Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Synteza masarymycyny, małocząsteczkowego inhibitora wzrostu bakterii Gram-dodatnich

1.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63191

⸱

7 stycznia 2022

 ,  , 
1Department of Science and Technology, Bryant University, 2Center for Health and Behavioral Sciences, Bryant University

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiono szczegółowy protokół przygotowania bakteriostatycznego diamidu masarimycyny, małocząsteczkowej sondy, która hamuje wzrost Bacillus subtilis i Streptococcus pneumoniae poprzez ukierunkowanie na degradację ściany komórkowej. Jego zastosowanie jako sondy chemicznej wykazano w testach synergii/antagonizmu i badaniach morfologicznych z B. subtilis i S. pneumoniae.

Streszczenie

Peptydoglikan (PG) w ścianie komórkowej bakterii to unikalna struktura makromolekularna, która nadaje kształt i chroni przed otaczającym środowiskiem. Kluczowe znaczenie dla zrozumienia wzrostu i podziału komórek ma wiedza o tym, jak degradacja PG wpływa na biosyntezę i tworzenie ścian komórkowych. Ostatnio doniesiono o metabolicznym znakowaniu PG poprzez wprowadzenie zmodyfikowanych cukrów lub aminokwasów. Podczas gdy chemiczne badanie etapów biosyntezy za pomocą inhibitorów małocząsteczkowych jest możliwe, narzędzia biologii chemicznej do badania degradacji PG przez autolizyny są słabo rozwinięte. Autolizyny bakteryjne to szeroka klasa enzymów, które biorą udział w ściśle skoordynowanej degradacji PG. W tym miejscu przedstawiono szczegółowy protokół przygotowania sondy małocząsteczkowej, masarymycyny, która jest inhibitorem N-acetyloglukozaminidazy LytG w Bacillus subtilis i metabolizmu ściany komórkowej w Streptococcus pneumoniae. Zapewnione jest przygotowanie inhibitora za pomocą wspomaganej mikrofalami i klasycznej syntezy organicznej. Przedstawiono jego przydatność jako narzędzia do badania fizjologii Gram-dodatniej w testach biologicznych.

Wprowadzenie

Peptydoglikan (PG) to polimer przypominający siatkę, który wyznacza kształt i strukturę komórek zarówno u bakterii Gram-dodatnich, jak i Gram-ujemnych1,2. Ten heteropolimer jest matrycą aminocukrów usieciowanych krótkimi peptydami3,4,5,6 ze szkieletem złożonym z β-(1,4)-połączonych naprzemiennie reszt N-acetyloglukozaminy (GlcNAc) i kwasu N-acetylomuraminowego (MurNAc) (Rysunek 1)1. Do ugrupowania laktylowego C-3 MurNAc przyłączony jest peptyd macierzysty. Metabolizm PG obejmuje ściśle skoordynowany system enzymów biosyntetycznych i degradacyjnych w celu włączenia nowego materiału do ściany komórkowej7,8. Degradacja PG jest przeprowadzana przez enzymy zbiorczo określane jako autolizyny9 i dalej klasyfikowane na podstawie specyficzności rozszczepionego wiązania. Autolizyny uczestniczą w wielu procesach komórkowych, w tym we wzroście komórek, podziale komórek, ruchliwości, dojrzewaniu PG, chemotaksji, wydzielaniu białek, kompetencjach genetycznych, różnicowaniu i patogenności10,11. Rozwikłanie specyficznych funkcji biologicznych poszczególnych autolizyn może być zniechęcające, częściowo ze względu na redundancję funkcjonalną. Jednak niedawne badania biofizyczne8,12,13 i badania obliczeniowe12 dostarczyły nowych informacji na temat ich roli w metabolizmie PG. Ponadto ostatnie raporty dostarczyły dalszych informacji na temat synthesis14 i membranowych15,16,17 etapów metabolizmu PG. Dogłębne zrozumienie związku między degradacyjnymi i syntetycznymi szlakami metabolizmu PG może doprowadzić do powstania wcześniej niewykorzystanych celów antybiotykowych.

Chociaż nastąpił znaczny postęp w metodologii badania glikobiologii u eukariontów, glikobiologia bakteryjna, a w szczególności metabolizm PG, nie rozwijała się w podobnym tempie. Obecne chemiczne podejścia do badania metabolizmu PG obejmują fluorescencyjnie znakowane antybiotyki18, sondy fluorescencyjne19,20, oraz etykietowanie metaboliczne21,22,23,24. Te nowe podejścia dostarczają nowych sposobów badania metabolizmu ścian komórkowych bakterii. Podczas gdy niektóre z tych strategii są w stanie oznaczyć PG in vivo, mogą być specyficzne dla gatunku19, lub działać tylko w szczepach bez określonej klasy autolysin25. Wiele strategii znakowania PG jest przeznaczonych do stosowania z izolowanymi ścianami komórkowymi26 lub z odtworzonymi in vitro szlakami biosyntezy PG20,27,28. Stosowanie antybiotyków znakowanych fluorescencyjnie jest obecnie ograniczone do etapów biosyntezy i transpeptydacji18.

Obecna wiedza na temat bakteryjnych autolizyn i ich roli w metabolizmie ściany komórkowej pochodzi z analizy genetycznej i biochemicznej in vitro11,29,30,31,32. Chociaż podejścia te dostarczyły wielu informacji na temat tej ważnej klasy enzymów, rozszyfrowanie ich biologicznej roli może być trudne. Na przykład, ze względu na redundancję funkcjonalną33, usunięcie autolizyny w większości przypadków nie powoduje zatrzymania wzrostu bakterii. Dzieje się tak pomimo ich domniemanej roli we wzroście i podziale komórek7,12. Kolejną komplikacją jest to, że genetyczna delecja autolizyn bakteryjnych może prowadzić do powstania meta-fenotypów34. Metafenotypy powstają w wyniku złożonej interakcji między szlakiem, na który wpływa delecja genetyczna, a innymi wzajemnie powiązanymi szlakami. Na przykład metafenotyp może powstać w wyniku efektu bezpośredniego, takiego jak brak enzymu, lub efektu pośredniego, takiego jak zakłócenie regulatorów.

Obecnie istnieje tylko kilka inhibitorów autolizyn glikozydazy, takich jak N-acetyloglukozaminidazy (GlcNAcase) i N-acetylmuramidazy, które mogą być używane jako sondy chemiczne do badania degradacji PG. Aby temu zaradzić, diamidowa masarymycyna (wcześniej określana jako fgkc) została zidentyfikowana i scharakteryzowana35 jako bakteriostatyczny inhibitor wzrostu Bacillus subtilis, który jest ukierunkowany na GlcNAcase LytG32 (Rysunek 1). LytG jest egzodziałającą GlcNAcase36, członkiem klastra 2 w rodzinie hydrolaz glikozylowych 73 (GH73). Jest to główny aktywny przypadek GlcNAcase podczas wzrostu wegetatywnego32. Według naszej wiedzy, masarymycyna jest pierwszym inhibitorem GlcNAcase działającego na PG, który hamuje wzrost komórek. Dodatkowe badania masarymycyny z Streptococcus pneumoniae wykazały, że masarymycyna prawdopodobnie hamuje metabolizm ściany komórkowej w tym organizmie37. W tym przypadku preparat masarimycyny jest zgłaszany do stosowania jako sonda biologii chemicznej do badania fizjologii organizmów Gram-dodatnich B. subtilis i S. pneumoniae. Przedstawiono przykłady analizy morfologicznej leczenia masarymycyną subminimalnym stężeniem hamującym, a także test synergii/antagonizmu. Testy synergii i antagonizmu przy użyciu antybiotyków o dobrze zdefiniowanych sposobach działania mogą być użytecznym sposobem badania powiązań między procesami komórkowymi38,39,40.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Metody ogólne

UWAGA: Wszystkie związki zostały zakupione od standardowych dostawców i użyte bez dalszego oczyszczania.

  1. Przeprowadzić cienkowarstwową chromatografię (TLC) na płytce aluminiowej powlekonej żelem krzemionkowym XG F254. Plamy wykrywać pod lampą UV, poprzez zanurzenie w odczynniku p-anisaldehydowym lub poprzez ekspozycję na opary I2 .
  2. Wszystkie widma magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) zarejestrować na spektrometrze 400 MHz.
    UWAGA: Widma 1H-NMR oraz 13C-NMR odniesiono do sygnałów pozostałego rozpuszczalnika. Stałe sprzężenia podano w [Hz], a przesunięcia chemiczne w [ppm].
  3. Widma spektrometrii mas z jonizacją chemiczną przy ciśnieniu atmosferycznym (APCI) dla masarymycyny zarejestrować na kompaktowym spektrometrze mas wyposażonym w sondę do analizy ciał stałych przy ciśnieniu atmosferycznym.

2. Ogólna procedura przygotowania masarymicyny

UWAGA: Poniższe kroki należy wykonać w dygestorium.

  1. Przygotować 0,1 M roztwór każdego z substratów w metanolu: cykloheksyloaminy oraz cykloheksylokarbaldehydu. o-kwas jodobenzoowy i izocyjanek cykloheksylu35.
    OSTRZEŻENIE: Cykloheksyloamina, cykloheksyloizocyjanek i cykloheksylokarboksaldehyd są łatwopalne. Mogą powodować oparzenia skóry oraz wywoływać toksyczność przy podaniu doustnym, przezskórnym, wziewnym lub toksyczność dla rozrodczości. Przechowywać związki z dala od otwartego ognia, gorących powierzchni i źródeł zapłonu. Należy stosować odpowiednie środki ochrony skóry i oczu, pracować w dobrze wentylowanym pomieszczeniu oraz unikać wdychania oparów lub mgły. W celu przechowywania butelki należy szczelnie zamykać i trzymać w chłodnym, suchym miejscu. Cykloheksylokarboksaldehyd przechowywać w eksykatorze pod atmosferą N2.2 atmosfera
  2. W zakorkowanej kolbie okrągłodennej wymieszać 5 ml cykloheksyloaminy (roztwór 0,1 M w metanolu) i 5 ml cykloheksylokarbaldehydu (0,1 M w metanolu), a następnie mieszać roztwór za pomocą mieszadła magnetycznego na płycie grzewczo-mieszalnej przez 30 min w temperaturze 40 °C w łaźni piaskowej. Temperaturę należy monitorować za pomocą termometru umieszczonego około 1 cm poniżej powierzchni piasku.
  3. Po 30 minutach do roztworu z kroku 2.2 należy dodać 5 ml cykloheksyloizocyjanianku (roztwór 0,1 M w metanolu) i mieszać przez kolejne 20 minut w 50 °CNa koniec dodać 5 ml o-kwas jodobenzoowy (roztwór 0,1 M w metanolu) do mieszaniny reakcyjnej i kontynuuj mieszanie w 55 °C przez 3–5 h.
  4. Monitoruj postępy reakcji okresowo za pomocą TLC, mniej więcej co godzinę, po tym jak powyższa mieszanina reakcyjna była mieszana przez 3 h.
  5. Wytnij pasek płytki TLC z podkładem aluminiowym o wymiarach 3 cm x 6 cm. Za pomocą ołówka nr 2 narysuj linię w odległości około 1 cm od dolnej krawędzi. Używając szklanej mikrokapilary, nanieś około 5 µL mieszaniny reakcyjnej na płytkę TLC i pozostawić do wyschnięcia.
  6. Do zlewki o pojemności 150 ml wlać taką ilość fazy ruchomej (heksan:izopropanol w stosunku 90:10), aby przykryła ona dno naczynia. Za pomocą pęsety ostrożnie umieścić opisaną płytkę TLC w zlewce, upewniając się, że płytka równomiernie zanurza się w fazie ruchomej. Górę zlewki przykryć kawałkiem folii aluminiowej.
    UWAGA: Należy upewnić się, że faza ruchoma nie zalewa linii startowej ani naniesionej próbki.
  7. Pozostaw fazę ruchomą do czasu, aż przemieści się w górę płytki TLC na odległość około 1 cm poniżej górnej krawędzi płytki. Wyjmij płytkę TLC i za pomocą ołówka narysuj linię wskazującą dystans, jaki przebyła faza ruchoma. Pozostaw płytkę TLC do wyschnięcia w dygestorium.
  8. Po wysuszeniu umieść płytkę TLC w zlewce zawierającej niewielką ilość substancji stałej I2 i przykryć zlewkę kawałkiem folii aluminiowej. Monitorować płytkę TLC pod kątem pojawienia się żółtych/brązowych plam. Po ich pojawieniu się wyjąć płytkę TLC i zaznaczyć ołówkiem położenie plam (Rycina uzupełniająca 1).
    UWAGA: Jeśli ja2 jeśli plamy nie zostaną zaznaczone, barwnik z czasem wyblaknie. Plamy na płytce TLC można również wizualizować za pomocą światła UV, pbarwienie anisaldehydem lub barwienie nadmanganianem potasu (patrz Informacje uzupełniające).
  9. Oblicz Rf wartości dla wszystkich zwizualizowanych plamek według następującego wzoru:
    Rf = Wzór chromatograficzny, obliczanie Rf, stosunek odległości, metoda chemiczna, analiza rozdziału.
  10. Reakcję uznaje się za zakończoną, gdy widoczna jest tylko jedna plama o wartości Rff = 0,3 jest widoczna na płytce TLC. Rozpuszczalnik usunąć za pomocą rotacyjnego odparowacza pod zmniejszonym ciśnieniem, a surowy produkt (otrzymany w postaci żółto-brązowego oleju) wysuszyć w wysokiej próżni do czasu całkowitego odparowania metanolu.
  11. Rozpuścić wysuszony produkt surowy w 30 ml octanu etylu i przelać do rozdzielacza. Wyekstrahować octan etylu sekwencyjnie za pomocą 1 M HCl (2 x 30 ml), H2O (30 ml), nasycony NaHCO33 roztwór (2 x 30 ml), H2O (30 ml) i nasycony roztwór NaCl (2 x 30 ml). Odrzucić warstwy wodne.
    UWAGA: Warstwa octanu etylu jest warstwą górną w każdym z etapów ekstrakcji. Podczas każdej ekstrakcji należy energicznie wstrząsnąć rozdzielaczem zawierającym octan etylu i roztwór wodny (HCl, H2O, NaHCO₃3, lub NaCl) i poczekać do całkowitego rozdzielenia się warstw.
  12. Odlaj warstwę octanu etylu z rozdzielacza i zbierz ją do kolby Erlenmeyera. Dodaj szpatułkę Na2SO4 (bezwodny) w celu usunięcia resztkowej wody z octanu etylu.
    UWAGA: Roztwór octanu etylu uznaje się za suchy, gdy Na2SO4 w kolbie sypie się swobodnie i nie tworzy grudek. Jeśli Na2SO4 w przypadku powstawania grudek, dodać kolejną szpatułkę Na2SO4 można dodać.
  13. Przefiltrować wysuszony roztwór octanu etylu przez papier filtracyjny nr 1, aby usunąć Na.2SO4Przemyj papier filtracyjny niewielką ilością octanu etylu. Przefiltrowany roztwór octanu etylu przelej do kolby okrągłej i odparuj rozpuszczalnik na ewaporatorze rotacyjnym pod zmniejszonym ciśnieniem; po całkowitym usunięciu octanu etylu masarimycyna zostanie otrzymana w postaci olejku.
  14. Rozpuścić otrzymany wcześniej olejek masarymycynowy w minimalnej ilości (1–2 ml) mieszaniny heksanu z izopropanolem w stosunku 9:1 i mieszać na mieszalce magnetycznej do całkowitego rozpuszczenia związku.
  15. Oczyść rozpuszczoną masarymycynę za pomocą chromatografii błyskawicznej, wykorzystując kolumnę z silikagelem w fazie normalnej o masie 12 g.
    1. Równoważyć kolumnę do chromatografii flash za pomocą 10 objętości kolumny fazy ruchomej (heksan:izopropanol 99:1), ustawiając przepływ urządzenia na 15 ml/min.
      UWAGA: Po zakończeniu równoważenia należy zatrzymać przepływ i odłączyć górną część kolumny od systemu.
    2. Pobrać rozpuszczoną masarymycynę za pomocą strzykawki 5 ml. Podłączyć strzykawkę bezpośrednio do górnej części wyrównanej kolumny do chromatografii błyskawicznej i wstrzyknąć roztwór do kolumny. Ponownie podłączyć załadowaną kolumnę do systemu chromatografii błyskawicznej i rozpocząć elucję gradientową.
    3. Wymyć masarymycynę z kolumny, stosując elucję gradientową do końcowego stężenia fazy ruchomej 10:90 heksan:izopropanol w ciągu 12 objętości kolumny. Monitorować elucję masarymycyny. poprzez absorpcja przy 230 i 254 nm.
    4. Związkami wymywanymi z kolumny należy zbierać za pomocą automatycznego zbieracza frakcji, ustawionego na pobieranie 20 ml rozpuszczalnika na jedną frakcję.
      UWAGA: W przypadku braku systemu do błyskawicznej chromatografii, oczyszczanie masarymicyny można przeprowadzić poprzez kolumna z krzemionką w układzie grawitacyjnym z fazą ruchomą 3:1 (heksan: octan etylu). Frakcje zawierające masarymycynę można zidentyfikować za pomocą TLC, stosując tę samą fazę ruchomą. Wizualizację plam w TLC przeprowadzono przy użyciu światła UV, I2 opary lub barwienie nadmanganianem potasu.
    5. Zidentyfikuj frakcje zawierające masarymycynę za pomocą TLC (kroki 2.5–2.9) lub spektrometrii mas przy użyciu kompaktowego spektrometru mas wyposażonego w sondę do analizy ciał stałych w warunkach atmosferycznych. Wysusz produkt końcowy w próżni (~0,3 mbar).
      UWAGA: Masarymycynę rutynowo otrzymuje się w postaci bezbarwnego oleju lub ciała stałego, przy wydajności wynoszącej 55%–70% w stosunku do mmol cykloheksylokarboksaldehydu dodanego do reakcji. Oblicz końcową wydajność masarymycyny, wyznaczając masę oczyszczonej masarymycyny i obliczając wydajność teoretyczną reakcji według następującego wzoru:
      wydajność % = Równanie obliczania czystości: masa oczyszczonego produktu podzielona przez teoretyczną masę produktu. x 100%
  16. Potwierdź strukturę masarymycyny za pomocą NMR.
    1. Rozpuścić ok. 10 mg próbki masarymicyny w 0,5 ml CDCl33Za pomocą pipety Pasteura przenieś roztwór do probówki do NMR o średnicy 5 mm i zakryj ją korkiem. Umieść probówkę NMR w spektrometrze.
    2. Pozyskać 1H i 13widma 13C NMR uzyskane przy użyciu predefiniowanych eksperymentów producenta. Przypisania przesunięć chemicznych oraz reprezentatywne widma przedstawiono w Rysunki uzupełniające 3-4.
  17. Przechowywać masarymycynę w formie suchej lub rozpuszczoną w DMSO (stężenie końcowe 25 mM) w temperaturze -20 °C do czasu użycia.

3. Procedura mikrofalowa przygotowania masarymicyny

  1. Przygotować 0,6 M roztwory cykloheksyloaminy, cykloheksyloceboaldehydu, cykloheksyloizocyjanidu oraz kwasu o-jodobenzoenowego w acetonitrylu.
  2. Do szklanej fiolki do reakcji w mikrofalach dodać mieszadło magnetyczne oraz 10 mL acetonitrylu.
  3. Do fiolki dodać 2 mL cykloheksyloaminy (0,6 M w acetonitrylu), 2 mL cykloheksyloceboaldehydu (0,6 M w acetonitrylu) oraz 7 mL acetonitrylu.
  4. Umieścić fiolkę do reakcji w karuzeli mikrofalowej. Mieszać mieszaninę, ogrzewać przez 30 min w temperaturze 50°C przy mocy 400 W, a następnie pozwolić jej ostygnąć do temperatury pokojowej.
  5. Do fiolki dodać 2 mL kwasu o-jodobenzoenowego (0,6 M w metanolu) oraz 2 mL cykloheksyloizocyjanidu (0,6 M w acetonitrylu). Mieszać mieszaninę, ogrzewać w mikrofalach do 100 °C przez 40 min przy mocy 400 W, a następnie pozwolić jej ostygnąć do temperatury pokojowej.
  6. Po zakończeniu kroku 3.5 monitorować przebieg reakcji za pomocą TLC (90:10 heksan: izopropanol), wykorzystując opary I2.
    UWAGA: Jeśli TLC wykaże, że reakcja nie została zakończona (tj. widoczne są wiele plam na płytce TLC), ponownie umieścić fiolkę w mikrofalach i zastosować warunki opisane w kroku 3.5.
  7. Po zakończeniu reakcji przelać roztwór do kolby okrągłodennej o pojemności 100 mL i odparować do suchości za pomocą rotacyjnego odparowacza.
  8. Postępować zgodnie z krokami 2.6-2.16 opisanymi powyżej, aby przeprowadzić obróbkę wodną, oczyszczanie oraz charakterystykę masarimycyny.

4. Analiza synergizmu i antagonizmu

  1. Hodowla Streptococcus pneumoniae R6 na płytkach z agarem Müllera-Hintona (MH) zawierających 5% (v/v) krwi owczej w 37 °C w warunkach beztlenowych. we wszystkich eksperymentach należy użyć komórek z drugiego pasażu hodowanych w 5 ml bulionu MH w temperaturze 37 °C w warunkach beztlenowych do momentu uzyskania OD600 wynosi około 0,4.
  2. Inhibitory masarimycinę i optochinę poddać seryjnym rozcieńczeniom 1:2 w odpowiednich rozpuszczalnikach, tak aby uzyskane stężenia obejmowały wartości minimalnego stężenia hamującego (MIC) dla każdego z inhibitorów.
    1. Przygotować początkowe rozcieńczenie masarymicyny w dimetylosulfotlenku (DMSO) do stężenia 100 µM zostanie osiągnięta. Od tego momentu należy przygotować rozcieńczenia masarymycyny w bulionie MH. Przygotować roztwór zapasowy optochiny (3,5 mM), rozpuszczając dostępną komercyjnie optochinę (patrz Tabela materiałów) w sterylnej pożywce MH.
      UWAGA: Roztwory zapasowe masarymycyny przygotowano w stężeniu 25 mM w DMSO.
  3. Do sterylnej mikropłytki do miareczkowania o 96 dołkach należy dodać 2 µL alikwoty każdego rozcieńczenia optochiny do każdego rzędu płytki. Do tej samej płytki należy dodać 2 µL alikwoty każdego rozcieńczenia masarymycyny do każdej kolumny, aby stworzyć na płytce macierz stężeń optochiny i masarymycyny (Rycina 2).
  4. Dodaj sterylny bulion MH (93 µL) do każdej studzienki zawierającej powyższe inhibitory. Zaszczep płytki mikrotitracyjne za pomocą 5 µL kultury (OD600 ~0,4) z kroku 4.1.
    UWAGA: Inokulacja płytki 96-dołkowej jest zazwyczaj przeprowadzana w warunkach beztlenowych w komorze beztlenowej. Objętość końcowa w dołku wynosi 100 µL.
  5. Inkubować hodowle przez 18 h w temperaturze 37 °C w warunkach beztlenowych, a następnie po dodaniu 30 µL 0,01% (m/v) roztworu soli sodowej rezazureny. Inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez 15 min, aby umożliwić utworzenie i stabilizację barwy.
    UWAGA: Roztwór rezazuryny przygotowuje się poprzez rozpuszczenie związku w wodzie destylowanej; można go przechowywać w 4 °C przez maksymalnie dwa tygodnie.
  6. Odczytaj bezpośrednio wartości stężeń z płytki i przypisz najniższe stężenie inhibitora, dla którego nie zaobserwowano wzrostu bakterii (kolor niebieski), jako [X] (patrz krok 4.7.1), czyli najniższe stężenie hamujące leku w obecności leku wspomagającego.
    UWAGA: Pozytywny wzrost bakterii w dołkach rozpoznaje się po zmianie koloru barwnika rezazuryny na różowy. Wartości MIC dla każdego leku podawanego pojedynczo (t.j. bez drugiego leku) określa się w podobny sposób, stosując test MIC z użyciem rezazuryny.35 z każdym lekiem osobno (Rycina uzupełniająca 5). MIC w S. pneumoniae są 7.8 µM i 15.85 µM odpowiednio dla masarymycyny i optochiny.
  7. Wyznaczanie frakcyjnego stężenia hamującego (FIC) oraz indeksu FIC (FICI) przy użyciu następujących równań.
    1. FIC = [X]/MICProszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia., gdzie [X] (z kroku 4.6) to najniższe stężenie hamujące leku w obecności leku wspomagającego, a MICPrzykładowy tekst źródłowy nie został dostarczony. Proszę o przesłanie tekstu do tłumaczenia. jest najniższym stężeniem hamującym lek w obecności leku pomocniczego.
    2. FICI= FICmasarymycyna + FICantybiotyk
      UWAGA: FICI < 0,5 = synergistyczny, 0,5 < FIC (frakcjonująca inhibitory koncentracja)I < 1 = dodatek, 1 < FICI < 4 = obojętny, FICI > 4 = antagonistyczny.

5. Badanie morfologiczne

  1. Hodować Bacillus subtilis 11774 na płytkach z agarem Luria-Bertani (LB) (10 g/L tryptony, 5 g/L ekstraktu drożdżowego i 5 g/L NaCl) zawierających 1,5% Bacto agar w temperaturze 37 °C. we wszystkich eksperymentach należy użyć komórek z drugiego pasażu wyhodowanych w 5 mL bulionu LB w temperaturze 37 °C aż do osiągnięcia OD600 = 1. Hodować S. pneumoniae w taki sam sposób, jak opisano w kroku 4.1.
  2. Po uzyskaniu gęstości hodowli komórkowej OD600nm = 1 dla B. subtilis lub OD600nm = 0,4 dla S. pneumoniae, dodać za pomocą pipety masarymycynę do probówki z hodowlą oznaczonej jako „treated” do końcowego stężenia 3,8 µM (0,75x MIC dla B. subtilis) lub 5,85 µM (0,75x MIC dla S. pneumoniae). Do drugiej probówki z hodowlą oznaczonej jako „control” dodać równoważną objętość DMSO.
  3. W przypadku B. subtilis próbki umieścić w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 90 min przy wytrząsaniu z prędkością 150 rpm. W przypadku S. pneumoniae inkubować komórki bez wytrząsania w warunkach beztlenowych.
  4. Po 90 min utrwalić chemicznie hodowle w mieszaninie 1:10 (v/v) pożywki i buforu utrwalającego (20 mM HEPES, 1% formaldehydu (pH 6,8)) w temperaturze 4 °C przez noc. Po zakończeniu utrwalania nanieść za pomocą pipety 10-20 µL próbek na szklane preparaty mikroskopowe i pozostawić do wyschnięcia na powietrzu. Próbki wysuszone na powietrzu utrwalić termicznie, podgrzewając szkiełka nad palnikiem Bunsena.
  5. Po utrwalaniu termicznym zabarwić próbki, dodając 100 µL 0,1% (m/v) błękitu metylenowego (roztwór w 20% (v/v) etanolu). Inkubować zabarwione szkiełka przez 10 min, a następnie wypłukać nadmiar barwnika wodą dH2O. Następnie delikatnie podgrzać zabarwione szkiełka do 60 °C w piecu przez 15-20 min, aby sprowadzić komórki do wspólnej płaszczyzny ogniskowej.
  6. Zabezpieczyć zabarwione próbki, nakładając na zabarwione komórki szkiełko nakrywki. Następnie uszczelnić krawędzie za pomocą cementu do preparatów mikroskopowych. Umieścić zabezpieczone szkiełko na stole mikroskopu i ustawić ostrość obrazu przy powiększeniu 100x w mikroskopii w polu jasnym.
  7. Nanieść kroplę olejku imersyjnego na szkiełko i ustawić ostrość pola widzenia przy powiększeniu 1000x. Wykonać mikrofotografie przy użyciu kamery podłączonej do mikroskopu oraz odpowiedniego oprogramowania. Obrazy należy rejestrować przy użyciu automatycznego balansu bieli i ustawień przysłony w oprogramowaniu.
    UWAGA: Alternatywnie obrazy można przetwarzać przy użyciu otwartoźródłowego oprogramowania ImageJ.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Masarimycyna jest małocząsteczkowym bakteriostatycznym inhibitorem B. subtilis oraz S. pneumoniae; wykazano, że hamuje ona działającą zewnątrzkomórkowo glcNAkazę LytG u B. subtilis35,37 oraz oddziałuje na ścianę komórkową S. pneumoniae37. Masarimycynę można efektywnie otrzymywać zarówno za pomocą klasycznej syntezy organicznej, jak i syntezy wspomaganej mikrofalowo, z wydajnością w zakresie 55%-70%. Synt...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Masarymycyna jest pojedynczym mikromolowym inhibitorem bakteriostatycznym wzrostu B. subtilis35 i S. pneumoniae37 . Wykazano, że u B. subtilis masarymycyna hamuje GlcNAcase LytG35, podczas gdy dokładny cel molekularny w ścianie komórkowej S. pneumoniae nie został zidentyfikowany37. Synteza masarimycyny przy użyciu klasycznej syntezy organicznej lub procedury mikrofalowej zapewnia inhibitor o dobrej w...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Reid, C. W. posiada własność intelektualną obejmującą konkretne zastosowania masarymycyny.

Podziękowania

Badania były wspierane przez National Science Foundation w ramach grantu numer 2009522. Analiza NMR masarymycyny została wsparta nagrodą National Science Foundation w ramach grantu numer 1919644. Wszelkie opinie, ustalenia, wnioski lub zalecenia wyrażone w tym materiale są opiniami autorów i niekoniecznie odzwierciedlają poglądy National Science Foundation.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kwas 2-jodobenzoesowySIGMA-ALDRICHI7675-25G, drażniący, jasnożółty do pomarańczowo-brązowego proszek
2-PropanolSIGMA-ALDRICH109827-4Lłatwopalna, drażniąca, bezbarwna ciecz
AcetonitrylSIGMA-ALDRICH34851-4Lłatwopalna, drażniąca, bezbarwna ciecz
Płyty krzemionkowe na podłożu aluminiowymSorbtech4434126żel krzemionkowy XG F254 na aluminiowych płytkach z podkładem
chloroform-dSIGMA-ALDRICH151823-50Grozpuszczalnik do
kompaktowego spektrometru masowegoNMR Kompaktowy spektrometr masowy Advion-InterchimAdvion CMSwyposażony w źródło APCI i sondę do analizy ciał stałych w atmosferze
Corning Costar 96-well flat bottom plates - sterylnyfisher chemical07-200-90do testów synergii / antagonizmu
Szkiełka nakrywkowefisher chemical12-547do mikroskopii
CykloheksanokarboksyaldehydCHEM-IMPEX INT'L INC.24451łatwopalna, drażniąca, bezbarwna do różowej ciecz
Izocyjanek cykloheksyluSIGMA-ALDRICH133302-5Gdrażniąca, bezbarwna ciecz, wyjątkowo nieprzyjemny zapach
CykloheksyloaminaSIGMA-ALDRICH240648-100ML, łatwopalna, drażniąca, bezbarwna ciecz, chyba że zanieczyszczona
Octan etyluSIGMA-ALDRICH537446-4Lłatwopalny, drażniący, bezbarwny wkład z ciekłą
krzemionką flash (12g)Advion-InterchimPF-50SIHP-F0012zestaw kolumn krzemionki błyskowej (12g) do oczyszczania masarimycyny
i formaldehyduSIGMA-ALDRICHF8775-25MLśrodek utrwalający do mikroskopii
HEPESSIGMA-ALDRICHH8651-25Gbufor do mikroskopii roztwór utrwalający
Heksan, mieszanina izomerówSIGMA-ALDRICH178918-4Lszkodliwy dla środowiska, łatwopalny, drażniący, zagrażający zdrowiu, bezbarwna ciecz
Wysokowydajny kompaktowy spektrometr masowyEkspresja advionSonda do analizy ciał stałych w atmosferze (ASAP), niska rozdzielczość
High VaceppendorfVacufuge pluspróżnia wspomagana siłą odśrodkową i temperaturą
Kwas solnySIGMA-ALDRICH258148-2.5L, drażniący, bezbarwny płynny
kwas solnySIGMA-ALDRICH320331-2.5Lolejek immersyjny z mocnym kwasem
rybak chemiczny12-365-19do mikroskopii
Jod, resublimowane kryształyAlfa Aesar41955szkodliwy dla środowiska, drażniący, zagrażający zdrowiu, ciemnoszare/fioletowe kryształy
Mestre MnovaMestreLab Researchoprogramowanie do przetwarzania widm NMR
MetanolSIGMA-ALDRICH439193-4Lłatwopalny, toksyczny, zagrażający zdrowiu, bezbarwny
płynny błękit metylenowySIGMA-ALDRICHM9140-25Gbarwnik mikroskopowy do barwienia ścian komórkowych
Płytki agarowe Meuller-Hinton + 5% pożywkachemicznaB21176Xwzrostu dla Streptococcus pneumoniae
bulion Meuller-Hintonfisher chemicalDF0757-17-6pożywka wzrostowa dla Streptococcus pneumoniae
Szkiełka mikroskopoweFisher Chemical22-310397do mikroskopii
Stacja laboratoryjna do syntezy mikrofalowejMILESTONESTART SYNTHurządzenie wymagające wentylacji dygestoriów, wyposażone w karuzelę syntezy
Rurki NMRSIGMA-ALDRICHZ562769-5EALampy NMR 5mm 600 MHz
Magnetyczny rezonans jądrowy (NMR)BrukerAscend 400(400 MHz)
optochinfisher chemicalAAB21627MCchlorowodorek etylohydrocupreiny
PetriegoCelltreat229695do przygotowania płytek agarowych do rozwoju bakterii
Primo Star Mikroskop z jasnym polem/kontrastem fazowym z kamerą ERc5sZeissdo badania morfologii
puriFlashinterchimXS520pluschromatografia flash system oczyszczania
resazurinSIGMA-ALDRICHR7017-1Gdo oznaczania synergii/antagonizmu
Parownik obrotowyHeidolphHei-VAP Wartość "The Collegiate"parownik rozpuszczalnikowy
Wodorowęglan soduSIGMA-ALDRICHS6014-500Gdrażniący, biały proszek
Chlorek sodufisher chemicznyS271-1krystaliczny, bezbarwny
Chlorek soduSIGMA-ALDRICHS5886-500Gdo wzrostu B.subtilis i przygotowania pożywki LB
Siarczan soduSIGMA-ALDRICH7985592-500Gbezwodny, granulowany, biały
tryptonfisher chemicznyBP1421-500do wzrostu B.subtilis i przygotowanie pożywki LB
Stacja robocza Whitney DG250 Stacja roboczaMicrobiology InternationalDG250beztlenowa. Zastosowano beztlenową mieszaninę gazów: 5% wodoru, 10% dwutlenku węgla, bilansowy
ekstrakt drożdżyazotowych fisher chemicalBP1422-500do wzrostu B.subtilis i przygotowania podłoża LB
Zen Lite (niebieski) oprogramowanieZeissdo pozyskiwania mikrofotografii
Duży magnes nadprzewodzący płytki

Bibliografia

  1. Vollmer, W., Blanot, D., de Pedro, M. A. Peptidoglycan structure and architecture. FEMS Microbiology Review. 32 (2), 149-167 (2008).
  2. Munita, J. M., Bayer, A. S., Arias, C. A. Evolving resistance among Gram-positive pathogens. Clinical Infectious Diseases. 61, suppl-2 48-57 (2015).
  3. Vollmer, W., Bertsche, U. Murein (peptidoglycan) structure, architecture and biosynthesis in Escherichia coli. Biochimica Biophysica Acta. 1778 (9), 1714-1734 (2008).
  4. Vollmer, W., Höltje, J. -V. The architecture of the murein (peptidoglycan) in Gram-negative bacteria: vertical scaffold or horizontal layer(s). Journal of Bacteriology. 186 (18), 5978-5987 (2004).
  5. Clarke, A. J. Compositional analysis of peptidoglycan by high-performance anion-exchange chromatography. Analytical Biochemistry. 212 (2), 344-350 (1993).
  6. Kim, S. J., Chang, J., Singh, M. Peptidoglycan architecture of Gram-positive bacteria by solid-state NMR. Biochimica Biophysica Acta. 1848, 350-362 (2014).
  7. Koch, A. L., Doyle, R. J. Inside-to-outside growth and turnover of the wall of gram-positive rods. Journal of Theoretical Biology. 117 (1), 137-157 (1985).
  8. Beeby, M., Gumbart, J. C., Roux, B., Jensen, G. J. Architecture and assembly of the Gram-positive cell wall. Molecular Microbiology. 88 (4), 664-672 (2013).
  9. Shockman, G. D., Daneo-Moore, L., Kariyama, R., Massidda, O. Bacterial walls, peptidoglycan hydrolases, autolysins, and autolysis. Microbial Drug Resistance. 2 (1), 95-98 (1996).
  10. Dijkstra, A. J., Keck, W. Peptidoglycan as a barrier to transenvelope transport. Journal of Bacteriology. 178 (19), 5555-5562 (1996).
  11. Blackman, S. A., Smith, T. J., Foster, S. J. The role of autolysins during vegetative growth of Bacillus subtilis 168. Microbiology. 144, 73-82 (1998).
  12. Misra, G., Rojas, E. R., Gopinathan, A., Huang, K. C. Mechanical consequences of cell-wall turnover in the elongation of a Gram-positive bacterium. Biophysical Journal. 104 (11), 2342-2352 (2013).
  13. Wheeler, R., et al. Bacterial cell enlargement requires control of cell wall stiffness mediated by peptidoglycan hydrolases. mBio. 6 (4), 00660(2015).
  14. Taguchi, A., Kahne, D., Walker, S. Chemical tools to characterize peptidoglycan synthases. Current Opinion in Chemical Biology. 53, 44-50 (2019).
  15. Welsh, M. A., Schaefer, K., Taguchi, A., Kahne, D., Walker, S. Direction of chain growth and substrate preferences of shape, elongation, division, and sporulation-family peptidoglycan glycosyltransferases. Journal of the American Chemial Society. 141 (33), 12994-12997 (2019).
  16. Rubino, F. A., et al. Detection of transport intermediates in the peptidoglycan flippase MurJ identifies residues essential for conformational cycling. Journal of the American Chemical Society. 142 (12), 5482-5486 (2020).
  17. Sjodt, M., et al. Structure of the peptidoglycan polymerase RodA resolved by evolutionary coupling analysis. Nature. 556 (7699), 118-121 (2018).
  18. Tiyanont, K., et al. Imaging peptidoglycan biosynthesis in Bacillus subtilis with fluorescent antibiotics. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 103 (29), 11033-11038 (2006).
  19. Lebar, M. D., et al. Reconstitution of peptidoglycan cross-linking leads to improved fluorescent probes of cell wall synthesis. Journal of the American Chemical Society. 136 (31), 10874-10877 (2014).
  20. Do, T., Page, J. E., Walker, S. Uncovering the activities, biological roles, and regulation of bacterial cell wall hydrolases and tailoring enzymes. Journal of Biological Chemistry. 295 (10), 3347-3361 (2020).
  21. Liang, H., et al. Metabolic labelling of the carbohydrate core in bacterial peptidoglycan and its applications. Nature Communications. 8, 15015(2017).
  22. DeMeester, K. E., et al. Metabolic incorporation of N-acetyl muramic acid probes into bacterial peptidoglycan. Current Protocol in Chemical Biology. 11 (4), 74(2019).
  23. Lazor, K. M., et al. Use of Bioorthogonal N-acetylcysteamine (SNAc) analogues and peptidoglycan O-acetyltransferase B (PatB) to label peptidoglycan. The FASEB Journal. 32, 630(2018).
  24. Wang, Y., Leimkuhler-Grimes, C. Fluorescent labeling of the carbohydrate backbone of peptidoglycan to track degradation in vivo. The FASEB Journal. 29, (2015).
  25. Kuru, E., et al. In probing of newly synthesized peptidoglycan in live bacteria with fluorescent D-amino acids. Angewandte Chemie International Edition. 51 (50), 12519-12523 (2012).
  26. Zhou, R., Chen, S., Recsei, P. A dye release assay for determination of lysostaphin activity. Analytical Biochemistry. 171 (1), 141-144 (1988).
  27. Qiao, Y., et al. Lipid II overproduction allows direct assay of transpeptidase inhibition by β-lactams. Nature Chemical Biology. 13 (7), 793-798 (2017).
  28. Lebar, M. D., et al. Forming cross-linked peptidoglycan from synthetic Gram-negative lipid II. Journal of the American Chemical Society. 135 (12), 4632-4635 (2013).
  29. Chen, R., Guttenplan, S. B., Blair, K. M., Kearns, D. B. Role of the D-dependent autolysins in Bacillus subtilis population heterogeneity. Journal of Bacteriology. 191 (18), 5775-5784 (2009).
  30. Yukie, S., Miki, K., Yoshio, N., Kuniaki, T., Yoshihisa, Y. Identification and characterization of an autolysin-encoding gene of Streptococcus mutans. Infection and Immunity. 73 (6), 3512-3520 (2005).
  31. Domenech, M., García, E., Moscoso, M. In vitro destruction of Streptococcus pneumoniae biofilms with bacterial and phage peptidoglycan hydrolases. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 55 (9), 4144-4148 (2011).
  32. Horsburgh, G. J., Atrih, A., Williamson, M. P., Foster, S. J. LytG of Bacillus subtilis is a novel peptidoglycan hydrolase: the major active glucosaminidase. Biochemistry. 42 (2), 257-264 (2003).
  33. Vermassen, A., et al. Cell wall hydrolases in bacteria: insight on the diversity of cell wall amidases, glycosidases and peptidases toward peptidoglycan. Frontiers in Microbiology. 10, 331(2019).
  34. Martin-Galiano, A. J., Yuste, J., Cercenado, M. I., de la Campa, A. G. Inspecting the potential physiological and biomedical value of 44 conserved uncharacterised proteins of Streptococcus pneumoniae. BMC Genomics. 15, 652(2014).
  35. Nayyab, S., et al. Diamide inhibitors of the Bacillus subtilis N-acetylglucosaminidase LytG that exhibit antibacterial activity. ACS Infectioius Diseases. 3 (6), 421-427 (2017).
  36. Lipski, A., et al. Structural and biochemical characterization of the β-N-acetylglucosaminidase from Thermotoga maritima: Toward rationalization of mechanistic knowledge in the GH73 family. Glycobiology. 25 (3), 319-330 (2014).
  37. Haubrich, B. A., et al. Inhibition of Streptococcus pneumoniae autolysins highlight distinct differences between chemical and genetic inactivation. bioRxiv. , 300541(2020).
  38. Farha, M. A., et al. Inhibition of WTA synthesis blocks the cooperative action of PBPs and sensitizes MRSA to β-lactams. ACS Chemical Biology. 8 (1), 226-233 (2013).
  39. Lehár, J., et al. Chemical combination effects predict connectivity in biological systems. Molecular Systems Biology. 3 (1), 80(2007).
  40. Farha, M. A., et al. Antagonism screen for inhibitors of bacterial cell wall biogenesis uncovers an inhibitor of undecaprenyl diphosphate synthase. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 112 (35), 11048-11053 (2015).
  41. Palomino, J. C., et al. Resazurin microtiter assay plate: simple and inexpensive method for detection of drug resistance in Mycobacterium tuberculosis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 46 (8), 2720-2722 (2002).
  42. Odds, F. C. Synergy, antagonism, and what the chequerboard puts between them. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 52 (1), 1(2003).
  43. Arrigucci, R., Pozzi, G. Identification of the chain-dispersing peptidoglycan hydrolase LytB of Streptococcus gordonii. PLoS One. 12 (4), 0176117(2017).
  44. Bai, X. -H., et al. Structure of pneumococcal peptidoglycan hydrolase LytB reveals insights into the bacterial cell wall remodeling and pathogenesis. of Biological Chemistry. 289 (34), 23403-23416 (2014).
  45. Garcia, P., Gonzalez, M. P., Garcia, E., Lopez, R., Garcia, J. L. LytB, a novel pneumococcal murein hydrolase essential for cell separation. Molecular Microbiology. 31 (4), 1275-1281 (1999).
  46. Giladi, M., Altman-Price, N., Levin, I., Levy, L., Mevarech, M. FolM, a new chromosomally encoded dihydrofolate reductase in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 185 (23), 7015-7018 (2003).
  47. Chua, P. R., et al. Effective killing of the human pathogen Candida albicans by a specific inhibitor of non-essential mitotic kinesin Kip1p. Molecular Microbiology. 65 (2), 347-362 (2007).
  48. Rico-Lastres, P., et al. Substrate recognition and catalysis by LytB, a pneumococcal peptidoglycan hydrolase involved in virulence. Scientific Reports. 5, 16198(2015).
  49. Vollmer, W., et al. The cell wall of Streptococcus pneumoniae. Microbiology Spectrum. 7 (3), (2019).
  50. Massidda, O., Nováková, L., Vollmer, W. From models to pathogens: how much have we learned about Streptococcus pneumoniae cell division. Environmental Microbiology. 15 (12), 3133-3157 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Synteza masarymycynyinhibitor bakterii Gram dodatnichautolizyny bakteryjnedegradacja peptydoglikanuchromatografia b yskawicznachromatografia cienkowarstwowaBacillus subtilisStreptococcus pneumoniaemetabolizm cian kom rkowychmikroskopia w jasnym polu
Synteza masarymycyny, małocząsteczkowego inhibitora wzrostu bakterii Gram-dodatnich
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.