Artykuł metodologiczny

Generowanie mutantów zerowych w celu wyjaśnienia roli glikozylotransferaz bakteryjnych w ruchliwości bakterii

DOI:

10.3791/63231

⸱

11 marca 2022

 ,  ,  , 
1Departamento de Genética, Microbiología y Estadística, Universidad de Barcelona, 2Human Health Therapeutics Research Centre, National Research Council Canada, 3Department of Chemistry, Carleton University, 4Department of Biology, Carleton University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisujemy budowę mutantów zerowych Aeromonas w określonych glikozylotransferazach lub regionach zawierających glikozylotransferazy, testy ruchliwości i oczyszczanie wici przeprowadzone w celu ustalenia udziału i funkcji kodowanych przez nie enzymów w biosyntezie glikanu, a także rolę tego glikanu w patogenezie bakterii.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badania nad glikozylacją u prokariontów to szybko rozwijający się obszar. Bakterie mają na swojej powierzchni różne glikozylowane struktury, których glikany tworzą kod kreskowy specyficzny dla szczepu. Związane z nimi glikany wykazują większą różnorodność składu i struktury cukrów niż u eukariontów i są ważne w procesach rozpoznawania bakterii i gospodarza oraz interakcji ze środowiskiem. U bakterii chorobotwórczych glikoproteiny biorą udział w różnych etapach procesu zakaźnego, a modyfikacje glikanów mogą zakłócać określone funkcje glikoprotein. Jednak pomimo postępów poczynionych w zrozumieniu składu, struktury i szlaków biosyntezy glikanów, wiedza na temat roli glikoprotein w patogenności lub interakcji ze środowiskiem pozostaje bardzo ograniczona. Ponadto w przypadku niektórych bakterii enzymy wymagane do glikozylacji białek są wspólne z innymi szlakami biosyntezy polisacharydów, takimi jak szlaki biosyntezy lipopolisacharydów i kapsułek. Funkcjonalne znaczenie glikozylacji zostało wyjaśnione u kilku bakterii poprzez mutację określonych genów, które uważa się za zaangażowane w proces glikozylacji i badanie jej wpływu na ekspresję docelowej glikoproteiny i glikanu modyfikującego. Aeromony mezofilne mają pojedynczą i O-glikozylowaną wić polarną. Glikany wiciowe wykazują różnorodność składu węglowodanowego i długości łańcucha między szczepami Aeromonas. Jednak wszystkie analizowane do tej pory szczepy wykazują pochodną kwasu pseudaminowego jako cukier łączący, który modyfikuje reszty seryny lub treoniny. Pochodna kwasu pseudaminowego jest niezbędna do składania wici polarnych, a jej utrata ma wpływ na adhezję, tworzenie biofilmu i kolonizację. Protokół szczegółowo opisany w tym artykule opisuje, w jaki sposób konstrukcja mutantów zerowych może być wykorzystana do zrozumienia udziału genów lub regionów genomu zawierających przypuszczalne glikozylotransferazy w biosyntezie glikanu wiciowego. Obejmuje to możliwość zrozumienia funkcji zaangażowanych glikozylotransferaz i roli glikanu. Zostanie to osiągnięte poprzez porównanie mutanta z niedoborem glikanów ze szczepem typu dzikiego.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Glikozylacja białek została opisana zarówno u bakterii Gram-dodatnich, jak i Gram-ujemnych i polega na kowalencyjnym przyłączeniu glikanu do łańcucha bocznego aminokwasu1,2. U prokariontów proces ten zwykle zachodzi poprzez dwa główne mechanizmy enzymatyczne: O- i N-glikozylację3. W O-glikozylacji glikan jest przyłączony do grupy hydroksylowej reszty seryny (Ser) lub treoniny (Thr). W N-glikozylacji glikan jest przyłączony do azotu amidowego o łańcuchu bocznym reszty asparaginy (Asn) w sekwencjach tripeptydowych Asn-X-Ser / Thr, gdzie X może być dowolnym aminokwasem z wyjątkiem proliny.

Glikany mogą przyjmować struktury liniowe lub rozgałęzione i składają się z monosacharydów lub polisacharydów kowalencyjnie połączonych wiązaniami glikozydowymi. U prokariontów glikany zwykle wykazują różnorodność składu i struktury cukrów w porównaniu z glikanami eukariotycznymi4. Ponadto opisano dwa różne szlaki glikozylacji bakteryjnej, które różnią się sposobem składania glikanu i przenoszenia go do białka akceptorowego: glikozylacja sekwencyjna i en bloc 5,6. W przypadku sekwencyjnej glikozylacji złożony glikan jest budowany bezpośrednio na białku przez kolejne dodawanie cukrów prostych. W glikozylacji en bloc wstępnie złożony glikan jest przenoszony do białka z oligosacharydu połączonego z lipidami przez wyspecjalizowaną oligosacharylotransferazę (OTazę). Wykazano, że oba szlaki są zaangażowane w procesy N- i O-glikozylacji7.

Glikozylacja białek odgrywa rolę w modulowaniu fizykochemicznych i biologicznych właściwości białek. Obecność glikanu może wpływać na to, jak białko oddziałuje ze swoim ligandem, co wpływa na aktywność biologiczną białka, ale może również wpływać na stabilność białka, rozpuszczalność, podatność na proteolizę, immunogenność i interakcje drobnoustroj-gospodarz8,9. Jednak kilka parametrów glikozylacji, takich jak liczba glikanów, skład glikanów, położenie i mechanizm przyłączania, może również wpływać na funkcję i strukturę białka.

Glikozylotransferazy (GT) są kluczowymi enzymami w biosyntezie złożonych glikanów i glikokoniugatów. Enzymy te katalizują tworzenie wiązania glikozydowego między ugrupowaniem cukrowym z aktywowanej cząsteczki donorowej a specyficznym akceptorem substratu. GT mogą wykorzystywać zarówno nukleotydy, jak i nienukleotydy jako cząsteczki donorowe i celować w różne akceptory substratów, takie jak białka, sacharydy, kwasy nukleinowe i lipidy10. Dlatego zrozumienie GT na poziomie molekularnym jest ważne dla zidentyfikowania ich mechanizmów działania i swoistości, a także umożliwia zrozumienie, w jaki sposób skład cukrów w glikanach, które modyfikują odpowiednie cząsteczki, jest powiązany z patogennością. Baza danych enzymów Carbohydrate Active (CAZy)11 klasyfikuje GT zgodnie z ich homologią sekwencji, co stanowi narzędzie predykcyjne, ponieważ w większości rodzin GT fałd strukturalny i mechanizmy działania są niezmienne. Jednak cztery powody utrudniają przewidzenie specyficzności substratowej wielu GT: 1) nie określono jasnego motywu sekwencji określającego specyficzność substratu u prokariontów12, 2) wiele GT i OTaz wykazuje rozwiązłość substratów13,14, 3) funkcjonalne GT są trudne do wytworzenia z wysoką wydajnością w formie rekombinowanej oraz 4) identyfikacja zarówno substratów donorowych, jak i akceptorowych jest złożona. Mimo to ostatnie badania mutagenezy umożliwiły uzyskanie znacznych postępów w zrozumieniu mechanizmów katalitycznych i odejmowaniu wiązania GT.

U bakterii O-glikozylacja wydaje się być bardziej rozpowszechniona niż N-glikozylacja. Miejsca O-glikozylacji nie wykazują sekwencji konsensusu, a wiele z białek O-glikozylowanych to białka wydzielane lub powierzchniowe komórek, takie jak wiciowce, pilusy lub autotransportery1. Glikozylacja witelliny wykazuje zmienność w liczbie miejsc akceptorowych, składzie glikanów i strukturze. Na przykład wiciowce Burkholderia spp mają tylko jedno miejsce akceptujące, podczas gdy u Campylobacter jejuni wiciowce mają aż 19 miejsc akceptujących15,16. Ponadto w przypadku niektórych bakterii glikan jest pojedynczym cukrem monosacharydowym, podczas gdy inne bakterie posiadają heterogeniczne glikany pozbawione różnych cukrów prostych, tworząc oligosacharydy. Ta niejednorodność występuje nawet wśród szczepów tego samego gatunku. Wiciowce Helicobacter są modyfikowane tylko przez kwas pseudaminowy (PseAc)17, a wiciowce Campylobacter mogą być modyfikowane przez PseAc, acetaminową formę kwasu pseudaminowego (PseAm) lub kwasu legionaminowego (LegAm), a glikany pochodzące z tych cukrów z acetylem, N-acetyloglukozaminą lub podstawieniami propionowymi18,19. W Aeromonas witelliny są modyfikowane przez glikany, których skład waha się od pojedynczej pochodnej kwasu PseAc do heteropolisacharydu20, a przyłączanie glikanów do monomerów flageliny odbywa się zawsze za pośrednictwem pochodnej PseAc.

Ogólnie, glikozylacja wiciowców jest niezbędna do składania włókien wiciowych, ruchliwości, zjadliwości i specyficzności gospodarza. Jednakże, podczas gdy wiciowce C. jejuni16, H. pylori17 i Aeromonas sp. 21 nie może złożyć się w filament, chyba że monomery białkowe są glikozylowane, Pseudomonas spp. i Burkholderia spp. 15 nie wymagają glikozylacji do montażu wici. Co więcej, w niektórych szczepach C. jejuni zmiany w składzie cukru gli wici wpływają na interakcję bakteria-gospodarz i mogą odgrywać rolę w unikaniu niektórych odpowiedzi immunologicznych16. Autoaglutynacja to kolejna cecha fenotypowa, na którą wpływają modyfikacje składu glikanów związanych z wiciowcami. Niższa autoaglutynacja prowadzi do zmniejszenia zdolności do tworzenia mikrokolonii i biofilmu22. U niektórych bakterii zdolność wici do wywoływania odpowiedzi prozapalnej była związana z glikozylacją flageliny. Tak więc u P. aeruginosa glikozylowana flagelina indukuje wyższą odpowiedź prozapalną niż niezluzylowana23.

Aeromonas to bakterie Gram-ujemne wszechobecne w środowisku, co pozwala im być na styku wszystkich komponentów One Health24. Mezofilne Aeromonas mają pojedynczą polarną wić, która jest wytwarzana konstytutywnie. Ponad połowa izolatów klinicznych wykazuje również ekspresję wiciowca bocznego, indukowaną w podłożach lub płytkach o wysokiej lepkości. Różne badania powiązały oba typy wici z wczesnymi etapami patogenezy bakteryjnej25. Podczas gdy zgłoszone do tej pory wiciowce polarne są O-glikozylowane przy resztach 5-8 Ser lub Thr ich centralnych domen immunogennych, wiciowce boczne nie są O-glikozylowane we wszystkich szczepach. Chociaż glikany wici polarnych z różnych szczepów wykazują różnorodność składu węglowodanowego i długości łańcucha20, wykazano, że cukier łączący jest pochodną kwasu pseudaminowego.

Celem tego manuskryptu jest opisanie metody uzyskiwania mutantów zerowych w określonych GT lub regionach chromosomalnych zawierających GT, aby przeanalizować ich udział w biosyntezie odpowiednich polisacharydów i patogenności bakteryjnej, a także rolę samego glikanu. Jako przykład identyfikujemy i usuwamy region chromosomalny zawierający GT Aeromonas, aby ustalić jego udział w polarnej glikozylacji witelliny i przeanalizować rolę glikanu witeliny. Pokazujemy, jak usunąć określony GT, aby ustalić jego funkcję w biosyntezie tego glikanu i rolę zmodyfikowanego glikanu. Chociaż na przykładzie Aeromonas, zasada ta może być wykorzystana do identyfikacji i badania wysp glikozylacji wici innych bakterii Gram-ujemnych oraz analizy funkcji GT zaangażowanych w biosyntezę innych glikanów, takich jak lipopolisacharyd antygenu O.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Schematyczne przedstawienie procedury jest pokazane w Rysunek 1.

1. Bioinformatyczna identyfikacja wyspy glikozylacji wici (FGIs) w Aeromonas

  1. Aby zidentyfikować klastry biosyntezy PseAc w genomach Aeromonas, użyj narzędzia tblastn z bazy danych NCBI26. Najpierw pobierz białka ortologiczne do PseC i PseI A. piscicola AH-3 (kody identyfikacyjne to OCA61126.1 i OCA61113.1) z baz danych zsekwencjonowanych szczepów Aeromonas, a następnie użyj narzędzia tblastn, aby przeszukać ich translowane sekwencje nukleotydów.
    UWAGA: Geny pse flankują FGI Aeromonas, przy czym pseB i pseC znajdują się na jednym końcu klastra, a pseI na drugim. Lokalizacja pozostałych genów pse może być różna w zależności od grupy FGI.
  2. Biorąc pod uwagę, że te polarne geny flageliny wielu szczepów sąsiadują z FGI, użyj tblastn z bazy danych NCBI, aby znaleźć białka ortologiczne do polarnych wiciowców FlaA i FlaB A. piscicola AH-3 (kody identyfikacyjne to OCA61104.1 i OCA61105.1) oraz genów, które je kodują.
  3. Ponadto Aeromonas FGIs biorące udział w biosyntezie glikanów heteropolisacharydowych (grupa II)27 zawierają kilka genów kodujących enzymy biorące udział w syntezie kwasów tłuszczowych, takich jak luxC i luxE. Użyj tblastn z bazy danych NCBI, aby znaleźć białka ortologiczne do LuxC A. piscicola AH-3 (kod identyfikacyjny to OCA61121.1) i gen, który go koduje.

2. Generowanie mutantów zerowych w genach wyspy glikozylacji wici

UWAGA: Ta metoda mutagenezy opiera się na allelicznej wymianie produktów delecji w ramce reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) przy użyciu wektora samobójczego pDM428 (GenBank: KC795686.1). Replikacja wektora pDM4 jest zależna od lambda pir, a pełna wymiana alleliczna jest wymuszona przez wykorzystanie genu sacB znajdującego się na wektorze.

  1. Budowa produktów do usuwania w ramce PCR.
    1. Zaprojektuj dwie pary starterów, które amplifikują regiony DNA przed (startery A i B) i za (startery C i D) wybranego genu lub regionu, który ma zostać usunięty (Rysunek 2B).
    2. Upewnij się, że startery A i D mają więcej niż 600 pz przed początkiem i za końcem, odpowiednio, genu lub genów, które mają zostać usunięte. Te dwa startery muszą zawierać na końcu 5' miejsce restrykcyjne dla endonukleazy, które umożliwia klonowanie w pDM4.
      UWAGA: Miejsce ograniczenia zawarte na końcu 5' starterów A i D nie powinno być takie samo jak miejsca w amplikonach AB lub CD.
    3. Upewnij się, że startery B i C znajdują się w genie, który ma zostać usunięty, lub w obrębie odpowiednio pierwszego i ostatniego genu regionu, który ma zostać usunięty. Upewnij się, że oba startery (B i C) znajdują się w ramce i znajdują się między 5-6 kodonami wewnątrz genu. Ponadto upewnij się, że oba startery zawierają na końcu 5' sekwencję komplementarną 21 pz (Tabela 1), która umożliwia połączenie amplikonów DNA AB i CD.
    4. Wyhodować wybrany szczep Aeromonas w 5 ml bulionu sojowego tryptycznego (TSB) przez noc (O/N) w temperaturze 30 °C. Użyj dostępnego w handlu zestawu do oczyszczania genomowego DNA i postępuj zgodnie z instrukcjami producenta (Tabela materiałów). Oznaczyć ilościowo 2 μl oczyszczonego DNA za pomocą spektrofotometru.
      UWAGA: Użyj podwójnie destylowanej wody jako ślepej próby, z przyrządem ustawionym na rejestrowanie absorbancji przy 260 nm. Zapisać absorbancję z 2 μl oczyszczonego DNA 3-5 razy i obliczyć średni odczyt absorbancji. Użyj prawa Beera-Lamberta, aby obliczyć stężenie DNA, gdzie A = Ɛ.c.l., gdzie "A" to absorbancja, "Ɛ" to średni molowy współczynnik ekstynkcji DNA, "c" to stężenie DNA, a "l" to długość ścieżki (patrz instrukcja producenta dotycząca długości ścieżki każdego instrumentu).
    5. Użyj 100 ng oczyszczonego chromosomalnego DNA jako matrycy w dwóch zestawach asymetrycznych PCR ze starterami AB i C-D (tabela materiałów). Użyj stosunku molowego par starterów A:B i D:C 10:1 (materiał uzupełniający).
      UWAGA: Asymetryczne PCR pozwalają na preferencyjną amplifikację jednej nici matrycy bardziej niż drugiej.
    6. Analizuj produkty PCR za pomocą elektroforezy w 1% żelu agarozowym. Użyj TAE (40 mM tris-acetate, 1 mM EDTA) jako bufor do biegania w żelu i ustawienie mocy 8 V/cm. Aby uwidocznić DNA, dodaj bromek etydyny (0,5 μg/ml) do żelu i uwidocznij produkty PCR za pomocą stacji bioobrazowania (tabela materiałów).
    7. Usunąć amplikony z żelu za pomocą skalpela, oczyścić zgodnie z protokołem producenta (tabela materiałów) i oznaczyć ilościowo.
    8. Połącz amplikony AB i CD przez ich nakładające się sekwencje 21 pz na końcu 3' produktów PCR (Rysunek 3). Wymieszaj 100 ng każdego amplikonu (AB i CD) w probówce do PCR z odczynnikami PCR (pre-AD PCR), ale bez starterów i przedłuż za pomocą programu termocyklera (materiał uzupełniający). Następnie dodać 100 μM starterów A i D do reakcji (AD PCR) i amplifikować jako pojedynczy fragment (materiał uzupełniający).
    9. Przeanalizować produkt PCR (amplikon AD) metodą elektroforezy w 1% żelu agarozowym w warunkach opisanych w kroku 2.1.6, wyciąć amplikon z żelu, oczyścić zgodnie z protokołem producenta i określić ilościowo amplikon (tabela materiałów).
  2. Budowa rekombinowanego plazmidu pDM4 z delecją w ramce.
    1. Wyhodować kulturę O/N Escherichia coli cc18λ pir zawierającą pDM4 w bulionie Luria-Bertani (LB) Miller (10 ml) z chloramfenikolem (25 μg/ml) w temperaturze 30 °C.
    2. Odwirować kulturę w temperaturze 5 000 x g w temperaturze 4 °C i zawiesić osad w 600 μl sterylnej wody destylowanej. Przeprowadzić ekstrakcję i oczyszczanie plazmidu pDM4 za pomocą dostępnego w handlu zestawu do oczyszczania plazmidu, postępując zgodnie z instrukcjami dostawcy (Tabela materiałów).
    3. Trawić 1 μg pDM4 i 400 ng amplikonu AD przez 2 godziny za pomocą endonukleazy zdolnej do trawienia obu końców amplikonu AD i miejsca klonowania pDM4 (Rysunek 3). Postępuj zgodnie z protokołem producenta enzymu dotyczącym warunków reakcji (tabela materiałów).
    4. Oczyść strawiony plazmid i amplikon za pomocą zestawu do oczyszczania DNA i oznacz je ilościowo zgodnie z instrukcjami producenta (Tabela materiałów).
    5. Aby zapobiec religacji zlinearyzowanego pDM4, należy usunąć grupę fosforanową z obu końców 5' za pomocą enzymu fosfatazy alkalicznej, postępując zgodnie z instrukcjami producenta (Tabela materiałów). Następnie należy oczyścić plazmid poddany działaniu środka i określić go ilościowo za pomocą spektrofotometru, jak opisano w kroku 2.1.4 (Tabela materiałów).
    6. Połączyć 150 ng strawionego i fosfatazy traktowanego alkalnie pDM4 z 95-100 ng strawionego amplikonu AD w stosunku wektor molowy do wstawki 1:4. Przygotować reakcję podwiązywania w objętości 15 μl, postępując zgodnie z instrukcjami producenta (Tabela materiałów).
    7. Inkubować O/N w temperaturze 20 °C lub w weekend w temperaturze 4 °C. Po inkubacji dezaktywować ligazę T4 w temperaturze 70 °C przez 20 minut.
    8. Użyj ligacji, aby wprowadzić plazmid do szczepuλpir Escherichia coli MC1061 za pomocą elektroporacji. Używaj elektrokompetentnych bakterii i kuwet do elektroporacji w odstępach 2 mm.
  3. Przygotowanie elektrokompetentnej E. coli i elektroporacja rekombinowanego plazmidu pDM4
    1. Zaszczepić pojedynczą kolonię szczepu E. coli MC1061λpir w bulionie Miller Luria-Bertani (LB) i wyhodować O/N w temperaturze 30 °C z wytrząsaniem 200 obr./min.
    2. Rozcieńczyć 2 ml kultury bakteryjnej w 18 ml bulionu LB i inkubować w temperaturze 30 °C z wytrząsaniem (200 obr./min) aż do uzyskania gęstości optycznej (OD600) między 0,4-0,6.
    3. Osadzać kulturę bakteryjną przez odwirowanie w temperaturze 5 000 x g i w temperaturze 4 °C przez 15 minut. Odrzucić supernatant i zawiesić osad w 40 ml schłodzonego destylowanegoH2O.
    4. Powtórz ten krok czyszczenia jeszcze dwa razy, aby usunąć wszystkie sole hodowlane. Na koniec zawiesić osad w 4 ml schłodzonego destylowanegoH2Oi przenieść 1 ml zawiesiny do każdej z czterech stożkowych probówek do mikrofuge o pojemności 1,5 ml.
    5. Osadzać kulturę bakteryjną przez odwirowanie w temperaturze 14 000 x g i temperaturze 4 °C przez 5 minut. Usunąć supernatant bez naruszania osadu i zawiesić każdą osadkę w 100 μl schłodzonego destylowanegoH2O.
    6. Dodać 3-3,5 μl mieszaniny ligacji do każdej probówki i inkubować na lodzie przez 5 minut. Następnie przenieś zawartość każdej probówki do schłodzonej kuwety elektroporacyjnej z 2 mm odstępem i zastosuj 2 kV, 129 Ω i stałą czasową około 5 ms.
      UWAGA: Wstępnie schłodzić kuwety do elektroporacji na lodzie. Utrzymuj bakterie na lodzie podczas całej procedury.
    7. Po elektroporacji dodać 250 μl pożywki SOC do każdej z czterech kuwet w celu odzyskania ich zawartości, przenieść je do probówki hodowlanej (około 1 ml) i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 30 °C z wytrząsaniem (200 obr./min).
    8. Umieść przekształcone komórki na płytkach agarowych Luria-Bertani (LB) uzupełnionych chloramfenikolem (25 μg / ml), aby upewnić się, że wszystkie kolonie rosnące na płytce mają szkielet plazmidowy.
    9. Zebrać kilka kolonii z płytek agarowych LB z chloramfenikolem i inkubować O/N w temperaturze 30 °C. Kiedy kolonie rosną, sprawdź wprowadzenie konstruktu delecyjnego do pDM4 przez PCR przy użyciu starterów, które flankują stronę klonowania pDM4: pDM4for i pDM4rev (Tabela 1), oraz zlizowanych kolonii jako matrycy (materiał uzupełniający).
    10. Wybierz jedną kolonię sterylną wykałaczką i zanurz ją w probówce o pojemności 1,5 ml zawierającej 15 μl 1% Triton X-100, 20 mM Tris-HCl pH 8,0, 2 mM EDTA pH 8,0. Inkubować probówki w temperaturze 100 °C przez 5 minut, a następnie 1 minutę na lodzie.
    11. Wiruj probówki w mikrofugach o wymiarach 12 000 x g przez 10 minut, aby osadzać bakterie i zanieczyszczenia. Użyć 1 μl supernatantu jako matrycy w reakcji PCR (tabela materiałów). Temperatura wyżarzania pary starterów wynosi 50 °C, a reakcja PCR wymaga 10% DMSO (materiału uzupełniającego).
    12. Zaszczepić kolonie, które amplifikowały produkt będący przedmiotem zainteresowania, w 10 ml bulionu LB chloramfenikolem (25 μg/ml) i hodować O/N w temperaturze 30 °C. Wyekstrahować plazmid z kultur zgodnie z opisem w krokach 2.2.1-2.2.2. Sekwencjonować za pomocą podkładów pDM4 zgodnie z instrukcjami producenta (Tabela materiałów).
  4. Przeniesienie usunięcia w ramce do szczepu Aeromonas
    UWAGA: Rekombinowany plazmid pDM4 musi zostać wprowadzony do wybranego szczepu Aeromonas poprzez krzyżowanie trirodzicielskie (Rysunek 4). Szczep Aeromonas musi być odporny na ryfampicynę, aby mógł zostać wybrany po kryciu trójrodzicielskim. Dlatego należy wyhodować wybrane szczepy O/N na TSB w temperaturze 30 °C, odwirować 2 ml, 4 ml i 6 ml kultur w temperaturze 5,000 x g przez 15 minut, zawiesić każdą osadkę w 100 μl TSB i płytkę w TSA z ryfampicyną (100 μg/ml).
    1. Przygotować kultury O/N E. coli MC1061λpir z rekombinowanym plazmidem pDM4 na agarze LB z 25 μg/ml chloramfenikolu (szczep dawcy), szczep Aeromonas odporny na ryfampicynę na TSA ze 100 μg/ml ryfampicyny (szczep biorcy) i E. coli HB101 z plazmidem pRK2073 na agarze LB z 80 μg/ml spektynomycyny (szczep pomocniczy) w temperaturze 30 °C.
    2. Kiedy kolonie wyrosną, zawiesić tę samą liczbę kolonii (10-15 kolonii) szczepów dawcy, biorcy i pomocnika delikatnie sterylną wykałaczką w trzech probówkach LB ze 150 μl LB.
    3. Następnie, na płytce agarowej LB, bez antybiotyków, wymieszaj trzy zawiesiny bakteryjne w dwóch kroplach na biorcę: stosunek pomocnika do dawcy 5:1:1 (50 μl biorcy, 10 μl dawcy i 10 μl pomocnika). Inkubować płytkę stroną do góry O/N w temperaturze 30 °C. Przeprowadzić negatywną kontrolę koniugacji przy użyciu szczepu dawcy bez rekombinowanego plazmidu.
      UWAGA: Szczep pomocniczy przenosi koniugacyjny plazmid pRK2073 i wspomaga transfer pDM4 do Aeromonas. Nie używaj wiru do zawieszania szczepów dawcy, biorcy i pomocnika, aby uniknąć złamania pilusów.
    4. Zbierz bakterie z płytki agarowej LB, dodając 1 ml bulionu LB i rozprowadzając go sterylnym szklanym rozsiewaczem w celu uzyskania zawiesiny bakteryjnej. Za pomocą pipety przenieś zawiesinę bakteryjną do stożkowej probówki do mikrofugi o pojemności 1,5 ml i energicznie przemieszaj.
    5. Aby wybrać kolonie biorców zawierające rekombinowany plazmid pDM4, należy rozlać 100 μl zebranej zawiesiny bakteryjnej na płytkach agarowych LB z ryfampicyną (100 μg/ml) i chloramfenikolem (25 μg/ml).
    6. Odwirować 200 μl i 600 μl próbek w mikrofudze przy 5 000 x g przez 15 min, zawiesić granulkę w 100 μl bulionu LB i płytkę na agarze LB z ryfampicyną (100 μg/ml) i chloramfenikolem (25 μg/ml). Inkubować wszystkie płytki przez 24-48 godzin w temperaturze 30 °C.
    7. Zebrać wyhodowane kolonie, przenieść na płytki LB z ryfampicyną (100 μg/ml) i chloramfenikolem (25 μg/ml) i inkubować je O/N w temperaturze 30 °C. Następnie potwierdź, że kolonie są Aeromonas za pomocą testu oksydazy29 i że rekombinowany plazmid pDM4 został wstawiony (pierwsza rekombinacja) do określonego regionu chromosomalnego przez PCR przy użyciu starterów E i F (materiał uzupełniający), które wiążą się poza regionem amplifikowanym starterami A i D (tabela materiałów). Jak opisano w kroku 2.3.11, użyj 1 μl zlizowanych kolonii jako szablonu.
    8. Aby zakończyć wymianę alleli w celu usunięcia w ramce, zmusz kolonie ze zintegrowanym plazmidem samobójczym do drugiej rekombinacji. Hodować rekombinowane kolonie w 2 ml LB z 10% sacharozą i bez antybiotyków, O/N w temperaturze 30 °C.
    9. Umieścić 100 μl kultur bakterii z kroku 2.4.8 na płytce agarowej LB z sacharozą (10%). Również należy rozlać na płytkę 100 μl różnych rozcieńczeń kultur (10-2-10-4) i inkubować O/N w temperaturze 30 °C.
    10. Aby potwierdzić utratę pDM4, należy zebrać kolonie, przenieść na płytki LB z chloramfenikolem i bez chloramfenikolu (25 μg/ml), inkubować je O/N w temperaturze 30 °C, a następnie wybrać kolonie wrażliwe na chloramfenikol
      11. .
    11. Analizuj wrażliwe kolonie metodą PCR, używając pary starterów E-F i 1 μl zlizowanych kolonii jako matrycy (tabela materiałów i materiałów uzupełniających). Wybierz kolonie, których produkt PCR korelował z rozmiarem usuniętego konstruktu.

3. Testy ruchliwości

UWAGA: U niektórych gatunków bakterii z glikozylowanymi wiciami, modyfikacje poziomów glikozylacji lub składu glikanów wpływają na tworzenie się wiciowców, co zwykle objawia się zmniejszeniem ruchliwości lub jej brakiem. W związku z tym przeprowadzono dwa testy ruchliwości z mutantami zerowymi.

  1. Oznaczanie ruchliwości w pożywkach płynnych
    1. Kultura Aeromonas odcedza O/N w 1 ml TSB w temperaturze 25-30 °C. Aby przykleić szkiełko podstawowe mikroskopu do wykopanego szkiełka, podnieś niewielką ilość silikonu końcówką wykałaczki i umieść małą kroplę na czterech rogach szkiełka nakrywkowego. Następnie umieścić 1 μl kultury Aeromonas na środku szkiełka przykrywkowego i wymieszać z kroplą świeżej pożywki TSB (2 μl).
    2. Umieść wykopany szkiełko na szkiełku pokrywowym. Dopasuj wykop do osadzonej kropli, delikatnie dociśnij i odwróć zjeżdżalnię do góry nogami.
    3. Analizuj ruchliwość pływania za pomocą mikroskopii świetlnej przy użyciu mikroskopu optycznego (tabela materiałów) z obiektywem 100x przy użyciu olejku immersyjnego.
      UWAGA: Jako kontrola pozytywna należy użyć szczepu Aeromonas typu dzikiego. Jako kontrolę negatywną użyj niewiciowej bakterii, takiej jak Klebsiella.
  2. Oznaczanie ruchliwości w podłożach półstałych
    1. Kultura Aeromonas szczepy O/N w TSB (1 ml) w temperaturze 25-30 °C. Następnie przenieś 3 μl kultury na środek miękkiej płytki agarowej (1% tryptonu, 0,5% NaCl, 0,25% agaru bakto) i inkubuj płytkę stroną do góry O/N w temperaturze 25-30 °C.
    2. Za pomocą linijki zmierz migrację bakterii przez agar od środka płytki w kierunku obrzeży.

4. Oczyszczanie wici

  1. Izolacja wici zakotwiczonej na powierzchni bakterii
    1. Kultura Aeromonas szczepy O/N w TSB (10 ml) w temperaturze 25-30 °C. Następnie rozwiń kulturę do kolby z TSB (900 ml) i pozwól jej wyrosnąć O/N w temperaturze 25-30 °C z wytrząsaniem (200 obr./min).
    2. Wirować przy 5 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Zawiesić osad w 20 ml 100 mM buforu Tris-HCl (pH 7,8).
    3. Aby usunąć zakotwiczoną wici, należy ścinać zawiesinę w wirze za pomocą szklanego pręta (o średnicy 2-3 mm) przez 3-4 minuty, a następnie przepuszczać powtarzalnie (minimum sześć razy) przez strzykawkę 21-G.
    4. Bakterie osadzane przez dwa kolejne wirowania w temperaturze 4 °C: najpierw w temperaturze 8 000 x g przez 30 minut. Usunąć sklarowany składnik osadu i wirować w temperaturze 18 000 x g przez 20 minut. Zebrać skondent zawierający wolne wici.
    5. Ultraodwirować supernatant przy 100 000 x g przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C i zawiesić osad w 150 μl 100 mM Tris-HCl (pH 7,8) plus 2 mM bufor EDTA. Osad zawiera włókna wici.
    6. Przeanalizować 5-10 μl zawieszonego osadu z kroku 4.1.5 za pomocą elektroforezy w 12% żelu poliakrylamidowym SDS i uwidocznić białka za pomocą barwienia Coomassie na niebiesko.
      UWAGA: Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi elektroforezy białek i barwienia żelem. Jako pozytywną kontrolę glikozylowanej witeleliny użyj oczyszczonej wici szczepu typu dzikiego. Oczyść wzbogaconą frakcję wici w gradiencie chlorku cezu (ClCs).
  2. Gradient chlorku cezu do oczyszczania wici.
    1. Zmieszać 12,1 g CsCl z 27 ml destylowanegoH2O.
    2. Przenieść wzbogaconą frakcję wici (150 μl) do cienkościennej, ultraprzezroczystej probówki (14 mm x 89 mm) (tabela materiałów) i napełnić ją 12 ml roztworu CsCl.
    3. Ultraodwirować probówkę o stężeniu 60 000 x g przez 48 godzin w temperaturze 4 °C w obracającym się wirniku kubełkowym (tabela materiałów).
    4. Zebrać pasmo wici do gradientu CsCl za pomocą strzykawki i dializować pod kątem 100 mM Tris-HCl (pH 7,8) plus 2 mM EDTA. Następnie przeanalizować dializowaną wici za pomocą elektroforezy w 12% żelu poliakrylamidowym SDS i barwienia na niebiesko Coomassie (krok 4.1.6) lub za pomocą spektrometrii mas.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta metodologia dostarcza skutecznego systemu do generowania mutantów zerowych w genach lub regionach chromosomalnych Aeromonas, które mogą wpływać na glikozylację wici i rolę włókna wici (Rysunek 1).

Protokół zaczyna się od bioinformatycznej identyfikacji domniemanych FGIs i genów kodujących GT obecnych w tym regionie. W Aeromonas lokalizacja chromosomalna FGI opiera się na wykryciu trzech typów genów: genów zaangażowanych w biosyntezę kwasu pseuda...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Krytycznym wczesnym etapem tej metody jest identyfikacja regionów zaangażowanych w glikozylację wici i przypuszczalnych GT, ponieważ enzymy te wykazują wysoką homologię i biorą udział w wielu procesach. Analiza bioinformatyczna genomów Aeromonas w publicznych bazach danych pokazuje, że region ten sąsiaduje z regionem wici polarnej 2, który zawiera geny flageliny w wielu szczepach i zawiera geny zaangażowane w biosyntezę kwasu pseudodaminowego27. Umożliwiło to opracowanie wytycznych dotycz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Kanadyjską Narodową Radę ds. Badań Naukowych, dla Plan Nacional de I + D (Ministerio de Economía y Competitividad, Hiszpania) oraz dla Generalitat de Catalunya (Centre de Referència en Biotecnologia).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
ABI PRISM Big Dye Terminator v. 3.1 Zestaw reakcyjny gotowy do sekwencjonowania cykluApplied Biosystems4337455Używany do sekwencjonowania
AccuPrime Taq DNA Polimeraza, wysoka wiernośćInvitrogen12346-086Używany do amplifikacji fragmentów AB, CD i AD
AgarozaConda-Pronadise8008Stosowany do elektroforezy DNA
Fosfataza alkaliczna, jelito cielęcia ()PromegaM1821Służy do usuwania fosforanu na końcu 5'
Agar BactoBecton Dickinson214010Służy do analizy ruchliwości
BamHIPromegaR6021Służy do ograniczania endonukleazy
BglIIPromegaR6081Służy do ograniczania endonukleazy
BioDoc-It Imagin SystemUVPStacja bioobrazowania używany do wizualizacji DNA
PolimerazaBiotaq BiolineBIO-21040Używany do badań przesiewowych kolonii
Chlorek cezuApplichemA1126,0100Używany do oczyszczania wici
ChloramfenikolApplichemA1806,0025Używany do krycia trirodzicielskiego
Cytiva illustra GFX PCR DNA i zestaw do oczyszczania żeluCytivia28-9034-71Służy do oczyszczania amplikonów PCR i fragmentów DNA.
Aplikacja EDTA131026.1211Używana do elektroforezy DNA
Kuwety elektroporacyjne Odstęp 2 mmVWR732-1133Używana do
transformacji Bromek etydynyApplichemA1152,0025Służy do wizualizacji DNA
Marker HyperLadder 1 KbMarker BiolineBIO-33053Marker
DNA Zestaw do oczyszczania gDNA Invitrogen Easy-DNAInvitrogen10750204Używany do bakteryjnego oczyszczania chromosomalnego DNA
Luria-Bertani (LB) Milleragar Condalab996Używany do Escherichia coli kultura
Luria-Bertani (LB) Rosół młynarskiCondalab1551Używany do hodowli Escherichia coli culture
Nanodrop ND-1000NanoDrop Techonologies IncSpektrofotometr używany do kwantyfikacji DNA
RyfampicynaApplichemA2220,0005Używany do krycia trójrodzicielskiego
SOC MediumInvitrogen15544034Używany do odzyskiwania elektroporacji
SpectinomycinApplichemA3834,0005Używany do krycia trójrodzicielskiego
SW 41 Ti Rotor wahadłowyBeckman331362Służy do oczyszczania
Ligaza DNA T4Invitrogen15224017Używany do reakcji ligacji
Tryptikazeina agar sojowyCondalab1068Używany do uprawy Aeromonas
Tryptikazeina bulion sojowyCondalab1224Używany do uprawy Aeromonas
TryptonCondalab1612Służy do analizy ruchliwości
TrisApplichemA2264,0500Służy do elektroforezy DNA i oczyszczania wici
Triton X-100ApplichemA4975,0100Używany do lizy bakteryjnej
Ultra Clear probówki (14 mm x 89 mm)Beckman344059Używany do oczyszczania wici
Veriti 96 well Thermal CyclerApplied BiosystemsUżywany do reakcji
PCR Zyppy Plasmid Miniprep II KitBadania ZymmoD4020Służy do izolacji plazmidowego DNA
wici

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Schäffer, C., Messner, P. Emerging facets of prokaryotic glycosylation. FEMS Microbiology Review. 41 (1), 49-91 (2017).
  2. De Maayer, P., Cowan, D. A. Flashy flagella: flagellin modification is relatively common and highly versatile among the Enterobacteriaceae. BMC Genomics. 17, 377(2016).
  3. Nothaft, H., Szymanski, C. M. Protein glycosylation in bacteria: sweeter than ever. Nature Review Microbiology. 8 (11), 765-778 (2010).
  4. Benz, I., Schmidt, M. A. Never say never again: protein glycosylation in pathogenic bacteria. Molecular Microbiology. 45 (2), 267-276 (2002).
  5. Guerry, P., Szymanski, C. M. Campylobacter sugars sticking out. Trends in Microbiology. 16 (9), 428-435 (2008).
  6. Hug, I., Feldman, M. F. Analogies and homologies in lipopolysaccharide and glycoprotein biosynthesis in bacteria. Glycobiology. 21 (2), 138-151 (2011).
  7. Iwashkiw, J. A., Vozza, N. F., Kinsella, R. L., Feldman, M. F. Pour some sugar on it: the expanding world of bacterial protein O-linked glycosylation. Molecular Microbiology. 89 (1), 14-28 (2013).
  8. Szymanski, C. M., Wren, B. W. Protein glycosylation in bacterial mucosal pathogens. Nature Review Microbiology. 3, 225-237 (2005).
  9. Tan, F. Y. Y., Tang, C. M., Exley, R. M. Sugar coating: bacterial protein glycosylation and host-microbe interactions. Trends Biochemistry Sciences. 40 (7), 342-350 (2015).
  10. Lairson, L. L., Henrissat, B., Davies, G. J., Withers, S. G. Glycosyltransferases: structures, functions, and mechanisms. Annual Review Biochemistry. 77, 521-555 (2008).
  11. Lombard, V., Golaconda Ramulu, H., Drula, E., Coutinho, P. M., Henrissat, B. The carbohydrate-active enzymes database (CAZy) in 2013. Nucleic Acids Research. 42, Database Issue 490-495 (2014).
  12. Weerapana, E., Imperiali, B. Asparagine-linked protein glycosylation: from eukaryotic to prokaryotic systems. Glycobiology. 16 (6), 91(2006).
  13. Faridmoayer, A., et al. Extreme substrate promiscuity of the Neisseria oligosaccharyl transferase involved in protein O-glycosylation. Journal of Biological Chemistry. 283 (50), 34596-34604 (2008).
  14. Wacker, M., et al. Substrate specificity of bacterial oligosaccharyltransferase suggests a common transfer mechanism for the bacterial and eukaryotic systems. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (18), 7088-7093 (2006).
  15. Scott, A. E., et al. Flagellar glycosylation in Burkholderia pseudomallei and Burkholderia thailandensis. Journal of Bacteriology. 193 (14), 3577-3587 (2011).
  16. Thibault, P., et al. Identification of the carbohydrate moieties and glycosylation motifs in Campylobacter jejuni flagellin. Journal of Biological Chemistry. 276 (37), 34862-34870 (2001).
  17. Schirm, M., et al. Structural, genetic and functional characterization of the flagellin glycosylation process in Helicobacter pylori. Molecular Microbiology. 48 (6), 1579-1592 (2003).
  18. McNally, D. J., et al. Targeted metabolomics analysis of Campylobacter coli VC167 reveals legionaminic acid derivatives as novel flagellar glycans. Journal of Biological Chemistry. 282 (19), 14463-14475 (2007).
  19. Logan, S. M., et al. Identification of novel carbohydrate modifications on Campylobacter jejuni 11168 flagellin using metabolomics-based approaches. FEBS Journal. 276 (4), 1014-1023 (2009).
  20. Wilhelms, M., Fulton, K. M., Twine, S. M., Tomás, J. M., Merino, S. Differential glycosylation of polar and lateral flagellins in Aeromonas hydrophila AH-3. Journal of Biological Chemistry. 287 (33), 27851-27862 (2012).
  21. Canals, R., et al. Non-structural flagella genes affecting both polar and lateral flagella-mediated motility in Aeromonas hydrophila. Microbiology. 153, Pt 4 1165-1175 (2007).
  22. Howard, S. L., et al. Campylobacter jejuni glycosylation island important in cell charge, legionaminic acid biosynthesis, and colonization of chickens. Infection and Immunity. 77 (6), 2544-2556 (2009).
  23. Verma, A., Arora, S. K., Kuravi, S. K., Ramphal, R. Roles of specific amino acids in the N-terminus of Pseudomonas aeruginosa flagellin and of flagellin glycosylation in the innate immune response. Infection and Immunity. 73 (12), 8237-8246 (2005).
  24. Lamy, B., Baron, S., Barraud, O. Aeromonas: the multifaceted middleman in the One Health world. Current Opinion in Microbiology. 65, 24-32 (2022).
  25. Gavín, R., et al. Lateral flagella of Aeromonas species are essential for epithelial cell adherence and biofilm formation. Molecular Microbiology. 43 (2), 383-397 (2002).
  26. Altschul, F. S., et al. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Research. 25 (17), 3389-3402 (1997).
  27. Forn-Cuní, G., et al. Polar flagella glycosylation in Aeromonas: Genomic characterization and Involvement of a specific glycosyltransferase (Fgi-1) in heterogeneous flagella glycosylation. Frontiers in Microbiology. 11, 595697(2021).
  28. Milton, D. L., O'Toole, R., Horstedt, P., Wolf-Watz, H. Flagellin A is essential for the virulence of Vibrio anguillarum. Journal of Bacteriol.ogy. 178 (5), 1310-1319 (1996).
  29. Kovács, N. Identification of Pseudomonas pyocyanea by the oxidase reaction. Nature. 178 (4535), 703(1956).
  30. Fulton, K. M., Mendoza-Barberá, E., Twine, S. M., Tomás, J. M., Merino, S. Polar glycosylated and lateral non-glycosylated flagella from Aeromonas hydrophila strain AH-1 (Serotype O11). International Journal of Molecular Sciences. 16 (12), 28255-28269 (2015).
  31. Khider, M., Willassen, N. P., Hansen, H. The alternative sigma factor RpoQ regulates colony morphology, biofilm formation and motility in the fish pathogen Aliivibrio salmonicida. BMC Microbiology. 18 (1), 116(2018).
  32. Pawar, S. V., et al. Novel genetic tools to tackle c-di-GMP-dependent signalling in Pseudomonas aeruginosa. Journal of Applied Microbiology. 120 (1), 205-217 (2016).
  33. Vander Broek, W., Chalmers, K. J., Stevens, M. P., Stevens, J. M. Quantitative proteomic analysis of Burkholderia pseuomallei Bsa Type III secretion system effectors using hypersecreting mutants. The American Society for Biochemistry and Molecular Biology. 14 (4), 905-916 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Null Mutant GenerationFlagella GlycosylationAeromonas StrainsGene DeletionPolar FlagellumMass SpectrometrySwimming MotilityGlycan Biosynthesis

Powiązane artykuły