Artykuł metodologiczny

Ilościowa ocena reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym ekspresji mikroRNA w nerkach i surowicy myszy z zależną od wieku niewydolnością nerek

2.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63258

⸱

29 kwietnia 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Nephrology, First Department of Integrated Medicine, Saitama Medical Center, Jichi Medical University, 2Division of Intensive Care Unit, First Department of Integrated Medicine, Saitama Medical Center, Jichi Medical University, 3Department of Medical Physiology, Meiji Pharmaceutical University

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiamy metodę oceny ekspresji mikroRNA w nerkach i surowicy myszy z zależną od wieku niewydolnością nerek za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją.

Streszczenie

MikroRNA (miRNA) to małe, niekodujące RNA składające się z 21-25 zasad. Nie są one przekształcane w białka, ale raczej działają w celu utrudnienia funkcjonowania docelowych informacyjnych RNA (mRNA) poprzez ich destabilizację i zakłócenie ich translacji. Chociaż zbadano profile ekspresji miRNA w różnych narządach i tkankach myszy, nie było standardowych metod oczyszczania i ilościowego oznaczania miRNA nerek i surowicy myszy. Opracowaliśmy skuteczną i wiarygodną metodę ekstrakcji i oceny ekspresji miRNA w surowicy i nerkach myszy z zależną od wieku niewydolnością nerek.

Metoda wykorzystuje ilościową reakcję łańcuchową polimerazy z odwrotną transkrypcją (qRT-PCR), a protokół wymaga sześciu kroków: (1) przygotowanie myszy z przyspieszoną rezygencją starzenia 1 (SAMR1) i myszy podatnych na starzenie (SAMP1); (2) ekstrakcja próbek surowicy od tych myszy; (3) pobranie próbki nerki od każdej myszy; (4) ekstrakcja całkowitego RNA (w tym miRNA) z próbek nerek i surowicy od każdej myszy; (5) synteza komplementarnego DNA (cDNA) z odwrotną transkrypcją z miRNA; (6) przeprowadzenie qRT-PCR z wykorzystaniem uzyskanego cDNA.

Ten protokół został użyty do potwierdzenia, że w porównaniu z kontrolami, ekspresja miRNA-7218-5p i miRNA-7219-5p została znacząco zmieniona w nerkach i surowicy mysiego modelu niewydolności nerek zależnej od wieku. Protokół ten wyjaśnił również związek między nerką a surowicą mysiego modelu zależnej od wieku niewydolności nerek. Protokół ten można wykorzystać do określenia ekspresji miRNA w nerkach i surowicy myszy z zależną od wieku niewydolnością nerek.

Wprowadzenie

Wiadomo, że ekspresja różnych mRNA, które odgrywają ważną rolę zarówno w fizjologii, jak i chorobie (np. zapaleniu, zwłóknieniu, zaburzeniach metabolicznych i raku) jest regulowana przez miRNA, które są krótkimi, niekodującymi RNA, które powodują degradację i hamują transkrypcję mRNA1. W związku z tym możliwe jest, że niektóre miRNA mogą służyć jako nowi kandydaci na biomarkery i/lub cele terapeutyczne dla różnych chorób2,3,4,5. Przeprowadzono badania nad profilami ekspresji miRNA w różnych narządach i tkankach myszy (w tym brain6, heart7, lung8, liver9 i kidney10). Nie ma jednak standardowych ani ustalonych metod ekstrakcji i oceny miRNA w nerkach lub surowicy myszy z zależną od wieku niewydolnością nerek.

Dlatego stworzyliśmy protokół, który może być używany do niezawodnego oczyszczania i wykrywania ekspresji miRNA w surowicy i nerkach myszy z niewydolnością nerek zależną od wieku. Protokół składa się z sześciu głównych etapów: (1) przygotowanie zarówno 50-tygodniowych samców myszy SAMR1, jak i samców myszy SAMP1; (2) ekstrakcja próbek krwi z żyły głównej dolnej obu szczepów myszy, a następnie użycie probówki szpica z heparyną, a następnie odwirowanie, w celu uzyskania próbki surowicy; (3) Ekstrakcja próbki nerki od myszy - homogenizator krzemowy A służy do oddzielnej homogenizacji próbki nerki, a następnie próbka jest przenoszona do systemu rozdrabniania biopolimerów na kolumnie wirowej mikrowirówki11; (4) ekstrakcja całkowitego RNA (zawierającego miRNA) z próbek surowicy za pomocą kolumny spinowej opartej na błonie krzemionkowej12 oraz ekstrakcja całkowitego RNA zawierającego miRNA z próbek nerek za pomocą kolumny spinowej opartej na błonie krzemionkowej11; (5) synteza komplementarnego DNA (cDNA) z całkowitego RNA przy użyciu odwrotnej transkryptazy, polimerazy poli(A) i startera oligo-dT13,14; i (6) wreszcie, określenie ekspresji miRNA za pomocą qRT-PCR i barwnika interkalacyjnego 13,14.

Ten nowy protokół został oparty na badaniach, które doprowadziły do ekstrakcji i oceny miRNA w różnych typach tkanek11,12,13. Wykazano, że opracowany w protokole system rozdrabniania biopolimerów jest w stanie oczyścić wysokiej jakości całkowite RNA z tkanek11. Ustalono dokładność i czułość aspektów tego protokołu stosowanego do oceny ekspresji miRNA metodą qRT-PCR z barwnikiem interkalacyjnym 13,14, na przykład synteza cDNA z odwrotną transkryptazą, polimerazą poli(A) i starterami oligo-dT z wyekstrahowanego całkowitego RNA. Nowy protokół ma kilka zalet: prostotę, oszczędność czasu i mniej błędów technicznych. Dzięki temu może być stosowany do badań, które wymagają dokładnej i czułej identyfikacji profili miRNA nerek i surowicy. Badania nad wieloma stanami patologicznymi mogą również wykorzystywać nowy protokół.

Profile ekspresji miRNA u myszy SAMP1, które są modelem zależnej od wieku niewydolności nerek, można określić jak pokazano poniżej. U ludzi zależna od wieku niewydolność nerek wiąże się z postępem niewydolności nerek i charakteryzuje się zarówno zwiększeniem obszaru zwłóknienia śródmiąższowego nerek, jak i postępem stwardnienia kłębuszków nerkowych15,16. Niewydolność nerek zależna od wieku jest również ważną i częstą cechą przewlekłej choroby nerek i schyłkowej niewydolności nerek15,16.

Protokół

Protokół eksperymentalny został zatwierdzony przez Komisję Etyki Zwierząt Uniwersytetu Medycznego Jichi i przeprowadzony zgodnie z Przewodnikiem dla Zwierząt Laboratoryjnych Uniwersytetu Medycznego Jichi i jego wytycznymi dotyczącymi użytkowania i opieki nad zwierzętami doświadczalnymi. W protokole tym wykorzystuje się cztery 50-tygodniowe samce myszy SAMR1 i samce myszy SAMP1 (40-45 g).

1. Pobieranie próbek surowicy

  1. Przygotuj następujące elementy dla każdej myszy: igły 30 G ze strzykawką o pojemności 1,0 ml, probówkę wirówkową o pojemności 1,0 ml ze szpicem i heparyną, probówki do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml, znieczulenie izofluranowe, arkusz korka, 70% etanolu, dwa waciki zwilżone solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS), szalka Petriego z PBS, pęseta i nożyczki chirurgiczne.
  2. Znieczulij mysz 1,5% izofluranem i utrzymuj na poziomie 1,5%. Podaj podskórnie środek przeciwbólowy (meloksykam 5 mg/kg), a następnie wstrzyknij 1,0 ml 70% etanolu do brzucha i umieść go w pozycji leżącej na arkuszu korka.
  3. Potwierdź głębokość znieczulenia poprzez zanik odruchu wycofania pedału. Za pomocą pęsety i nożyczek chirurgicznych naciąć skórę brzucha. Przetnij mięśnie i błonę otrzewnową od pęcherza do lewej dolnej krawędzi żeber.
  4. Za pomocą pęsety unieś błonę otrzewnową i wykonaj boczne nacięcie w górnej krawędzi błony otrzewnej nożyczkami chirurgicznymi. Kontynuuj nacięcie wzdłuż najniższej krawędzi żeber.
  5. Zidentyfikuj żyłę główną dolną za pomocą dwóch wacików zwilżonych PBS. Wprowadzić jedną z igieł 30 G ze strzykawką o pojemności 1,0 ml do żyły głównej dolnej, a następnie pociągnąć strzykawkę. Powoli wyciągnij igłę z żyły głównej dolnej, aby uniknąć hemolizy. Przenieś krew do probówki szpica o pojemności 1,0 ml z heparyną, a następnie wymieszaj, kilkakrotnie odwracając probówkę.
    UWAGA: Mysz jest uśpiona przez zwichnięcie szyjki macicy.
  6. Wiruj rurkę szpica w temperaturze pokojowej (RT), 3 000 × g przez 10 minut.
  7. Powoli odsysać supernatant, upewnić się, że nie zawiera osadu, a następnie przenieść go do nieużywanej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml.
  8. Przed użyciem przechowywać probówkę w temperaturze -80 °C.
    UWAGA: W przypadku natychmiastowego przejścia do kroku 3 probówka nie musi być przechowywana w temperaturze -80 °C.

2. Pobieranie próbek nerek

  1. Przygotuj następujące elementy dla każdej myszy: 2,0 ml krioprobówek, znieczulenie izofluranem, arkusz korka, 70% etanol, szalkę Petriego z PBS, pęsetę i nożyczki chirurgiczne.
  2. Znieczulij mysz 1,5% izofluranem i utrzymuj na poziomie 1,5%. Podaj podskórnie środek przeciwbólowy (meloksykam 5 mg/kg), a następnie wstrzyknij 1,0 ml 70% etanolu do brzucha i umieść go w pozycji leżącej na arkuszu korka.
  3. Potwierdź głębokość znieczulenia poprzez zanik odruchu wycofania pedału. Użyj pęsety i nożyczek chirurgicznych, aby wykonać nacięcie w skórze brzucha. Przetnij mięśnie i błonę otrzewnową od pęcherza moczowego do lewej dolnej krawędzi żeber.
  4. Za pomocą pęsety unieś błonę otrzewnej i wykonaj boczne nacięcie w górnej krawędzi błony otrzewnej nożyczkami chirurgicznymi. Kontynuuj nacięcie wzdłuż najniższej krawędzi żeber.
  5. Zidentyfikuj lewą nerkę. Refluksuj go za pomocą PBS, aby wypłukać krew z naczyń, aż nerka zmieni kolor na żółtawo-biały. Najpierw wytnij całą nerkę za pomocą nożyczek chirurgicznych, aby przeciąć lewą tętnicę nerkową i żyłę. Umieścić nerkę na szalce Petriego i dokładnie umyć ją PBS.
    UWAGA: Mysz jest uśpiona przez zwichnięcie szyjki macicy.
  6. Użyj pęsety i nożyczek chirurgicznych, aby pociąć nerkę na próbki 10 mg (10 mg to odpowiednia wielkość próbki do następnego kroku). Umieść każdą próbkę nerki we własnej krioprobówce o pojemności 2,0 ml. Zamknij nakrętkę tuby.
  7. W celu długotrwałego przechowywania należy przenieść każdą krioprobówkę do ciekłego azotu i przechowywać ją w temperaturze -80 °C.

3. Całkowita ekstrakcja RNA z próbki surowicy

  1. Najpierw przygotuj następujące elementy: mieszalnik wirowy, odczynnik do lizy na bazie fenolu/guanidyny, 80% etanolu, 100% etanolu, 100% chloroformu, biopolimerowe kolumny wirowe (w probówkach zbiorczych 2,0 ml11), kolumny wirowe zakotwiczone w membranie (w probówkach zbiorczych 2,0 ml11), bufor do płukania #1 (tj. bufor płuczący zawierający guanidynę i 100% etanolu w stosunku 1:2), bufor do płukania #2 (tj. bufor płuczący zawierający guanidynę i 100% etanol w stosunku 1:4), wodę wolną od RNaz, probówki mikrowirówkowe o pojemności 1,5 ml i probówki do mikrowirówek o pojemności 2,0 ml.
  2. Najpierw weź próbkę surowicy o objętości 200 μl do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml, a następnie dodaj 1,000 μl odczynnika do lizy na bazie fenolu/guanidyny. Wiruj mieszaninę przez 5 sekund.
  3. Inkubować próbkę w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
  4. Dodać 200 μl chloroformu do próbki surowicy w probówce i szczelnie zamknąć nakrętkę probówki. Odwróć probówkę 15x, aby wymieszać chloroform i próbkę surowicy.
  5. Każdą próbkę inkubuje się w temperaturze pokojowej przez 3 minuty. Następnie obracać próbkę w temperaturze 4 °C przez 15 minut przy 12 000 x g.
  6. Przenieść 300 μl supernatantu do nowej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml bez naruszania osadu. Dodaj 450 μl 100% etanolu i wiruj probówkę przez 5 s.
    UWAGA: We wszystkich poniższych krokach umieść zakotwiczoną w błonie kolumnę wirową w celu oddzielenia RNA i DNA w probówce zbiorczej o pojemności 2.0 ml, aby ją odwirować.
  7. Następnie należy usunąć 700 μl próbki, załadować ją na zakotwiczoną w membranie kolumnę wirową i zamknąć nakrętkę. Obracać kolumnę w temperaturze pokojowej przez 15 s w temperaturze 8 000 × g i pozostawić supernatant w kolumnie. Wyrzucić osad pozostały w probówce zbiorczej.
  8. Dodać 700 μl buforu płuczącego #1, który jest częścią zestawu surowica/osocza (patrz tabela materiałów) do zakotwiczonej w membranie kolumny wirowej, aby dokładnie oczyścić próbkę. Zamknąć nasadkę kolumny i obracać kolumnę w temperaturze RT przez 15 s w temperaturze 8 000 × g, a supernatant pozostawić w kolumnie. Wyrzucić osad pozostały w probówce zbiorczej.
  9. W celu usunięcia soli śladowych weź 500 μl buforu płuczącego #2 i załaduj go na zakotwiczoną w membranie kolumnę wirową. Po zamknięciu nasadki kolumny obracać kolumnę w temperaturze RT przez 15 s w temperaturze 8 000 × g i pozostawić supernatant w kolumnie. Wyrzuć granulki z probówki zbiorczej.
  10. W celu usunięcia soli śladowych weź 500 μl 80% etanolu i załaduj go na zakotwiczoną w membranie kolumnę wirową. Po zamknięciu nasadki kolumny obracać kolumnę w temperaturze RT przez 15 s w temperaturze 8 000 × g i pozostawić supernatant w kolumnie. Wyrzuć granulki z probówki zbiorczej.
  11. Ponownie obracać zakotwiczoną w membranie kolumnę wirującą w temperaturze pokojowej przez 5 minut przy masie 15 000 × g.
  12. Po przeniesieniu zakotwiczonej w membranie kolumny wirowej do nowej probówki zbiorczej o pojemności 1,5 ml, dodaj do kolumny 14 μl wody wolnej od RNaz, aby rozpuścić całkowite RNA. Po zamknięciu nasadki kolumny odczekaj 5 minut z rurką pozostawioną w pozycji RT. Ponownie wiruj kolumnę przez 1 minutę przy 15 000 × g przy RT.
  13. Przed użyciem należy przechowywać probówki z próbkami w temperaturze -80 °C.

4. Ekstrakcja całkowitego RNA z próbki nerki

  1. Najpierw przygotuj następujące elementy: homogenizator silikonowy, lód, mieszalnik wirowy, 100% etanol, 100% chloroform, biopolimerowe kolumny wirowe (w probówkach zbiorczych 2,0 ml 11), kolumny wirowe zakotwiczone w membranie (w probówkach zbiorczych 2,0 ml11), odczynnik do lizy na bazie fenolu/guanidyny, bufor do płukania #1 (ten sam bufor co w kroku 3.1.), bufor do płukania #2 (ten sam bufor co w kroku 3.1.), Woda wolna od RNaz, probówki do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml i probówki do mikrowirówek o pojemności 2,0 ml.
  2. Umieścić próbkę nerki o stężeniu 10 mg w homogenizatorze krzemowym i dodać 700 μl odczynnika do lizy na bazie fenolu/guanidyny.
  3. Ustawić homogenizator. Delikatnie dociśnij i przekręć tłuczek homogenizatora do próbki nerki, aby homogenizować próbkę. Kontynuuj naciskanie i przekręcanie tłuczka, aż próbka nerki zostanie całkowicie zhomogenizowana w odczynniku do lizy na bazie fenolu/guanidyny.
  4. W celu dalszej homogenizacji należy pobrać homogenizowany lizat (w probówce zbiorczej o pojemności 2,0 ml) i przenieść go do biopolimerowej kolumny wirowej.
  5. Odwirować homogenizowany lizat w temperaturze pokojowej przez 3 minuty w temperaturze 14 000 × g, a następnie przenieść cały wytrącony osad do nieużywanej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml w celu odwrócenia wytrąconego osadu
  6. Wymieszać osad ze 140 μl chloroformu w probówce, a następnie szczelnie zamknąć nakrętkę probówki. Odwróć probówkę 15x, aby wymieszać lizat i chloroform.
    UWAGA: Chloroform może być bezpiecznie stosowany bez kaptura.
  7. Inkubować próbkę w temperaturze pokojowej przez 2-3 minuty. Odwirowywać próbkę w temperaturze 4 °C przez 15 minut w temperaturze 12 000 × g.
  8. Przenieść supernatant (zwykle o pojemności ~300 μl) do nowej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml, nie naruszając osadu. Dodaj 1,5-krotność jego objętości (która zwykle wynosi ~450 μL) 100% etanolu. Mieszaj mieszaninę przez 5 s.
    UWAGA: We wszystkich poniższych krokach umieść zakotwiczoną w błonie kolumnę wirową do oddzielania RNA i DNA w probówce zbiorczej o pojemności 2.0 ml, aby ją odwirować.
  9. Załadować 700 μl próbki na jedną z zakotwiczonych w membranie kolumn wirowych. Zamknąć nakrętkę i odwirować kolumnę przy 15 000 × g przez 15 s. Wytrącony lizat pozostały w probówce zbiorczej należy wyrzucić.
  10. Dodaj 700 μl buforu do płukania #1 do kolumny wirowej, aby dokładnie ją umyć. Zamknąć nakrętkę i odwirować kolumnę przy 15 000 × g przez 15 s. Wytrącony lizat pozostały w probówce zbiorczej należy wyrzucić.
  11. W celu usunięcia śladowych ilości soli załadować 500 μl buforu płuczącego #2 na zakotwiczoną w membranie kolumnę wirową. Po zamknięciu pokrywy kolumny należy ją odwirować przy ciśnieniu 15 000 × g przez 15 s. Wytrącony lizat wyrzucić do probówki zbiorczej.
  12. Powtórz krok 4.11.
  13. Ponownie odwirować zakotwiczoną w membranie kolumnę wirową przez 1 minutę przy sile 15 000 × g. Wytrącony lizat wyrzucić do probówki zbiorczej.
  14. Weź zakotwiczoną w membranie kolumnę wirową i przenieś ją do nowej probówki zbiorczej o pojemności 1,5 ml. Dodaj 30 μl wody wolnej od RNaz do kolumny, aby rozpuścić całkowite RNA. Po zamknięciu nasadki kolumny należy odczekać 5 minut z probówką w temperaturze pokojowej, a następnie odwirować kolumnę przez 1 minutę w stężeniu 15 000 × g.
  15. Przenieść całkowitą objętość próbki zawierającej całkowite RNA do nowej probówki do mikrowirówki. Umieść probówkę na lodzie i zmierz całkowite stężenie RNA za pomocą spektrofotometrii. Upewnij się, że całkowite stężenie RNA wynosi ~300-1,500 ng/μL.
  16. Przed użyciem należy przechowywać probówki zawierające próbki w temperaturze -80 °C.

5. Synteza cDNA z odwrotną transkrypcją całkowitego RNA w surowicy

UWAGA: Minimalne informacje potrzebne do publikacji wytycznych dotyczących ilościowych eksperymentów PCR w czasie rzeczywistym (MIQE) zalecają stosowanie lepszych praktyk eksperymentalnych w celu uzyskania wiarygodnych, jednoznacznych wyników17. W tym protokole cDNA jest syntetyzowane z całkowitego RNA oczyszczonego w dwuetapowej procedurze przy użyciu odwrotnej transkryptazy, polimerazy poli(A) i starterów oligo-dT.

  1. Przygotuj najpierw: mieszalnik wirowy, termocykler, ośmiodołkowe probówki paskowe, nakrętkę każdej ośmioczęściowej probówki, wodę destylowaną, lód, zestaw odwrotnej transkryptazy (patrz Tabela Materiałów)13,14 w stanie stopionym i 1,5 ml probówek do mikrowirówek.
  2. Uruchom termocykler.
  3. Przygotować roztwór mieszanki wzorcowej; aby uzyskać łącznie 8,0 μl mieszanki wzorcowej na ośmiodołkową probówkę z paskami, dodać 2,0 μl mieszaniny odwrotnej transkryptazy (dołączonej do zestawu) i 2,0 μl mieszaniny 10x kwasów nukleinowych do 4,0 μl buforu do odwrotnej transkrypcji w probówce mikrowirówki o pojemności 1,5 ml.
  4. Umieścić 8,0 μl roztworu mieszanki głównej w każdej probówce ośmiodołkowej probówki paskowej.
  5. Umieścić 12 μl podwielokrotności całkowitego RNA w każdej probówce ośmiodołkowej probówki paskowej i zamknąć nakrętkę probówki. Odwirować probówkę przez 15 s w temperaturze pokojowej i 2 000 × g.
  6. Umieścić probówkę w termocyklerze i inkubować przez 60 minut w temperaturze 37 °C. Inkubować próbkę przez dodatkowe 5 minut w temperaturze 95 °C w celu syntezy cDNA.
  7. Po inkubacji przenieś cDNA do nowej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Rozcieńczyć cDNA dziesięciokrotnie (1:10) wodą destylowaną. Wirować i odwirowywać probówkę przez 5 s w temperaturze pokojowej i 2 000 × g.
  8. Rozcieńczone cDNA należy tymczasowo przechowywać na lodzie. Przed użyciem rozcieńczone próbki należy przechowywać w temperaturze -80 °C.

6. Synteza cDNA z odwrotną transkrypcją całkowitego RNA w nerkach

UWAGA: Wytyczne MIQE zachęcają do stosowania lepszych praktyk eksperymentalnych, aby zapewnić wiarygodne i jednoznaczne wyniki17. Protokół ten wykorzystuje odwrotną transkryptazę, polimerazę poli(A) i startery oligo dT do syntezy cDNA z 1,0 μg oczyszczonego całkowitego RNA w dwuetapowej procedurze.

  1. Najpierw przygotuj następujące elementy: mieszalnik wirowy, termocykler, probówki mikrowirówkowe o pojemności 1,5 ml, ośmiodołkowe probówki paskowe, nasadkę każdej probówki ośmiopaskowej, wodę destylowaną, lód i zestaw do odwrotnej transkryptazy (patrz Tabela materiałów)13,14 w stanie stopionym.
  2. Uruchom termocykler.
  3. Przygotować roztwór mieszaniny wzorcowej; aby uzyskać łącznie 8,0 μl roztworu mieszaniny wzorcowej na probówkę, dodać 2,0 μl mieszaniny odwrotnej transkryptazy, która jest dołączona do zestawu i 2,0 μl mieszaniny 10x kwasów nukleinowych do 4,0 μl buforu do odwrotnej transkrypcji.
  4. Dodać 8,0 μl roztworu mieszanki głównej do każdej probówki z ośmiodołkową probówką paskową.
  5. Dostosuj całkowitą gęstość RNA w następujący sposób. W celu oddzielenia 1,0 μg całkowitego RNA od próbki nerki za pomocą 12 μl wody wolnej od RNaz, należy pobrać odpowiednią ilość całkowitego RNA i przenieść ją do wody destylowanej, stosując stężenie zmierzone w sposób opisany powyżej (w kroku 4.15).
    UWAGA: W przypadku zanieczyszczenia DNA, zanieczyszczone DNA jest koamplifikowane za pomocą qRT-PCR.
  6. Wykonaj ten sam proces, który opisano powyżej w krokach 5.5.-5.8.

7. qRT-PCR miRNA

UWAGA: Metoda interkalatora jest używana do qRT-PCR miRNA. Startery są używane do RNA: U6 small nuclear 2 (RNU6-2), miRNA-223-3p, miRNA-423-5p, miRNA-7218-5p i miRNA-7219-5p.

  1. Przygotuj następujące elementy: mieszalnik wirowy, system PCR w czasie rzeczywistym, 96-dołkową płytkę reakcyjną do qRT-PCR, folię klejącą do 96-dołkowej płytki reakcyjnej, aplikator folii adhezyjnej, 96-dołkowy wirnik wirówki, startery specyficzne dla miRNA, zestaw PCR na bazie zielonego barwnika zawierający 2x mieszankę główną PCR i 10x uniwersalny starter (patrz Tabela Materiałów)13,14, i probówkę do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml.
  2. Po wymieszaniu ich w probówce mikrowirówki o pojemności 1,5 ml należy przemieszać: 6,25 μl wody destylowanej, po 1,25 μl 5 μM startera miRNA rozpuszczonego w wodzie wolnej od nukleaz, 12,5 μl 2x mieszanki głównej PCR i 2,5 μl 10 ml uniwersalnego startera.
  3. Przygotować i rozpuść zsyntetyzowane cDNA zgodnie z opisem w Kroku 5 (surowica) lub Kroku 6 (nerka). Wirować i odwirowywać cDNA przez 5 s.
  4. Pobrać 22,5 μl porcji odczynnika (jak opisano w kroku 7.2 powyżej) i umieścić je oddzielnie w każdym dołku płytki 96-dołkowej.
  5. Dodać 2,5 μl porcji cDNA do każdego dołka płytki.
  6. Aby przymocować folię samoprzylepną do płytki, użyj aplikatora folii samoprzylepnej. Odwirować płytkę przez 30 s przy 1 000 x g w 96-dołkowym wirniku wirówki. Ustabilizuj reakcję na dnie każdej studzienki.

8. Korzystanie z systemu PCR w czasie rzeczywistym i oprogramowania do uruchomienia programu cyklicznego PCR

  1. Rozpocznij system PCR w czasie rzeczywistym. Umieść utworzoną tabliczkę zgodnie z opisem w kroku 7.6. w systemie PCR w czasie rzeczywistym. Zmodyfikuj ustawienia; podaj nazwę eksperymentu, a następnie wybierz 96-dołkowy (0,2 ml) jako typ eksperymentu systemu, porównawczy CT (ΔΔCT) jako metodę oznaczania ilościowego, standardowy jako tryb pracy systemu i zielone odczynniki SYBR jako odczynniki do wykrywania sekwencji docelowej.
  2. Podaj nazwy próbki i docelowych miRNA oraz nazwij próbkę i docelowe miRNA w każdym dołku. Przypisz zduplikowane próbki, aby uzyskać dane odpowiednie do potwierdzenia wyników, a następnie wybierz próbkę referencyjną i kontrolę endogenną. Aby barwnik miał być używany jako odniesienie pasywne, wybierz opcję brak. Aby wyeliminować zanieczyszczenie krzyżowe odczynników, należy ustawić ujemną odwrotną transkryptazę i kontrolę bez matrycy dla ekspresji miRNA.
  3. Następnie upewnij się, że objętość reakcji jest ustawiona na 20 μl, a warunki cyklu PCR są ustawione w następujący sposób: 95 °C przez 15 min, następnie 40 cykli denaturacji w 94 °C przez 15 s, wyżarzanie w 55 °C przez 30 s, a na koniec przedłużenie w 70 °C przez 30 s.
  4. Kliknij przycisk Analizuj w oprogramowaniu systemu, aby przeanalizować dane qRT-PCR po zakończeniu procesu. Upewnij się, że linia progowa automatycznie wybrana przez program jest odpowiednia dla każdej studzienki.
  5. Sprawdź wartość cyklu progowego (CT) endogennej kontroli i docelowych miRNA analizowanych w każdej próbce. Określ wartości CT przez przecięcie krzywej wzmocnienia i linii progowej.
    UWAGA: W niniejszym badaniu RNU6-2 i miRNA-423-5p zastosowano jako endogenne kontrole docelowych poziomów ekspresji miRNA, a metodę ΔΔCT zastosowano do określenia względnych poziomów ekspresji każdego docelowego miRNA18.

Wyniki

W modelu mysim z wiekowo-zależnym upośledzeniem funkcji nerek wykorzystano 50-tygodniowe samce myszy SAMP1 o masie 40-45 g. Od każdej myszy pobrano około 0,8 mL krwi, którą przeniesiono do probówki spitz o pojemności 1,0 mL z heparyną, wymieszano przez odwracanie i odwirowano. Każką nerkę przepłukano PBS, wypreparowano i przechowywano w ciekłym azocie do dalszych analiz. Jako kontrolę zastosowano 50-tygodniowe myszy SAMR1. Na podstawie danych z miRNA qRT-PCR uzyskanych w tym modelu wiekowo-zależnego upośledzenia funkcji nerek zaobserwowano, że poziom miRNA-7219-5p w nerkach był znacząco podwyższony, a poziom miRNA-7218-5p w nerkach był wyraźnie obniżony u myszy SAMP1 w porównaniu z grupą kontrolną (Rysunek 1). Poziomy surowicze zarówno miRNA-7219-5p, jak i miRNA-7218-5p były znacznie podwyższone u myszy SAMP1 w porównaniu z kontrolą (Rysunek 2). Poziomy ekspresji miRNA-223-3p nie uległy zmianie w żadnej z linii oraz pomiędzy nerkami a surowicą (Rysunek 1 oraz Rysunek 2).

Analiza ekspresji mikroRNA; wykresy słupkowe; porównanie danych w grupie SAMR1 i SAMP1; badania biologiczne.
Rycina 1: Różnicowo wyrażane mikroRNA w nerkach myszy SAMP1. Analiza qRT-PCR ekspresji miRNA-223-3p, miRNA-7218-5p oraz miRNA-7219-5p u myszy SAMR1 (kontrola, n = 4) i myszy SAMP1 (n = 4). Dane przedstawiono jako średnia ± błąd standardowy (słupki błędów); do analizy różnic między grupami zastosowano testy t; za istotne uznano p < 0.05 (*p < 0.05), n.s.: brak istotności. Skróty: miRNA = mikroRNA; SAMP1 = senescence-accelerated mouse prone; SAMR1 = senescence-accelerated mouse resistance 1; qRT-PCR = ilościowa reakcja polimerazy w łańcuchu z odwrotną transkrypcją. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Analiza ekspresji miRNA; wykres przedstawiający ekspresję względną w grupie SAMR1 w porównaniu z SAMP1; wyniki statystyczne.
Rysunek 2: Różnicowo eksprimowane miRNA w surowicy myszy SAMP1. Analiza qRT-PCR ekspresji miRNA-223-3p, miRNA-7218-5p oraz miRNA-7219-5p u myszy SAMR1 (kontrola, n = 4) i myszy SAMP1 (n = 4). Dane przedstawiono jako średnia ± SE (słupki błędów); do badania istotnych różnic między grupami zastosowano testy t. *p < 0.05 w teście t. Skróty: miRNA = microRNA; SAMP1 = senescence-accelerated mouse prone; SAMR1 = senescence-accelerated mouse resistance 1; qRT-PCR = ilościowa reakcja polimerazy w łańcuchu z odwrotną transkrypcją Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Poziomy ekspresji docelowych miRNA udało się określić za pomocą opisanego powyżej protokołu z wykorzystaniem qRT-PCR. Ocena wyekstrahowanych miRNA jest ważnym krokiem w uzyskaniu znaczących danych qRT-PCR. Aby potwierdzić odpowiednią jakość miRNA przed wykonaniem qRT-PCR, należy zastosować spektrofotometrię w celu określenia stosunku absorbancji przy 260 nm do tej przy 280 nm. Może dojść do zanieczyszczenia DNA i/lub dimerów starterów w każdym dołku płytki reakcyjnej może być obecny, jeśli qRT-PCR nie zapewnia pojedynczej amplifikacji PCR o oczekiwanej długości i temperaturze topnienia lub jeśli zapewnia monomodalną krzywą topnienia.

Poziomy ekspresji MiRNA można ocenić za pomocą kilku metod innych niż qRT-PCR, w tym northern blot, mikromacierzy i testów ochrony rybonukleazami. Jednak metoda qRT-PCR jest czułą, dokładną, prostą i powtarzalną procedurą, która wymaga mniejszej objętości próbki niż te, które są wymagane do testów ochrony przed northern blotting i rybonukleazą19. Ponieważ mikromacierze mogą jednocześnie mierzyć ekspresję dziesiątek tysięcy miRNA, można je wykorzystać do identyfikacji potencjalnych markerów miRNA. Dane z mikromacierzy wykazują również wysoką ogólną korelację z danymi uzyskanymi za pomocą qRT-PCR20. Nie osiągnięto jednak konsensusu co do optymalnej metodologii porównywania danych z mikromacierzy uzyskanych w różnych badaniach21.

Ocena miRNA w surowicy ma następujące cechy. Po pierwsze, łatwo jest zebrać surowicę, a ponieważ miRNA surowicy są odporne na zamarzanie i rozmrażanie, temperaturę i kwas, miRNA mogą być dobrymi biomarkerami. Po drugie, istnieje wysoka homologia miRNA między gatunkami, a wyniki eksperymentów na zwierzętach można łatwo ekstrapolować na ludzi. Po trzecie, miRNA w surowicy wykazały potencjał do wykorzystania jako leki terapeutyczne3. Kilka badań wykazało również, że poziom ekspresji miRNA w narządach jest skorelowany z miRNA w surowicy 22,23,24. W niniejszym badaniu miRNA-223-3p, którego poziomy w nerkach nie wykazały znaczącej różnicy między myszami SAMR1 i SAMP1, nie wykazały również znaczącej różnicy między szczepami w surowicy. Natomiast miRNA-7218-5p i miRNA-7219-5p, których poziomy nerek wykazały istotną różnicę między myszami SAMR1 i SAMP1, wykazały znaczne różnice między szczepami w surowicy.

Ten protokół ma następujące ograniczenia. Po pierwsze, jego przydatność nie została zweryfikowana w innych narządach, takich jak wątroba i płuca, a po drugie, nie została przetestowana na innych zwierzętach laboratoryjnych, takich jak szczury, psy i świnie. Kilka grup badawczych wykorzystało ten protokół do oczyszczania i wykrywania miRNA za pomocą qRT-PCR i poinformowało, że protokół ten umożliwił oczyszczenie wysokiej jakości RNA z tkanek i surowicy 13,14,22,23,24. Wykazano, że metoda ta ma wysoką dokładność i czułość w wykrywaniu ekspresji miRNA 13,14,22,23,24. Wyniki niniejszego badania pokazują, że protokół ten może z powodzeniem wykrywać ekspresję miRNA w surowicy i nerkach myszy. Dlatego protokół może być stosowany do określania profili ekspresji miRNA w surowicy i nerkach u myszy z różnymi patologiami. Ze względu na prostotę protokołu, jednocześnie można przetwarzać dużą liczbę próbek. Analizy ekspresji wielu miRNA w różnych stanach patologicznych nerki mogą zatem wykorzystywać opisany w niniejszym dokumencie protokół.

Istnieją pewne aspekty protokołu, o których należy pamiętać. Aby uniknąć degradacji oczyszczonych miRNA, która nastąpiłaby w temperaturze pokojowej, miRNA muszą być przechowywane na lodzie. Próbki nerek muszą być homogenizowane aż do całkowitego rozpuszczenia w odczynniku do lizy. Nerka myszy zawiera znaczną ilość tkanki łącznej, która jest nierozpuszczalna w odczynniku do lizy, a zatem do dalszej homogenizacji wymagany jest rozdrabniacz kolumnowy. Ponadto odpowiednie endogenne kontrolne miRNA (o stabilnej ekspresji wśród próbek) powinno być walidowane przez cały czas trwania eksperymentu qRT-PCR. Dzieje się tak, ponieważ interferencja różnych substancji podczas wykonywania tego protokołu może zmienić poziomy ekspresji endogennych kontrolnych miRNA, co może pogorszyć wyniki. Podsumowując, w artykule opisano protokół qRT-PCR do wykrywania, oczyszczania i oceny ekspresji miRNA w surowicy i nerkach myszy z zależną od wieku niewydolnością nerek.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie pozostają w konflikcie interesów.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1,0 ml szpica z heparynąGreiner-bio-one450534
Buffer RPE (bufor płuczący #2 zawierający guanidynę i etanol w stosunku 1:4)Qiagen79216Bufor płuczący 2
Bufor RWT (bufor płuczący #1 zawierający guanidynę i etanol w stosunku 1:2)Qiagen1067933Bufor do płukania 1
MicroAmp Optyczna 96-dołkowa płytka reakcyjna do qRT-PCRThermo Fisher Scientific431681396-dołkowa płytka reakcyjna
Optyczna folia samoprzylepna MicroAmpThermo Fisher Scientific4311971Folia samoprzylepna do 96-dołkowej płytki reakcyjnej
miRNA-223-3p starterQiagenMS000038715'-CGUGUAUUUGACAAGCUGAGU
G-3'miRNA-423-5p
PrimerQiagenMS000120055'-UGAGGGGCAGAGAGCGAGACU
UU-3'
Starter miRNA-7218-5pQiagenMS000680675'-UGCAGGGUUUAGUGUAGAGGG
-
starterQiagenMS000680815'-UGUGUUAGAGCUCAGGGUUGA
GA-3'miRNeasy
Mini kitQiagen217004Kolumna wirowa zakotwiczona w membranie w probówce zbiorczej o pojemności 2,0 ml
miRNeasy Zestaw Serum/PlasmaQiagen217184Kolumna wirowa zakotwiczona w membranie w probówce zbiorczej o pojemności 2,0 ml
Zestaw miScript II RT (bufor do odwrotnej transkrypcji)Qiagen218161Zestaw do odwrotnej transkryptazy
miScript SYBR Zielony zestaw do PCRQiagen218073Zestaw do PCR na bazie zielonego barwnika
NiszczarkaQIA Qiagen79654Biopolimerowe kolumny wirowe w probówce zbiorczej o pojemności 2,0 ml
Odczynnik do lizy QIAzol (liza na bazie fenolu/guanidyny odczynnik)Qiagen79306Odczynnik do lizy na bazie fenolu/guanidyny
QuantStudio 12K Flex System Real-Time PCR ThermoFisher Scientific4472380Narzędzie do PCR w czasie rzeczywistym
QuantStudio 12K Flex w wersji oprogramowania 1.2.1.Thermo Fisher Scientific 4472380Oprogramowanie instrumentu do PCR w czasie rzeczywistym
Woda wolna od RNazQiagen129112
RNU6-2 starterQiagenMS00033740Nieujawnione ze względu na poufność
Myszy męskie SAMP1Nippon SLC CorporationNie przypisano
Samce myszySamr1 Nippon SLC CorporationNie przypisano
Standard biomasy TakaraTakara Bio9790BHomogenizator krzemu
3'miRNA-7219-5p

Bibliografia

  1. Huang, Y. The novel regulatory role of lncRNA-miRNA-mRNA axis in cardiovascular diseases. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 22 (12), 5768-5775 (2018).
  2. Yang, C., Dou, R., Yin, T., Ding, J. MiRNA-106b-5p in human cancers: diverse functions and promising biomarker. Biomedicine and Pharmacotherapy. 127, 110211(2020).
  3. Lu, T. X., Rothenberg, M. E. MicroRNA. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 141 (4), 1202-1207 (2018).
  4. McGuire, A., Brown, J. A., Kerin, M. J. Metastatic breast cancer: the potential of miRNA for diagnosis and treatment monitoring. Cancer and Metastasis Reviews. 34 (1), 145-155 (2015).
  5. Bjorkman, S., Taylor, H. S. MicroRNAs in endometriosis: biological function and emerging biomarker candidates. Biology of Reproduction. 100 (5), 1135-1146 (2019).
  6. Zhou, C. X., et al. miRNA and circRNA expression patterns in mouse brain during toxoplasmosis development. BMC Genomics. 21 (1), 46(2020).
  7. Jing, R., Zhong, Q. Q., Long, T. Y., Pan, W., Qian, Z. X. Downregulated miRNA-26a-5p induces the apoptosis of endothelial cells in coronary heart disease by inhibiting PI3K/AKT pathway. European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 23 (11), 4940-4947 (2019).
  8. Xie, W., et al. miR-34b-5p inhibition attenuates lung inflammation and apoptosis in an LPS-induced acute lung injury mouse model by targeting progranulin. Journal of Cellular Physiology. 233 (9), 6615-6631 (2018).
  9. Bala, S., et al. Circulating microRNAs in exosomes indicate hepatocyte injury and inflammation in alcoholic, drug-induced, and inflammatory liver diseases. Hepatology. 56 (5), 1946-1957 (2012).
  10. Ishii, H., et al. MicroRNA expression profiling in diabetic kidney disease. Translational Research. 237, 31-52 (2021).
  11. Latorre Luque, J. Relevance of the epigenetic regulation exercised by hepatic microRNAs in the fatty liver arena: from the bedside to the bench. , Available from: http://hdl.handle.net/10803/671499 (2019).
  12. Mastropasqua, R., et al. Serum microRNA levels in diabetes mellitus. Diagnostics (Basel). 11 (2), 284(2021).
  13. Gordanpour, A., Nam, R. K., Sugar, L., Bacopulos, S., Seth, A. MicroRNA detection in prostate tumors by quantitative real-time PCR (qPCR). Journal of Visualized Experiments: JoVE. (63), e3874(2012).
  14. Ahn, J. H., Kwak, J., Lee, J. H., Lee, S. S. Efficient and accurate analysis of microRNA using a specific extension sequence. Molecular Biology Reports. 45 (4), 611-619 (2018).
  15. Denic, A., Glassock, R. J., Rule, A. D. Structural and functional changes With the aging kidney. Advances in Chronic Kidney Disease. 23 (1), 19-28 (2016).
  16. Weinstein, J. R., Anderson, S. The aging kidney: physiological changes. Advances in Chronic Kidney Disease. 17 (4), 302-307 (2010).
  17. Bustin, S. A., et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clinical Chemistry. 55 (4), 611-622 (2009).
  18. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  19. Rajeevan, M. S., Vernon, S. D., Taysavang, N., Unger, E. R. Validation of array-based gene expression profiles by real-time (kinetic) RT-PCR. The Journal of Molecular Diagnostics. 3 (1), 26-31 (2001).
  20. Chen, Y., Gelfond, J. A., McManus, L. M., Shireman, P. K. Reproducibility of quantitative RT-PCR array in miRNA expression profiling and comparison with microarray analysis. BMC Genomics. 10, 407(2009).
  21. Dallas, P. B., et al. Gene expression levels assessed by oligonucleotide microarray analysis and quantitative real-time RT-PCR -- how well do they correlate. BMC Genomics. 6, 59(2005).
  22. Petriella, D., et al. miRNA profiling in serum and tissue samples to assess noninvasive biomarkers for NSCLC clinical outcome. Tumour Biology. 37 (4), 5503-5513 (2016).
  23. Skrzypa, M., et al. miRNA-146a-5p is upregulated in serum and cartilage samples of patients with osteoarthritis. Polski Przeglad Chirurgiczny. 91 (3), 1-5 (2019).
  24. Farzanehpour, M., et al. Serum and tissue miRNAs: potential biomarkers for the diagnosis of cervical cancer. Journal of Virology Journal. 16 (1), 116(2019).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Ilo ciowa PCR w czasie rzeczywistymmikroRNA w surowicy i nerkachekstrakcja RNAodwrotna transkrypcjadetekcja SYBR Greenmetoda por wnawczego CTnerka myszyprzygotowanie pr bek surowicy
Ilościowa ocena reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym ekspresji mikroRNA w nerkach i surowicy myszy z zależną od wieku niewydolnością nerek
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.