Wykorzystanie optogenetyki do odwrócenia neuroplastyczności i zahamowania poszukiwania kokainy u szczurów

Podsumowanie

Opisane tutaj metody opisują procedurę używaną do optogenetycznie odwracającej plastyczności wywołanej przez kokainę w behawioralnie istotnym obwodzie u szczurów. Utrzymująca się stymulacja optyczna synaps wzgórzowo-migdałowatych o niskiej częstotliwości wywołuje długotrwałą depresję (LTD). Indukowane optogenetycznie LTD in vivo u szczurów doświadczonych z kokainą skutkowało późniejszym osłabieniem poszukiwania narkotyków motywowanego sygnałem.

Streszczenie

Ten protokół demonstruje kroki potrzebne do użycia narzędzi optogenetycznych do odwrócenia plastyczności wywołanej przez kokainę w obwodach wzgórzowo-migdałowatych, aby zmniejszyć późniejsze zachowania związane z poszukiwaniem kokainy u szczura. W naszych badaniach odkryliśmy, że gdy szczury samodzielnie podają kokainę dożylnie w połączeniu ze wskazówką audiowizualną, synapsy utworzone na wejściu z przyśrodkowego jądra kolankowatego wzgórza (MGN) na główne neurony bocznego ciała migdałowatego (LA) stają się silniejsze w miarę uczenia się związku sygnał-kokaina. Postawiliśmy hipotezę, że odwrócenie plastyczności wywołanej przez kokainę w tych synapsach zmniejszy zachowania związane z poszukiwaniem kokainy motywowane sygnałami. Aby osiągnąć ten rodzaj neuromodulacji in vivo, chcieliśmy wywołać synaptyczną depresję długotrwałą (LTD), która zmniejsza siłę synaps MGN-LA. W tym celu wykorzystaliśmy optogenetykę, która umożliwia neuromodulację obwodów mózgowych za pomocą światła. Pobudzająca opsyna oChiEF ulegała ekspresji na presynaptycznych końcach MGN w LA poprzez wprowadzenie AAV zawierającego oChiEF do MGN. Następnie wszczepiono światłowody do LA i światło laserowe o długości 473 nm pulsowano z częstotliwością 1 Hz przez 15 minut, aby wywołać LTD i odwrócić plastyczność indukowaną kokainą. Manipulacja ta powoduje długotrwałe zmniejszenie zdolności sygnałów związanych z kokainą do wywoływania działań związanych z poszukiwaniem narkotyków.

Wprowadzenie

Nadużywanie substancji jest bardzo poważnym problemem zdrowia publicznego w USA i na całym świecie. Pomimo dziesięcioleci intensywnych badań, istnieje bardzo niewiele skutecznych opcji terapeutycznych^1,2. Główną przeszkodą w leczeniu jest fakt, że przewlekłe zażywanie narkotyków generuje długotrwałe wspomnienia skojarzeniowe między sygnałami środowiskowymi a samym lekiem. Ponowna ekspozycja na sygnały związane z narkotykami napędza reakcje fizjologiczne i behawioralne, które motywują do dalszego używania narkotyków i nawrotu³. Nowatorską strategią terapeutyczną jest wprowadzenie terapii opartych na pamięci, które mają na celu manipulowanie obwodami zaangażowanymi w regulację skojarzeń między lekami a sygnałami. Ostatnio zaobserwowano, że synapsy w bocznym ciele migdałowatym (LA), w szczególności te powstające z przyśrodkowego jądra kolankowatego (MGN) wzgórza, są wzmacniane przez powtarzające się samodzielne podawanie kokainy związane ze wskazówkami i że to wzmocnienie może wspierać zachowania związane z poszukiwaniem kokainy^4,5. W związku z tym zaproponowano, że przywrócenie wywołane cue może być osłabione przez odwrócenie plastyczności w synapsach MGN-LA.

Zdolność do precyzyjnego celowania w plastyczność synaptyczną określonego obwodu mózgu była głównym wyzwaniem dla tej dziedziny. Tradycyjne narzędzia farmakologiczne odniosły pewien sukces w zmniejszaniu zachowań nawrotowych, ale są ograniczone przez niemożność manipulowania poszczególnymi synapsami. Jednak niedawny rozwój optogenetyki in vivo dostarczył narzędzi potrzebnych do przezwyciężenia tych ograniczeń i kontrolowania ścieżek neuronowych z precyzją czasową i przestrzenną^6,7,8. Poprzez ekspresję światłoczułych opsyn w określonym obwodzie mózgu, światło laserowe może być następnie wykorzystane do aktywacji lub zahamowania obwodu. Stymulacja optyczna zależna od częstotliwości może być wykorzystana do specyficznego manipulowania plastycznością synaptyczną obwodu u zachowującego się zwierzęcia.

Ten manuskrypt opisuje procedurę podjętą w celu manipulowania behawioralnie istotnym obwodem MGN-LA za pomocą optogenetyki in vivo. Po pierwsze, pobudzająca opsyna oChIEF uległa ekspresji w MGN, a światłowody zostały obustronnie wszczepione do LA. Zwierzęta zostały następnie przeszkolone do samodzielnego podawania kokainy w sposób zależny od sygnału, co wzmacnia szlak MGN-LA. Następnie, ciągła stymulacja o niskiej częstotliwości światłem laserowym o długości fali 473 nm została wykorzystana do wytworzenia LTD specyficznego dla obwodu. Odwrócenie plastyczności wywołanej używaniem kokainy spowodowało długotrwałe zmniejszenie zdolności sygnałów do wywoływania działań, które są związane z zachowaniami związanymi z poszukiwaniem narkotyków.

Protokół

Eksperymenty opisane w tym protokole były zgodne z wytycznymi określonymi przez National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals i zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee Uniwersytetu w Pittsburghu. Wszystkie zabiegi zostały przeprowadzone na dorosłych, niedoświadczonych szczurach Sprague-Dawley, które w momencie przybycia ważyły 275-325 g.

1. Budowa implantów światłowodowych i krosowych

1. Przygotuj implanty światłowodowe zgodnie z wcześniej opublikowanymi protokołami⁹. W eksperymentach opisanych w tym protokole wykorzystano włókno rdzeniowe 200 μm (0,5 NA) i wielomodową tuleję ceramiczną LC/PC Ø1,25 mm, rozmiar otworu Ø230 μm.
   1. Użyj narzędzia Dremel, aby naciąć dolną trzecią część skuwki (najbliżej płaskiego końca skuwki). Nacinanie skuwek pomaga im pozostać przywiązanymi do cementu dentystycznego, zwiększając prawdopodobieństwo, że pozostaną bezpieczne przez cały okres eksperymentów.
   2. Użyj nożyc do drutu, aby przeciąć ~35 mm włókna. Użyj narzędzia do zdejmowania izolacji z włókien, aby usunąć ~ 25 mm włókna, pozostawiając 10 mm nieodsłonięte.
   3. Przygotuj żywicę epoksydową utwardzalną na gorąco zgodnie z instrukcjami producenta. Rozpuścić 1 g żywicy w proszku w 100 mg utwardzacza. Przymocować igłę o rozmiarze 25 do strzykawki o pojemności 1 ml. Napełnij strzykawkę żywicą epoksydową i przymocuj końcówkę igły o rozmiarze 25.
   4. Użyj imadła lub clamp aby bezpiecznie przytrzymać tuleję płaską stroną skierowaną do góry i wypukłą stroną skierowaną w dół. Za pomocą strzykawki wypełnionej żywicą epoksydową dodaj jedną kroplę żywicy epoksydowej na płaską stronę skuwki, zachowując ostrożność, aby wytrzeć nadmiar żywicy epoksydowej z boków skuwki.
   5. Włóż odizolowaną część włókna przez tulejkę, pozostawiając odsłonięte dodatkowe 5 mm odizolowanego włókna. W przypadku implantów LA włókno zostanie wszczepione 7,9 mm brzusznie do bregmy, więc odsłonięta długość nieodizolowanego włókna powinna wynosić ~13 mm.
   6. Utwardź żywicę epoksydową opalarką przez około 30-40 s, aż zmieni kolor na/bursztynowy.
   7. Naciąć włókno bezpośrednio na styku wypukłego końca skuwki za pomocą diamentowego noża i delikatnie stuknąć włókno palcem.
   8. Wypoleruj wypukły koniec skuwki, przytrzymując hemostatem, upewniając się, że wywierasz równomierny nacisk i wykonując 20 okrągłych obrotów każdy na serii papierów polerskich (od wysokiej jakości do niskiej jakości; 5, 3, 1, 0,3 μm).
   9. Przymocuj nieodizolowane włókno do stołu za pomocą taśmy i naciąć odizolowane włókno, pozostawiając dodatkowe 2 mm poza współrzędną brzuszną (w przypadku implantów LA ostateczna długość włókna wynosi ~10 mm). Użyj hemostatu, aby pociągnąć za skuwkę i równomiernie rozbić włókno w miejscu, w którym zostało nacięte. Uważaj, aby nie przeciąć całkowicie włókna podczas nacinania, w przeciwnym razie rdzeń włókna zostanie uszkodzony.
2. Zbuduj krosowe, które są kompatybilne z implantami światłowodowymi. Zakupiono krosowe zaprojektowane na zamówienie (patrz tabela materiałów). Alternatywnie, krosowe mogą być konstruowane zgodnie z wcześniej opublikowanymi protokołami⁹.
   UWAGA: Średnica i NA światłowodu tulejowego i światłowodu krosowego muszą pasować do złącza sprzęgającego, aby zapobiec nadmiernej utracie światła, co może spowodować brak wystarczającej stymulacji aktywności neuronalnej.
3. Zmierz strumień świetlny przez krosowy i implanty światłowodowe, podłączając krosowy/światłowód do odpowiedniego źródła światła laserowego (473 nm, moc wyjściowa 1 mW) i mierząc moc wyjściową za pomocą czujnika światła. Pomyślnie skonstruowane włókno będzie emitować koncentryczny krąg światła i będzie miało nie więcej niż 30% strat światła.

2. Cewnikowanie dożylne gryzoni, dostarczanie wirusa i implantacja światłowodu

1. Przygotuj zwierzę do operacji.
   1. W pełni znieczulij szczury wybranym środkiem znieczulającym w oparciu o wytyczne instytucjonalne. Jedną z opcji jest chlorowodorek ketaminy (87,5-100 mg/kg, i.m.) i chlorowodorek ksylazyny (5 mg/kg, i.m.). Upewnij się, że szczur jest w pełni znieczulony, sprawdzając, czy nie ma odruchu szczypania palców.
      UWAGA: Ketamina jest substancją kontrolowaną, z którą należy obchodzić się zgodnie z wytycznymi instytucji.
      UWAGA: W tym badaniu stosuje się domięśniowe wstrzyknięcie środków znieczulających, ponieważ spowodowało szybsze i bardziej niezawodne wstrzyknięcie znieczulenia niż wstrzyknięcie dootrzewnowe. Stale monitoruj oddech i reakcję szczura oraz zapewnij wsparcie termiczne przez cały czas trwania operacji.
   2. Ogol duży obszar grzbietu szczura (górna część pleców od tuż nad łopatkami do środka pleców), a także obszar szyi pod prawą kończyną przednią i skórę głowy.
   3. Umieść szczura w obszarze operacyjnym i nałóż puralube (sztuczne łzy) na oczy. Wstrzyknąć podskórnie (s.c.) karprofen (środek przeciwbólowy) o masie ciała przez skórę górnej części pleców, a następnie wstrzyknąć 5 ml roztworu Ringera z mleczanami przez skórę dolnej części pleców.
   4. Zdezynfekuj wszystkie miejsca operowane, zwilżając kawałek sterylnej gazy betadyną i wycierając ją po ogolonym obszarze operacyjnym okrężnymi ruchami. Następnie powtórz proces z 70% etanolem. Powtórz ten naprzemienny cykl trzy razy.
2. Wykonaj dożylną implantację cewnika zgodnie z wcześniej opublikowanymi protokołami^4,10.
   UWAGA: Podczas tej operacji nie używa się serwety chirurgicznej, aby uniknąć podrażnień podczas implantacji cewnika. Wysterylizuj wszystkie instrumenty i sprzęt przed użyciem. Używaj sterylnych rękawiczek i zmieniaj rękawice, jeśli dojdzie do kontaktu z jakąkolwiek niesterylną powierzchnią.
3. Bezpośrednio po wszczepieniu cewnika należy zabezpieczyć szczura w ramie stereotaktycznej w celu wykonania zastrzyków AAV.
   1. Podać podskórnie (s.c) wstrzyknięcie 2% lidokainy (0,2-0,3 ml) do skóry głowy jako środek znieczulający miejscowo.
      UWAGA: Podczas implantacji cewnika dożylnego nie stosuje się znieczulenia miejscowego, aby uniknąć zmian w wynikach operacji.
   2. Podłączyć kaniulę iniekcyjną ze stali nierdzewnej o rozmiarze 26 do strzykawki Hamilton wypełnionej 1 μl stężonego roztworu AAV: AAV5-hSyn-tdTomato lub AAV5-hSyn-oChIEF-tdTomato
      UWAGA: oChIEF jest wariantem wrażliwej na niebieskie opsynę kanałową rodopsyny (ChR2), która może reagować na szeroki zakres częstotliwości^8,11, a zatem ma użyteczność w eksperymentach LTD o niskiej częstotliwości omówionych w tym protokole, ale także w eksperymentach LTP o wysokiej częstotliwości (nie omówione tutaj). Konstrukt oChIEF został podarowany przez dr Rogera Tsiena i przetworzony w celu pakowania i oczyszczania przez Duke Viral Vector Core. Potrzebne są co najmniej 3-4 tygodnie między dniem wstrzyknięcia a dniem indukcji LTD, aby umożliwić optymalną ekspresję wirusa w końcach aksonów MGN.
      UWAGA: Ogólnie rzecz biorąc, AAV jest uważany za organizm o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 1 (BSL-1), o niskim ryzyku samozakażenia, chyba że do jego produkcji używa się wirusa pomocniczego. Jego stosowanie wymaga zatwierdzenia przez IACUC, a odpowiednie środki ochrony osobistej muszą być używane przez cały czas zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi, aby ograniczyć niepotrzebne narażenie.
   3. Za pomocą skalpela wykonaj nacięcie 0,5 mm od przodu do tyłu czaszki i usuń leżącą nad nią tkankę, aby odsłonić powierzchnię czaszki.
   4. Wyrównaj głowę szczura w osi przedniej/tylnej i zeruj współrzędne stereotaktyczne do bregmy.
   5. Wywierć trzy małe otwory w czaszce za pomocą narzędzia Dremel wyposażonego w małe wiertło. Użyj śrubokręta, aby mocno zamocować ze stali nierdzewnej (M2x4 965-A2) na miejscu.
      UWAGA: są niezbędne do prawidłowego wiązania cementu dentystycznego i tworzenia solidnych, trwałych nasadek głowic. Położenie powinno być rozłożone w poprzek osi przednio-tylnej czaszki, z dala od miejsca wstrzyknięcia AAV.
   6. Wywierć obustronne otwory do wstrzyknięcia AAV na podstawie współrzędnych z Atlasu Mózgu Szczura (Watson i Paxinos)¹² dla przyśrodkowej części jądra kolankowatego przyśrodkowego (MGN); w mm od bregma, AP: -5,4; ML: ±3.0; DV: -6,6. Powoli opuszczać kaniule iniekcyjne (4 mm/min), aż zostaną umieszczone w MGN. Wstrzyknąć stężony roztwór AAV z szybkością 0,1 μl/min.
   7. Pozostaw kaniulę do wstrzykiwań na miejscu przez 5 minut po zakończeniu infuzji, aby umożliwić dyfuzję z dala od kaniuli, a następnie powoli wyjmij kaniulę z mózgu.
4. Natychmiast po wstrzyknięciu wirusa kontynuuj wszczepianie światłowodów^4,9 celując w końcówki MGN-LA.
   1. Za pomocą narzędzia Dremel wywiercić obustronne otwory pod implanty światłowodowe skierowane do bocznego ciała migdałowatego (w mm od bregma, AP: -3,0; ML ±5.1).
   2. Użyj kleszczyków, aby chwycić skuwkę implantu światłowodowego i przymocować ją do adapterów stereotaktycznych, aby były bezpiecznie utrzymywane na miejscu.
   3. Powoli opuszczaj włókna z prędkością 2 mm/min, aż końcówka włókna znajdzie się w grzbietowej części LA (DV: -7,9 mm).
   4. Najpierw przymocuj okucia do czaszki za pomocą cienkiej warstwy kleju błyskawicznego Loctite, a następnie cementu dentystycznego i okuć za pomocą tulei o średnicy 1,25 mm i osłon przeciwpyłowych.
      UWAGA: Wybór kleju do mocowania skuwek do czaszki powinien zostać zatwierdzony przez lokalną lub instytucjonalną komisję ds. opieki i użytkowania zwierząt. Loctite jest używany w tym badaniu, aby niezawodnie przymocować okucia do czaszki po próbach i błędach za pomocą wielu klejów; Można jednak rozważyć dostępne alternatywy.
5. Po zabiegach chirurgicznych szczury trzymane są w domu indywidualnie i zapewniają swobodny dostęp do pożywienia i wody. Zapewnienie opieki pooperacyjnej zgodnej z wytycznymi instytucjonalnymi. Codziennie przepłukiwać cewniki solą fizjologiczną zawierającą gentamycynę (5 mg/ml) i heparynę (30 USP/ml) w celu utrzymania drożności. Co najmniej 5 dni po operacji i 24 godziny przed rozpoczęciem eksperymentów behawioralnych, pokarm ogranicza szczury do ~90% ich wagi podczas swobodnego karmienia.

3. Samodzielne podawanie kokainy przez gryzonie i instrumentalne wymieranie

dźwigni

UWAGA: Wszystkie procedury behawioralne są przeprowadzane w standardowych komorach warunkowania instrumentalnego, wyposażonych w dwie wysuwane dźwignie na jednej ścianie, światło stymulujące nad każdą dźwignią, generator tonów, oświetlenie domowe i pompę infuzyjną.

1. Poddaj szczury codziennym 1-godzinnym sesjom treningowym samodzielnego podawania kokainy (2 mg / ml) zgodnie z harmonogramem wzmacniania FR1.
   1. Umieszczaj szczury w komorze operacyjnej każdego dnia i pozwól szczurom nacisnąć dźwignię. Naciśnięcie wyznaczonej "aktywnej dźwigni" (z przeciwwagą między lewą i prawą dźwignią) powoduje infuzję kokainy (1,0 mg/kg/infuzję) i 10-sekundową prezentację złożonej wskazówki świetlnej i tonalnej. Naciśnięcie wyznaczonej "nieaktywnej dźwigni" nie ma zaprogramowanych efektów.
   2. Kontynuuj eksperymenty samodzielnego podawania przez co najmniej 10 dni i do momentu, gdy szczury pomyślnie zdobędą co najmniej 8 naparów dziennie przez 3 kolejne dni. Niespełnienie kryteriów akwizycji do 20 dnia skutkuje wykluczeniem z badania.
2. Po pomyślnym spełnieniu kryteriów nabycia należy poddać szczury 1-godzinnym sesjom instrumentalnego wymierania przez 6-10 dni.
   1. Umieść szczury w komorach operacyjnych i pozwól szczurom swobodnie naciskać dźwignię. Jednak reakcje zarówno na aktywne, jak i nieaktywne dźwignie nie mają zaprogramowanych konsekwencji.
   2. Niech szczury kontynuują instrumentalne wymieranie codziennie, aż nastąpi średnio < 25 naciśnięć dźwigni w ciągu dwóch kolejnych dni.

4. Indukcja optogenetyczna in vivo LTD

UWAGA: Eksperymenty z inhibicją optogenetyczną odbywają się 24 godziny po ostatnim dniu instrumentalnego wyginięcia.

1. Podłącz krosowe do niebieskiej diody laserowej 473 nm za pomocą obrotowego złącza zawieszonego nad czystą, standardową klatką obudowy gryzoni ze zdjętą pokrywą. Taka konfiguracja pozwala gryzoniom na swobodne poruszanie się po klatce podczas stymulacji optogenetycznej.
2. Włącz diodę laserową zgodnie z instrukcją obsługi i podłącz do generatora impulsów. Dostosuj ustawienia tak, aby po włączeniu szczur otrzymywał 900 impulsów światła 2 ms o częstotliwości 1 Hz.
   UWAGA: Podczas pracy lasera należy zawsze stosować odpowiednią ochronę oczu.
3. Zmierz natężenie światła przez krosowy za pomocą czujnika światła. Dostosuj intensywność lasera tak, aby strumień świetlny przez krosowy wynosił ~5-7 mW.
4. Umieść szczury w czystej klatce. Zdejmij osłony przeciwpyłowe i tuleje tulejowe, odsłaniając tuleje. Podłącz krosowe obustronnie do implantów światłowodowych. Pozwól szczurom badać środowisko przez 3 minuty przed indukcją LTD.
5. Włącz generator impulsów, aby zainicjować stymulację optogenetyczną.
   UWAGA: Chociaż jest to mało prawdopodobne, jeśli szczur doświadczy jakichkolwiek niepożądanych reakcji na stymulację, eksperyment jest natychmiast przerywany, a szczury są odpowiednio uśpione w oparciu o wytyczne instytucjonalne.
6. Po indukcji LTD trzymaj szczury w klatce przez 3 minuty, a następnie umieść je z powrotem w klatkach domowych.
7. W przypadku eksperymentów kontrolnych należy zastosować tę samą procedurę stymulacji na szczurach, u których występuje ekspresja wirusa kontrolnego AAV5-tdTomato. W przypadku pozorowanych eksperymentów podłącz krosowy do światłowodu szczurów, które wyrażają wirusa AAV5-oChIEF, ale podczas 15-minutowej sesji nie jest dostarczana stymulacja.

5. Przetestuj wpływ stymulacji optogenetycznej na poszukiwanie kokainy wywołane sygnałem

1. 24 godziny po stymulacji optogenetycznej in vivo umieść szczury z powrotem w komorach kondycjonowania instrumentalnego. Szczury są poddawane 1-godzinnej standardowej sesji przywracania do zdrowia w celu oceny zachowań związanych z poszukiwaniem kokainy.
   UWAGA: Podczas przywracania wywołanego przez sygnał, odpowiedź na aktywną dźwignię daje 10-sekundową prezentację sygnału związanego z kokainą, ale bez wlewów kokainy.
2. Wykonaj drugi test przywracający do pracy co najmniej 1 tydzień po pierwszym teście, aby ustalić, czy indukcja optogenetyczna LTD skutkuje długotrwałym zanikiem kokainy

6. Barwienie, fluorescencja i obrazowanie w celu histologicznej weryfikacji ekspresji wirusa i rozmieszczenia światłowodów

1. Zrób 1x sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) i 4% paraformaldehydu (PFA). Oba roztwory należy przechowywać na lodzie. Całkowita objętość będzie zależeć od liczby szczurów w badaniu (~100 ml PBS i 200 ml PFA zostanie użyte na szczura).
   UWAGA: PFA jest toksyczną substancją chemiczną i znanym czynnikiem rakotwórczym. Zachowaj odpowiednią ostrożność, aby uniknąć wdychania, a także kontaktu ze skórą. Jego użytkowanie i utylizacja powinny być zgodne z wytycznymi instytucjonalnymi, w tym z użyciem odpowiednich środków ochrony osobistej i kaptura przepływowego środków chemicznych.
2. Ustaw pompę perystaltyczną na natężenie przepływu 20 ml / min. Napełnij rurkę pompy 1x PBS. Przymocuj igłę o rozmiarze 20 do końca rurki.
3. Głęboko znieczulij szczury pentobarbitalem sodu (100 mg/kg, i.p.). Potwierdź głębokość znieczulenia przez brak reakcji na uszczypnięcie palca u nogi, zanim przejdziesz dalej.
   UWAGA: Pentobarbital sodu jest stosowany, ponieważ perfuzja jest zabiegiem końcowym.
4. Użyj nożyczek chirurgicznych, aby rozciąć jamę brzuszną szczura poniżej przepony. Przetnij klatkę piersiową wzdłuż bocznych krawędzi, aby odsłonić serce szczura. Użyj hemostatu, aby zacisnąć rostralną część klatki piersiowej z dala od serca. Odetnij całą leżącą tkankę tłuszczową otaczającą serce.
5. Włóż igłę przez lewą komorę i w górę do aorty. Wytnij mały otwór w prawym przedsionku, aby spuścić roztwór, który wraca do serca.
6. Perfuzja każdego szczura z 1x PBS przez 5 minut, a następnie 4% PFA, pH 7,4 przez 10 minut.
7. Odetnij głowę szczura, wyekstrahuj mózg i umieść go w 4% PFA przez 24 godziny. Następnie przenieś mózg do 30% roztworu sacharozy na 2-3 dni.
8. Wycinaj mózgi pod kątem 50 μm za pomocą kriostatu.
9. Umieścić wszystkie plastry zawierające LA lub MGN na szkiełkach podstawowych i szkiełku nakrywkowym.
10. Wycinki obrazu za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego w celu weryfikacji ekspresji AAV-oChIEF-tdPomidora w MGN i jego projekcji do LA, a także umieszczenia światłowodu nad LA.

7. Przygotowanie do eksperymentów elektrofizjologicznych do perfuzji i ostrego wycinka mózgu

UWAGA: Eksperymenty elektrofizjologiczne są przeprowadzane na podgrupie zwierząt, aby potwierdzić sukces LTD in vivo.

1. Przygotować roztwory elektrofizjologiczne przy użyciu odczynników wymienionych w tabelach 1-3^4,13. Dostosować pH wszystkich roztworów do 7,4 za pomocą HCl i dostosować osmolarność do 300-310 mOsm/kg_H2O. Przed eksperymentami należy przygotować świeże roztwory i przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 1 tygodnia. Nasycić wszystkie roztwory karbogenem (95% O₂/5% CO₂) przez cały czas użytkowania.
2. Stosując izofluran zgodnie z lokalnymi lub instytucjonalnymi wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami i użytkowania, głęboko znieczulij szczura w zamkniętej komorze eutanazyjnej. Upewnij się, że zwierzę jest w pełni znieczulone za pomocą odruchu szczypania palców u stóp.
3. Napełnij małą zlewkę 50 ml lodowatego roztworu do krojenia. Napełnij rurkę pompy perystaltycznej roztworem i dostosuj natężenie przepływu do 20 ml / min. Przymocuj igłę o rozmiarze 20 do końca rurki.
4. Otwórz jamę brzuszną (patrz kroki 6.4 i 6.5) i krótko przelej szczura roztworem tnącym (maksymalnie 1-2 min).
5. Po perfuzji natychmiast odetnij głowę szczurowi. Wyjąć mózg i umieścić go w małej zlewce wypełnionej roztworem tnącym o temperaturze 4 °C na 30 s-1 min.
6. Przenieś mózgi za pomocą szpatułki i szybko przymocuj je do komory wibratomu. Usuń pia za pomocą cienkich kleszczy. Napełnić komorę roztworem tnącym o temperaturze 4 °C i przygotować ostre plastry koronalne (o grubości 250 μm) ciała migdałowatego z prędkością 0,37 mm/s i częstotliwością 70 Hz.
7. Po uzyskaniu plastrów umieścić je w komorze wypełnionej roztworem do krojenia i inkubować w temperaturze 37 °C przez 10-12 minut. Na jedno zwierzę można uzyskać około 5-7 plastrów zawierających LA.
8. Przenieść plastry do zlewki z roztworem o temperaturze pokojowej (RT) i pozostawić do odzyskania na >30 minut przed eksperymentem.
   UWAGA: Plastry na ogół pozostają zdrowe, gdy są przechowywane w roztworze przez 4-6 godzin. Ze względu na fluorescencyjny charakter AAV, plastry są przechowywane w warunkach słabego oświetlenia.

8. Nagrania elektrofizjologiczne ex vivo

1. Przygotować roztwory wewnątrzkomórkowe przy użyciu odczynników wymienionych w tabelach 4-5.
   UWAGA: Roztwory wewnątrzkomórkowe powinny być sporządzane przed eksperymentami i mogą być przechowywane długotrwale (3-12 miesięcy) w temperaturze -80 °C lub krótkotrwale (1-2 miesiące) w temperaturze -20 °C. Roztwory mają pH dostosowane do 7,3 (z CsOH dla roztworu wewnątrzkomórkowego na bazie Cs i z KOH dla roztworu wewnątrzkomórkowego na bazie K). Dostosować do końcowej osmolarności 290-300 mOsm/kg H₂O.
2. Przygotować 500 mM roztwór podstawowy pikrotoksyny rozpuszczony w dimetylosulfotlenku (DMSO).
   UWAGA: Zapasy pikrotoksyny są podawane i przechowywane w temperaturze -20 °C. W dniu użycia podwielokrotności rozmraża się i dodaje do roztworu rejestrującego do końcowego stężenia 100 μM.
   UWAGA: Pitrotoksyna jest niekonkurencyjnym antagonistą receptorów GABA_A, więc wlew z pikrotoksyny ma działanie stymulujące. Jest silnie toksyczny po spożyciu doustnym lub wchłanianiu przez skórę. Podczas pracy z pikrotoksyną należy zawsze używać odpowiednich środków ochrony osobistej.
3. Przenieś plastry do pionowego mikroskopu przeznaczonego do eksperymentów elektrofizjologicznych.
4. Podczas eksperymentów należy w sposób ciągły kąpać plastry perfuzyjne roztworem nagrywającym, który jest podgrzewany do temperatury 31-33 °C.
5. Powiększ LA za pomocą obiektywu 4x. Zidentyfikuj główne neurony na podstawie morfologii za pomocą 40-krotnej soczewki zanurzonej w wodzie.
6. Użyj szklanej pipety (3-5 MΩ) wypełnionej roztworem wewnątrzkomórkowym na bazie Cs (do eksperymentów z zaciskiem napięciowym) lub roztworem wewnątrzkomórkowym na bazie K (do eksperymentów z zaciskiem prądowym), aby uzyskać zapisy klamry krosowej całej komórki.
7. Zidentyfikuj projekcje aksonalne MGN zakażone AAV pod wpływem fluorescencji (przy użyciu filtra RFP). Stymuluj projekcje za pomocą lasera DPSS o niebieskim świetle (473 nm) podłączonego do generatora impulsów.
   UWAGA: Aby ograniczyć ekspozycję na laser, skolimowane światło laserowe jest sprzężone z portem fluorescencyjnym w mikroskopie i skupiane na przekroju obiektywu.
   UWAGA: W trybie cęgów napięciowych pobudzające prądy postsynaptyczne (EPSC) są optycznie wywoływane przy 0,1 Hz. Neurony odbierające dane wejściowe z neuronów MGN zakażonych AAV będą wykazywać niezawodne EPSC.
8. Aby indukować ex vivo LTD, w obecnym trybie zaciskowym, zapisuj stabilną linię bazową pobudzających potencjałów postsynaptycznych (EPSP) przez co najmniej 10 minut. Następnie dostarczyj 900 impulsów 2 ms światła o długości 473 nm i częstotliwości 1 Hz (całkowity czas = 15 min). Następnie nagrywaj w sposób ciągły EPSP z częstotliwością 0,1 Hz przez ≥60 min.

Wyniki

Oś czasu przedstawiająca kolejność eksperymentów jest pokazana w Rysunek 1. W eksperymentach behawioralnych liczba wlewów kokainy, jak również liczba reakcji na aktywną dźwignię, służy jako miara intensywności zachowań związanych z poszukiwaniem kokainy. W pierwszych dniach samodzielnego przyjmowania kokainy liczba aktywnych reakcji powinna stopniowo wzrastać w każdym dniu nabycia, zanim ustabilizuje się w drugim tygodniu. I odwrotnie, reakcje nieaktywnej dźwigni powinny pozostać niskie prze...

Dyskusja

Jak opisano powyżej, istnieje kilka krytycznych kroków, które są ważne dla osiągnięcia prawidłowych wyników eksperymentalnych. Protokół będzie prawdopodobnie skuteczny tylko u zwierząt, które prawidłowo nabywają samodzielne podawanie kokainy, a do tej pory był testowany tylko przy użyciu parametrów opisanych powyżej. Możliwe jest, że dawka kokainy, harmonogram wzmacniania i parametry cue mogą być modyfikowane z prawdopodobnie niewielkim wpływem na wyniki behawioralne, z wyjątkiem tego, że schemat wzmacniania drugiego rzę...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
0,9% Saline	Fisher Scientific	NC0291799
A.M.P.I. Izolator bodźca	Iso-Flex
AAV5.hSyn.oChIEF.tdTomato	Duke Viral Vector Core (przez Rogera Tsiena)	#268	Patrz Lin i in., 2009; Nabavi i wsp., 2014
AAV5.hSyn.tdPomidor (kontrola)		rdzenia wektora wirusa Duke	Zobacz Lin i in., 2009; Nabavi i wsp., 2014
Sztuczne łzy (maść okulistyczna)	Covetrus	70349
ATP Sól magnezowa	Fisher Scientific	A9187
Betadine	Butler Schein	38250
Chlorek wapnia	Fisher Scientific	C1016
Chlorek cezu	Fisher Scientific	289329
Cez wodorotlenek	Fisher Scientific	516988
Metanosulfonian cezu	Fisher Scientific	C1426
w Kokainę HCl	NIDA	9041-001
Kriostat	Leica	CM1950
D-Glukoza	Sigma-Aldrich	G8270
DMSO	Fisher Scientific	BP231-1
Dwukanałowy regulator temperatury	Warner Instruments	TC-344C
EGTA	Fisher Scientific	E3889
Etanol	Uniwersytet w Pittsburghu Magazyn chemiczny	200C5000
Osłony przeciwpyłowe z okuciami	Thor Labs	CAPL	Białe plastikowe osłony przeciwpyłowe do okuć 1,25 mm
Tuleje współpracujące z okuciami	Doric Soczewki	F210-3011	Sleeve_BR_1.25, brąz, 1,25 mm ID
Ferrule	Precyzyjne produkty z włókien	MM-FER2007C-2300	i Oslash; Skuwka ceramiczna 1,25 mm wielomodowa LC/PC, & Oslash; 230 μ m rozmiar otworu
Światłowód	Thor Labs	FP200URT	200 μ Światłowód wielomodowy z rdzeniem m (0,5 NA)
Światłowodowe złącze obrotowe	Prizmatix	(zamówione w Amazon)	Średnica 18 mm, złącze FC-FC do
włókna Narzędzie do ściągania izolacji z włókien	Thor Labs	T12S21
Fluoroshield z DAPI	Sigma-Aldrich	F6057
Gentamycyna	Henry Schein	6913
GTP Sól sodowa	Fisher Scientific	G8877
Strzykawka Hamilton	Hamilton	80085	10 μ L objętość, 26 gauge, 2 cale, styl punktowy 3
Opalarka	Allied Electronics	972-6966	250 V, 750-800 ° F
Utwardzane termicznie	precyzyjne produkty z włókien	PFP-353ND-8OZ
Heparyna	Henry Schein	55737
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Kwas solny	Fisher Scientific	219405490
Isofluran	Henry Schein	29405
Ketamina HCl	Henry Schein	55853	Ketamina jest substancją kontrolowaną i należy postępować z nią zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi
Ringer z mleczanami" s	Henry Schein	9846
Laser, sterownik i sprzęgacz laser-światłowód	OEM Systemy laserowe	BL-473-00100-CWM-SD-xx-LED-0	100 mW, 473-nm, pompowany diodowo laser półprzewodnikowy (jedna opcja)
L-glutation	Fisher Scientific	G4251
Lidokaina	Butler Schein	14583
Czujnik światła	Thor Labs	PM100D	Kompaktowa konsola licznika energii z cyfrowym wyświetlaczem
Klej błyskawiczny Loctite	Grainger	5E207
Siarczan magnezu	Sigma-Aldrich	203726
Wzmacniacz mikroelektrod / Akwizycja danych	Urządzenia molekularne	MULTICLAMP700B / Digidata 1440A
Pompa mikroiniekcyjna	Aparat Harvard	70-4501	Podwójna strzykawka
Mikromanipulator	Sutter Instruments	MPC-200/ROE-200
Mikroskop	Olympus	BX51WI	Mikroskop pionowy do elektrofizjologii
	Mikroskop Olympus	BX61VS	Epifluorescencyjny mikroskop skaningowy szkiełkowy
N-metylo-D-glukamina	Sigma-Aldrich	M2004
Cement dentystyczny Orthojet, płynny	Lang Dental	1504BLK
cement dentystyczny Orthojet, proszek	Lang Dental	1530BLK	Współczesny proszek,
Paraformaldehyd	Sigma-Aldrich	P6148
	Thor Labs	FP200ERT	wielomodowy, FT030 Rurki
Piprotoksyna	Fisher Scientific	AC131210010
Tarcza polerska	Thor Labs	D50FC
Pad polerski	Thor Labs	NRS913	9" x 13"
Bibuła polerska	Thor Labs	LFG5P	5 μ
papier polerski	ziarnistości m Thor Labs	LFG3P	3 μ
papier polerski	ziarnistości m Thor Labs	LFG1P	1 μ
papier polerski	ziarnistości m Thor Labs	LFG03P	0,3 μ m grit
Chlorek potasu	Sigma-Aldrich	P9333
Wodorotlenek potasu	Fisher Scientific	P5958
Metanosulfonian potasu	Fisher Scientific	83000
QX-314-Cl Alomone	Labs	Q-150
Rimadyl (karprofen)	Henry Schein	24751
Samodzielne podawanie Chambers/Software	Med Associates	MED-NP5L-D1
Wodorowęglan sodu	Sigma-Aldrich	S5761
Chlorek sodu	Sigma-Aldrich	S7653
Wodorotlenek sodu	Sigma-Aldrich	1064980500
L-askorbinian sodu	Sigma-Aldrich	A7631
Pentobarbital sodu	Henry Schein	24352
Fosforan sodu	Sigma-Aldrich	S9638
Fosfokreatyna sodu	Fisher Scientific	P7936
Pirogronian sodu	Sigma-Aldrich	P2256
Wkręty maszynowe ze stali nierdzewnej	WW Grainger	6GB25	M2-0,40mm Śruba maszynowa, patelnia, krzyżak, A2 Stal nierdzewna, gładka, 3 mm długości
Adapter stereotaktyczny do okuć	Thor Labs	XCL
Rama stereotaktyczna	Stoelting	51603
Sacharoza	Sigma-Aldrich	S8501
Nić do szwów	Fine Science Tools	18020-50	Nić jedwabna; Rozmiar: 5/0, Średnica: 0,12 mm
Chlorek herbaty	Fisher Scientific	T2265
Tiomocznik	Sigma-Aldrich	T8656
Klej do tkanek Vetbond	Covetrus	001505
Vibratome	Leica	VT1200S
Xylazine	Butler Schein	33198