Method Article

In vitro Charakterystyka białek opiekuńczych histonów za pomocą testów analitycznych, pull-down i chaperoningowych

DOI:

10.3791/63218

⸱

December 29th, 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Life Sciences, 2Regional Centre for Biotechnology, 3School of Biotechnology, KIIT University, 4Department of Molecular Biophysics and Biochemistry, Yale University, 5Department of Pharmacology, University of Vermont College of Medicine

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje zestaw metod, które obejmują analityczną chromatografię wykluczającą wielkość do badania oligomeryzacji i stabilności histonów opiekuńczych, test pull-down do rozwikłania interakcji chaperon-histon histon, AUC do analizy stechiometrii kompleksów białkowych oraz test opiekuńczy histonów do funkcjonalnego scharakteryzowania domniemanego chaperonu histonów in vitro.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Białka histonowe łączą się z DNA, tworząc chromatynę eukariotyczną. Podstawową jednostką chromatyny jest nukleosom, zbudowany z oktamera histonowego składającego się z dwóch kopii histonów rdzeniowych H2A, H2B, H3 i H4, owiniętych wokół DNA. Oktamer składa się z dwóch kopii dimeru H2A/H2B i jednej kopii tetrameru H3/H4. Wysoce naładowane histony jądra są podatne na niespecyficzne interakcje z kilkoma białkami w cytoplazmie komórkowej i jądrze. Białka opiekuńcze histonów tworzą zróżnicowaną klasę białek, które transportują histony z cytoplazmy do jądra i wspomagają ich odkładanie na DNA, wspomagając w ten sposób proces składania nukleosomów. Niektóre białka opiekuńcze histonów są specyficzne dla H2A/H2B lub H3/H4, a niektóre pełnią funkcję opiekuńczych dla obu. Protokół ten opisuje, w jaki sposób techniki laboratoryjne in vitro, takie jak testy pull-down, analityczna chromatografia wykluczająca rozmiar, analityczne ultrawirowanie i test opiekuńczy histonów, mogą być stosowane w połączeniu w celu potwierdzenia, czy dane białko działa jako opiekuńczy histon.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nukleosomy złożone z DNA i białek histonowych tworzą jednostkę strukturalną chromatyny i regulują kilka krytycznych zdarzeń komórkowych. Nukleosomy są dynamicznie repozycjonowane i przebudowywane, aby DNA było dostępne dla różnych procesów, takich jak replikacja, transkrypcja i translacja1,2. Histony, które są wysoce zasadowe, albo mają tendencję do interakcji z kwaśnymi białkami w środowisku komórkowym, albo ulegają agregacji, co prowadzi do różnych defektów komórkowych3,4,5. Grupa dedykowanych białek zwanych opiekuńczymi histonów wspomaga transport histonów z cytoplazmy do jądra i zapobiega nieprawidłowym zdarzeniom agregacji histonów-DNA6,7. Zasadniczo, większość opiekuńczych histonów przechowuje i przenosi histony do DNA przy fizjologicznej sile jonowej, wspomagając w ten sposób tworzenie nukleosomów8,9. Niektóre opiekuńcze histony mają zdecydowaną preferencję dla oligomerów histonowych H2A/H2B lub H3/H410.

Opiekuńcze histonów są charakteryzowane na podstawie ich zdolności do tworzenia nukleosomów zależnych lub niezależnych od syntezy DNA11. Na przykład czynnik składania chromatyny-1 (CAF-1) jest zależny, podczas gdy regulator histonów A (HIRA) jest niezależny od syntezy DNA12,13. Podobnie, rodzina nukleoplazmin opiekuńczych histonów bierze udział w dekondensacji chromatyny plemników i składaniu nukleosomów14. Członkowie rodziny białek składania nukleosomów (NAP) ułatwiają tworzenie struktur podobnych do nukleosomów in vitro i biorą udział w przenoszeniu histonów między cytoplazmą a jądrem15. Nukleoplazminy i białka z rodziny NAP są funkcjonalnymi opiekuńczymi histonami, ale nie mają żadnych wspólnych cech strukturalnych. Zasadniczo, żadna pojedyncza cecha strukturalna nie pozwala na klasyfikację białka jako chaperonu histonowego16. Zastosowanie testów funkcjonalnych i biofizycznych wraz z badaniami strukturalnymi najlepiej sprawdza się w charakterystyce opiekuńczych histonów.

Ta praca opisuje biochemiczne i biofizyczne metody charakteryzowania białka jako opiekuńczego histonu, który wspomaga tworzenie nukleosomów. W pierwszej kolejności przeprowadzono analityczną chromatografię wykluczania wielkości w celu przeanalizowania oligomerycznego statusu i stabilności białek opiekuńczych histonów. Następnie przeprowadzono test pull-down w celu określenia sił napędowych i konkurencyjnego charakteru interakcji chaperon-histon w dół. Jednak parametrów hydrodynamicznych tych oddziaływań nie można było dokładnie obliczyć za pomocą analitycznej chromatografii wykluczającej ze względu na kształt białka i jego kompleksy, które wpływają na ich migrację przez kolumnę. W związku z tym zastosowano ultrawirowanie analityczne, które zapewnia właściwości makrocząsteczkowe w roztworze, które obejmują dokładną masę cząsteczkową, stechiometrię oddziaływania i kształt cząsteczek biologicznych. W poprzednich badaniach szeroko stosowano test opiekuńczy histonów in vitro do funkcjonalnego scharakteryzowania białek opiekuńczych histonów, takich jak yScS11617, DmACF18, ScRTT106p19, HsNPM120. Test opiekuńczy histonów został również wykorzystany do funkcjonalnego scharakteryzowania białek jako białek opiekuńczych histonów.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Analityczna chromatografia wykluczająca wielkość w celu wyjaśnienia oligomerycznego statusu i stabilności białek opiekuńczych histonów

  1. Analiza oligomerycznego stanu białek opiekuńczych histonów
    1. Zrównoważyć 24 ml analitycznej chromatografii wykluczającej wielkość (SEC) z 1,2 objętością kolumny (CV), tj. 28,8 ml odgazowanego buforu SEC [20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 300 mM NaCl i 1 mM β-merkaptoetanolu (β-ME)] w temperaturze 4 °C (patrz tabela materiałów).
      UWAGA: Typ kolumny, skład buforu i pH buforu można wybrać na podstawie białka będącego przedmiotem zainteresowania. Objętość wstrzykiwanej próbki nie powinna przekraczać 500 μl dla kolumny o pojemności 24 ml. Ponadto ciśnienie w kolumnie musi być utrzymywane poniżej 5 MPa.
    2. Z podstawowego roztworu białka o wyższym stężeniu przygotować 500 μl próbki białka o stężeniu 0,5 mg/ml w odgazowanym buforze SEC i wstrzyknąć ją do kolumny wstępnie zrównoważonej za pomocą pętli iniekcyjnej o pojemności 500 μl. Pozwolić, aby chromatografia przebiegała z izokratycznym natężeniem przepływu 0,2-0,3 ml/min z buforem SEC w temperaturze 4 °C.
    3. Monitorować profil elucji białka, mierząc absorbancję przy długości fali 280 nm. W przypadku białek pozbawionych reszt aromatycznych należy zmierzyć absorbancję przy 214 nm.
    4. Użyj objętości elucji białka, aby obliczyć jego przybliżoną masę cząsteczkową w kDa za pomocą standardowej krzywej kalibracyjnej21.
      UWAGA: Krzywą kalibracyjną przygotowuje się przez wykreślenie objętości retencyjnej białek o znanej masie cząsteczkowej w stosunku do logarytmu ich odpowiednich mas cząsteczkowych (log Mr), eluowanego przy użyciu tej samej kolumny.
  2. Analiza stabilności termicznej białek opiekuńczych histonów
    1. Pobrać 500 μl z 0,5 mg/ml próbki białka przygotowanej w odgazowanym buforze SEC (takim samym, jak stosowany w ppkt 1.1.1) w oddzielnych probówkach do mikrowirówek i podgrzać każdą probówkę do określonej temperatury w zakresie od 20 °C do 90 °C (20 °C, 40 °C, 60 °C i 90 °C) przez 10 minut w łaźni wodnej.
    2. Następnie odwirować próbki poddane obróbce cieplnej w temperaturze 16 200 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C, zebrać supernatant za pomocą mikropipety i wstrzyknąć każdą próbkę indywidualnie za pomocą pętli iniekcyjnej o pojemności 500 μl do kolumny analitycznej, wstępnie zrównoważonej buforem SEC w temperaturze 4 °C.
    3. Pozwolić, aby chromatografia przebiegała z izokratycznym natężeniem przepływu 0,2-0,3 ml/min z buforem SEC w temperaturze 4 °C.
    4. Obserwuj położenie i wysokość pików elucji i szukaj pojawienia się dodatkowych pików dla różnych próbek.
  3. Analiza stabilności chemicznej białek opiekuńczych histonów
    1. W celu zbadania stabilności soli opiekuńczych histonów należy inkubować 500 μl próbki białka o stężeniu 0,5 mg/ml przygotowanej w buforze Tris [20 mM Tris-HCl (pH 7,5) i 1 mM β-ME] uzupełnionego rosnącymi stężeniami NaCl (300 mM, 600 mM, 1 M, 1,5 M i 2 M) w oddzielnych probówkach do mikrowirówek przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Odwirować próbki przy 16 200 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i zachować supernatant.
    2. Następnie należy indywidualnie załadować próbki białek o różnych stężeniach NaCl, używając pętli iniekcyjnej o pojemności 500 μl do kolumny analitycznej wstępnie zrównoważonej 1,2 CV (28,8 ml) odpowiedniego buforu zawierającego rosnące stężenia NaCl w temperaturze 4 °C.
    3. Pozwolić, aby chromatografia przebiegała z izokratycznym natężeniem przepływu 0,2-0,3 ml/min z 1 CV (24 ml) odpowiedniego buforu w temperaturze 4 °C.
    4. Obserwuj położenie i wysokość pików elucji i szukaj pojawienia się dodatkowych pików dla różnych próbek.
    5. Podobnie, w celu analizy stabilności mocznika, inkubować 500 μl 0,5 mg/ml próbki białka przygotowanej w buforze Tris [20 mM Tris-HCl (pH 7,5) i 1 mM β-ME] uzupełnionych zwiększającymi się stężeniami mocznika (1 M, 2 M, 3 M, 4 M i 5 M) w oddzielnych probówkach wirówkowych przez 16 godzin w temperaturze pokojowej. Odwirować próbki o masie 16 200 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej i zachować supernatant.
    6. Następnie należy załadować próbki białek poddane działaniu mocznika pojedynczo za pomocą pętli iniekcyjnej o pojemności 500 μl do kolumny analitycznej wstępnie zrównoważonej 1,2 CV (28,8 ml) odpowiedniego buforu zawierającego różne stężenia mocznika w temperaturze pokojowej.
    7. Pozwolić, aby chromatografia przebiegała z izokratycznym natężeniem przepływu 0,2-0,3 ml/min z 1 CV (24 ml) odpowiedniego buforu w temperaturze pokojowej><. UWAGA: Nie wykonuj eksperymentów z buforem zawierającym mocznik w niższej temperaturze, ponieważ mocznik ma tendencję do krystalizacji i uszkadzania kolumny.
    8. Obserwuj położenie i wysokość pików elucji i szukaj pojawienia się dodatkowych pików dla różnych próbek.

2. Testy pull-down oparte na gradiencie soli w celu zrozumienia rodzaju interakcji przyczyniających się do tworzenia kompleksu między oligomerami histonowymi a opiekuńczym histonem

  1. Dla każdej reakcji testu pull-down należy odpipetować 40 μl żywicy Ni-NTA do kolumny wirowej i przemyć sterylną wodą podwójnie destylowaną. Następnie zrównoważyć żywicę ze 100 CV (4 ml) buforu równoważącego [20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 300 mM NaCl, 10 mM imidazolu, 10 μg/ml BSA i 1 mM β-ME] (patrz tabela materiałów).
    UWAGA: Ściąganie można również wykonać w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.
  2. Przygotować próbkę, mieszając 5 μM opiekuńczego histonu znakowanego Hisem z 20 μM dimeru histonu H2A/H2B lub tetrameru H3/H4 w buforze równowagowym. Inkubować próbkę na lodzie przez 1 godz.
    UWAGA: Dimer H2A/H2B i tetramer H3/H4 są przygotowywane z rekombinowanych ludzkich histonów21, a integralność oligomerów potwierdza się na podstawie oszacowanych mas cząsteczkowych za pomocą analitycznego ultrawirowania (AUC). Te same oligomery histonowe zostały użyte we wszystkich eksperymentach wymienionych poniżej.
  3. Załadować próbki do oddzielnych wstępnie zrównoważonych kolumn wirowych z żywicą Ni-NTA z kroku 2.1, z których każda jest oznaczona dla określonego stężenia soli, i przechowywać kolumny przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Odwirować kolumny przy 1000 x g przez 1 minutę.
  4. Następnie przepłukać kolumny 100 CV (4 ml) buforu płuczącego [20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 50 mM imidazolu, 0,2% Tween-20 i 1 mM β-ME] zawierających różne stężenia soli (tj. 300 mM, 500 mM, 600 mM, 700 mM, 800 mM, 900 mM i 1 M NaCl). Przemyć każdą kolumnę buforem o określonym stężeniu soli.
  5. Po etapie przemywania solą eluować białko z różnych kolumn za pomocą 100 μl buforu elucyjnego [20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 300 mM NaCl, 300 mM imidazolu i 1 mM β-ME].
  6. Następnie poddaj eluowane próbki działaniu 18% SDS-PAGE22 i zwizualizuj żel po zabarwieniu Coomassie Brilliant Blue R250 (patrz Tabela materiałów). Alternatywnie można bezpośrednio załadować żywicę do żelu SDS-PAGE zamiast eluować związane białko z żywicy Ni-NTA.
    UWAGA: Kompozycje równoważących, płuczących i elucyjnych oraz pH mogą być modyfikowane w zależności od białka będącego przedmiotem zainteresowania.

3. Konkurencyjny test pull-down w celu określenia preferencji białka opiekuńczego histonu dla H2A/H2B lub H3/H4

  1. Przygotuj kolumnę wirowania zgodnie z opisem w kroku 2.1
  2. Inkubować 5 μM białka opiekuńczego histonów z 20 μM dimeru H2A/H2B w 300 μl buforu równoważącego (przygotowanego w kroku 2.1) przez 30 minut na lodzie.
    UWAGA: Stosunek oligomeru histonowego do białka opiekuńczego histonu w reakcji można wybrać na podstawie znanych danych stechiometrycznych wiązania; Użyj pięciokrotnego nadmiaru histonu, jeśli nie są dostępne żadne informacje.
  3. Odwirować kompleks opiekuńczy histonów-H2A/H2B przy sile 16 200 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C w celu usunięcia osadu. Następnie załadować próbkę do kolumny wirowej wstępnie zrównoważoną buforem równoważącym (przygotowanym w kroku 2.1) i inkubować przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
  4. Przepłukać kolumnę 100 CV (4 ml) buforu płuczącego [20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 300 mM NaCl, 50 mM imidazolu, 0,2% Tween-20 i 1 mM β-ME] w celu usunięcia nadmiaru dimera H2A/H2B. Następnie wymieszać kompleks opiekuńczy histonów-H2A/H2B z 20-60 μM tetrameru H3/H4 i inkubować przez 30 minut na lodzie.
  5. Ponownie przepłukać kolumnę 100 CV (4 ml) buforu do przemywania (przygotowanego w kroku 3.4) w celu usunięcia niezwiązanego tetrameru H3/H4 i elucji próbkę za pomocą buforu elucyjnego (przygotowanego w kroku 2.5). Poddaj eluowane próbki działaniu 18% SDS-PAGE i zwizualizuj po barwieniu Coomassie Brilliant Blue R250.
    UWAGA: Test można odwrócić, w którym najpierw tetramer H3 / H4 można zmieszać z opiekunem, kompleks można związać z kulkami Ni-NTA, a następnie kompleks inkubować z różnymi stężeniami dimera H2A / H2B.

4. Eksperymenty analityczne ultrawirowania - prędkości sedymentacji (AUC-SV) do analizy stechiometrii wiązania między białkami opiekuńczymi histonów a histonami

  1. Przygotowanie próbki do AUC
    1. Odtworzony dimer histonu H2A/H2B, tetramer H3/H4 i opiekuńczy histon należy dializować oddzielnie przez rurkę dializacyjną o napięciu 7 kDa23, w stosunku do buforu do dializy [20 mM Tris (pH 7,5), 300 mM NaCl i 1 mM β-ME] (patrz Tabela materiałów). Aby zminimalizować błąd tła spowodowany niezgodnością buforu, należy intensywnie wykonywać dializy z użyciem buforu dializacyjnego, najlepiej trzy razy w okresie 24 godzin
      UWAGA: Początkowy OD280 próbek białka powinien mieć dwu- do trzykrotnie wyższą wartość, aby osiągnąć końcowy OD280 0,3-0,5. Ma to na celu przede wszystkim zniwelowanie skutków rozcieńczenia.
    2. Dimer H2A/H2B, tetramer H3/H4 i opiekuńczy histon należy oczyścić indywidualnie za pomocą buforu dializacyjnego, stosując analityczną chromatografię wykluczającą wielkość (jak wspomniano w kroku 1). Należy zachować bufor z przebiegu, aby później przygotować dalsze rozcieńczenia i użyć go jako odniesienia w komórce AUC.
  2. Ładowanie próbki dla AUC
    1. Wymieszać oczyszczone białka w końcowej objętości 450 μl, używając buforu dializacyjnego z kroku 4.1.1, aby osiągnąć OD280 0,3-0,6. Wymieszaj chaperon histonowy z dimerem H2A/H2B lub tetramerem H3/H4 w celu utworzenia kompleksu w oddzielnych probówkach reakcyjnych. Inkubować mieszaniny białek przez 2-3 godziny
      UWAGA: Alternatywnie, dane sedymentacyjne można uzyskać za pomocą interferencyjnego systemu skanowania optycznego w ultrawirówce analitycznej. Oddzielnie, w celu mieszania oczyszczonych białek, należy ustalić stężenie białka opiekuńczego histonów i inkubować je ze zwiększającymi się stężeniami oligomerów histonowych, aby uzyskać dokładną stechiometrię.
    2. Zmontuj komórkę z centralnym elementem z podwójnym sektorem i oknami kwarcowymi do eksperymentu AUC-SV za pomocą detektora absorbancji ultrawirówki analitycznej, jak opisano wcześniej szczegółowo24.
    3. Wlać 400 μl roztworu próbki i 420 μl buforu dializacyjnego do dwóch sektorów (odpowiednio próbki i sektora odniesienia) komórki.
      UWAGA: W sektorze referencyjnym stosuje się większą objętość buforu, aby utrzymać menisk odniesienia powyżej menisku próbki. Jednak w przypadku korzystania z systemu zakłóceń optycznych należy wypełnić oba sektory równą objętością.
    4. Zważ i dokładnie zważ ogniwa i załaduj je do czteromiejscowego tytanowego wirnika (patrz tabela materiałów). Wyrównaj komórki za pomocą znaczników znajdujących się na dole komórek i pokrętła. Załaduj wirnik do wirówki, zamknij pokrywę i pozwól wytworzyć podciśnienie, aż ciśnienie spadnie do mniej niż 15 mikronów Hg, a temperatura wirnika ustabilizuje się do 20 °C (zwykle trwa to 2-2,5 godziny).
      UWAGA: Parametry operacyjne AUC obejmują temperaturę eksperymentalną, prędkość wirnika, odstęp między skanowaniami oraz liczbę skanów do zebrania. W przypadku eksperymentów SV odstęp między skanami jest podawany zgodnie z masą cząsteczkową białka; Mniejsze białka wymagają większych odstępów czasu między skanami. Prędkość wirnika jest również ustawiana zgodnie z oczekiwaną masą cząsteczkową białka, a eksperyment przeprowadza się w temperaturze 20 °C. Dane dotyczące absorbancji są monitorowane przy długości fali 280 nm.
    5. Aby uzyskać dokładną stechiometrię, utrzymuj stałe stężenie białka opiekuńczego histonów i inkubuj ze wzrostem stężeń oligomerów histonowych, aby osiągnąć nasycenie.
  3. Analiza danych AUC
    1. Przeprowadź analizę danych zgodnie z wcześniejszym opisem25. Krótko mówiąc, oblicz gęstość i lepkość składników bufora za pomocą programu SEDNTERP26 (patrz Tabela materiałów). Podobnie należy obliczyć częściową objętość właściwą białka na podstawie jego składu aminokwasowego, również za pomocą SEDNTERP.
    2. Załaduj dane z maszyny AUC do programu SEDFIT27 i zdefiniuj menisk (czerwona linia), dolną część komórki (niebieska linia) i granice analizy danych (zielone linie). Jako model należy wybrać ciągły rozkład C(s).
    3. Następnie ustaw maksymalną rozdzielczość do 100; ustaw współczynnik sedymentacji (s), s min: 0 i s max: 10-15; ustaw początkowo współczynnik tarcia na 1,2 i zdecyduj się na float, aby wyprowadzić stosunek na podstawie danych; ustaw poziom ufności (F-ratio; który określa wielkość regularyzacji) na 0,68 dla regularyzacji 1 sigma; ustaw częściowe wartości objętości właściwej, gęstości buforu i lepkości buforu uzyskane z SEDNTERP.
    4. Naciśnij przycisk URUCHOM, aby umożliwić oprogramowaniu rozwiązanie równania Lamm27. Dostosuj parametry, jeśli występuje znaczna niezgodność danych. Po dostosowaniu parametrów naciśnij FIT, aby doprecyzować wszystkie parametry. Oceń jakość dopasowania na podstawie wartości odchylenia średniokwadratowego (RMSD), która powinna być mniejsza niż 0,01 jednostki sygnału.
    5. Oszacuj masy cząsteczkowe pików, wybierając opcję: pokaż pik "Mw w c(s)" w funkcji wyświetlania głównego paska narzędzi, która dostarczy informacji o "s" cząsteczki/kompleksu.

5. Test superzwijania plazmidu w celu potwierdzenia funkcji opiekuńczej histonów

  1. Reakcja składania nukleosomów
    1. Zmieszać 2 μM tetrameru H3/H4 i 4 μM dimeru H2A/H2B ze zwiększającymi się stężeniami białka opiekuńczego histonu (1-6 μM) w buforze montażowym [20 mM Tris HCl (pH 7,5), 1 mM DTT, 1 mM MgCl2, 0,1 mg/ml BSA i 100 mM NaCl] do końcowej objętości 50 μL. Inkubować mieszaninę w temperaturze 4 °C przez 30 minut.
    2. Równocześnie, w oddzielnej reakcji, należy wstępnie potraktować 500 ng ujemnie superskręconego plazmidu pUC19 1 μg enzymu topoizomerazy I (patrz tabela materiałów) w buforze montażowym w końcowej objętości 50 μl i inkubować w temperaturze 30 °C przez 30 min.
      UWAGA: Topoizomeraza I rozluźnia superskręcone dwuniciowe plazmidowe DNA, generując jednoniciowe nacięcie. Można zastosować enzym topoizomerazy I pochodzenia eukariotycznego, taki jak dostępna w handlu topoizomeraza I z kiełków pszenicy lub topoizomeraza I o ekspresji rekombinowanej Drosophila melanogaster.
    3. Następnie połączyć tetramer H3/H4, dimer H2A/H2B, mieszaninę opiekuńczo-opiekuńczą histonów (z kroku 5.1.1), mieszaninę reakcyjną zrelaksowanego plazmidu DNA (z kroku 5.1.2) i dalej inkubować w temperaturze 30 °C przez 90 min.
      UWAGA: Ustawić dwie reakcje kontrolne dla testu; jeden ma opiekuńczy histon i zrelaksowany plazmidowy DNA (ale nie histony), a drugi ma oligomery histonowe i zrelaksowany plazmidowy DNA (ale nie opiekuńczy histon
      4. ).
    4. Zatrzymać reakcję składania przez dodanie 100 μl buforu 2x stop (40 mM EDTA, 2% SDS i 0,4 mg/ml proteinazy K) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 min.
      UWAGA: Bufor Stop deproteinizuje plazmidowe DNA poprzez denaturację i proteolizę związanych histonów.
  2. Ekstrakcja fenolowo-chloroformowa i wytrącanie etanolu
    1. Dodać równą objętość fenolu nasyconego trisem do probówki zawierającej mieszaninę reakcyjną z kroku 5.1.4 i dobrze wymieszać, a następnie odwirować przy 16,200 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
    2. Delikatnie zebrać górną fazę wodną zawierającą plazmidowe DNA za pomocą mikropipety i wymieszać z równą objętością chloroformu. Mieszaninę należy wirować i odwirowywać przy 16 200 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
      UWAGA: Na tym etapie można dodać alkohol izoamylowy, aby uniknąć rozmytego interfejsu między fazą wodną a organiczną.
    3. Następnie zebrać górną fazę wodną, dodać 1/10 objętości 3 M octanu sodu (pH 5,5) i 2,5 objętości lodowatego etanolu (patrz tabela materiałów). Dobrze wymieszaj roztwór, odwracając probówkę 3-4 razy i przechowuj mieszaninę w zamrażarce o temperaturze -20 °C przez 30 minut, aby całkowicie wytrącić plazmidowe DNA.
    4. Odwirować próbkę z etapu 5.2.3 przy 16200 x g przez 10 minut i delikatnie odrzucić supernatant. Utrzymuj probówki otwarte w temperaturze pokojowej, aż nawet śladowe ilości etanolu odparują, pozostawiając wytrącone plazmidowe DNA w probówce.
  3. Wykonaj elektroforezę w żelu agarozowym, aby zaobserwować efekt superzwijania plazmidu.
    1. Rozpuścić wytrącone plazmidowe DNA z kroku 5.2.4 w sterylnej wodzie podwójnie destylowanej.
    2. Rozpuść próbki na 1% żelu agarozowym w 1x buforze tris-octanu-EDTA (TAE) (40 mM Tris, 20 mM kwasu octowego i 1 mM EDTA) (patrz tabela materiałów).
    3. Wybarwić żel bromkiem etydyny o stężeniu 0,2-0,5 μg/ml i obserwować w promieniowaniu UV, aby uwidocznić prążki DNA na żelu.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rekombinowana domena N-końcowej nukleoplazminy białka FKBP53 z Arabidopsis thaliana została poddana analitycznemu SEC. Objętość piku elucji zestawiono z krzywą standardową w celu określenia jego stanu oligomerycznego. Wyniki analityczne SEC ujawniły, że domena istnieje jako pentamer w roztworze, o przybliżonej masie cząsteczkowej 58 kDa (Rysunek 1A,B). Ponadto domena nukleoplazminy została przeanalizowana pod kątem stabilności termicznej i chemicznej w połączeniu z analityczn...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Praca ta demonstruje i weryfikuje kompleksowy zestaw protokołów do biochemicznej i biofizycznej charakterystyki domniemanego białka opiekuńczego histonów. W tym przypadku do zademonstrowania protokołów wykorzystano rekombinowane i oczyszczone białka z rodziny NAP, AtNRP1 i AtNRP2 oraz N-końcową domenę nukleoplazminy AtFKBP53. Ten sam zestaw eksperymentów może być z powodzeniem wykorzystany do wyznaczenia funkcjonalnych atrybutów wcześniej niescharakteryzowanych białek opiekuńczych histonów z dowolnego organizmu.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Stypendia zaoczne dla Dileepa Vasudevana z Rady Badań Naukowych i Inżynieryjnych, Rządu Indii [CRG/2018/000695/PS] oraz Departamentu Biotechnologii, Ministerstwa Nauki i Technologii, Rządu Indii [BT/INF/22/SP33046/2019], a także wsparcie stacjonarne z Instytutu Nauk Przyrodniczych w Bhubaneswar, są bardzo doceniane. Dziękujemy Pani Sudeshnie Sen i Pani Annapurnie Sahoo za pomoc w przygotowaniu histonów. Doceniamy również dyskusje z naszymi kolegami: dr Chinmayee Mohapatra, panem Manas Kumar Jagdev i dr Shaikh Nausad Hossain.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Kwas octowy (lodowaty)SigmaA6283
AkrylamidMP Biomedicals814326
AgarozaMP Biomedicals193983
AKTA Pure 25M FPLCCytiva29018226Przyrząd do oczyszczania białek
Nadsiarczan amonu (APS)Wirnik
An-60TiBeckman Coulter361964Rotor do ultrawirowania analitycznego
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)SigmaA7030
Coomassie błękit brylantowy R 250Sigma1.15444
Rurka do dializy (odcięcie 7 kDa)Thermo Fisher68700Do dializy próbek białka
Ditiothreitol ( DTT)MP Biomedicals100597
DNA Loading DyeNew England BiolabsB7025S
EDTA sól disodowaMP Biomedicals194822
Waga elektronicznaShimadzuATX224R
EtanolSigmaE7023
Bromek etydyny (EtBr)SigmaE8751
Żel Doc SystemBio-Rad12009077Do obrazowania żeli po barwieniu
Aparatura do elektroforezy żelowejpoziomej Bio-Rad1704405Przyrząd do elektroforezy w żelu agarozowym
Kwas solny (HCl)Sigma320331
ImidazolMP Biomedicals102033
Chlorek magnezu (MgCl2)SigmaM8266
MikropipetyEppendorfZ683779Do pipetowania mikroobjętości
System do elektroforezy Mini-PROTEANBio-Rad1658000Przyrząd do SDS-PAGE
N,N-metyleno-bis-akryloamiduMP Biomedicals800172
Nano kroplaThermo FisherND-2000Do pomiaru stężeń
Agaroza Ni-NTAInvitrogenR901-15Koraliki żywiczne do testu pull-down
Optima AUC ultrawirówka analitycznaBeckman CoulterB86437Przyrząd do analitycznego ultrawirowania
pH-metrMettler ToledoMT30130863
PhenolSigmaP4557
Zestaw do izolacji plazmiduQiagen27104
Proteinaza KSigma-Aldrich1.07393
pUC19Thermo FisherSD0061Plazmid do testu superzwijania
Wirówka szybkoobrotowa z chłodzeniemThermo Fisher75002402
Marker białkowy SDS-PAGEBio-Rad1610317
SEDFITDarmowy program do analizy danych ultrawirowania analiza
SEDNTERPDarmowy program do szacowania lepkości i gęstości buforu oraz częściowej objętości właściwej białka
SigmaPrep Kolumny wirująceSigmaSC1000Do testu pull-down
Octan soduSigmaS2889
Chlorek sodu (NaCl)MerckS9888
Dodecylosiarczan sodu (SDS)MP Leki biomedyczne102918
Superdex 200 Increase 10/300 GLCytiva28990944Kolumna do analitycznej chromatografii wykluczającej
wielkość Superdex 75 Increase 10/300 GLCytiva29148721Kolumna do analitycznej chromatografii wykluczającej
TEMEDSigma1.10732
Topoizomeraza IInspiralisWGT102Enzym stosowany w test superzwijania plazmidowego
Tris baseMerckT1503
Tween-20SigmaP1379
MocznikMP Biomedicals191450
Łaźnia wodnaNü veNB 5Do obróbki cieplnej próbek białek
β-merkaptoetanol (β-ME)SigmaM6250
Sigma A3678 Chloroform Sigma C2432 białek i DNA

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hübner, M. R., Eckersley-Maslin, M. A., Spector, D. L. Chromatin organization and transcriptional regulation. Current Opinion in Genetics and Development. 23 (2), 89-95 (2013).
  2. Lai, W. K. M., Pugh, B. F. Understanding nucleosome dynamics and their links to gene expression and DNA replication. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (9), 548-562 (2017).
  3. Kim, U. J., Han, M., Kayne, P., Grunstein, M. Effects of histone H4 depletion on the cell cycle and transcription of Saccharomyces cerevisiae. EMBO Journal. 7 (7), 2211-2219 (1988).
  4. Prado, F., Aguilera, A. Partial depletion of histone H4 increases homologous recombination-mediated genetic instability. Molecular and Cellular Biology. 25 (4), 1526-1536 (2005).
  5. Meeks-Wagner, D., Hartwell, L. H. Normal stoichiometry of histone dimer sets is necessary for high fidelity of mitotic chromosome transmission. Cell. 44 (1), 43-52 (1986).
  6. Groth, A., et al. Human Asf1 regulates the flow of S phase histones during replicational stress. Molecular Cell. 17 (2), 301-311 (2005).
  7. Laskey, R. A., Honda, B. M., Mills, A. D., Finch, J. T. Nucleosomes are assembled by an acidic protein which binds histones and transfers them to DNA. Nature. 275 (5679), 416-420 (1978).
  8. Das, C., Tyler, J. K., Churchill, M. E. A. The histone shuffle: histone chaperones in an energetic dance. Trends in Biochemical Sciences. 35 (9), 476-489 (2010).
  9. Akey, C. W., Luger, K. Histone chaperones and nucleosome assembly. Current Opinion in Structural Biology. 13 (1), 6-14 (2003).
  10. De Koning, L., Corpet, A., Haber, J. E., Almouzni, G. Histone chaperones: An escort network regulating histone traffic. Nature Structural and Molecular Biology. 14 (11), 997-1007 (2007).
  11. Eitoku, M., Sato, L., Senda, T., Horikoshi, M. Histone chaperones: 30 years from isolation to elucidation of the mechanisms of nucleosome assembly and disassembly. Cellular and Molecular Life Sciences. 65 (3), 414-444 (2008).
  12. Quivy, J. P., Grandi, P., Almouzni, G. Dimerization of the largest subunit of chromatin assembly factor 1: importance in vitro and during Xenopus early development. EMBO Journal. 20 (8), 2015-2027 (2001).
  13. Ray-Gallet, D., et al. HIRA is critical for a nucleosome assembly pathway independent of DNA synthesis. Molecular Cell. 9 (5), 1091-1100 (2002).
  14. Frehlick, L. J., Eirín-López, J. M., Ausió, J. New insights into the nucleophosmin/nucleoplasmin family of nuclear chaperones. Bioessays. 29 (1), 49-59 (2007).
  15. Ito, T., Bulger, M., Kobayashi, R., Kadonaga, J. T. Drosophila NAP-1 is a core histone chaperone that functions in ATP-facilitated assembly of regularly spaced nucleosomal arrays. Molecular and Cellular Biology. 16 (6), 3112-3124 (1996).
  16. Elsässer, S. J., D'Arcy, S. Towards a mechanism for histone chaperones. Biochimica et Biophysica Acta. 1819 (3-4), 211-221 (2013).
  17. Rodríguez-Campos, A., Koop, R., Faraudo, S., Beato, M. Transcriptionally competent chromatin assembled with exogenous histones in a yeast whole cell extract. Nucleic Acids Research. 32 (13), 111(2004).
  18. Levenstein, M. E., Kadonaga, J. T. Biochemical analysis of chromatin containing recombinant Drosophila core histones. Journal of Biological Chemistry. 277 (10), 8749-8754 (2002).
  19. Huang, S., et al. Rtt106p is a histone chaperone involved in heterochromatin-mediated silencing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (38), 13410-13415 (2005).
  20. Swaminathan, V., Kishore, A. H., Febitha, K. K., Kundu, T. K. Human histone chaperone nucleophosmin enhances acetylation-dependent chromatin transcription. Molecular and Cellular Biology. 25 (17), 7534-7545 (2005).
  21. Singh, A. K., Datta, A., Jobichen, C., Luan, S., Vasudevan, D. AtFKBP53: A chimeric histone chaperone with functional nucleoplasmin and PPIase domains. Nucleic Acids Research. 48 (3), 1531-1550 (2020).
  22. Scofield, B. T. K. H. Protein Electrophoresis. , (2012).
  23. Andrew, S. M., Titus, J. A., Zumstein, L. Dialysis and concentration of protein solutions. Current Protocols in Toxicology, Appendix 3. , 1-5 (2002).
  24. Balbo, A., Zhao, H., Brown, P. H., Schuck, P. Assembly, loading, and alignment of an analytical ultracentrifuge sample cell. Journal of Visualized Experiments. (33), e1530(2009).
  25. Padavannil, A., Brautigam, C. A., Chook, Y. M. Molecular size analysis of recombinant importin-histone complexes using analytical ultracentrifugation. Bio-protocol. 10 (10), 3625(2019).
  26. Zhao, H., Brautigam, C. A., Ghirlando, R., Schuck, P. Overview of current methods in sedimentation velocity and sedimentation equilibrium analytical ultracentrifugation. Current Protocols in Protein Science. , Chapter 20, Unit20.12 (2013).
  27. Schuck, P. Size-distribution analysis of macromolecules by sedimentation velocity ultracentrifugation and Lamm equation modelling. Biophysical Journal. 78 (3), 1606-1619 (2000).
  28. Kumar, A., Kumar Singh, A., Chandrakant Bob de, R., Vasudevan, D. Structural characterization of Arabidopsis thaliana NAP1-related protein 2 (AtNRP2) and comparison with its homolog AtNRP1. Molecules. 24 (12), 2258(2019).
  29. Liu, W. H., Roemer, S. C., Port, A. M., Churchill, M. E. A. CAF-1-induced oligomerization of histones H3/H4 and mutually exclusive interactions with Asf1 guide H3/H4 transitions among histone chaperones and DNA. Nucleic Acids Research. 45 (16), 9809(2017).
  30. Bowman, A., et al. The histone chaperones Vps75 and Nap1 form ring-like, tetrameric structures in solution. Nucleic Acids Research. 42 (9), 6038-6051 (2014).
  31. Newman, E. R., et al. Large multimeric assemblies of nucleosome assembly protein and histones revealed by small-angle X-ray scattering and electron microscopy. Journal of Biological Chemistry. 287 (32), 26657-26665 (2012).
  32. Edlich-Muth, C., et al. The pentameric nucleoplasmin fold is present in Drosophila FKBP39 and a large number of chromatin-related proteins. Journal of Molecular Biology. 427 (10), 1949-1963 (2015).
  33. Franco, A., et al. Structural insights into the ability of nucleoplasmin to assemble and chaperone histone octamers for DNA deposition. Scientific Reports. 9 (1), 9487(2019).
  34. Xiao, H., Jackson, V., Lei, M. The FK506-binding protein, Fpr4, is an acidic histone chaperone. FEBS Letters. 580 (18), 4357-4364 (2006).
  35. Graziano, G. Role of hydrophobic effect in the salt-induced dimerization of bovine beta-lactoglobulin at pH 3. Biopolymers. 91 (12), 1182-1188 (2009).
  36. Burgess, R. J., Zhang, Z. Histone chaperones in nucleosome assembly and human disease. Nature Structural and Molecular Biology. 20 (1), 14-22 (2013).
  37. Donham, D. C., Scorgie, J. K., Churchill, M. E. The activity of the histone chaperone yeast Asf1 in the assembly and disassembly of histone H3/H4-DNA complexes. Nucleic Acids Research. 39 (13), 5449-5458 (2011).
  38. Avvakumov, N., Nourani, A., Côté, J. Histone chaperones: Modulators of chromatin marks. Molecular Cell. 41 (5), 502-514 (2011).
  39. Ransom, M., Dennehey, B. K., Tyler, J. K. Chaperoning histones during DNA replication and repair. Cell. 140 (2), 183-195 (2010).
  40. Chu, X., et al. Importance of electrostatic interactions in the association of intrinsically disordered histone chaperone Chz1 and histone H2A.Z-H2B. PLoS Computational Biology. 8 (7), 1002608(2012).
  41. Heidarsson, P. O., et al. Disordered proteins enable histone chaperoning on the nucleosome. bioRxiv. , (2020).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Histone ChaperonesChromatin AssemblyPull Down AssayAnalytical UltracentrifugationSize Exclusion ChromatographyPlasmid Super CoilingNucleosome AssemblyH2A H2B DimerH3 H4 TetramerProtein DNA Interaction

Related Articles