Artykuł metodologiczny

Kontrast trzech technik inokulacji stosowanych do określenia rasy nieznanego Fusarium oxysporum f.sp. niveum powiedział: Izolatów

DOI:

10.3791/63181

⸱

28 października 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Plant Pathology, University of Florida, 2University of Florida Institute of Food and Agricultural Sciences, 3Gulf Coast Research and Education Center, University of Florida, 4Horticultural Sciences Department, University of Florida, 5Tropical Research and Education Center, University of Florida, 6Department of Horticulture, University of Georgia

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opanowanie więdnięcia arbuza przez Fusarium wymaga wiedzy na temat obecnych ras patogenów. Tutaj opisujemy metody zanurzania korzeni, poinfestowanego wysiewu ziaren i zmodyfikowanego zaszczepiania tacowego, aby wykazać ich skuteczność w typowaniu rasowym chorobotwórczego grzyba Fusarium oxysporum f. sp niveum (Fon).

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Więdnące mięso arbuza (Citrullus lanatus), spowodowane przez Fusarium oxysporum f. sp. niveum (Fon), ponownie stało się głównym ograniczeniem produkcji w południowo-wschodnich Stanach Zjednoczonych, zwłaszcza na Florydzie. Stosowanie strategii integrowanej ochrony przed szkodnikami, takich jak odmiany odporne specyficzne dla danej rasy, wymaga informacji na temat różnorodności i gęstości populacji patogenu na polach hodowców. Pomimo pewnego postępu w opracowywaniu molekularnych narzędzi diagnostycznych do identyfikacji izolatów patogenów, określenie rasy często wymaga podejść opartych na testach biologicznych.

Typowanie rasy zostało przeprowadzone przez inokulację zanurzeniową w korzeniach, metodę wysiewu zainfekowanych ziaren oraz zmodyfikowaną metodę zanurzania tacek z każdym z czterech różnic arbuza (Black Diamond, Charleston Grey, Calhoun Grey, Plant Introduction 296341-FR). Izolatom przypisuje się oznaczenie rasy poprzez obliczenie częstości występowania choroby pięć tygodni po zaszczepieniu. Jeśli mniej niż 33% roślin dla danej odmiany było objawowych, były one klasyfikowane jako odporne. Odmiany, których częstość występowania przekraczała 33%, uznano za podatne. W artykule opisano trzy różne metody inokulacji w celu ustalenia rasy, zanurzenia w korzeniach, zainfekowanego ziarna i zmodyfikowanego szczepienia tacowego, których zastosowania różnią się w zależności od projektu eksperymentalnego.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Grzyby glebowe, które tworzą kompleks gatunkowy Fusarium oxysporum (FOSC), są wpływowymi hemibiotroficznymi patogenami roślin, które mogą powodować poważne choroby i straty plonów w różnych uprawach1. Więdnięcie arbuza Fusarium, wywoływane przez F. oxysporum f. sp. niveum (Fon), w ciągu ostatnich kilku dekad rosło pod względem zasięgu, częstości występowania i nasilenia na całym świecie2,3. U sadzonek objawy więdnięcia Fusarium często przypominają zwilżenie. U starszych roślin liście stają się szare, chlorotyczne i nekrotyczne. W końcu więdnięcie roślin postępuje do całkowitego załamania się rośliny i śmierci4. Bezpośrednia utrata plonów występuje z powodu objawów i śmierci rośliny, podczas gdy pośrednia utrata plonów może wystąpić z powodu uszkodzeń słonecznych spowodowanych eliminacją baldachimu dolistnego5. Rozmnażanie płciowe i związane z nim struktury rozrodcze nigdy nie zostały zaobserwowane u F. oxysporum. Jednak patogen wytwarza dwa rodzaje bezpłciowych zarodników, mikro- i makrokonidia, a także większe, długoterminowe struktury przetrwania zwane chlamydosporami, które mogą przetrwać w glebie przez wiele lat6.

FOSC jest klasyfikowany do form specjalnych na podstawie obserwowanych zakresów gospodarzy, zwykle ograniczonych do jednego lub kilku gatunków gospodarzy1. Chociaż ostatnie badania wykazały, że ten kompleks gatunkowy może być złożeniem 15 różnych gatunków, konkretne gatunki, które infekują arbuzy, są obecnie nieznane7. F. oxysporum f. sp. niveum (Fon) to nazwa grup szczepów, które infekują wyłącznie Citrullus lanatus lub udomowionego arbuza8,9. Szczepy F. oxysporum w obrębie większości patogennych formae speciale wykazują pewien poziom różnorodności w odniesieniu do ich składników genetycznych i zjadliwości w stosunku do gatunku żywiciela. Na przykład jeden szczep może zainfekować wszystkie odmiany żywiciela, podczas gdy inny może zainfekować tylko bardziej podatne odmiany. Aby wyjaśnić taką zmienność, grupy te są nieformalnie klasyfikowane do ras na podstawie powiązań ewolucyjnych lub wspólnych cech fenotypowych. W obrębie Fon scharakteryzowano cztery rasy (0, 1, 2 i 3) na podstawie ich patogenności w stosunku do zestawu wybranych odmian arbuza, przy czym odkrycie rasy 3 miało miejsce niedawno10.

Pomimo tej pozornej różnorodności, morfologie zarodników lub strzępek nie są rozróżnialne między rasami ras Fon, co oznacza, że testy molekularne lub fenotypowe są potrzebne do zidentyfikowania unikalnej rasy izolatu11. Badania molekularne zidentyfikowały pewne różnice genetyczne. Na przykład rola efektorów wydzielanych w ksylemie (SIX) jest badana od lat w F. oxysporum, a niektóre z tych efektorów zostały zlokalizowane na chromosomach wymienianych podczas poziomego transferu genów12. Na przykład SIX6 znajduje się w wyścigach Fon 0 i 1, ale nie w wyścigu 213. SZEŚĆ efektorów zostało zaangażowanych w patogeniczność F. oxysporum f. sp. lycopersici i F. oxysporum f. sp. cubense, które powodują więdnięcie Fusarium odpowiednio na pomidorach i bananach14,15,16,17. Analiza SZEŚCIU profili efektorowych wśród szczepów F. oxysporum f. sp. spiniciae, patogenu więdnącego Fusarium na szpinaku, umożliwiła klasyfikację, która dokładnie odzwierciedla różnorodność genetyczną i fenotypową18. Jednak różnice między mechanizmami wirulencji ras Fon nie są obecnie w pełni zrozumiałe, a testy molekularne opracowane po ich użyciu wykazały niespójne i niedokładne wyniki19. Dlatego wyniki fenotypowe z testów infekcji są obecnie najlepszym sposobem klasyfikacji izolatów.

F. oxysporum początkowo infekuje gospodarzy przez korzenie, zanim przedostanie się do xylem20. To sprawia, że bezpośrednia inokulacja korzeni danej odmiany gospodarza jest skutecznym sposobem na przeprowadzenie typowania rasowego i jest podstawą metod inokulacji root-dip i tray-dip21. Gdy nie zaraża żywiciela, F. oxysporum przebywa w glebie i może pozostawać w stanie uśpienia przez lata. Uprawa podatnych odmian arbuza w glebie z pola zainteresowania jest jednym ze sposobów sprawdzenia obecności Fon. Rozszerzenie tej metody na odmiany o różnych znanych poziomach odporności w glebie, która jest celowo porażona przez Fon, jest również dobrym sposobem na przeprowadzenie typowania rasowego (Tabela 1) i stanowi podstawę metody wysiewu porażonych ziaren. Zmodyfikowana metoda zanurzania tacek jest odmianą oryginalnej metody zanurzania tacy, która pozwala na wysokoprzepustowe typowanie rasowe, w którym można szybko zbadać wiele roślin i izolatów polowych22. Ważnymi czynnikami szybkiego i skutecznego testu biologicznego typowania rasowego są użycie odmian, które mają udokumentowane różnice w odporności na różne rasy patogenów, zapewnienie, że inokulum jest zarówno biologicznie aktywne, jak i obfite podczas infekcji, utrzymanie środowiska, które sprzyja zarówno patogenowi, jak i gospodarzowi, oraz stosowanie spójnego systemu oceny ciężkości lub częstości występowania choroby. Ten artykuł opisuje metody root-dip23,24, zainfekowane metody wysiewu ziaren25,26 oraz zmodyfikowane metody tray-dip22 do fenotypowego typowania rasy oparte na zasadach opisanych powyżej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Określanie rasy metodą RDM (root-dip)

  1. Przygotowanie środowiska eksperymentalnego
    1. Ponieważ ekspresja objawów jest w dużym stopniu zależna od warunków środowiskowych, utrzymuj rośliny na kontrolowanym obszarze. Monitoruj wilgotność względną, temperaturę, fotoperiod i natężenie światła (Rysunek 1).
      1. Ustaw temperaturę na 26-28 °C, wilgotność względną na 50-75% i ustaw 16-godzinny fotoperiod, aby zapewnić odpowiedni wzrost i zdrowie roślin.
        UWAGA: Aby zapobiec niedotlenieniu, więdnięciu sadzonek i/lub gniciu nasion, nie należy nadmiernie podlewać ani pozostawiać stojącej wody wokół sadzonek.
      2. Użyj dwóch lamp fluorescencyjnych, każda o co najmniej 1850 lumenach światła i temperaturze barwowej 2,800 K na rząd świateł, aby wspierać wzrost fotosyntezy.
      3. Utrzymuj obszar w czystości i stosuj praktyki higieniczne, w tym usuwanie odpadów, gleby i resztek roślinnych, aby zapobiec uszkodzeniom przez szkodniki i przypadkowym infekcjom.
    2. Warunki sadzenia
      1. Wypełnij 8 x 16-komorowe (25 cm szerokości x 50 cm długości), zaczynając od mieszkań podłożem do sadzenia i postukaj w dół, aby lekko zagęścić glebę (Rysunek 2).
      2. Zdobądź nasiona czterech odmian zróżnicowanych: Black Diamond/Sugar Baby, Charleston Grey/Allsweet/Dixielee, Calhoun Grey i PI-296341-FR.
      3. Wysiewaj nasiona z wierzchołkiem (spiczastym końcem) skierowanym do góry na głębokość równą ich długości. Po wysianiu nasion przykryj podłoże zawierające zakopane nasiona 100% Ziemią Fullera lub inną alternatywą gliny bentonitowej na głębokość 0,3175-0,635 cm.
      4. Spryskaj mieszkania, aby zwilżyć podłoże bez tworzenia stojącej lub gromadzącej się wody. Następnie utrzymuj podłoże wilgotne, spryskując je przez 20 s co 180 minut lub podlewając ręcznie raz dziennie, aż nasiona wykiełkują przez około 5 dni. Po wykiełkowaniu podlewaj raz dziennie i w razie potrzeby, aby wspomóc wzrost sadzonek.
    3. Przygotowanie podłoża
      UWAGA: Oba podłoża są mocowane dodatkowym granulowanym agarem, aby umożliwić zbieranie zarodników poprzez skrobanie powierzchni.
      1. Sok klarowany V8 podłoże (V8)
        1. Przygotuj 500 ml oczyszczonego soku V8 (V8)27, dodając 100 ml sklarowanego oryginalnego 100% soku warzywnego V8 z 1% CaCO3 do 400 ml wody destylowanej.
        2. Dodać 7,5 g agaru granulowanego.
        3. Dobrze wymieszaj składniki, przelej w autoklawie i pozostaw do ostygnięcia do 50 °C przed przelaniem do sterylnych szalek Petriego.
      2. Pożywka agarowa z dekstrozą ziemniaczaną o mocy ćwiartkowej (qPDA)
        1. Przygotować pożywkę qPDA, dodając 4,5 g granulowanego agaru do 500 ml wody destylowanej, dodać 3,8 g agaru z dekstrozą ziemniaczaną.
        2. Dobrze wymieszaj składniki, przelej w autoklawie i pozostaw do ostygnięcia do 50 °C przed przelaniem 12-15 ml na sterylne szalki Petriego.
  2. Przygotowanie zabiegów eksperymentalnych
    1. Przygotować inokulum.
      1. Pięć dni po posadzeniu (dpp) umieść infiltrowane krążki papierowe (o średnicy 1-1,25 cm) zawierające preferowany izolat F. oxysporum na jednej płytce V8 i jednej qPDA i przechowuj je w inkubatorze (~28 °C) przez osiem dni28 (Rysunek 3A).
      2. W ósmym dniu wzrostu grzyba i w dniu poprzedzającym inokulację (patrz sekcja 1.3.2) przenieść płytki V8 i qPDA z inkubatora do komory bezpieczeństwa biologicznego.
      3. Dla każdego izolatu dozuj 6 ml wysterylizowanej wody dejonizowanej na każdą płytkę hodowlaną V8 i qPDA.
      4. Usuń konidia, zeskrobując sterylny rozsiewacz komórek po powierzchni podłoża (Rysunek 3B). Zebrać płynną zawiesinę konidialną i przenieść ją do sterylnej probówki hodowlanej o pojemności 50 ml (Rysunek 3C).
      5. Powtarzaj ten proces, aż całkowita objętość płynnej zawiesiny konidialnej w probówce hodowlanej o pojemności 50 ml wyniesie około 12 ml.
      6. Przed przystąpieniem do kolejnego izolatu należy wysterylizować powierzchniowo obszar roboczy i rozsiewacz komórek alkoholem. Wysterylizuj rozsiewacz komórek, przepuszczając go przez palnik Bunsena po zanurzeniu w ≥70% etanolu.
      7. Po przeniesieniu płynnych zawiesin konidialnych do probówek hodowlanych dla wszystkich izolatów, należy określić ilościowo liczbę zarodników. Najpierw przemieszaj pojedynczą probówkę hodowlaną o pojemności 50 ml i dozuj 10 μl do każdej komory hemacytometru. Następnie oblicz liczbę zarodników w hemacytometrze, jak opisano wcześniej29.
      8. Przygotować końcowy roztwór inokulum, przenosząc obliczoną objętość dla 106 + 10% do innej sterylnej probówki hodowlanej i doprowadzić całkowitą objętość do 30 ml przez dodanie sterylnej wody dejonizowanej.
      9. Probówki hodowlane należy przechowywać przez noc w temperaturze 8 ± 1 °C.
        UWAGA: Można to zrobić bez utraty żywotności konidiów, na co wskazują niepublikowane dane.
  3. szczepienie
    1. Przygotować szczepionkę.
      1. Przed dniem inokulacji mocno podlać trzynastodniowe siewki do nośności gleby.
      2. Wstępnie oznacz paliki odpowiednimi informacjami, w tym izolatem, który ma być badany, odmianą arbuza i datą szczepienia.
      3. Umieść 6 x 12-komorowych (20 cm szerokości x 40 cm długości) styropianowych płaskich powierzchni, uprzednio zdezynfekowanych 10% wybielaczem i dobrze spłukanych, aby otrzymać zaszczepione rośliny.
      4. Przyłóż wszystkie potrzebne materiały (patrz Tabela materiałów).
    2. Zaszczep korzenie roślin.
      1. Solidnie podlej rośliny na kilka godzin przed rozpoczęciem inokulacji. Co najmniej 2 godziny po podlaniu usuń sadzonki z 8 x 16-komorowych styropianowych płaskich powierzchni i opłucz ich korzenie, aby usunąć wszelkie przylegające cząstki materiału sadzeniowego.
      2. Tymczasowo przechowuj opłukane rośliny w czystych pojemnikach z wodą z kranu do czasu użycia, trzymając odmiany oddzielnie od siebie (Rysunek 4A). Podziel sadzonki na grupy po sześć osobników i trzymaj grupy sadzonek zawinięte w mokre ręczniki papierowe na tacy laboratoryjnej, aby zapobiec wysuszeniu.
      3. Umieść 25-30cm3 ziemi na dnie każdej komórki styropianowej tacki o wymiarach 6 x 12 i użyj butelki ze spryskiwaczem, aby zwilżyć glebę, aż będzie widocznie wilgotna.
      4. Zaszczep rośliny i przesadź je w kolejności zgodnej z odmianą, tak aby Black Diamond, Charleston Grey, Calhoun Grey, a następnie PI 296341 01 FR sadzi się od lewej do prawej.
      5. Zaczynając od zdrowej kontroli, umieścić grupę sześciu nieuszkodzonych sadzonek tej samej odmiany w probówkach o pojemności 50 ml zawierających inokulum. W przypadku zdrowej kontroli należy użyć wody z kranu zamiast zawiesiny zarodników. Na końcu zaszczepić rośliny kontrolą pozytywną (rasa Fon 3).
      6. Po wejściu do probówki upewnij się, że korzenie roślin sięgają inokulum (woda z kranu) i są wystawione na działanie tego produktu.
      7. Wiruj rurki z korzeniami sadzonek zanurzonymi na 30 s (Rysunek 4B). Po wirowaniu umieść pojedynczą sadzonkę na komórkę w styropianowych płaskich powierzchniach o wymiarach 6 x 12. Umieść rośliny tej samej odmiany w tej samej kolumnie na tacy.
      8. Po umieszczeniu zdezynfekuj ręce w rękawiczkach, trzymając je w wiadrach z 0,7% dostępnym roztworem chloru przez 30 s, a następnie spłucz wodą z kranu przez 1 minutę.
      9. Następnie przykryj umieszczone sadzonki podłożem do sadzenia i delikatnie zamocuj. Za pomocą strzykawki lub pipety ostrożnie podlej sadzonki w ilości 20 ml na sadzonkę, unikając rozpryskiwania.
      10. Przed przystąpieniem do następnego zestawu roślin ponownie zdezynfekuj ręce w rękawiczkach za pomocą roztworu chloru i płukania wodą z kranu.
      11. Po przesadzeniu wszystkich sadzonek należy je ponownie minimalnie podlać, aby zapobiec spływaniu inokulum.
      12. Trzymaj sadzonki przez noc w zamkniętym, ciemnym środowisku o średniej temperaturze 27 °C. Następnego dnia przenieś rośliny do szklarni, utrzymując średnią temperaturę na poziomie 27 °C.
  4. Utrzymanie i pielęgnacja zaszczepionych roślin
    1. Aby zapobiec przelewaniu się nadmiaru wody, należy lekko podlewać mieszkania trzy razy dziennie przez 4-5 dni, aż rośliny się ustabilizują.
    2. Sprawdzaj tace 2-3 razy dziennie przez co najmniej trzy dni, aby zapewnić odpowiednie i równomierne pokrycie podlewania.
    3. Unikaj suszenia z powodu światła słonecznego lub zacienienia, obracając mieszkania i/lub zapewniając dodatkowe zacienienie/podlewanie w razie potrzeby.
    4. W dawce 3 dpp nawozić rośliny nawozem o szybkim uwalnianiu 20-20-20 (10 g/3,78 l) w ilości 3-6 ml na litr wody.
    5. Nawozić co tydzień przez 3-4 tygodnie.
    6. Na tym etapie utrzymuj te same warunki oświetleniowe i środowiskowe.

2. Określanie rasy metodą jądra zainfekowanego (IKM)

  1. Porażenie ziaren
    1. Przygotować inokulum.
      1. Z przechowywanej lub nowo pobranej próbki wyizolować i wyhodować szczep F. oxysporum f. sp. niveum będący przedmiotem zainteresowania na płytce qPDA do punktu, w którym jego wzrost pokrywa połowę płytki.
        UWAGA: Świadczy to o tym, że jest aktywny i żywotny, co jest niezbędne do znacznego porażenia ziarna w późniejszych etapach.
    2. Przygotuj jądra.
      1. Na wadze odmierzyć 200 g jagód żyta (Secale spp.) (lub ziaren pszenicy Maxie var. (Triticum spp.) w dowolnym wystarczająco dużym pojemniku i wlać je do jednej lub więcej szklanych kolb Erlenmeyera o pojemności 1 l. Dodaj sterylną wodę z kranu do kolb, aby całkowicie pokryć ziarna do co najmniej 5 cm (Rysunek 5A).
      2. Moczyć ziarna w temperaturze pokojowej (~24 °C) przez 2 godziny. Spuść wodę z kolb; zatkaj otwór kawałkiem bawełnianej rolki owiniętej w gazę; i przykryj otwór folią aluminiową (Rysunek 5B).
    3. Odkazić jądra. Gdy ziarno wchłonie wodę, należy je dwukrotnie przelać w autoklawie na dwa różne sposoby, aby zabić inne niepożądane drobnoustroje przed zaszczepieniem.
      1. Po raz pierwszy należy autoklawować ziarno w przygotowanych kolbach w cyklu grawitacyjnym (121,2 °C, 1,06 kg/cm2) przez 1 godzinę z 5-minutowym czasem suszenia. Pozostawić kolby do ostygnięcia do temperatury pokojowej.
      2. Przed autoklawowaniem po raz drugi przenieś ziarna do małego worka do uprawy pieczarek z filtrem 0,5 μm. Usuń powietrze z torby, a następnie złóż nadmiar plastiku wokół torby.
      3. Umieść torbę w plastikowym pojemniku nadającym się do autoklawu. Przykryj kosz folią aluminiową (Rysunek 5C).
        UWAGA: Nie używaj metalowego pojemnika podczas autoklawowania ziaren w workach, ponieważ może to spowodować stopienie worków.
      4. Autoklaw pojemnika w cyklu grawitacyjnym przez 1 godzinę z 5-minutowym czasem schnięcia, tym samym cyklem co poprzednio.
        UWAGA: Autoklaw worka tylko za drugim razem, a nie za pierwszym, ponieważ filtr i port mogą zostać naruszone, jeśli worki zostaną dwukrotnie autoklawowane. Zapobiegaj kondensacji pary wodnej na filtrze, pozwalając workom powoli i całkowicie ostygnąć przed wyjęciem ich z autoklawu, ponieważ filtr workowy do uprawy zostanie naruszony, jeśli ulegnie zamoczeniu.
    4. Zaszczep jądra.
      1. Pracując z płytką hodowlaną i torbą w komorze bezpieczeństwa biologicznego, wytnij krążki agarowe o średnicy 6 mm ze strefy aktywnego wzrostu na płytce hodowlanej ze sterylnym otworem korkowym w rozmiarze #4. Rozłóż torbę. Stosując ścisłą sterylną technikę, umieść 5 krążków agaru w torbie. Użyj sterylnego cylindra z podziałką o pojemności 50 ml, aby odmierzyć 35 ml sterylnej wody z kranu i dodaj ją do torebki.
      2. Lekko zwiń otwór torby, a następnie spryskaj zewnętrzną stronę 70% etanolem, aby wysterylizować powierzchnię.
        UWAGA: Nie spryskuj filtra, ponieważ wilgoć również go zagrozi.
      3. Zamknij worek, składając rogi w kierunku środka, a następnie ponad dwa razy nad filtrem. Zabezpiecz torbę za pomocą worka clamps i przezroczystej rurki winylowej dostarczonej przez producenta.
        UWAGA: Zaciski są wielokrotnego użytku.
      4. Wyjmij worek z szafki bezpieczeństwa biologicznego.
    5. Przechowuj patogen do wzrostu.
      1. Przechowuj torbę w pozycji pionowej. Upewnij się, że filtr jest odciągnięty od przeciwnej strony worka, aby umożliwić maksymalną wymianę gazu (Rysunek 5D).
      2. Inkubować materiały w temperaturze pokojowej przez około trzy tygodnie. Regularnie rozprowadzaj ziarna, aby zapewnić równomierny wzrost patogenu.
        UWAGA: Torby nie są wielokrotnego użytku.
  2. Zakażenie sadzonek arbuza porażonym ziarnem
    1. Źródło nasion arbuza, jak opisano wcześniej.
    2. Określ grupy eksperymentalne.
      UWAGA: Jedynym wymaganym szczepem (szczepami) patogenu są izolaty testowane w celu identyfikacji rasy. Jednak kontrole negatywne i pozytywne pomogą w porównaniach z roślinami, które nie mają infekcji lub mają określony poziom infekcji.
      1. Aby przygotować kontrolę ujemną, należy użyć ziaren pszenicy wysterylizowanych zgodnie z wcześniej wspomnianą metodą, ale bez inokulacji.
      2. Aby przygotować kontrolę pozytywną, należy użyć ziaren pszenicy zaszczepionych już sklasyfikowanym szczepem w celu porównania z nieznanym izolatem.
    3. Połącz glebę i ziarno.
      1. Odmierz 14 ziaren porażonych ziaren do dużej plastikowej torby (Rysunek 5E). Napełnij plastikowe doniczki (15 cm średnicy x 10 cm wysokości) mieszanką doniczkową, aby odmierzyć potrzebną ilość mieszanki. Opróżnij mieszaninę do torby. Stwórz poduszkę powietrzną w torbie i przekręć ją lub zamknij.
      2. Wymieszaj ziarna i glebę, kilkakrotnie odwracając torbę. W przypadku kontroli ujemnej należy przeprowadzić ten sam proces w innej torbie z czystymi ziarnami. W przypadku kontroli dodatniej należy przeprowadzić ten sam proces w innej torbie z ziarnami zaatakowanymi przez szczep porównawczy.
      3. Napełnij cztery wysterylizowane powierzchniowo doniczki porażoną mieszanką gleby. W celu kontroli ujemnej należy doniczkować tę mieszaninę przed kontaktem z glebą zanieczyszczoną Fonem.
    4. Zasiej pestki arbuza.
      1. Zasiej sześć nasion w każdej doniczce. Upewnij się, że każda doniczka zawiera nasiona tylko jednej odmiany. Umieść nasiona tak, aby wierzchołek nasion był skierowany do góry, aby umożliwić prawidłowy wzrost podczas wschodów (Rysunek 6A).
      2. Za pomocą butelki z rozpylaczem zwilż górne 0,3-0,6 cm gleby wodą. Umieść przezroczyste plastikowe naczynie (o średnicy 15 cm) pod i nad każdą doniczką, aby stworzyć wilgotne środowisko do kiełkowania nasion (Rysunek 6B).
    5. Ustal warunki wzrostu.
      1. Podlewaj doniczki trzy razy dziennie butelką z rozpylaczem, aby utrzymać jędrność bez spływania, aż nasiona wykiełkują (około 5 dni).
        UWAGA: Ilość zużytej wody będzie się zwiększać wraz z wielkością rośliny i wielkością doniczki.
      2. Gdy nasiona wykiełkują, przenieś górne naczynie na spód doniczki.
      3. Podlewaj rośliny codziennie w razie potrzeby dla optymalnego wzrostu roślin. Wystawić rośliny na działanie 16-godzinnego fotoperiodu w warunkach oświetleniowych podobnych do opisanych wcześniej i w temperaturze 27 °C (± 1 °C).

3. Określanie rasy za pomocą zmodyfikowanej metody zanurzania tacek (MTDM)

  1. Przygotowanie materiałów do inokulacji
    1. Ustal warunki sadzenia.
      1. Wypełnij 48-komorowe wkładki (3,68 cm szerokości x 5,98 cm długości x 4,69 cm głębokości) pasteryzowanym parą wodną piaskiem: torfem: wermikulitem (4:1:1) i postukaj, aby lekko ścisnąć glebę. Umieść wkładki w plastikowych tackach (27,9 cm szerokości x 53,3 cm długości x 5,1 cm głębokości).
      2. Wysiewaj nasiona tak, aby ich wierzchołek (bliższy koniec) był skierowany do góry na głębokość równą ich długości.
      3. Pozyskuj nasiona zgodnie z wcześniejszym opisem.
      4. Następnie utrzymuj podłoże wilgotne, spryskując je przez 20 s co 180 minut lub podlewając ręcznie raz dziennie.
      5. Po wykiełkowaniu (około 5 dni) podlewaj raz dziennie i w razie potrzeby, aby wspomóc wzrost sadzonek.
    2. Przygotuj nośnik.
      1. Przygotować pożywkę qPDA, dodając 5,625 g granulowanego agaru do 500 ml wody destylowanej; dodać 4,875 g agaru z dekstrozą ziemniaczaną. Dobrze wymieszaj składniki, przelej w autoklawie i ostudź do 50 °C przed przelaniem do sterylnych szalek Petriego. Uszczelnić szalki Petriego folią i przechowywać płytki w lodówce (4 °C) do czasu użycia.
      2. Aby przygotować podłoże bulionowe, zważ i dodaj 24 g dekstrozy ziemniaczanej do butelki o pojemności 1 l. Doprowadź mieszaninę do 1000 ml, dodając do butelki wodę destylowaną, umieść butelkę na gorącej płycie i mieszaj, aż się rozpuści. Rozlać 100 ml bulionu do 250 ml kolb Erlenmeyera. Użyj gazy do uszczelnienia kolb i autoklawu.
    3. Przygotować inokulum.
      1. Siedem dni przed sadzeniem zaszczepij pięć płytek qPDA infiltrowanym papierem28 i przechowuj je w inkubowanym obszarze przez osiem dni w 14 godzinnym / 10 godzinnym cyklu ciemności22.
      2. Siódmego dnia przenieść dwie 1 cm 2 zatyczki agarowe do każdej kolby Erlenmeyera o pojemności 250 ml zawierającej 100 ml dekstrozy ziemniaczanej. Umieścić kolby Erlenmeyera na wytrząsarce stołowej z prędkością 200 obr./min na 7 dni w cyklu 14 godzin/10 godzin światła/ciemności.
      3. W dniu inokulacji (14 dni po siewie) należy zebrać zarodniki, filtrując inokulum przez cztery warstwy sterylnej gazy.
      4. Oznaczyć stężenie mikrokonidiów w kolbach za pomocą hemocytometru, jak opisano wcześniej. Przygotuj 7 l zawiesiny inokulum w plastikowej pojemniku (40,6 cm szerokości x 67,3 cm długości x 16,8 cm głębokości), przenosząc odpowiednią objętość zawiesiny zarodników do sterylnej wody, aby uzyskać końcowe stężenie zarodników 1 × 106 ml−1 (Ryc. 7A).
  2. szczepienie
    1. Czternaście dni po wysiewie (przynajmniej pierwsza faza prawdziwych liści) przenieś wkładki komórkowe z sadzonkami do parcianych tacek (26,9 cm szerokości x 53,7 cm długości x 6,28 cm głębokości). Delikatnie umieść parciane tace z sadzonkami w plastikowej pojemniku zawierającej 7 litrową zawiesinę inokulum. Zaszczepiaj każdą tacę pojedynczo (Rysunek 7B).
    2. Pozostaw sadzonki w nienaruszonym stanie w inokulum przez 15 minut. Po 15 minutach delikatnie przenieś wkładki komórkowe zawierające zaszczepione sadzonki do tacek bez otworów (27,9 cm szerokości x 53,3 cm długości x 5,1 cm głębokości). Powtórz ten proces dla każdej tacy.
    3. Umieść tace bez otworów na ławce szklarniowej i podlewaj w razie potrzeby. Utrzymuj te same warunki oświetleniowe i środowiskowe, jak opisano dla testu biologicznego zanurzania korzeni.

4. Ocena choroby

  1. Wybierz przedziały czasowe oceny.
    1. W przypadku metody zanurzania korzeni i modyfikowanej metody zanurzania w tacy, rozpocznij ocenę tydzień po zaszczepieniu sadzonek i kontynuuj co tydzień przez kolejne cztery tygodnie.
      UWAGA: Połączony zestaw danych będzie zawierał pięć zestawów obserwacji z tego okresu.
    2. Korzystając z metody jądra, rozpocznij oceny dopiero po pojawieniu się sadzonek i kontynuuj co tydzień, co daje w sumie sześć ocen.
  2. Obserwuj i obliczaj częstość występowania.
    1. Podczas każdej oceny wykonuj zdjęcia cyfrowe, aby udokumentować postęp choroby.
    2. Zgłaszaj częstość więdnięcia i obumierania roślin. Oblicz częstość występowania, biorąc pod uwagę sumę roślin z objawami w porównaniu ze zdrową kontrolą oraz liczbę martwych roślin w stosunku do całkowitej liczby roślin w tej odmianie.
  3. Przeanalizuj wyniki. Porównaj wzorce infekcji między odmianami i między grupami eksperymentalnymi, jeśli zastosowano kontrole.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Te eksperymenty pomagają określić względną odporność powszechnie uprawianych odmian (Tabela 1). Informacje te mogą być następnie wykorzystane do sformułowania zaleceń dotyczących zarządzania w oparciu o lokalne populacje Fonów. Innymi słowy, jeśli wiadomo, że rasa 0 lub 1 występuje na polu komercyjnym, rolnik może być skłonny do uprawy "odpornej" odmiany, takiej jak Calhoun Gray, Sunsugar lub równoważna. Wyniki testów biologicznych z zastosowaniem wszystkich metod pokazują, że gdy siewki były zakażone iz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiono trzy metody typowania ras. Każda z tych metod jest najlepiej dopasowana do konkretnych pytań i warunków eksperymentalnych. Metoda inokulacji poinfestowanych ziaren (porażenie gleby) jest być może prostsza i bardziej nieskomplikowana, co czyni ją szczególnie przydatną do oceny chorobotwórczości30. Używanie tej metody do prostego typowania rasy jest bardzo skuteczne. Jednak zastosowanie tej metody do określenia odporności konkretnej odmiany może być trudne, biorąc pod uwagę, że każda r...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować Dr. Ali i Laboratorium Diagnostyki Molekularnej Roślin, a także Dr. Pingsheng Ji z University of Georgia, których przywództwo i wsparcie pomogły w ustanowieniu naszego programu Fon.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
100% pełniejszy" s EarthSigma-AldrichF200-5KG
1 L szklana kolba ErlenmeyerPYREX4980-1L
15 ml probówki sokołaFisher Scientific14-959-49B
Butla z podziałką 50 mlLab Safety Supply41121805
50 ml Eppendorf Rurki stożkowe FisherScientific05-413-921
FoliaaluminiowaReynolds Wrap720
WybielaczWalmart587192290
palnik BunsenaFisher Scientific03-391-301
CaCO3sigma-Aldrich239216
rozsiewacze komórekFisher Scientific08-100-11
SerowicaLions Services, Inc8305-01-125-0725
Przezroczyste plastikowe naczyniaVisions Wave999RP6CLSSo średnicy ~ 15 cm
Przezroczyste rurki winylowe do zacisków do worków na grzybyDostawa grzybów 6"do małej torby, 8" do średniej torby, 10 " do dużej torby
Bawełniane kulkiFisherbrand22-456-885Sterylny
etanolFisher ChemicalA4094100%, a następnie połącz z wodą, aby uzyskać 70% do użycia
Lampy fluorescencyjneMaxLumeModel T52800 K Temperatura barwowa, agar granulowany o długości 24 '' lub 48 ''
VWR International90000-786
Ręczna butelka z rozpylaczemMożliwość jednego24122002~ 0,95 l
Fisher Scientific02-671-55AHemacytometr dwukomorowy
Tace laboratoryjneFisher Scientific15-236-2A
Duże, zamykane torby plastikoweZiploc43080538 cm x 38 cm
Zamgłaszczarka / konewkaBar5FB10H22
Zacisk do worków na grzybyDostawa6" do małej torby, 8" do średniej torby, 10" do dużej torby
Rękawice nitryloweFisher Scientific19-130-1597D
Organiczne Jagody żytaZapas grzybów Worki0,5 galona lub 25 funtów
Pipeta i końcówki P1000Fisher Scientific14-388-100
szalki PetriegoFisherbrandFB0875713Okrągły, średnica 100 mm, wysokość 15 mm
Podłoża do sadzeniaJolly GardenerPro-Line C/B
Plastikowy dzbanekBrandTechUX06008501 l lub większy
Doniczki plastikoweNeo/SCI01-1177~15 cm średnicy i ~10 cm wysokości
Plastikowy, bezpieczny w autoklawie koszThermo ScientificUX06010223 L
Pożywka agarowa z dekstrozą ziemniaczaną o mocy ćwiartkiCole-ParmerUX1420028Użyj proszku w połączeniu z przepisem na naukową wagę QPDA
, mierząc w gOhaus30208458Sprawdzi się każda precyzyjna waga, która może pomieścić i zmierzyć 200 g
Rozmiar #4 otwór korkowyCole-ParmerNC9585352
Mała torba do uprawy grzybówFiltr Shroom Supply0,5 mikrona, występuje również w średnich i dużych rozmiarach
Kielnia do glebyWalmart563876946
Styropianowe mieszkania (6 x 12 komórek)SpeedlingModel TR72A
Styropianowe mieszkania (8 x 16 komórki)SpeedlingModel TR128A
Strzykawka (5 lub 10 ml)fisher Scientific14-829-19C
TimerWalmartTM-01
V8 Oryginalny 100% sok warzywnyWalmart564638212
vortexFisher Scientific02-215-418
Pestki arbuza - Black DiamondWillhite Seed Inc17
Pestki arbuza - Calhoun GrayHolmes Seed Company4440
Nasiona arbuza - Charleston GreyBonnie Plants7.15339E+11
Nasiona arbuza - PI 296341-FRAutorzy kontaktowiAutorzy Skontaktuj się z autorami
Ziarna pszenicy (Maxie var.) (opcjonalnie)Alachua County Feed & Nasienie
hemacytometru grzybów

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Edel-Hermann, V., Lecomte, C. Current status of Fusarium oxysporum formae speciales and races. Phytopathology. 109 (4), 512-530 (2019).
  2. Everts, K. L., Himmelstein, J. C. Fusarium wilt of watermelon: Towards sustainable management of a re-emerging plant disease. Crop Protection. 73, 93-99 (2015).
  3. Martyn, R. Cucurbitaceae 2012. Proceedings of the Xth EUCARPIA Meeting on Genetics and Breeding of Cucurbitaceae. , University of Cukurova, Ziraat Fakultesi. Antalya, Turkey. 136-156 (2012).
  4. Roberts, P., Dufault, N., Hochmuth, R., Vallad, G., Paret, M. [PP352] Fusarium wilt (Fusarium oxysporum f. sp. niveum) of watermelon. EDIS. 2019 (5), 4(2019).
  5. Keinath, A. Integrated management for Fusarium wilt of watermelon. Land-Grant Press by Clemson Extension, LGP 1022. , Available from: http://lgpress.clemson.edu/publication/integrated-management-for-fusarium-wilt-of-watermelon (2019).
  6. Costa, A. E. S., et al. Resistance to Fusarium wilt in watermelon accessions inoculated by chlamydospores. Scientia Horticulturae. 228, 181-186 (2018).
  7. Lombard, L., Sandoval-Denis, M., Lamprecht, S. C., Crous, P. Epitypification of Fusarium oxysporum-clearing the taxonomic chaos. Persoonia: Molecular Phylogeny and Evolution of Fungi. 43, 1(2019).
  8. Martyn, R. D. Fusarium wilt of watermelon: 120 years of research. Horticultural Reviews. 42 (1), 349-442 (2014).
  9. Zhou, X., Everts, K. Characterization of a regional population of Fusarium oxysporum f. sp. niveum by race, cross pathogenicity, and vegetative compatibility. Phytopathology. 97 (4), 461-469 (2007).
  10. Zhou, X., Everts, K., Bruton, B. Race 3, a new and highly virulent race of Fusarium oxysporum f. sp. niveum causing Fusarium wilt in watermelon. Plant Disease. 94 (1), 92-98 (2010).
  11. Leslie, J. F., Summerell, B. A. The Fusarium laboratory manual. , John Wiley & Sons. (2008).
  12. Lo Presti, L., et al. Fungal effectors and plant susceptibility. Annual Review of Plant Biology. 66, 513-545 (2015).
  13. Niu, X., et al. The FonSIX6 gene acts as an avirulence effector in the Fusarium oxysporum f. sp. niveum-watermelon pathosystem. Scientific Reports. 6 (1), 1-7 (2016).
  14. Lievens, B., Houterman, P. M., Rep, M. Effector gene screening allows unambiguous identification of Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici races and discrimination from other formae speciales. FEMS Microbiology Letters. 300 (2), 201-215 (2009).
  15. Houterman, P. M., Cornelissen, B. J., Rep, M. Suppression of plant resistance gene-based immunity by a fungal effector. PLoS Pathogens. 4 (5), 1000061(2008).
  16. Houterman, P. M., et al. The effector protein Avr2 of the xylem-colonizing fungus Fusarium oxysporum activates the tomato resistance protein I-2 intracellularly. The Plant Journal. 58 (6), 970-978 (2009).
  17. Czislowski, E., et al. Investigation of the diversity of effector genes in the banana pathogen, Fusarium oxysporum f. sp. cubense, reveals evidence of horizontal gene transfer. Molecular Plant Pathology. 19 (5), 1155-1171 (2018).
  18. Batson, A. M., Fokkens, L., Rep, M., du Toit, L. J. Putative effector genes distinguish two pathogenicity groups of Fusarium oxysporum f. sp. spinaciae. Molecular Plant-Microbe Interactions. 34 (2), 141-156 (2021).
  19. Keinath, A. P., DuBose, V. B., Katawczik, M. M., Wechter, W. P. Identifying races of Fusarium oxysporum f. sp. niveum in South Carolina recovered from watermelon seedlings, plants, and field soil. Plant Disease. 104 (9), 2481-2488 (2020).
  20. Gordon, T. R. Fusarium oxysporum and the Fusarium wilt syndrome. Annual Review of Phytopathology. 55, 23-39 (2017).
  21. Martyn, R., Netzer, D. Resistance to races 0, 1, and 2 of Fusarium wilt of watermelon in Citrullus sp. PI-296341-FR. HortScience. 26 (4), 429-432 (1991).
  22. Meru, G., McGregor, C. Genotyping by sequencing for SNP discovery and genetic mapping of resistance to race 1 of Fusarium oxysporum in watermelon. Scientia Horticulturae. 209, 31-40 (2016).
  23. Freeman, S., Rodriguez, R. A rapid inoculation technique for assessing pathogenicity of Fusarium oxysporum f. sp. niveum and F. o. melonis on cucurbits. Plant Disease. 77 (12), 1198-1201 (1993).
  24. Martyn, R. Fusarium oxysporum f. sp. niveum race 2: A highly aggressive race new to the United States. Plant Disease. 71 (3), 233-236 (1987).
  25. Lai, X., et al. Evaluating inoculation methods to infect sugar beet with Fusarium oxysporum f. Beat and F. secorum. Plant Disease. 104 (5), 1312-1317 (2020).
  26. Kirk, W., et al. Optimizing fungicide timing for the control of Rhizoctonia crown and root rot of sugar beet using soil temperature and plant growth stages. Plant Disease. 92 (7), 1091-1098 (2008).
  27. Ferguson, A., Jeffers, S. Detecting multiple species of Phytophthora in container mixes from ornamental crop nurseries. Plant Disease. 83 (12), 1129-1136 (1999).
  28. Fong, Y., Anuar, S., Lim, H., Tham, F., Sanderson, F. A modified filter paper technique for long-term preservation of some fungal cultures. Mycologist. 14 (3), 127-130 (2000).
  29. Rice, W. N. The hemocytometer method for detecting fungus spore load carried by wheat. Proceedings of the Association of Official Seed Analysts of North America. 31, 124-127 (1939).
  30. Kleczewski, N. M., Egel, D. S. A diagnostic guide for Fusarium wilt of watermelon. Plant Health Progress. 12 (1), 27(2011).
  31. Dhingra, O. D., Sinclair, J. B. Basic plant pathology methods. , CRC Press. (2017).
  32. Latin, R., Snell, S. Comparison of methods for inoculation of muskmelon with Fusarium oxysporum f. sp. melonis. Plant Disease. 70 (4), 297-300 (1986).
  33. Martyn, R. An iInitial survey of the United States for races of Fursarium oxysporum f. HortScience. 24 (4), 696-698 (1989).
  34. Zhou, X., Everts, K. Races and inoculum density of Fusarium oxysporum f. sp. niveum in commercial watermelon fields in Maryland and Delaware. Plant Disease. 87 (6), 692-698 (2003).
  35. Fulton, J. C., et al. Phylogenetic and phenotypic characterization of Fusarium oxysporum f. sp. niveum isolates from Florida-grown watermelon. PLoS One. 16 (3), 0248364(2021).
  36. Zhou, X., Everts, K. Quantification of root and stem colonization of watermelon by Fusarium oxysporum f. sp. niveum and its use in evaluating resistance. Phytopathology. 94 (8), 832-841 (2004).
  37. Nutter, F. W., Esker, P. D., Netto, R. A. C. Disease assessment concepts and the advancements made in improving the accuracy and precision of plant disease data. European Journal of Plant Pathology. 115 (1), 95-103 (2006).
  38. Nutter, F., Gleason, M., Jenco, J., Christians, N. Assessing the accuracy, intra-rater repeatability, and inter-rater reliability of disease assessment systems. Phytopathology. 83 (8), 806-812 (1993).
  39. Chiang, K. -S., Bock, C. H., Lee, I. -H., El Jarroudi, M., Delfosse, P. Plant disease severity assessment-how rater bias, assessment method, and experimental design affect hypothesis testing and resource use efficiency. Phytopathology. 106 (12), 1451-1464 (2016).
  40. Nita, M., Ellis, M., Madden, L. Reliability and accuracy of visual estimation of Phomopsis leaf blight of strawberry. Phytopathology. 93 (8), 995-1005 (2003).
  41. Zhang, Z., Zhang, J., Wang, Y., Zheng, X. Molecular detection of Fusarium oxysporum f. sp. niveum and Mycosphaerella melonis in infected plant tissues and soil. FEMS Microbiology Letters. 249 (1), 39-47 (2005).
  42. Lin, Y. -H., et al. Development of the molecular methods for rapid detection and differentiation of Fusarium oxysporum and F. oxysporum f. sp. niveum in Taiwan. New Biotechnology. 27 (4), 409-418 (2010).
  43. van Dam, P., de Sain, M., Ter Horst, A., vander Gragt, M., Rep, M. Use of comparative genomics-based markers for discrimination of host specificity in Fusarium oxysporum. Applied and Environmental Microbiology. 84 (1), 01868(2018).
  44. Baayen, R. P., et al. Gene genealogies and AFLP analyses in the Fusarium oxysporum complex identify monophyletic and nonmonophyletic formae speciales causing wilt and rot disease. Phytopathology. 90 (8), 891-900 (2000).
  45. O'Donnell, K., Kistler, H. C., Cigelnik, E., Ploetz, R. C. Multiple evolutionary origins of the fungus causing Panama disease of banana: concordant evidence from nuclear and mitochondrial gene genealogies. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (5), 2044-2049 (1998).
  46. Laurence, M., Summerell, B., Liew, E. Fusarium oxysporum f. sp. canariensis: evidence for horizontal gene transfer of putative pathogenicity genes. Plant Pathology. 64 (5), 1068-1075 (2015).
  47. Hudson, O., et al. Marker development for differentiation of Fusarium oxysporum f. sp. Niveum race 3 from races 1 and 2. International Journal of Molecular Sciences. 22 (2), 822(2021).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

wi dni cie z powodu Fusariumchoroba arbuzatypowanie rasmetoda zanurzania korzenimetoda zaka onych ziarenmetoda zanurzania w tackachizolat patogenuzapadalno na chorobodmiany odporne

Powiązane artykuły