórki, które przeżyły, mogą modulować odpowiedź immunologiczną, kierować przebudową macierzy zewnątrzkomórkowej i wspomagać regenerację narządów.

Cytokiny to małe, wydzielane białka niezbędne do modulowania dojrzewania, wzrostu i reakcji organizmów wielokomórkowych6,7. Funkcjonują jako przekaźniki sygnałowe między różnymi typami komórek, w tym komórkami odpornościowymi i nabłonkowymi8. Chociaż uważa się, że cytokiny są wydzielane głównie przez komórki odpornościowe, wieloletnie badania wykazały, że komórki nabłonka nerek i śródmiąższowe również wydzielają cytokiny jako sygnały dla innych rezydentnych komórek nerkowych, takich jak komórki kanalików, komórki śródmiąższowe i komórki odpornościowe9,10. W szczególności PTC odgrywają ważną rolę w fazie inicjacji i odzyskiwania po AKI11. Wiadomo jednak, że nieprzystosowanie naprawione PTC wydzielają cytokiny profibrotyczne, takie jak transformujący czynnik wzrostu-β (TGF-β), płytkopochodny czynnik wzrostu D (PDGF-D) i czynnik wzrostu tkanki łącznej (CTGF), przyczyniając się do progresji PChN12. W ten sposób komórki nabłonka nerek wykorzystują wydzielane cytokiny do modulowania uszkodzenia nerek.

Chociaż wiadomo, że komórki nabłonka nerek wydzielają cytokiny, dokładne źródło i względny udział każdego typu komórek były trudne do określenia ze względu na techniczne wyzwania związane z badaniem wydzielanych białek13. Cytometria przepływowa, powszechne podejście stosowane do pomiaru cytokin, jest trudna do wykonania na uszkodzonych nerkach, zwłaszcza w nerkach silnie zwłóknieniowych. W przypadku rekombinazy Cre napędzanej przez promotor cytokin, myszy reporterowe cytokin są często używane do identyfikacji typu komórki, która wyraża daną cytokinę. Jednak użycie myszy reporterowych jest ograniczone ze względu na wymóg krzyżowania myszy reporterowych z różnymi tłami nokautującymi, brak odpowiednich reporterów oraz fakt, że tylko jedna cytokina może być analizowana na raz. Dlatego konieczne jest opracowanie prostej, wszechstronnej i niedrogiej techniki wykrywania komórek nerkowych uwalniających cytokiny.

Postawiliśmy hipotezę, że wstrzyknięcie BFA, inhibitora wydzielania, który blokuje endoplazmatyczny transport retikulum i Golgiego in vivo, pozwoliłoby na zabarwienie wydzielanych białek w tkance nerkowej (Rysunek 1A,B), jak pokazano w testach opartych na cytometrii przepływowej14,15. Wraz z twórcami specyficznymi dla typu komórek, technika ta może być wykorzystana do identyfikacji źródła i względnego udziału komórek wytwarzających cytokin w uszkodzonych nerkach. W przeciwieństwie do próbek do cytometrii przepływowej, utrwalone tkanki mogą być przechowywane przez długi czas z zachowaniem białek i struktur komórkowych, co pozwala na dokładniejsze badanie komórek wydzielniczych. Aby przetestować tę hipotezę, nerki myszy zostały uszkodzone za pomocą modelu AKI (cisplatyny) i modelu PChN (nefropatii kwasu arystolochowego (AAN)), wstrzyknięto BFA i wybarwiono przy użyciu standardowych technik immunofluorescencyjnych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z protokołem użytkowania zwierząt zatwierdzonym przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowników Centrum Medycznego Uniwersytetu Vanderbilt.

1. Zwierzęta

  1. Użyj 8-12-tygodniowych samców myszy BALB/c (masa ciała: około 25 g) do nefropatii wywołanej cisplatyną lub kwasem arystolochowym.
  2. Upewnij się, że myszy są zdrowe i nie mają widocznych oznak niepokoju lub ran spowodowanych walką.
    UWAGA: Rany, zwłaszcza na ogonie, mogą zakłócać opisany tutaj protokół. Myszy BALB/c zostały wybrane, ponieważ łatwiej jest uwidocznić żyłę ogonową do wstrzyknięcia u tych myszy. Opisany tutaj protokół działa w przypadku innych szczepów myszy; Jednak dawkowanie cisplatyny lub kwasu arystolochowego może się różnić w zależności od szczepu.

2. Wstrzyknięcie cisplatyny

  1. Rozpuścić cisplatynę w sterylnym roztworze soli fizjologicznej do końcowego stężenia 1 mg/ml.
    UWAGA: Cisplatyna nie rozpuści się całkowicie w temperaturze pokojowej. Należy go obsługiwać w dygestorium.
  2. Roztwór cisplatyny ogrzać w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C i kilkakrotnie mieszać, aż cisplatyna całkowicie się rozpuści.
  3. Zważyć myszy i obliczyć objętość roztworu cisplatyny potrzebną do wstrzyknięcia 20 mg/kg masy ciała.
  4. Zdezynfekuj skórę brzucha za pomocą wacików z jodonem (7,5%) i alkoholem (70%) na przemian po 3 razy.
  5. Za pomocą strzykawki insulinowej z igłą 25 G wstrzyknąć roztwór cisplatyny dootrzewnowo.
  6. Przejść do punktu 4 w 3 dniu po wstrzyknięciu.

3. Wstrzyknięcie kwasu arystolochowego (AA)

  1. Rozpuścić kwas arystolochowy-I w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) w końcowym stężeniu 0,5 mg/ml.
    UWAGA: Z AA należy obchodzić się pod wyciągiem. Należy stosować AA-I, ponieważ jest to dominująca forma wywołująca uszkodzenie nerek.
  2. Ogrzać roztwór AA w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C i kilkakrotnie mieszać, aż do całkowitego rozpuszczenia.
  3. Zważyć myszy i obliczyć objętość roztworu AA do wstrzyknięcia 5 mg/kg masy ciała.
  4. Zdezynfekuj skórę brzucha za pomocą wacika z jodonem powidonu (7,5%) i alkoholu (70%) 3x.
  5. Za pomocą strzykawki insulinowej z igłą 25 G wstrzyknąć roztwór AA dootrzewnowo.
  6. Wstrzykiwać AA co drugi dzień, w sumie 3 wstrzyknięcia.
  7. Przejść do punktu 4 w 42 dniu po ostatnim wstrzyknięciu.

4. Przygotowanie roztworu BFA

  1. Rozpuścić BFA w dimetylosulfotlenku w stężeniu 10 mg/ml w celu uzyskania roztworu podstawowego.
  2. Przechowywać roztwór podstawowy w temperaturze -20 °C.
  3. Rozcieńczyć roztwór podstawowy BFA sterylnym PBS do końcowego stężenia roboczego 1,25 mg/mL
    UWAGA: Za każdym razem bezpośrednio przed wstrzyknięciem należy przygotować świeży roztwór roboczy.

5. Iniekcja do żyły ogonowej BFA

  1. Przed wstrzyknięciem należy założyć klatkę do połowy, a do połowy odłożyć poduszkę grzewczą o temperaturze 37 °C na 10 minut, aby upewnić się, że myszy są ciepłe, aby zapobiec spadkowi temperatury ciała, który może spowodować zwężenie naczyń krwionośnych w ogonie i zakłócić wstrzyknięcie.
    UWAGA: Umieść klatkę na poduszkach grzewczych tak, aby połowa klatki znajdowała się na podkładce, a połowa nie. W ten sposób, gdy myszom jest ciepło, mogą przejść na drugą stronę klatki i odwrotnie. Aby uniknąć oparzeń termicznych, konieczne jest użycie poduszki grzewczej sterowanej termostatem w temperaturze 37 °C.
  2. Skrępować myszy za pomocą dostępnych na rynku urządzeń przytrzymujących o odpowiedniej wielkości.
  3. Zdezynfekuj ogon za pomocą trzykrotnie jodowego jodu powidonu i wacika nasączonego alkoholem, jak opisano powyżej.
  4. Trzymaj ogon poziomo i wizualizuj boczne żyły ogonowe (Rysunek 1C).
    UWAGA: Zastosowanie dostępnych na rynku platform iniekcji żył ogonowych z wbudowanymi niskotemperaturowymi źródłami światła LED może pomóc w łatwiejszym zlokalizowaniu żyły ogonowej. Można stosować inne źródła światła, ale należy uważać, aby uniknąć oparzeń termicznych.
  5. Wprowadzić igłę 28 G, trzymając igłę i strzykawkę równolegle do żyły w kierunku głowy.
  6. Wstrzyknąć 200 μl roztworu BFA o stężeniu 1,25 mg/ml (0,25 mg BFA). Poczekaj, aż żyła stanie się czysta, gdy krew zostanie zastąpiona roztworem do wstrzykiwań, co oznacza, że wstrzyknięcie się powiodło.
  7. Wyjąć igłę i delikatnie docisnąć ogonek, aż krwawienie ustanie.
  8. Umieść myszy z powrotem w klatce i monitoruj je pod kątem dodatkowego krwawienia lub oznak niepokoju.

6. Ofiarowanie i pobieranie nerek

  1. Sześć godzin po wstrzyknięciu BFA należy poddać myszy eutanazji za pomocą przedawkowania izofluranu, 5% izofluranu w słoiku, a następnie zwichnięcia szyjki macicy, aby zapewnić śmierć.
    UWAGA: Punkt czasowy 6 godzin został wybrany na podstawie literatury wykazującej, że 6 godzin leczenia BFA w innych narządach pozwala na wystarczającą akumulację cytokin w komórkach, aby uwidocznić je za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego16.
  2. Bezpośrednio po złożeniu ofiary odsłoń brzuch myszy przez brzuszne nacięcie linii środkowej.
  3. Odsłoń serce, chwytając mostek kleszczami. Za pomocą nożyczek przetnij klatkę piersiową po lewej i prawej stronie mostka. Należy zachować ostrożność, aby uniknąć nacięcia serca lub głównych naczyń krwionośnych. Przetnij tkankę osierdzia, aby uwolnić serce od ściany klatki piersiowej.
  4. Zebrać 100-500 μl krwi do testu azotu mocznikowego (BUN) we krwi przez nakłucie serca. Użyj igieł 25 G i strzykawek insulinowych o pojemności 1 ml, aby pobrać krew. Aby zapobiec krzepnięciu, dodać 5 μl roztworu heparyny (100 mg/15 ml dH2O) do każdej próbki.
    UWAGA: Do testu BUN potrzebne jest co najmniej 20 μl krwi; jednak około 500 μl można pobrać przez nakłucie serca po eutanazji, co może być przydatne w innych testach. Zbierz jak najwięcej krwi.
  5. Próbki krwi należy przechowywać na lodzie do czasu pobrania nerek, o których mowa w sekcji 7 poniżej.
    1. Odwirować próbki krwi o masie 1 300 × g przez 10 minut.
    2. Delikatnie wyizolować osocze i przechowywać je w temperaturze -20 °C do czasu, gdy będzie gotowe do przeprowadzenia testu BUN w sekcji 17 poniżej. Alternatywnie, przechowuj próbki osocza do testów kreatyniny.

7. Perfuzja i usunięcie nerek

  1. Przeprowadzić fuzję myszy z 10-20 ml PBS przez lewą komorę za pomocą strzykawki o pojemności 20 ml z szybkością przepływu 2-4 ml / min, aż perfuzat stanie się czysty.
  2. Usuń nerki, przytrzymując tętnicę nerkową i żyłę kleszczami blisko brodawki i przecinając naczynia z boku z dala od nerki.
  3. Delikatnie wyjmij torebkę nerkową, odklejając ją ręcznie lub za pomocą cienkich, sterylnych kleszczyków.
  4. W zależności od przeciwciała należy przejść do sekcji 8 w celu przygotowania utrwalonej tkanki zatopionej w parafinie lub sekcji 10 w celu przygotowania utrwalonej zamrożonej tkanki.
    UWAGA: Przetwarzanie tkanek będzie musiało być zoptymalizowane dla każdego przeciwciała, które ma być użyte do barwienia.

8. Tkanka zatopiona w parafinie do barwienia TGF-β i PDGF-D

  1. Przetnij nerkę, umieszczając ją na czystym szkiełku podstawowym i przecinając poziomo nową żyletką. Umieść jedną połówkę w 10 ml 4% paraformaldehydu (PFA) w PBS przez 24 godziny na rotatorze typu end-over-end z prędkością 10 obrotów na minutę (rpm).
    UWAGA: Cała nerka nie jest potrzebna do sekcji. Jedna połowa nerki może być przechowywana lub używana do innych testów.
  2. Zastąp PFA 70% etanolem.
  3. Na tym etapie należy przesłać połówkę nerki do przetworzenia i zatopienia w parafinie, a następnie przeciąć tkanki nerkowe zatopione w parafinie pod kątem 4-6 μm za pomocą mikrotomu i zamontować je na wstępnie oczyszczonych, naładowanych szkiełkach17,18.
    UWAGA: Nerki zostały przetworzone i zatopione w parafinie przez Vanderbilt University Medical Center Translational Pathology Shared Resource i przechowywane w temperaturze pokojowej.

9. Deparafinizacja i ponowne nawodnienie

  1. Umieść szkiełka w stojaku do barwienia szkiełek i zanurz je w studzience barwiącej zawierającej D-limonen na 5 minut, upewniając się, że tkanka jest całkowicie zanurzona. Powtórz w studzience zawierającej świeży D-limonen.
  2. Ponownie nawodnić tkanki, zanurzając szkiełka w seryjnych rozcieńczeniach etanolu 100% (2x), 95%, 90% i 70% przez 5 minut każde.
  3. Myć szkiełka w przepływie dH2O przez 5 minut.
  4. Pobrać antygen przez inkubację skrawków w buforze cytrynianowym (pH 6,0) w szybkowarze w temperaturze 121 °C i ciśnieniu 15 psi przez 45 minut.
  5. Myć szkiełka w przepływie dH2O przez 20 minut.
  6. Przejdź do sekcji 12.

10. Przygotowanie zamrożonej tkanki do barwienia CTGF

  1. Przeciąć nerkę wzdłuż osi poziomej na pół za pomocą świeżej żyletki.
    UWAGA: Cała nerka nie jest potrzebna do sekcji. Jedna połowa nerki może być przechowywana lub używana do innych testów.
  2. Umieścić połówkę nerki w 10 ml 0,5% PFA w probówce o pojemności 15 ml na rotatorze na 2 godziny w temperaturze 4 °C z prędkością 10 obr./min.
  3. Zdekantować PFA do pojemnika w celu właściwej utylizacji i dodać 10 ml 0,1 M glicyny do PBS przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C z prędkością 10 obr./min.
  4. Zdekantować glicynę, dodać 10 ml 15% sacharozy rozpuszczonej w PBS i umieścić probówkę na noc na rotatorze w temperaturze 4 °C i 10 obr./min.
  5. Zdekantować 15% sacharozę i zastąpić 10 ml 30% sacharozy rozpuszczonej w PBS przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C i przy 10 obr./min.
  6. Napełnij formę do zatapiania związkiem o optymalnej temperaturze cięcia (OCT) i osadź połowę nerki od kroku 10.5 z powierzchnią cięcia nerki skierowaną w dół.
  7. Umieść formę zawierającą półnerkę i OCT ostrożnie w kałuży ciekłego azotu do zamrożenia.
    UWAGA: Nie pozwól, aby ciekły azot miał bezpośredni kontakt z OCT, ponieważ może to spowodować tworzenie się pęcherzyków. Podczas używania ciekłego azotu należy nosić odpowiednie środki ochrony osobistej, takie jak gogle/osłona twarzy, rękawice kriogeniczne i fartuch laboratoryjny. Do umieszczenia foremek w ciekłym azocie najlepiej użyć długich, ~25 cm, kleszczy.
  8. Po zamrożeniu formy należy przechowywać w temperaturze -80 °C.

11. Zamrożone sekcje

  1. Upewnij się, że kriostat ma temperaturę -20 °C.
  2. Formy zawierające próbki należy przechowywać w OCT w kriostacie w temperaturze -20 °C przez 2 godziny w celu zrównoważenia temperatury.
  3. Wyjmij formę, przytrzymując wypustki i naciskając od dołu.
  4. Umieść świeży OCT na uchwycie próbki i umieść zamrożony blok próbki na górze, stroną z tkanką skierowaną w stronę przeciwną do uchwytu próbki.
  5. Umieść uchwyt na próbkę i próbkę na półce do zamrażania.
  6. Umieść obciążony ekstraktor ciepła na górze bloku, aby spłaszczyć powierzchnię. Pokrywę kriostatu należy zamykać, gdy nie jest używana, aby zapobiec wahaniom temperatury.
  7. Po zamrożeniu świeżego OCT między blokiem próbki a uchwytem próbki sprawdź, czy połączenie jest bezpieczne.
  8. Clamp uchwyt próbki na głowicy mikrotomu kriostatu.
  9. Rozpocznij cięcie, aż tkanka będzie widoczna w bloku próbki.
  10. Podziel tkankę nerkową na 4-6 μm i przenieś skrawki na szkiełko o temperaturze pokojowej19.
  11. Po pobraniu chusteczki należy przechowywać szkiełko w temperaturze od -20 °C do -80 °C, aż będzie gotowe do barwienia. Nie pozwól, aby się rozmroził, dopóki nie będzie gotowy do rozpoczęcia barwienia.
  12. Przed barwieniem wyjmij szkiełko (szkiełka) z magazynu i pozostaw do ogrzania do temperatury pokojowej. Nie dopuścić do wyschnięcia sekcji.
  13. Po osiągnięciu temperatury pokojowej natychmiast umyj skrawki PBS przez 5 minut dwa razy w temperaturze pokojowej, aby wyeliminować związek OCT.
  14. Przejdź do sekcji 12.

12. Barwienie immunofluorescencyjne

  1. Obrysuj skrawki tkanki hydrofobowym markerem barierowym. Zachowaj co najmniej 5 mm odległości od tkanki do obrysu bariery hydrofobowej.
  2. Dodać 50 μl buforu blokującego zawierającego 3% surowicy osła i 0,1% Tritonu w 1% albuminy surowicy bydlęcej/soli fizjologicznej buforowanej Tris (TBS) na wierzch sekcji i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w wilgotnej komorze.
  3. Rozcieńczyć przeciwciała pierwszorzędowe PBS w odpowiednim stężeniu. Do wykrywania cytokin należy użyć 50 μl roztworów pierwszorzędowych przeciwciał skierowanych przeciwko TGF-β1 (1:200), PDGF-D (1:400) i CTGF (1:200). Do znakowania miofibroblastów należy użyć 50 μl roztworu pierwszorzędowego przeciwciała skierowanego przeciwko aktynie alfa-mięśni gładkich (α-SMA) sprzężonej z Cy3 w stosunku 1:200.
  4. Usunąć roztwór blokujący i dodać pierwszorzędowe przeciwciała do sekcji, upewniając się, że nie wycieka ona z okrągłego konturu hydrofobowego i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C w wilgotnej komorze. Ponownie nałóż barierę hydrofobową, jeśli wystąpi wyciek.
  5. Myć 3x PBS przez 5 min.
  6. Rozcieńczyć odpowiednie przeciwciała drugorzędowe w stosunku 1:200 za pomocą PBS.
  7. Próbki inkubować z 50 μl roztworów przeciwciał drugorzędowych przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w wilgotnej komorze.
  8. Myć PBS przez 5 min.
  9. Rozcieńczona lektyna tetragonolobusu lotosu (LTL) sprzężona z fluoresceiną w PBS z Ca2+ i Mg2+ w stężeniu 10 μg/ml.
    UWAGA: Ca2+ i Mg2+ są niezbędne do wiązania LTL.
  10. Inkubować tkanki z 50 μl roztworu LTL przez 30 minut w temperaturze pokojowej w wilgotnej komorze.
  11. Myć PBS z Ca2+ i Mg2+ przez 5 min.
  12. Inkubować z 50 μl 4',6-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI, 5 μg/ml w wodzie) w celu barwienia DNA/jąder przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  13. Zamocuj szkiełka nakrywkowe, dodając 20 μl odczynnika montażowego zapobiegającego blaknięciu na tkankę i powoli umieszczając szkiełko nakrywkowe. Poczekaj 24 godziny, aż odczynnik zapobiegający blaknięciu zestale się przed obrazowaniem.
    UWAGA: Wiązanie lektyny może z czasem ulec degradacji, powodując utratę sygnału. Najlepiej jest obrazować próbki barwione lektyną wkrótce po ustawieniu odczynnika do montowania. W przypadku zaobserwowania utraty sygnału, Ca2+ i Mg2+ można dodać do odczynnika montażowego, aby zachować zabarwienie.

13. Akwizycja obrazu

  1. Włączyć mikroskop odwrócony (patrz tabela materiałów) z automatycznym stolikiem XY.
  2. Wybierz obiektyw 20x.
  3. Otwórz oprogramowanie do akwizycji obrazów (patrz Spis materiałów).
  4. Kliknij na Na żywo, aby otworzyć okno podglądu na żywo.
  5. Znajdź sekcję tkanki i upewnij się, że jest ostra.
  6. Kliknij menu Acquire (Nabierz) i wybierz opcję Scan Large Image (Skanuj duży obraz).
  7. W oknie Skanuj duży obraz skonfiguruj obszar do skanowania, przesuwając stolik za pomocą joysticka do skrajnej lewej części sekcji tkanki i klikając strzałkę w lewo. Powtórz te czynności dla górnych, najbardziej prawych i dolnych segmentów tkanki.
  8. Kliknij menu pobierania.
  9. Upewnij się, że pole wyboru dla dużego obrazu jest zaznaczone.
    1. Jeśli przechwytujesz obrazy wielokanałowe, kliknij kartę Lambda.
    2. Kliknij każdy kanał i ustaw czas ekspozycji na poziom, na którym barwienie jest widoczne bez nasycenia jakiejkolwiek części obrazu.
      UWAGA: Te ustawienia muszą być spójne w jednej grupie eksperymentalnej. Zmiana ustawień akwizycji między próbkami doprowadzi do niedokładnych wyników.
    3. Powtórz krok 9.2 dla każdego kanału, który ma zostać zebrany.
  10. Kliknij Skanuj.

14. Analiza obrazu

  1. Otwórz oprogramowanie do akwizycji obrazów.
  2. Kliknij pozycję Plik | Otwórz i wybierz obraz.
  3. Kliknij prawym przyciskiem myszy okno obrazu i wybierz wielokątny obszar zainteresowania (ROI).
  4. Obrysuj zwrot z inwestycji za pomocą narzędzia odręcznego. Nakreśl komórki kanalikowe LTL-dodatnie lub komórki śródmiąższowe α-SMA-dodatnie.
  5. Kliknij zakładkę Pomiar | Próg.
  6. Ustaw górną i dolną granicę progu, ustawiając suwaki po obu stronach obszaru sygnału dodatniego.
  7. Kliknij zakładkę ROI.
  8. Kliknij ikonę Eksportuj, aby zapisać wartości. Użyj oprogramowania do obsługi arkuszy kalkulacyjnych, aby obliczyć procent obszaru sygnału dodatniego/obszaru ROI.

15. Alternatywa: Analiza obrazu za pomocą darmowego oprogramowania (ImageJ)

  1. Otwórz plik ImageJ.
  2. Kliknij pozycję Plik | Otwórz, aby wyświetlić obraz.
  3. Kliknij zaznaczenia odręczne.
  4. Wybierz ROI, obrysowując go za pomocą narzędzia odręcznego. Nakreśl komórki kanalikowe LTL-dodatnie lub komórki śródmiąższowe α-SMA-dodatnie.
  5. Kliknij menu Edycja i wybierz opcję Wyczyść na zewnątrz.
  6. Kliknij przycisk Analizuj i wybierz opcję Zmierz, aby określić obszar zwrotu z inwestycji.
  7. Przejdź do obrazu | Kolor | Podziel kanały.
  8. Dostosuj górną i dolną granicę progu, aby wykryć obszar sygnału dodatniego.
  9. Kliknij przycisk Analizuj i wybierz opcję Zmierz.
  10. Zapisz dane.
  11. Otwórz dane za pomocą arkusza kalkulacyjnego i oblicz stosunek obszaru sygnału dodatniego do obszaru ROI.

16. Opcjonalnie: Obrazowanie za pomocą laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego

UWAGA: Aby uzyskać obrazy o wyższej rozdzielczości do publikacji, skaningowa mikroskopia konfokalna zapewnia wyraźniejsze obrazy i zredukowane tło w tkance nerkowej.

  1. Włącz laserowy skaningowy mikroskop konfokalny (patrz Tabela materiałów).
  2. Wybierz obiektyw 40x (patrz tabela materiałów).
  3. Kliknij kartę Zlokalizuj i znajdź tkanki, dostosowując ostrość.
  4. Przejdź do zakładki Akwizycja, kliknij Kanały i wybierz 1 AU w ustawieniu otworkowym.
  5. Dostosuj intensywność wzmocnienia lasera w każdym kanale tak, aby sygnał dodatni był widoczny, ale nie nasycony. Upewnij się, że ustawienia w zestawie próbek eksperymentalnych pozostają stałe.
  6. Kliknij przycisk Snap (Przyciągaj) i zapisz obraz w żądanym formacie.

17. Poziom BUN plazmy

  1. Pobrać próbki z temperatury -20 °C i rozmrozić je na lodzie.
  2. Rozcieńczyć osocze dH2O w stosunku 1:10.
  3. Dla każdej próbki należy przeprowadzić trzy oddzielne reakcje w dwóch odstępach na 96-dołkowej płytce.
    1. Do próbki plus wzorca dodać 5 μl mocznika 200 mg/dl i 20 μl rozcieńczonego osocza.
    2. Do samej próbki dodać 5 μl dH2O i 20 μl rozcieńczonego osocza.
    3. W przypadku ślepej próby dodać 5 μl dH2O i 20 μl rozcieńczonego osocza.
  4. Zmieszać 85 μl odczynnika + 1 μl ureazy na próbkę, aby przygotować roztwór roboczy.
  5. Dodać 80 μl roztworu roboczego do studzienek "próbka plus wzorzec" i "próbka pojedyncza".
  6. Dodać 80 μl odczynnika (bez ureazy) do "studzienki ślepej próbki" z kroku 17.3 powyżej.
  7. Delikatnie postukaj w płytkę, aby wymieszać i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  8. Odczytać OD560 za pomocą czytnika płytek.
  9. Obliczyć stężenie mocznika Eq (1) i przeliczyć je na BUN za pomocą Eq (2).
    Mocznik (mg/dl) = (sama próbka-Ślepa próbka)/(Sama próbka wzorcowa) x (Standard/4) x (współczynnik rozcieńczenia) (1)
    BUN (mg/dl) = stężenie mocznika/2,14 (2)
    UWAGA: Ten test mierzy zawartość mocznika (masa cząsteczkowa: 60) w surowicy; jednak BUN odnosi się tylko do zawartości azotu w moczniku (masa cząsteczkowa: 28). W związku z tym potrzebna jest poprawka o 2,14 (60/28), aby przeliczyć stężenie mocznika na BUN.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby zbadać rolę komórek nabłonka kanalików w produkcji cytokin po indukowanym cisplatyną AKI, cisplatynę wstrzyknięto w stężeniu 20 mg/kg, a następnie dożylnie wstrzyknięto 0,25 mg BFA w dniu 3 po wstrzyknięciu cisplatyny. Nerki pobrano 6 godzin później. Nerki zatopione w parafinie zostały pocięte i wybarwione TGF-β, PDGF-D i CTGF, reprezentatywnymi cytokinami odpowiedzialnymi za naprawę tkanek w AKI. Jak pokazano w Rysunek 2A, pęcherzyki TGF-β+ obserwuje się w PTC znakowanych LTL w nerkach...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wiadomo, że PTC nerek regulują AKI i PChN poprzez wydzielanie TGF-β, TNF-α, CTGF, PDGF, czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego, a także wielu innych białek 20,21,22,23. Podobnie kłębuszki nerkowe, kanaliki dystalne i inne komórki nabłonka nerek, a także komórki śródmiąższowe, wydzielają te i/lub inne białka podczas urazu 24,25,26.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Amerykańskie Towarzystwo Kardiologiczne (AHA): Kensei Taguchi, 20POST35200221; HHS | Światowy Urząd Gospodarczy (NIH Narodowy Instytut Cukrzycy i Chorób Układu Pokarmowego i Nerek (NIDDK): Craig Brooks, DK114809-01 DK121101-01.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1 ml Strzykawki insulinoweBD329654
10 ml StrzykawkaBD302995
Probówka 2 mlMarka Fisher05-408-138
Strzykawka 20 mlBD302830
Igły 25 GBD305125
28 GBD329424
96-dołkowapłytka Corning9017
Kwas arystolochowy-ISigma-AldrichA9461
&alfa;-SMA przeciwciało sprzężone z Cy3Sigma-AldrichC6198RRID:AB_476856
Ostrze do kriostatuCL Sturkey. IncDT315R50
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)  Sigma-AldrichA7906
Brefeldin ASigma-AldrichB6542
CisplatynaSigma-AldrichP4394
Kwas cytrynowySigma-Aldrich791725
Mikroskop konfokalnyZEISS  LSM710
Obiektywy do mikroskopii konfokalnejZEISS40x / 1.10 LD C-Apochromat WATER
Oprogramowanie konfokalneZEISSZEN
Słoik CoplinFisher Scientific19-4
Szkło nakrywkowemarki Fisher12545F
KriostatLeicaCM1850
Przeciwciało CTGFGenetexGTX124232RRID:AB_11169640
Cy3-AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)Jackson immunoresearch711-165-152RRID: AB_2307443
Cy5-AffiniPure Donkey Anti-Goat IgG (H+L)Jackson immunoresearch705-175-147RRID: AB_2340415
DAPISigma-AldrichD9542
Dimetylosulfotlenek (DMSO)Sigma-AldrichD8418
Jednorazowe formy bazowemarki Fisher22-363-553
surowica osłaJackson immunoresearch017-000-121
EtanolDecon Labs, Inc.2701
KleszczeVETUSESD-13
Glicynamarki Fisher12007-0050
Poduszki grzewczeKent scientificDCT-20
Sól sodowa heparynyACROS organics41121-0010100mg/15ml dH2O
Komora nawilżanaInvitrogen44040410Plastikowe pudełko pokryte folią może służyć jako alternatywna komora nawilżana.
Strzykawki insulinoweBD329461
Mikroskop odwróconyNIKONEclipse Ti-E2immunofluorescencja
KIM-1 przeciwciałoR & DAF1817RRID: AB_2116446
Lemozol (Histo-clear)Diagnostyka krajowaHS-200
lektyna lotus tetragonolobus VectorFL-13212
Szkiełko mikroskopoweFisher scientific12-550-343
ReichertJung 820 II
NIKON  Zestaw chirurgiczny myszy DS-Qi-2
scientificINSMOUSEKIT
NIS ElementsObiektywy NIKON
OprogramowanieNIKONPlan Apo 20x/0.75połączone z Eclipse Ti-E2 (mikroskop odwrócony)
Związek OCTScigen4586
Pióro do patodonuVectorH-4000
PBS z wapniem i magnezemCorning21-030-CV
PBS bez wapnia i magnezu  Corning21-031-CV
Przeciwciało PDGF-DThermo-Fisher scientific40-2100
Mikroskopia elektronowa PFAScience15710RRID: AB_2533455
Czytnik płytekPromegaGloMax® Discover Microplate Reader4% PFA jest rozcieńczony od 16% w PBS.
powidon-jod (Betadine)Avrio Health L.P.NDC 67618-151-17
Szybkowar  Tristar 8Qt. Power Cooker Plus
ProLong Gold Odczynnik przeciw blaknięciuInvitrogenP36930
Zestaw do oznaczania mocznika Quantichrom (BUN) II Systemytestów biologicznychDUR2-100
Jednoostrzowa żyletka do rozwarstwiania nerek (.009", 0.23 mm)Narzędzia IDL521013
Podgrzewacz do slajdówLab Scientific Inc.,XH-2001
OprogramowanieNIKONNIS elementy
sacharozyRPIS24060
TGF-b1 anitbodySigma-AldrichSAB4502954
Tris EDTA bufferCorning46-009-CMRRID: AB_10747473
Cytrynian trisodowy dwuwodnySigma-AldrichSLBR6660V
Cytrynian trisodowy dwuwodnySigma-Aldrich
TritonSigma-Aldrich9002-93-1
Tween 20Sigma-AldrichP1379
Szkiełko mikroskopowe z białym szkłem, rozmiar 25 x 75 mm, szlifowane krawędzie, niebieska matowakula ziemska Scientific1358D
Mikrotomowa monochromatyczna kamera CMOS Kent do akwizycji obrazów SLBR6660V

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. GBD Chronic Kidney Disease Collaboration. Global, regional, and national burden of kidney disease, 1990-2017: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2017. Lancet. 395 (10225), 709-733 (2020).
  2. Canaud, G., Bonventre, J. V. Cell cycle arrest and the evolution of chronic kidney disease from acute kidney injury. Nephrology Dialysis Transplantation. 30 (4), 575-583 (2015).
  3. Chawla, L. S., Eggers, P. W., Star, R. A., Kimmel, P. L. Acute kidney injury and chronic kidney disease as interconnected syndromes. New England Journal of Medicine. 371 (1), 58-66 (2014).
  4. Berger, K., Moeller, M. J. Mechanisms of epithelial repair and regeneration after acute kidney injury. Seminars in Nephrology. 34 (4), 394-403 (2014).
  5. Bonventre, J. V., Yang, L. Cellular pathophysiology of ischemic acute kidney injury. The Journal of clinical investigation. 121 (11), 4210-4221 (2011).
  6. Kurts, C., Panzer, U., Anders, H. J., Rees, A. J. The immune system and kidney disease: basic concepts and clinical implications. Nature Reviews. Immunology. 13 (10), 738-753 (2013).
  7. Panzer, U., Steinmetz, O. M., Stahl, R. A., Wolf, G. Kidney diseases and chemokines. Current Drug Targets. 7 (1), 65-80 (2006).
  8. Commins, S. P., Borish, L., Steinke, J. W. Immunologic messenger molecules: cytokines, interferons, and chemokines. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 125 (2), Suppl 2 53-72 (2010).
  9. Jaber, B. L., et al. Cytokine gene promoter polymorphisms and mortality in acute renal failure. Cytokine. 25 (5), 212-219 (2004).
  10. Black, L. M., Lever, J. M., Agarwal, A. Renal inflammation and fibrosis: A double-edged sword. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 67 (9), 663-681 (2019).
  11. van Kooten, C., Woltman, A. M., Daha, M. R. Immunological function of tubular epithelial cells: the functional implications of CD40 expression. Experimental Nephrology. 8 (4-5), 203-207 (2000).
  12. Canaud, G., et al. Cyclin G1 and TASCC regulate kidney epithelial cell G2-M arrest and fibrotic maladaptive repair. Science Translational Medicine. 11 (476), (2019).
  13. Burton, C. J., Combe, C., Walls, J., Harris, K. P. Secretion of chemokines and cytokines by human tubular epithelial cells in response to proteins. Nephrology, Dialysis, Transplantation. 14 (11), 2628-2633 (1999).
  14. Ripley, C. R., Fant, J., Bienkowski, R. S. Brefeldin A inhibits degradation as well as production and secretion of collagen in human lung fibroblasts. Journal of Biological Chemistry. 268 (5), 3677-3682 (1993).
  15. Kovacs, S. B., Oh, C., Aachoui, Y., Miao, E. A. Evaluating cytokine production by flow cytometry using brefeldin A in mice. STAR Protocols. 2 (1), 100244(2021).
  16. Fujiwara, T., Oda, K., Yokota, S., Takatsuki, A., Ikehara, Y. Brefeldin A causes disassembly of the Golgi complex and accumulation of secretory proteins in the endoplasmic reticulum. Journal of Biological Chemistry. 263 (34), 18545-18552 (1988).
  17. Sadeghipour, A., Babaheidarian, P. Making formalin-fixed, paraffin embedded blocks. Methods in Molecular Biology. 1897, 253-268 (2019).
  18. Qin, C., et al. The cutting and floating method for paraffin-embedded tissue for sectioning. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (139), e58288(2018).
  19. Honvo-Houeto, E., Truchet, S. Indirect immunofluorescence on frozen sections of mouse mammary gland. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (106), e53179(2015).
  20. Chung, S., et al. TGF-β promotes fibrosis after severe acute kidney injury by enhancing renal macrophage infiltration. JCI Insight. 3 (21), 123563(2018).
  21. Meng, X. M., Nikolic-Paterson, D. J., Lan, H. Y. TGF-β: the master regulator of fibrosis. Nature Reviews. Nephrology. 12 (6), 325-338 (2016).
  22. Kok, H. M., Falke, L. L., Goldschmeding, R., Nguyen, T. Q. Targeting CTGF, EGF and PDGF pathways to prevent progression of kidney disease. Nature Reviews. Nephrology. 10 (12), 700-711 (2014).
  23. Engel, J. E., Williams, E., Williams, M. L., Bidwell, G. L., Chade, A. R. Targeted VEGF (vascular endothelial growth factor) therapy induces long-term renal recovery in chronic kidney disease via macrophage polarization. Hypertension. 74 (5), 1113-1123 (2019).
  24. Liu, B. C., Tang, T. T., Lv, L. L., Lan, H. Y. Renal tubule injury: a driving force toward chronic kidney disease. Kidney International. 93 (3), 568-579 (2018).
  25. de Haij, S., Woltman, A. M., Bakker, A. C., Daha, M. R., van Kooten, C. Production of inflammatory mediators by renal epithelial cells is insensitive to glucocorticoids. British Journal of Pharmacology. 137 (2), 197-204 (2002).
  26. Hong, S., Healy, H., Kassianos, A. J. The emerging role of renal tubular epithelial cells in the immunological pathophysiology of lupus nephritis. Frontiers in Immunology. 11, 578952(2020).
  27. Hwang, B., Lee, J. H., Bang, D. Single-cell RNA sequencing technologies and bioinformatics pipelines. Experimental & Molecular Medicine. 50 (8), 1-14 (2018).
  28. See, P., Lum, J., Chen, J., Ginhoux, F. A single-cell sequencing guide for immunologists. Frontiers in Immunology. 9, 2425(2018).
  29. Gewin, L., et al. Deleting the TGF-β receptor attenuates acute proximal tubule injury. Journal of the American Society of Nephrology. 23 (12), 2001-2011 (2012).
  30. Nlandu-Khodo, S., et al. Blocking TGF-β and β-catenin epithelial crosstalk exacerbates CKD. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (12), 3490-3503 (2017).
  31. Brooks, C. R., et al. KIM-1-/TIM-1-mediated phagocytosis links ATG5-/ULK1-dependent clearance of apoptotic cells to antigen presentation. EMBO Journal. 34 (19), 2441-2464 (2015).
  32. Kishi, S., et al. Proximal tubule ATR regulates DNA repair to prevent maladaptive renal injury responses. The Journal of Clinical Investigation. 129 (11), 4797-4816 (2019).
  33. Yu, S. M., Bonventre, J. V. Acute kidney injury and maladaptive tubular repair leading to renal fibrosis. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 29 (3), 310-318 (2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Bia ka wydzielane przez nerkidetekcja cytokinostre uszkodzenie nerekprzewlek a choroba nerekkom rki kanalik w proksymalnychbarwienie immunofluorescencyjneakumulacja TGF betawstrzykni cie do y y ogonowejmikroskopia konfokalna

Powiązane artykuły