Artykuł metodologiczny

Oczyszczanie endogennych kanałów potencjału przejściowego receptora Drosophila

DOI:

10.3791/63260

⸱

28 grudnia 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Shenzhen Key Laboratory for Neuronal Structural Biology, Biomedical Research Institute, Shenzhen Peking University-The Hong Kong University of Science and Technology Medical Center

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Na podstawie mechanizmu składania kompleksu białkowego INAD, w tym protokole, zmodyfikowano strategię oczyszczania powinowactwa i konkurencji w celu oczyszczenia endogennego kanału TRP Drosophila.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fototransdukcja Drosophila jest jednym z najszybszych znanych szlaków sygnałowych sprzężonych z białkiem G. Aby zapewnić specyficzność i skuteczność tej kaskady, przepuszczalny dla wapnia (Ca2 +) kanał kationowy, przejściowy potencjał receptorowy (TRP), ściśle wiąże się z białkiem rusztowania, inaktywacją bez potencjału wtórnego D (INAD) i tworzy duży kompleks białek sygnałowych ze specyficzną dla oka kinazą białkową C (ePKC) i fosfolipazą Cβ/No potencjał receptora A (PLCβ/NORPA). Jednak właściwości biochemiczne kanału TRP Drosophila pozostają niejasne. W oparciu o mechanizm składania kompleksu białkowego INAD opracowano zmodyfikowaną strategię oczyszczania powinowactwa i konkurencji w celu oczyszczenia endogennego kanału TRP. Po pierwsze, oczyszczony fragment NORPA 863-1095 znakowany histydyną (His) został związany z kulkami Ni i użyty jako przynęta do ściągania endogennego kompleksu białkowego INAD z homogenatów głowy Drosophila. Następnie, nadmiernie oczyszczony fragment TRP 1261-1275 oznaczony s-transferazą glutationową (GST) został dodany do kulek Ni, aby konkurować z kanałem TRP. Wreszcie, kanał TRP w supernatancie został oddzielony od nadmiaru peptydu TRP 1261-1275 za pomocą chromatografii wykluczającej rozmiar. Metoda ta umożliwia zbadanie mechanizmu bramkowania kanału TRP Drosophila zarówno pod kątem biochemicznym, jak i strukturalnym. W przyszłości można również zmierzyć właściwości elektrofizjologiczne oczyszczonych kanałów TRP Drosophila.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fototransdukcja to proces, w którym pochłonięte fotony są przekształcane w kody elektryczne neuronów. Przekazuje wyłącznie opsyny i następującą po nich kaskadę sygnalizacyjną sprzężoną z białkiem G zarówno u kręgowców, jak i bezkręgowców. U Drosophila, wykorzystując swoje pięć domen PDZ, inaktywacja białka rusztowania bez dodatkowego potencjału D (INAD) organizuje supramolekularny kompleks sygnalizacyjny, który składa się z kanału przejściowego potencjału receptorowego (TRP), fosfolipazy Cβ/No potencjału receptora A (PLCβ/NORPA) i specyficznej dla oka kinazy białkowej C (ePKC)1. Powstanie tego supramolekularnego kompleksu sygnalizacyjnego gwarantuje prawidłową lokalizację subkomórkową, wysoką wydajność i specyficzność maszynerii fototransdukcji Drosophila. W tym kompleksie światłoczułe kanały TRP działają jako efektory dolne do NORPA i pośredniczą w napływie wapnia i depolaryzacji fotoreceptorów. Wcześniejsze badania wykazały, że w otwarciu kanału TRP Drosophila pośredniczą protony, zakłócenie lokalnego środowiska lipidowego lub siła mechaniczna2,3,4. Kanał TRP Drosophila oddziałuje również z kalmoduliną5 i jest modulowany przez wapń zarówno przez pozytywne, jak i ujemne sprzężenie zwrotne6,7,8.

Do tej pory badania elektrofizjologiczne nad mechanizmem bramkowania kanałów TRP i TRP podobnych do TRP (TRPL) opierały się na wyciętych plamach błony, zapisach całych komórek z dysocjowanych fotoreceptorów Drosophila typu dzikiego oraz kanałach o heteroekspresji w komórkach S2, SF9 lub HEK2,9,10,11,12,13, ale nie na oczyszczonych kanałach. Informacje strukturalne kanału TRP Drosophila na całej długości również pozostają niejasne. W celu zbadania właściwości elektrofizjologicznych oczyszczonego białka w odtworzonym środowisku błonowym i uzyskania informacji strukturalnych o pełnej długości kanału TRP Drosophila, uzyskanie oczyszczonych kanałów TRP o pełnej długości jest niezbędnym pierwszym krokiem, podobnym do metodologii stosowanych w badaniach kanałów TRP u ssaków14,15,16,17.

Niedawno, w oparciu o mechanizm składania kompleksu białkowego INAD18,19,20, po raz pierwszy opracowano strategię oczyszczania powinowactwa i konkurencji, aby oczyścić kanał TRP z homogenatów głowy Drosophila za pomocą kulek streptawidyny5. Biorąc pod uwagę niską pojemność i wysoki koszt kulek streptawidyny, wprowadzono tutaj ulepszony protokół oczyszczania, który wykorzystuje białko przynęty znakowane przez Hisa i odpowiadające mu tanie kulki Ni o znacznie większej pojemności. Proponowana metoda pomoże w zbadaniu mechanizmu bramkowania kanału TRP pod kątem strukturalnym oraz w pomiarze właściwości elektrofizjologicznych kanału TRP z oczyszczonymi białkami.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Oczyszczanie fragmentów TRP i NORPA oznaczonych tagiem GST

  1. Oczyść fragment TRP 1261-1275 oznaczony GST
    1. Przekształć plazmid pGEX 4T-1 TRP 1261-1275 class10 w komórki Escherichia coli (E. coli) BL21 (DE3) przy użyciu metody transformacji szoku cieplnego CaCl221. Zaszczepić pojedynczą kolonię w 10 ml pożywki Luria Bertani (LB) i rosnąć przez noc w temperaturze 37 °C. Następnie amplifikować 10 ml kultury siewnej w 1 l pożywki LB w temperaturze 37 °C.
    2. Gdy gęstość optyczna (OD600) komórek osiągnie 0,5, schłodzić komórki do 16 °C i dodać 0,1 mM izopropylo β-D-1-tiogalaktopiranozydu (IPTG; stężenie końcowe) w celu wywołania nadekspresji białka docelowego i inkubować w temperaturze 16 °C przez 18 godzin.
    3. Po nadekspresji, osadzać 1 l hodowanych komórek przez odwirowanie przy 3,993 × g przez 20 minut i ponownie zawiesić w 40 ml buforowanego fosforanem buforu soli fizjologicznej (PBS).
    4. Załadować zawieszone komórki do homogenizatora wysokociśnieniowego wstępnie schłodzonego w temperaturze 4 °C. Powoli zwiększać ciśnienie homogenizatora do 800 barów. Otwórz kran wlotowy i pozwól zawieszonym komórkom przejść okrężnie przez zawór z bardzo wąskimi szczelinami.
      UWAGA: Ogniwa są homogenizowane przez duże siły ścinające spowodowane dużym spadkiem ciśnienia i kawitacją.
    5. Załaduj 5 ml kulek glutationu do kolumny przepływu grawitacyjnego i przemyj kulki 50 ml buforu PBS w sumie trzy razy.
    6. Odwirować lizat komórkowy z homogenizatora wysokociśnieniowego przy 48,384 x g. Dodać supernatant z odwirowanego lizatu komórkowego (40 ml) do zrównoważonych kulek glutationu w kolumnie grawitacyjnej i inkubować przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Zawiesić kulki glutationu co 10 minut.
    7. Po 30 minutach inkubacji otwórz kurek wylotowy kolumny, aby oddzielić kulki i frakcję przepływową. Odrzuć frakcję przepływową. Pozostałe kulki glutationu przepłukać dwukrotnie 50 ml buforu PBS.
    8. Dodać 15 ml buforu elucyjnego do kulek glutationu i inkubować przez 30 minut. Ponownie zawiesić kulki co 10 minut.
    9. Po 30 minutach inkubacji eluować fragment TRP 1261-1275 oznaczony GST w stożkowej probówce o pojemności 50 ml i załadować do kolumny wykluczającej wielkość (stopień przygotowania), która jest równoważona przy użyciu buforu 50 mM Tris (pH 7,5, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT).
    10. Utrzymuj natężenie przepływu elucji w kolumnie wykluczającej wielkość na poziomie 3 ml/min. Zebrać eluowane białka z szybkością 5 ml / probówkę.
    11. Zidentyfikować pik białka docelowego w kolumnie wykluczającej rozmiar, analizując sygnały absorpcyjne UV przy 280 nm i zweryfikować za pomocą analizy żelu SDS-PAGE (parametry elektroforezy: 150 V dla żelu do układania; 200 V dla żelu rozdzielczego). Żel zabarwić kolorem Coomassie blue R250.
    12. Zagęścić oczyszczony fragment TRP 1261-1275 oznaczony GST z kolumny wykluczającej wielkość do 1 ml za pomocą 15 ml ultrafiltracyjnej kolumny wirowej odwirowanej przy 3 000 x g w temperaturze 4 °C w wirówce z chłodzeniem biurkowym.
    13. Określ stężenie skoncentrowanego białka za pomocą prawa Beera-Lamberta. Zmierz absorpcję promieniowania UV fragmentu TRP 1261-1275 oznaczonego GST przy długości fali 280 nm za pomocą spektrofotometru.
    14. Uzyskaj współczynnik ekstynkcji przy 280 nm, importując sekwencje białek do programu Protparam (https://web.expasy.org/protparam/). Zazwyczaj 1 l kultury TRP 1261-1275 oznaczonego GST daje 1 ml 600 μM białka (6 x 10-7 mol). Patrz Tabela 1, aby zapoznać się z potrzebnymi materiałami.
  2. Oczyszczenie oznaczonego przez niego fragmentu NORPA 863-1095
    1. Przekształć plazmid20 plazmidu pETM.3C NORPA 863-1095 w komórki E. coli BL21 (DE3) za pomocą metody transformacji szoku cieplnego CaCl221. Zaszczepić pojedynczą kolonię w 10 ml pożywki LB i rosnąć przez noc w temperaturze 37 °C. Następnie amplifikować 10 ml kultury siewnej w 1 l pożywki LB w temperaturze 37 °C.
    2. Gdy OD600 komórek osiągnie 0,5, schłodzić komórki do 16 °C i dodać 0,1 mM IPTG (stężenie końcowe) w celu wywołania nadekspresji białka docelowego i inkubować w temperaturze 16 °C przez 18 godzin.
    3. Po nadekspresji, osadzać 1 l hodowanych komórek przez odwirowanie przy 3,993 x g przez 20 minut i ponownie zawiesić w 40 ml buforu wiążącego. Następnie poddać lizie zawieszone komórki w homogenizatorze wysokociśnieniowym w temperaturze 4 °C, jak opisano w kroku 1.1.4.
    4. Załaduj 5 ml kulek niklu do kolumny przepływu grawitacyjnego i przemyj trzykrotnie 50 ml buforu wiążącego.
    5. Odwirować lizat komórkowy z homogenizatora wysokociśnieniowego przy 48,384 x g. Dodać supernatant z odwirowanego lizatu komórkowego do zrównoważonych kulek niklu w kolumnie grawitacyjnej i inkubować przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Zawiesić kulki niklu co 10 minut.
    6. Po 30 minutach inkubacji otwórz kurek wylotowy kolumny, aby oddzielić kulki i frakcję przepływową. Odrzucić frakcję przepływową i dwukrotnie przepłukać pozostałe kulki niklu 50 ml buforu do mycia.
    7. Dodać 15 ml buforu elucyjnego do kulek niklu i inkubować przez 30 minut. Ponownie zawiesić kulki niklu co 10 minut.
    8. Po 30 minutach inkubacji zebrać wymyty fragment NORPA 863-1095 znakowany Hisem w stożkowej probówce o pojemności 50 ml i załadować do kolumny wykluczającej wielkość (stopień przygotowania), która jest równoważona przy użyciu 50 mM Tris (pH 7,5, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT).
    9. Utrzymuj natężenie przepływu elucji w kolumnie wykluczającej wielkość na poziomie 3 ml/min. Zebrać eluowane białko z szybkością 5 ml / probówkę.
    10. Zidentyfikować pik białka docelowego w kolumnie wykluczającej rozmiar, analizując sygnały absorpcyjne UV przy 280 nm i zweryfikować za pomocą analizy żelu SDS-PAGE (parametry elektroforezy: 150 V dla żelu do układania; 200 V dla żelu rozdzielczego). Odbarwić żel za pomocą Coomassie blue R250.
    11. Zagęścić oczyszczony fragment NORPA 863-1095 oznaczony znakiem His z kolumny wykluczającej wielkość do 1 ml za pomocą 15 ml ultrafiltracyjnej kolumny wirowej odwirowanej przy 3 000 x g w temperaturze 4 °C w wirówce z chłodzeniem biurkowym.
    12. Określ stężenie skoncentrowanego białka za pomocą prawa Beera-Lamberta. Zmierz absorpcję promieniowania UV fragmentu NORPA 863-1095 oznaczonego przez Hisa przy długości fali 280 nm za pomocą spektrofotometru.
    13. Uzyskaj współczynnik ekstynkcji przy 280 nm, importując sekwencje białek do programu Protparam (https://web.expasy.org/protparam/). Zazwyczaj 1 l kultury znakowanego przez Hisa fragmentu NORPA 863-1095 daje 1 ml 600 μM białka (6 x 10-7 mol). Patrz Tabela 2, aby zapoznać się z potrzebnymi materiałami.

2. Przygotowanie głów Drosophila

  1. Dorosłe muchy należy zebrać do stożkowych probówek wirujących o pojemności 50 ml przy użyciu metody znieczulaniaCO2 22,23; natychmiast zamrozić w ciekłym azocie na 10 minut i przechowywać w zamrażarce o temperaturze -80°C.
  2. Po zebraniu wystarczającej liczby much energicznie potrząśnij ręcznie zamrożonymi stożkowymi probówkami o pojemności 50 ml, aby oddzielić nogi, głowy, skrzydła i ciała much. Przenieś mieszaninę na trzy kolejno ułożone w stosy, wstępnie schłodzone sita ze stali nierdzewnej (odpowiednio rozmiar oczek 20/30/40) i potrząśnij sitami.
  3. Następnie, ponieważ głowice nie mogą przejść przez sito o oczkach 40, należy użyć szczotki, aby zmieść głowice muchowe z sita o oczkach 40, przenieść je do probówek stożkowych o pojemności 50 ml i przechowywać w temperaturze -80 °C.
  4. Ciągle zbieraj muchy i ich głowy i przechowuj je w zamrażarce o temperaturze -80 °C, aż osiągną wymaganą ilość potrzebną do eksperymentów (0,5 g). Zazwyczaj, aby zebrać 0,5 g głów, potrzeba 35 ml much w stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Patrz Tabela 3, aby zapoznać się z potrzebnymi materiałami.

3. Oczyszczanie kanału TRP Drosophila

  1. Zważyć łącznie 0,5 g główek i całkowicie zhomogenizować w ciekłym azocie za pomocą wstępnie schłodzonego tłuczka moździerzowego. Rozpuścić homogenizowane głowice w 10 x v/w buforze do lizy (5 ml), inkubować w wytrząsarce w temperaturze 4 °C przez 20 minut, a następnie odwirować w temperaturze 20,817 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C.
  2. Zebrać supernatant z odwirowaniem ("20817 g S", Rysunek 4) i dalej odwirować go przy 100 000 x g przez 60 minut w temperaturze 4 °C. Użyć supernatantu z odwirowaniem ("100 000 g S", Rysunek 4) do następnego testu pull-down.
  3. Dodać 1 ml kulek niklu do kolumny przepływu grawitacyjnego i przemyć kulki 10 ml podwójnie destylowanegoH2O(ddH2O) w temperaturze 4 °C, w sumie trzykrotnie. Zrównoważyć kulki trzykrotnie w 10 objętościach kolumny buforu do lizy w temperaturze 4 °C.
  4. Dodać 500 μl oczyszczonego białka NORPA 863-1095 znakowanego Hisem (3 x 10-7 mol) o stężeniu 600 μM do kolumny niklu i inkubować przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Zawiesić kulki co 10 minut.
  5. Otwórz kran wylotowy kolumny, aby oddzielić kulki i frakcję przepływową. Weźmy frakcję przepływową do analizy SDS-PAGE (NORPA F, Rysunek 4). W tej sekcji białka przynęty są unieruchomione na kulkach Ni.
  6. Przemyć kulki niklu 10 objętościami kolumny buforu do lizy (10 ml) w temperaturze 4 °C i zachować frakcję płuczącą do analizy SDS-PAGE (Wash 1, Rysunek 4A). Powtórz powyższe kroki i zachowaj próbkę do analizy SDS-PAGE (Wash 2, Rysunek 4A). W tej sekcji usuwane są nadmierne białka przynęty na kulkach Ni.
  7. Dodać supernatant homogenatu głowy Drosophila po odwirowaniu 100 000 x g do kolumny niklu w temperaturze 4 °C, gdzie unieruchomiony został fragment NORPA 863-1095 oznaczony przez Hisa.
  8. Inkubować supernatant z kulkami niklu w temperaturze 4 °C przez 30 minut. Ponownie zawiesić kulki co 10 minut. Następnie otwórz kran wylotowy kolumny, aby oddzielić kulki i frakcję przepływową.
  9. Zebrać supernatant do analizy SDS-PAGE (Dro head lysis F, Rysunek 4A). W tej sekcji kompleksy białkowe INAD (INAD/TRP/EPKC) w homogenatach głowy są wychwytywane przez unieruchomione fragmenty NORPA 863-1095 na kulkach Ni.
  10. Przemyć kulki niklu 10 objętościami kolumny buforu do lizy (10 ml) w temperaturze 4 °C i chronić supernatant przed wytrącaniem grawitacyjnym do analizy SDS-PAGE (Wash 3, Rysunek 4A). Powtórz powyższe kroki i zbierz supernatant do analizy SDS-PAGE (Wash 4, Rysunek 4A). W tej sekcji niezwiązane białka na kulkach Ni są usuwane.
  11. Dodać 500 μl z 600 μM białka TRP 1261-1275 znakowanego GST (3 x 10-7 mol) do kulek niklu i inkubować przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Ponownie zawiesić kulki co 10 minut.
  12. Zbierz eluowaną frakcję z kolumny grawitacyjnej (TRP E1, Rysunek 4B), która zawiera endogenny kanał TRP Drosophila. Powtórz powyższe kroki i zbierz frakcję elucyjną (TRP E2, Rysunek 4B). W tym etapie, używając fragmentów TRP 1261-1275 oznaczonych GST jako konkurenta, kanały TRP są eluowane z przechwyconych kompleksów białkowych INAD (INAD/TRP/EPKC) na kulkach Ni.
  13. Przemyć kulki niklowe 10 objętościami kolumny buforu wiążącego (10 ml; Tabela 1) w temperaturze 4 °C i zebrać frakcję płuczącą do analizy SDS-PAGE (Wash 5, Rysunek 4B).
  14. Dodać 500 μl buforu elucyjnego (Tabela 1) do kulek niklu i inkubować przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Zebrać frakcję elucyjną z kolumny przepływu grawitacyjnego (NORPA E1, Rysunek 4B). Powtórz powyższe kroki i zbierz frakcję elucyjną (NORPA E2, Rysunek 4B).
  15. Za pomocą buforu elucyjnego eluować znakowany Hisem fragment NORPA 863-1095 w towarzystwie kompleksów białkowych INAD/ePKC. Następnie ponownie zawieś kulki niklowe w 500 μl buforu wiążącego.
  16. Weź ponownie zawieszone kulki Ni, aby uruchomić SDS-PAGE (barwiony na niebiesko Coomassie R250), aby przeanalizować wydajność elucji i ocenić, czy bufor elucji działa (koraliki, Rysunek 4B). Patrz Tabela 4, aby zapoznać się z potrzebnymi materiałami.

4. Oczyszczanie kanału TRP Drosophila w kolumnie wykluczającej rozmiar

  1. Zainstalować kolumnę wykluczającą wielkość (klasa analityczna) w systemie oczyszczania białek. Zrównoważyć kolumnę z buforem kolumny (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 2 mM DTT, 0,75 mM DDM), który jest filtrowany przez filtr 0,45 μm.
  2. Zagęścić frakcję TRP E1 i E2 z kroku 3.14 za pomocą 4 ml ultrafiltracyjnej kolumny wirowej, odwirowanej przy 3 000 x g w temperaturze 4 °C w wirówce z chłodzeniem.
  3. Przepłukać pętlę próbki za pomocą buforu kolumny i załadować próbkę do pętli próbki. Wstrzyknąć próbkę do kolumny wykluczającej wielkość i wymyć białka z odpowiednią szybkością przepływu (0,5 ml/min).
  4. Zidentyfikuj pik białka docelowego przez absorpcję przy 280 nm i uruchom żel SDS-PAGE w celu wykrycia oczyszczonego endogennego kanału TRP Drosophila (Rysunek 5). Patrz Tabela 5, aby zapoznać się z potrzebnymi materiałami.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym artykule zademonstrowano metodę oczyszczania białek w celu oczyszczenia endogennego kanału TRP Drosophila (Rysunek 1).

Po pierwsze, stosuje się rekombinowaną ekspresję i oczyszczanie białek w celu uzyskania przynęty i białek konkurencyjnych. Następnie oznaczony GST fragment TRP 1261-1275 ulega ekspresji w komórkach E. coli BL21 (DE3) w pożywce LB i oczyszcza za pomocą kulek glutationu i kolumny wykluczającej rozmiar (Rysun...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

INAD, który zawiera pięć domen PDZ, jest głównym organizatorem maszynerii fototransdukcji Drosophila. Wcześniejsze badania wykazały, że INAD PDZ3 wiąże się z C-końcowym ogonem kanału TRP z wyjątkową specyficznością (K, D = 0,3 μM)18. Tandem INAD PDZ45 oddziałuje z fragmentem NORPA 863-1095 o wyjątkowo wysokim powinowactwie wiązania (KD = 30 nM). Odkrycia te stanowią solidną podstawę biochemiczną do zaprojektowania strategii oczyszczania powinowactwa i konkurencji, kt...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (nr 31870746), Shenzhen Basic Research Grants (JCYJ20200109140414636) oraz Fundację Nauk Przyrodniczych prowincji Guangdong, Chiny (nr 2021A1515010796) dla W. L. Dziękujemy LetPub (www.letpub.com) za pomoc językową podczas przygotowywania tego manuskryptu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Szczepy bakteryjne
BL21(DE3) Kompetentne komórkiNovagen69450Nadekspresja białka
Modele eksperymentalne
D.melanogaster: szczep W1118Bloomington Drosophila Stock CenterBDSC:3605Drosophila < / em> przygotowanie głowy
< mocny>Materiał< / mocny>
siatki ze stali nierdzewnej 20/30/40 siatkafirmy JiufengGB / T6003.1Drosophila < / em> przygotowanie głowy
30% Akrylamid-N,N & prime;-metylenobisakryloamid (29:1)LableadA3291SDS-PAGE preparat żelowy
Nadsiarczan amonuInvitrogenHC2005SDS-PAGE
Inhibitor proteazy koktajlowejRoche05892953001Inhibitor proteazy
Coomassie błękit brylantowy R-250Sangon BiotechA100472-0025Barwienie żelem SDS-PAGE
DL-Dithiothreitol (DTT)Sangon BiotechA620058-0100Przygotowanie
buforu kolumny wykluczającej rozmiarSól disodowa kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA)Sangon BiotechA500838-0500Przygotowanie buforu kolumny wykluczającej wielkość
GlicynaSangon BiotechA610235-0005Preparat buforowy SDS-PAGE
Glutation Sepharose 4 kulki Fast FlowCytiva17513202Chromatografia powinowactwa
ImidazolSangon BiotechA500529-0001Bufor elucyjny preparat do kolumny Ni
izopropylo-beta-D-tiogalaktopiranozydu (IPTG)Sangon BiotechA600168-0025Indukcja nadekspresji białek
LB Bulion w proszkuSangon BiotechA507002-0250E.coli. kultura komórkowa
zredukowana L-glutationem (GSH)Sigma-aldrichG4251-100GBufor elucyjny preparat do kulek
glutationuKoraliki Ni-Sepharose excelCytiva17371202Chromatografia powinowactwa
N-dodecyl beta-D-maltozyd (DDM)Sangon BiotechA610424-001Detergent do oczyszczania białek
N,N,N',N'-Tetrametyloetylenodiamina (TEMED)Sigma-aldrichT9281-100MLSDS-PAGE preparat żelowy
PBSSangon BiotechE607008-0500Bufor homogenizacyjny dla komórek E.coli.
PMSFLableadP0754-25GInhibitor proteazy
Wstępnie wybarwiony marker białkowyThermo Scientific26619/26616wybarwiona drabinka białkowa
Kolumna wykluczająca rozmiar (klasa preparatu)Cytiva28989336Kolumna HiLoad 26/60 Superdex 200 PG
Kolumna wykluczająca rozmiar (klasa analityczna)Cytiva29091596Kolumna Superose 6 Increase 10/300 GL
Chlorek soduSangon BiotechA501218-0001Preparat buforowy do oczyszczania białek
Dodecylosiarczan sodu (SDS)Sangon BiotechA500228-0001SDS-PAGE preparat żelowy/buforowy
Tris baseSigma-aldrichT1503-10KGPreparat buforowy do oczyszczania białek
Ultrafiltracja spinowa kolumnaMilliporeUFC901096/801096Stężenie białka
Sprzęt
Waga analitycznaDENVERAPX-60Metage of Drosophila head
Biurkowa wirówka z chłodzeniem o dużej prędkości do stożkowych probówek wirowych 15 ml i 50 mlEppendorf5810RStężenie białka
Biurkowa wirówka z chłodzeniem o dużej prędkości 1,5 ml Probówki wirówkoweEppendorf5417RWirowanie lizatu głowy Drosophila po homogenizacji
Pusta kolumna przepływu grawitacyjnego (średnica wewnętrzna = 1,0 cm)Bio-Rad738-0015Oczyszczanie białka TRP
Pusta kolumna przepływu grawitacyjnego (średnica wewnętrzna = 2,5 cm)Bio-Rad738-0017Oczyszczanie przynęty i białka konkurencji z E.coli.
Gel SystemDokumentacja Bio-RadUniversal Hood II Gel Doc XR System ObrazowanieSDS-PAGE
Szybkoobrotowa wirówka z chłodzeniemRedlica BeckmanAvanti J-26 XPWirowanie komórek E.coli. komórek/lizatu komórkowego
Homogenizator wysokociśnieniowyUNION-BIOTECHUH-05Homogenizacja komórek E.coli.
Zbiornik ciekłego azotuTaylor-WhartonCX-100Drosophila head preparat
System oczyszczania białekCytivaAKTAOczyszczacz białka
Lodówka (-80° C)Thermo900GPem>Drosophila head Przygotowanie
spektrofotometruMAPADAUV-1200OD600 pomiar komórek E.coli.
SpektrofotometrThermo ScientificNanoDrop 2000cOznaczanie stężenia białka
UltrawirówkaBeckman CoulterOptima XPN-100 UltrawirówkaUltrawirowanie
metalowa Preparat żelowy Wstępnie <

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tsunoda, S., et al. A multivalent PDZ-domain protein assembles signalling complexes in a G-protein-coupled cascade. Nature. 388 (6639), 243-249 (1997).
  2. Huang, J., et al. Activation of TRP channels by protons and phosphoinositide depletion in Drosophila photoreceptors. Current Biology: CB. 20 (3), 189-197 (2010).
  3. Chyb, S., Raghu, P., Hardie, R. C. Polyunsaturated fatty acids activate the Drosophila light-sensitive channels TRP and TRPL. Nature. 397 (6716), 255-259 (1999).
  4. Hardie, R. C., Franze, K. Photomechanical responses in Drosophila photoreceptors. Science. 338 (6104), 260-263 (2012).
  5. Chen, W., et al. Calmodulin binds to Drosophila TRP with an unexpected mode. Structure. 29 (4), 330-344 (2021).
  6. Hardie, R. C. Effects of intracellular Ca2+ chelation on the light response in Drosophila photoreceptors. Journal of Comparative Physiology. A, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 177 (6), 707-721 (1995).
  7. Scott, K., Sun, Y., Beckingham, K., Zuker, C. S. Calmodulin regulation of Drosophila light-activated channels and receptor function mediates termination of the light response in vivo. Cell. 91 (3), 375-383 (1997).
  8. Hardie, R. C., Minke, B. Phosphoinositide-mediated phototransduction in Drosophila photoreceptors: the role of Ca2+ and trp. Cell Calcium. 18 (4), 256-274 (1995).
  9. Delgado, R., et al. Light-induced opening of the TRP channel in isolated membrane patches excised from photosensitive microvilli from Drosophila photoreceptors. Neuroscience. 396, 66-72 (2019).
  10. Lev, S., Katz, B., Minke, B. The activity of the TRP-like channel depends on its expression system. Channels (Austin). 6 (2), 86-93 (2012).
  11. Hardie, R. C., Raghu, P. Activation of heterologously expressed Drosophila TRPL channels: Ca2+ is not required and InsP3 is not sufficient. Cell Calcium. 24 (3), 153-163 (1998).
  12. Gutorov, R., et al. Modulation of transient receptor potential C channel activity by cholesterol. Frontiers in Pharmacology. 10, 1487(2019).
  13. Yagodin, S., et al. Thapsigargin and receptor-mediated activation of Drosophila TRPL channels stably expressed in a Drosophila S2 cell line. Cell Calcium. 23 (4), 219-228 (1998).
  14. Guo, W., Chen, L. Recent progress in structural studies on canonical TRP ion channels. Cell Calcium. 83, 102075(2019).
  15. Li, X., Fine, M. TRP channel: The structural era. Cell Calcium. 87, 102191(2020).
  16. Liao, M., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. Structure of the TRPV1 ion channel determined by electron cryo-microscopy. Nature. 504 (7478), 107-112 (2013).
  17. Cao, E., Liao, M., Cheng, Y., Julius, D. TRPV1 structures in distinct conformations reveal activation mechanisms. Nature. 504 (7478), 113-118 (2013).
  18. Liu, W., et al. The INAD scaffold is a dynamic, redox-regulated modulator of signaling in the Drosophila eye. Cell. 145 (7), 1088-1101 (2011).
  19. Ye, F., Liu, W., Shang, Y., Zhang, M. An exquisitely specific PDZ/target recognition revealed by the structure of INAD PDZ3 in complex with TRP channel. Structure. 24 (3), 383-391 (2016).
  20. Ye, F., et al. An unexpected INAD PDZ tandem-mediated plcβ binding in Drosophila photo receptors. eLife. 7, (2018).
  21. Rahimzadeh, M., Sadeghizadeh, M., Najafi, F., Arab, S., Mobasheri, H. Impact of heat shock step on bacterial transformation efficiency. Molecular Biology Research Communications. 5 (4), 257-261 (2016).
  22. Ashburner, M., Golic, K. G., Hawley, S. Drosophila: A laboratory handbook. Second Edition. 80 (2), The Quarterly Review of Biology. (2005).
  23. Nicolas, G., Sillans, D. Immediate and latent effects of carbon dioxide on insects. Annual Review of Entomology. 34 (1), 97-116 (1989).
  24. Arachea, B. T., et al. Detergent selection for enhanced extraction of membrane proteins. Protein Expression and Purification. 86 (1), 12-20 (2012).
  25. Hellmich, U. A., Gaudet, R. Structural biology of TRP channels. Handbook of Experimental Pharmacology. 223, 963-990 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Kana y TRP Drosophilaoczyszczanie kompleks w bia kowychoczyszczanie powinowactwachromatografia elowakuleczki niklowekuleczki glutationowekompleks bia kowy INADszlak fototransdukcjitechniki krio EM

Powiązane artykuły