Artykuł metodologiczny

Ocena funkcjonalna kinezyny-7 CENP-E w spermatocytach za pomocą inhibicji in vivo, immunofluorescencji i cytometrii przepływowej

DOI:

10.3791/63271

⸱

28 grudnia 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cell Biology and Genetics, The School of Basic Medical Sciences, Fujian Medical University, 2Key Laboratory of Stem Cell Engineering and Regenerative Medicine, Fujian Province University, 3Fujian Obstetrics and Gynecology Hospital, 4Medical Research Center, Fujian Maternity and Child Health Hospital, Affiliated Hospital of Fujian Medical University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten artykuł opisuje in-vivo hamowanie CENP-E poprzez operację jamy brzusznej i wstrzyknięcie do jąder GSK923295, cenny model męskiego podziału mejotycznego. Korzystając z testów immunofluorescencji, cytometrii przepływowej i transmisyjnej mikroskopii elektronowej, pokazujemy, że hamowanie CENP-E powoduje niewspółosiowość chromosomów i niestabilność genomu w spermatocytach myszy.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

U eukariontów mejoza jest niezbędna dla stabilności genomu i różnorodności genetycznej w rozmnażaniu płciowym. Eksperymentalne analizy spermatocytów w jądrach mają kluczowe znaczenie dla badań nad składaniem wrzeciona i segregacją chromosomów w męskim podziale mejotycznym. Spermatocyt myszy jest idealnym modelem do mechanistycznych badań mejozy, jednak brakuje skutecznych metod analizy spermatocytów. W artykule przedstawiono praktyczną i skuteczną metodę hamowania in vivo kinezyny-7 CENP-E w spermatocytach myszy. Przedstawiono szczegółową procedurę wstrzykiwania do jąder specyficznego GSK923295 inhibitora poprzez chirurgię jamy brzusznej u 3-tygodniowych myszy. Ponadto opisano tutaj szereg protokołów pobierania i utrwalania tkanek, barwienia hematoksyliny-eozyny, immunofluorescencji, cytometrii przepływowej i transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Tutaj przedstawiamy model hamowania in vivo poprzez chirurgię jamy brzusznej i wstrzyknięcie jąder, który może być potężną techniką badania męskiej mejozy. Wykazaliśmy również, że hamowanie CENP-E powoduje niewspółosiowość chromosomów i zatrzymanie metafazy w pierwotnych spermatocytach podczas mejozy I. Nasza metoda hamowania in vivo ułatwi mechanistyczne badania mejozy, posłuży jako użyteczna metoda modyfikacji genetycznych męskich linii rozrodczych i rzuci światło na przyszłe zastosowania kliniczne.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mejoza jest jednym z najważniejszych, bardzo sztywnych, ewolucyjnie zachowanych zdarzeń w organizmach eukariotycznych i jest niezbędna dla gametogenezy, rozmnażania płciowego, integralności genomu i różnorodności genetycznej1,2,3. U ssaków komórki rozrodcze przechodzą dwa kolejne podziały komórkowe, mejozę I i II, po jednej rundzie replikacji DNA. W przeciwieństwie do chromatyd siostrzanych w mitozie, zduplikowane chromosomy homologiczne łączą się w pary i segregują na dwie komórki potomne podczas mejozy I4,5. W mejozie II chromatydy siostrzane rozdzielają się i segregują, tworząc haploidalne gamety bez replikacji DNA6. Błędy w którymkolwiek z dwóch podziałów mejotycznych, w tym wady montażu wrzeciona i nieprawidłowa segregacja chromosomów, mogą skutkować utratą gamet, bezpłodnością lub zespołami aneuploidii7,8,9.

Coraz więcej badań wykazało, że motory rodziny kinezyny odgrywają kluczową rolę w regulacji dopasowania i segregacji chromosomów, montażu wrzeciona, cytokinezy i progresji cyklu komórkowego zarówno w komórkach mitotycznych jak i mejotycznych10,11,12. Kinesin-7 CENP-E (białko centromerowe E) jest silnikiem kinetochorowym ukierunkowanym na koniec dodatni, niezbędnym do kongresacji chromosomów, transportu i wyrównania chromosomów oraz regulacji punktu kontrolnego składania wrzeciona w mitozie13,14,15,16,17,18. Podczas mejozy hamowanie CENP-E przez specyficzny inhibitor GSK923295 prowadzi do zatrzymania cyklu komórkowego, niewspółosiowości chromosomów, dezorganizacji wrzeciona i niestabilności genomu w komórkach spermatogennych19. Wzorce lokalizacji i dynamika CENP-E w centromerach dzielących się spermatocytów wskazują, że CENP-E oddziałuje z białkami kinetochoru w celu sekwencyjnego składania centromerów podczas mejozy I20,21. W oocytach CENP-E jest wymagany do wyrównania chromosomów i zakończenia mejozy I13,22,23. Przeciwciała lub wstrzyknięcie morfoliny CENP-E powoduje niewspółosiowość chromosomów, nieprawidłową orientację kinetochoru i zatrzymanie mejozy zarówno u oocytów myszy, jak i Drosophila23. W porównaniu z zasadniczymi rolami CENP-E w mitozie, funkcje i mechanizmy CENP-E w mejozie pozostają w dużej mierze nieznane. Szczegółowe mechanizmy działania CENP-E w kongresacji chromosomów i stabilności genomu w męskich komórkach mejotycznych pozostają do wyjaśnienia.

Spermatogeneza to złożony i długotrwały proces fizjologiczny, obejmujący sekwencyjną proliferację spermatogonii, mejozę i spermiogenezę. W związku z tym cały proces jest niezwykle trudny do odtworzenia in vitro u ssaków i innych gatunków24,25. Niemożliwe jest wywołanie różnicowania spermatocytów po etapie pachytenu in vitro. Badania nad męskimi podziałami mejotycznym były na ogół ograniczone do eksperymentalnych analiz wczesnej profazy mejotycznej25,26. Pomimo wielu przedsięwzięć technologicznych, w tym krótkoterminowej hodowli spermatocytów27,28 i metod hodowli narządów25, istnieje niewiele skutecznych metod badania męskiego podziału mejotycznego. Co więcej, genetyczna delecja podstawowych genów zwykle powoduje zatrzymanie rozwoju i śmiertelność zarodka. Na przykład zarodki myszy pozbawione CENP-E nie zagnieżdżają się i nie mogą rozwinąć się po implantacji29, co jest przeszkodą w badaniach mechanistycznych CENP-E w meji. Podsumowując, ustanowienie praktycznego i wykonalnego systemu badania męskiego podziału mejotycznego może znacznie przyczynić się do rozwoju badań nad mejozą.

Inhibitor przenikający małe komórki jest potężnym narzędziem do badania silników kinezynowych w procesie podziału i rozwoju komórki. Inhibitor allosteryczny, GSK923295, specyficznie wiąże się z domeną motoryczną CENP-E, blokuje uwalnianie ADP (difosforanu adenozyny) i ostatecznie stabilizuje interakcje między CENP-E a mikrotubulami30. W tym badaniu przedstawiono mysi model hamowania in vivo poprzez chirurgię jamy brzusznej i wstrzyknięcie GSK923295 do jąder. Hamowanie CENP-E powoduje niewspółosiowość chromosomów w metafazie I pierwotnych spermatocytów. Ponadto hamowanie CENP-E prowadzi do mejotycznego zatrzymania spermatocytów i zaburzenia spermatogenezy. Opisano szereg protokołów do analiz spermatocytów, które można zastosować do obserwacji mikrotubul wrzeciona mejotycznego, chromosomów homologicznych i organelli subkomórkowych w spermatocytach. Nasza metoda inhibicji in vivo jest skuteczną metodą do badań podziału mejotycznego i spermatogenezy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały sprawdzone i zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania na Uniwersytecie Medycznym Fujian (numer protokołu SYXK 2016-0007). Wszystkie eksperymenty na myszach przeprowadzono zgodnie z odpowiednimi wytycznymi Opieki i Wykorzystania Zwierząt Laboratoryjnych National Institutes of Health (publikacje NIH nr 8023, poprawione w 1978 r.).

1. Budowa modeli myszy hamujących CENP-E za pośrednictwem GSK923295

  1. Sterylizuj narzędzia chirurgiczne w temperaturze 121 °C przez 30 minut. Naświetlaj chirurgiczny ultraczysty stół warsztatowy ultrafioletem C (UVC) przez 2 godziny. Zważ 3-tygodniowe samce myszy ICR (Institute of Cancer Research) używane do eksperymentów i oblicz wymagane dawki środka znieczulającego.
  2. Znieczulenie myszy należy podając kombinację ketaminy (100 mg/kg) i ksylazyny (10 mg/kg) we wstrzyknięciu dootrzewnowym. Sprawdź głębokość znieczulenia myszy poprzez kombinację odruchu rogówkowego myszy, odruchu nocyceptywnego, oddychania, a także napięcia mięśniowego. Upewnij się, że myszy są głęboko znieczulone.
    UWAGA: Umieść zwierzę na poduszce grzewczej, aby zapewnić wsparcie termiczne podczas operacji.
  3. Zwiąż kończyny myszy i przymocuj je do tacki na wosk. Umieść kroplę maści weterynaryjnej na oczach myszy, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia. Ogolić włosy na brzuchu myszy od dolnej części brzucha do moszny za pomocą eksperymentalnej maszynki do golenia dla zwierząt. Zabezpiecz obszar operacyjny sterylną serwetą.
  4. Zdezynfekuj brzuszną część brzucha peelingiem Betadine, a następnie trzykrotnie dodaj 75% etanolu. Otworzyć jamę brzuszną za pomocą sterylnego skalpela i wykonać otwór o średnicy <5 mm.
  5. Zacisnąć skórę sterylnymi klamrami chirurgicznymi i pociągnąć poduszeczkę tłuszczową najądrza sterylnymi kleszczami preparacyjnymi, aby zlokalizować jądra za pomocą sterylnej pęsety. Utrwalić jądro sterylnymi kleszczami pod stereoskopem i powoli wstrzyknąć 10 μl GSK923295 do kanalików nasiennych w końcowym stężeniu 10 μM przy użyciu 10 μL reodyne30. W celu budowy grupy kontrolnej wstrzyknąć 10 μl 1% roztworu DMSO (sultlenek dimetylu)/PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanem).
    UWAGA: Przechowywać roztwór GSK923295 w stężeniu 10 mM w temperaturze -80 °C. Rozpuścić 0,1 μl z 10 mM GSK923295 w 100 μl roztworu PBS, aby przygotować 10 μM roztworu GSK923295
    6. .
  6. Delikatnie wepchnij jądro z powrotem do jamy brzusznej za pomocą sterylnych kleszczy chirurgicznych. Zszyj otrzewną i skórę osobno za pomocą dwóch do czterech szwów za pomocą linii do szycia o średnicy 0,1 mm.
  7. Oznacz miejsce o wymiarach 3 x 3 mm na grzbiecie zwierzęcia markerem permanentnym po operacji jamy brzusznej, umieść mysz z powrotem w klatce do karmienia i zapewnij czyste i wolne od patogenów środowisko z wystarczającą ilością pożywienia i wody.
  8. Utrzymuj środowisko w stanie sterylnym przez przefiltrowane powietrze, sterylizowaną żywność i wodę. Opiekuj się zwierzęciem, dopóki nie odzyska wystarczającej przytomności, aby utrzymać pozycję leżącą mostka. W przypadku analgezji pooperacyjnej dawkę buprenorfiny (0,1 mg/kg) należy podawać podskórnie co 12 godzin przez 3 dni. Upewnij się, że mysz nie zostanie zwrócona do towarzystwa innych zwierząt, dopóki w pełni nie wyzdrowieje.
    UWAGA: Myszom zapewnia się opiekę pooperacyjną i odpowiednio podaje się ranę w znieczuleniu miejscowym przy użyciu 0,5% lidokainy, aby w razie potrzeby zmniejszyć ból pooperacyjny.

2. Barwienie hematoksyliną-eozyną (HE) i histopatologia

  1. Cztery dni po operacji jamy brzusznej należy poddać myszy eutanazji z CO2 przy natężeniu przepływu 2 l/min w komorze CO2. Potwierdź zgon przez zwichnięcie szyjki macicy jako potwierdzającą metodę eutanazji. Użyj nożyczek chirurgicznych, aby otworzyć mosznę i usunąć jądra za pomocą kleszczy. Zbierz jądra myszy 4 dni po GSK923295 wstrzyknięciu i utrwal je w 30 ml 10% roztworu formaldehydu w temperaturze pokojowej przez 12 godzin.
  2. W przypadku dehydratacji gradientowej należy sekwencyjnie inkubować próbkę w 40 ml 70% etanolu przez 1 godzinę, w 40 ml 85% etanolu przez 1 godzinę, w 40 ml 95% etanolu przez 1 godzinę i w 40 ml 100% etanolu przez 1 godzinę.
  3. Inkubować próbkę w 40 ml ksylenu przez 40 minut, a następnie w 40 ml parafiny przez 1 godzinę w temperaturze 65 °C. Umieścić tkanki na dnie pudełka do zatapiania. Dodaj stopioną parafinę do pudełka do zatapiania. Schłodzić tkanki do całkowitego zestalenia w temperaturze 4 °C przez 6 godzin.
  4. Zamocować próbki na uchwycie ultramikrotomu, utrzymać kąt między próbkami a powierzchnią noża na poziomie 5-10° i dostosować grubość plastra do 5 μm. Przygotować skrawki o grubości 5 μm za pomocą ultramikrotomu, rozprowadzić szkiełka w łaźni wodnej o temperaturze 40 °C i wysuszyć skrawki w suszarce do szkiełek przez 12 godzin w temperaturze 37 °C.
  5. Inkubować szkiełka w 200 ml ksylenu przez 40 min, w 200 ml 100% etanolu przez 6 min, w 200 ml 95% etanolu przez 2 min, w 200 ml 90% etanolu przez 2 min, w 200 ml 80% etanolu przez 2 min, a w 200 ml 70% etanolu przez 2 min, a następnie w 200 ml 70% etanolu przez 2 min, odpowiednio.
  6. Opłucz szkiełka w wodzie destylowanej przez 5 minut i zabarwij je roztworem hematoksyliny Mayera przez 6 minut w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Roztwór hematoksyliny Mayera: 0,011 mol/L hematoksyliny, 6,7% bezwodnego etanolu, 0,646 mol/L siarczanu glinowo-potasowego i 0,003 mol/l jodanu sodu.
  7. Opłucz szkiełka pod bieżącą wodą przez 5 minut i inkubuj w wodzie destylowanej przez 2 minuty.
  8. Inkubuj szkiełka w 1% chlorowodorku etanolu przez 3 s, a następnie płucz je pod bieżącą wodą przez 2 minuty.
  9. Próbkę barwić 1% eozyną przez 15 s, a następnie inkubować je z 95% etanolem przez 5 s, ze 100% etanolem przez 2 minuty i w ksylenie przez 40 minut.
  10. Uszczelnić szkiełka za pomocą 15 μl neutralnej gumy i szkiełka nakrywkowego o wymiarach 24 x 50 mm.

3. Immunofluorescencja i mikroskopia konfokalna

  1. Zbierz skrawki parafiny o grubości 5 μm jąder myszy w celu immunofluorescencji. Inkubować szkiełka w ksylenie przez 40 min, w 100% etanolu przez 6 min, w 95% etanolu przez 2 min, w 90% etanolu przez 2 min, w 80% etanolu przez 2 minuty i w 70% etanolu przez 2 min. Płukać szkiełka w wodzie destylowanej przez 5 minut, a następnie płukać szkiełka 0,01 M PBS przez 5 minut.
  2. Umieścić szkiełka w roztworze do pobierania antygenu (0,01 M bufor cytrynianu) i gotować pod wysokim ciśnieniem w szybkowarze przez 4 minuty w celu pobrania antygenu. Schłodzić szkiełka w naturalny sposób do temperatury pokojowej. Płukać wodą destylowaną przez 5 minut dwa razy, a PBS przez 5 min.
    UWAGA: 0,01 M bufor cytrynianowy (pH 6,0): 2,1 mmol/L kwas cytrynowy, 11,6 mmol/L dwuwodny cytrynian trisodowy.
  3. Przepuszczalność komórek poprzez inkubację szkiełek w 500 μl 0,25% TritonX-100/PBS przez 10 minut. Przepłukać szkiełka PBS przez 5 minut trzy razy.
  4. W celu zablokowania antygenu inkubować próbki z 300 μl 3% albuminy surowicy bydlęcej (BSA)/PBST (0,1% Tween-20 w PBS) przez 1 godzinę. Próbki inkubować z pierwszorzędowymi przeciwciałami w 3% BSA/PBST przez 16 godzin w temperaturze 4 °C. Umieścić szkiełka w wilgotnym pudełku, aby zapobiec wysychaniu tkanek. Rozgrzej szkiełka w naturalny sposób do temperatury pokojowej przez 30 minut.
  5. Wyrzucić przeciwciało pierwszorzędowe, a następnie trzykrotnie płukać szkiełka w PBST przez 5 minut. Rozcieńczyć przeciwciała drugorzędowe w 3% BSA/PBST. Inkubować próbki z przeciwciałami drugorzędowymi przez 1-2 godziny w temperaturze 37 °C. Przepłukać próbki w PBST przez 5 minut pięć razy.
  6. Wybarwić jądra 50 μl 4', 6-diamidyno-2-fenyloindolu (DAPI) przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Zamontuj szkiełko nakrywkowe za pomocą środka montażowego zapobiegającego blaknięciu i uszczelnij szkiełko nakrywkowe lakierem do paznokci.
  7. Obserwuj i rejestruj sygnały fluorescencyjne na szkiełkach za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w obiektyw NA 40x/ 0,75.

4. Cytometria przepływowa

  1. Zbierz jądra myszy na 6 cm szalkach Petriego i pokrój jądra na 1 mm3 kawałki za pomocą nożyczek chirurgicznych.
  2. Trawić jądra przy użyciu 1 ml 1% kolagenazy w 1,5 ml probówki wirówkowej przez 10 minut w temperaturze 37 °C, a następnie odwirowywać próbki przy 1 000 x g przez 5 minut w celu wytrącenia komórek plemnikowych.
  3. Odrzucić supernatant, a następnie dodać 1 ml 0,25% roztworu trypsyny-EDTA (kwasu etylenodiaminotetraoctowego) przez 20 minut w temperaturze 37 °C, a następnie odwirować próbki przy 1 000 x g przez 5 minut.
  4. Odrzucić supernatant, a następnie inkubować wytrącone komórki z 1 ml 70% zimnego etanolu przez ponad 8 godzin w temperaturze 4 °C.
  5. Odwirować próbki o masie 1 000 x g przez 5 minut, a następnie zebrać osady komórkowe. Wybarwić komórki spermatogenne roztworem barwiącym 500 μl jodku propidyny (PI) (50 μg/ml PI, 100 μg/ml RNazy A i 0,2% Triton X-100 w PBS) w temperaturze 37 °C przez 30 min.
    UWAGA: Delikatnie potrząsaj probówką wirówkową co 5 minut, aby uniknąć agregacji komórek.
  6. Przefiltrować próbki za pomocą sita o siatku 300 w celu pozbycia się resztek komórek; zebrać komórki w rurze przepływowej i przechowywać je w temperaturze 4 °C.
  7. Wykrywanie sygnałów fluorescencyjnych i rozpraszania światła przy długości fali wzbudzenia 488 nm za pomocą cytometru przepływowego. Analizuj zawartość DNA i rozpraszanie światła za pomocą oprogramowania Modfit MFLT32.

5. Transmisyjna mikroskopia elektronowa

  1. Pokrój jądra na 1 mm3 kawałki za pomocą ostrego skalpela i szybko inkubuj próbki z 3% roztworem aldehydu glutarowego i 1,5% paraformaldehydu w 0,1 M PBS (pH 7,2) przez 4 godziny w 4 °C, aby uniknąć zmian ultrastruktury. Przepłukać próbki trzykrotnie 0,1 M PBS przez 5 minut.
    UWAGA: Skalpel i nożyczki powinny być ostre i staraj się unikać sztucznego ściskania i ciągnięcia. Przetwarzanie próbek powinno odbywać się w płynie utrwalającym.
  2. Utrwalić próbki w 1% roztworze kwasu osmicznego i 1,5% żelazocyjanku potasu w temperaturze 4 °C przez 1,5 godziny. Osuszyć wodę bibułą filtracyjną i trzykrotnie płukać próbki 0,1 M PBS przez 5 minut.
  3. Odwodnić próbki w 40 ml 50% alkoholu etylowego przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Próbki inkubować w 40 ml 70% alkoholu etylowego nasyconego octanem uranu w temperaturze 4 °C przez 12 godzin, w 40 ml 90% etanolu przez 10 minut w temperaturze 4 °C, w 40 ml 90% etanolu-acetonu przez 10 minut w temperaturze pokojowej, i w 40 ml bezwodnego acetonu przez 10 minut trzy razy w temperaturze pokojowej.
  4. Próbki inkubować w bezwodnej mieszaninie acetonu i żywicy epoksydowej 618 (v / v = 1:1) przez 1,5 godziny, a następnie zanurzyć próbki w środkach do zatapiania żywicy epoksydowej 618 w temperaturze 35 °C przez 3 godziny.
  5. W przypadku polimeryzacji żywicy próbki inkubować w środkach do zatapiania żywicy epoksydowej 618 w temperaturze 35 °C przez 12 godzin, w temperaturze 45 °C przez 12 godzin, a następnie w temperaturze 60 °C przez 24 godziny.
  6. Zainstaluj próbki i szklany nóż, a następnie wyreguluj odległości między próbkami a nożem. Przygotuj ultracienkie skrawki o grubości 90 nm za pomocą ultracienkiego mikrotomu. Pokrój próbki ze stałą prędkością, a następnie umieść szkiełka na siatce niklowej. Umieść szkiełka na szalce Petriego w temperaturze pokojowej.
  7. Barwić szkiełka 2% octanem uranylu przez 10 minut, a następnie barwić próbki 2% cytrynianem ołowiu przez 10 minut. Szkiełka płukać wodą destylowaną. Suszyć szkiełka przez 24 godziny w temperaturze pokojowej.
  8. Obserwuj szkiełka i rejestruj obrazy elektronów przy napięciu 70-100 kV za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Udało nam się zbudować model inhibicji CENP-E in vivo jąder myszy poprzez operację jamy brzusznej i wstrzyknięcie jąder GSK92329519. Kluczowe kroki techniczne tej metody zostały pokazane w Rysunek 1. Po wstrzyknięciu GSK923295 do jąder przez 4 dni, jądra pobrano do dalszych analiz. W grupie kontrolnej fala spermatogenna w kanalikach nasiennych była regularna i zorganizowana (Ryc. 2A). Jednak w grupie GSK923295 fala spermatogenna została zm...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym badaniu ustaliliśmy model hamowania in vivo CENP-E jąder myszy za pomocą chirurgii jamy brzusznej i mikroiniekcji GSK923295. Chirurgia jamy brzusznej i metoda iniekcji jąder zastosowana w tym badaniu ma następujące zalety. Po pierwsze, nie ogranicza się do wieku myszy. Eksperymentatorzy mogą wykonać wstrzyknięcie do jąder na wczesnym etapie, na przykład u 3-tygodniowych lub młodszych myszy. Po drugie, GSK923295 ma specyficzne i doskonałe działanie hamujące na CENP-E. Po trzecie, metoda ta jest prosta w obs...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy wszystkim członkom Laboratorium Cytoszkieletu na Uniwersytecie Medycznym Fujian za pomocne dyskusje. Dziękujemy Jun-Jin Linowi z Publicznego Centrum Usług Technologicznych Uniwersytetu Medycznego Fujian za pomoc techniczną w zakresie cytometrii przepływowej. Dziękujemy Ming-Xia Wu i Lin-Ying Zhou z Laboratorium Mikroskopii Elektronowej Publicznego Centrum Usług Technologicznych Uniwersytetu Medycznego Fujian za pomoc techniczną w zakresie mikroskopii elektronowej. Dziękujemy Si-Yi Zheng, Ying Lin, Qi Ke i Jun Song z Eksperymentalnego Centrum Nauczania Podstawowych Nauk Medycznych na Uniwersytecie Medycznym Fujian za ich wsparcie. Badanie to było wspierane przez następujące granty: Chińska Narodowa Fundacja Nauk Przyrodniczych (numer grantu 82001608), Fundacja Nauk Przyrodniczych Prowincji Fujian, Chiny (numer grantu 2019J05071), Fujian Provincial Health Technology Project (numer grantu 2018-1-69), Startup Fund for Scientific Research, Fujian Medical University (numer grantu 2017XQ1001), projekt finansowania start-upów w zakresie talentów naukowych na Uniwersytecie Medycznym Fujian (numer grantu XRCZX2017025) oraz projekt badawczy kształcenia i nauczania online studentów medycyny chińskiej (grant nr B-YXC20200202-06).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,25% Trypsin-EDTAGibco25200056
1 ml StrzykawkaDostępnychSterylne.
1,5 ml Probówka wirówkowaAxygenMCT-150-C
50 ml Probówka wirówkowaCorning430828
6 cm szalka PetriegoCorning430166
95% etanolSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10009164
tubulina królika przeciwciało poliklonalneBeyotimeAF0001Do testów immunofluorescencyjnych. Użyj w 1:100.
królicze przeciwciało monoklonalne anty-histon H3 (fosfo S10)Abcamab267372Do testów immunofluorescencyjnych. Użyj w 1:100.
królicze przeciwciało poliklonalne anty-TUBA4ASangon BiotechD110022Do testów immunofluorescencyjnych. Użyj w 1:100.
Królicze przeciwciało monoklonalne anty-SYCP3Abcamab175191Do testów immunofluorescencyjnych. Użyj w 1:100.
Szkiełka mikroskopowe adhezyjneCITOTEST188105
Alexa fluor 488 kozie przeciwciało anty-króliczeBeyotimeA0423Sencodary. Użyj o 1:500.
Siarczan glinowo-potasowySinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10001060
Bezwodny etanolSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd100092690
Medium montażowe zapobiegające blaknięciuBeyotimeP0131Zapobiegaj fotowybielaniu sygnałów fluorescencyjnych.
BD FACS Canto IIBD BiosciencesFACS Canto II
Albumina surowicy bydlęcejSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd69003435
WirówkaEppendorf5424BK745380
Hydrat chloraluSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd80037516
Kwas cytrynowyShanghai Experiment Reagent Co., Ltd122670
KolagenazaSangon BiotechA004194-0100
Szkiełka nakrywkoweCITOTEST10212020C20 & razy; 20 mm. Grubość 0,13-0,16 mm.
DAPIBeyotimeC1006
do barwieniaDostępnych jest kilka marek komercyjnych91347802
Eosin Y, rozpuszczalny w alkoholuSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd71014460
EtherSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10009318
Formaldehyd - roztwór wodnySinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10010018
GSK923295MedChemExpressHY-10299
Hematoksylina, bezwodnaSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd71020784
Mysz ICRShanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd
Oprogramowanie Image JNational Institutes of Healthhttps://imagej.nih.gov/ij/Analiza obrazu fluorescencyjnego.
UltramikrotomLeica Leica
EM UC-7 ultramikrotomLeicaEM UC7
Modfit MFLT32Verity Software HouseDo analizy wyników cytometrii przepływowej.
Lakier do paznokcijest kilka marek komercyjnych
Guma neutralnaSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10004160
mikroskop Nikon Ti-S2
Kwas pikrynowySinopharm Chemical Reagent Co., LtdJ60807
RheodyneSangon BiotechF519160-000110 μ l reodyna
Parafina w plastrachSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd69019461
Jodan soduSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd80117214
Instrumenty chirurgiczneDostępnychdo chirurgii jamy brzusznej. Sterylizować w temperaturze 121 & C, 20 min.
Transmisyjny mikroskop elektronowyFEITecnai G2
Dihydrat cytrynianu trisodowegoShanghai Experiment Reagent Co., Ltd173970
Triton X-100Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd30188928Rozcieńczyć w sterylnym PBS, aby uzyskać 0,25% roztwór roboczy.
Tween 20Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd30189328Rozcieńczyć w sterylnym PBS, aby uzyskać 0,1% roztwór roboczy.
ParaformaldehydSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd80096618
XyleneSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10023418
jest kilka marek komercyjnych Dostępnych jest kilka marek komercyjnych

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lenormand, T., Engelstädter, J., Johnston, S. E., Wijnker, E., Haag, C. R. Evolutionary mysteries in meiosis. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 371 (1706), 20160001(2016).
  2. Brandeis, M. New-age ideas about age-old sex: separating meiosis from mating could solve a century-old conundrum. Biological Reviews of the Cambridge Philosophical Society. 93 (2), 801-810 (2018).
  3. Lane, S., Kauppi, L. Meiotic spindle assembly checkpoint and aneuploidy in males versus females. Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS. 76 (6), 1135-1150 (2019).
  4. Handel, M. A., Schimenti, J. C. Genetics of mammalian meiosis: regulation, dynamics and impact on fertility. Nature Reviews Genetics. 11 (2), 124-136 (2010).
  5. Miller, M. P., Amon, A., Ünal, E. Meiosis I: when chromosomes undergo extreme makeover. Current Opinion in Cell Biology. 25 (6), 687-696 (2013).
  6. Duro, E., Marston, A. L. From equator to pole: splitting chromosomes in mitosis and meiosis. Genes & Development. 29 (2), 109-122 (2015).
  7. Eaker, S., Pyle, A., Cobb, J., Handel, M. A. Evidence for meiotic spindle checkpoint from analysis of spermatocytes from Robertsonian-chromosome heterozygous mice. Journal of Cell Science. 114, Pt 16 2953-2965 (2001).
  8. Faisal, I., Kauppi, L. Reduced MAD2 levels dampen the apoptotic response to non-exchange sex chromosomes and lead to sperm aneuploidy. Development. 144 (11), 1988-1996 (2017).
  9. Bolcun-Filas, E., Handel, M. A. Meiosis: the chromosomal foundation of reproduction. Biology of Reproduction. 99 (1), 112-126 (2018).
  10. Lawrence, C. J., et al. A standardized kinesin nomenclature. The Journal of Cell Biology. 167 (1), 19-22 (2004).
  11. Cross, R. A., McAinsh, A. Prime movers: the mechanochemistry of mitotic kinesins. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (4), 257-271 (2014).
  12. Camlin, N. J., McLaughlin, E. A., Holt, J. E. Motoring through: the role of kinesin superfamily proteins in female meiosis. Human Reproduction Update. 23 (4), 409-420 (2017).
  13. Yen, T. J., Li, G., Schaar, B. T., Szilak, I., Cleveland, D. W. CENP-E is a putative kinetochore motor that accumulates just before mitosis. Nature. 359 (6395), 536-539 (1992).
  14. Wood, K. W., Sakowicz, R., Goldstein, L. S., Cleveland, D. W. CENP-E is a plus end-directed kinetochore motor required for metaphase chromosome alignment. Cell. 91 (3), 357-366 (1997).
  15. Abrieu, A., Kahana, J. A., Wood, K. W., Cleveland, D. W. CENP-E as an essential component of the mitotic checkpoint in vitro. Cell. 102 (6), 817-826 (2000).
  16. Mao, Y., Desai, A., Cleveland, D. W. Microtubule capture by CENP-E silences BubR1-dependent mitotic checkpoint signaling. The Journal of Cell Biology. 170 (6), 873-880 (2005).
  17. Gudimchuk, N., et al. Kinetochore kinesin CENP-E is a processive bi-directional tracker of dynamic microtubule tips. Nature Cell Biology. 15 (9), 1079-1088 (2013).
  18. Yu, K. W., Zhong, N., Xiao, Y., She, Z. Y. Mechanisms of kinesin-7 CENP-E in kinetochore-microtubule capture and chromosome alignment during cell division. Biology of the Cell. 111 (6), 143-160 (2019).
  19. She, Z. Y., et al. Kinesin-7 CENP-E regulates chromosome alignment and genome stability of spermatogenic cells. Cell Death Discovery. 6, 25(2020).
  20. Parra, M. T., et al. Sequential assembly of centromeric proteins in male mouse meiosis. PLoS Genetics. 5 (3), 1000417(2009).
  21. Parra, M. T., et al. Expression and behaviour of CENP-E at kinetochores during mouse spermatogenesis. Chromosoma. 111 (1), 53-61 (2002).
  22. Duesbery, N. S., et al. CENP-E is an essential kinetochore motor in maturing oocytes and is masked during mos-dependent, cell cycle arrest at metaphase II. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (17), 9165-9170 (1997).
  23. Gui, L., Homer, H. Spindle assembly checkpoint signalling is uncoupled from chromosomal position in mouse oocytes. Development. 139 (11), 1941-1946 (2012).
  24. Parks, J. E., Lee, D. R., Huang, S., Kaproth, M. T. Prospects for spermatogenesis in vitro. Theriogenology. 59 (1), 73-86 (2003).
  25. Sato, T., et al. In vitro production of functional sperm in cultured neonatal mouse testes. Nature. 471 (7339), 504-507 (2011).
  26. Staub, C. A century of research on mammalian male germ cell meiotic differentiation in vitro. Journal of Andrology. 22 (6), 911-926 (2001).
  27. Handel, M. A., Caldwell, K. A., Wiltshire, T. Culture of pachytene spermatocytes for analysis of meiosis. Developmental Genetics. 16 (2), 128-139 (1995).
  28. La Salle, S., Sun, F., Handel, M. A. Isolation and short-term culture of mouse spermatocytes for analysis of meiosis. Methods in Molecular Biology. 558, 279-297 (2009).
  29. Putkey, F. R., et al. Unstable kinetochore-microtubule capture and chromosomal instability following deletion of CENP-E. Developmental Cell. 3 (3), 351-365 (2002).
  30. Wood, K. W., et al. Antitumor activity of an allosteric inhibitor of centromere-associated protein-E. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (13), 5839-5844 (2010).
  31. Nam, D., Sershon, R. A., Levine, B. R., Della Valle, C. J. The use of closed incision negative-pressure wound therapy in orthopaedic surgery. Journal of the American Academy Orthopaedic Surgeons. 26 (9), 295-302 (2018).
  32. She, Z. Y., et al. Kinesin-5 Eg5 is essential for spindle assembly and chromosome alignment of mouse spermatocytes. Cell Division. 15, 6(2020).
  33. She, Z. Y., et al. Kinesin-6 family motor KIF20A regulates central spindle assembly and acrosome biogenesis in mouse spermatogenesis. Biochimica et Biophysica Acta-Molecular Cell Research. 1867 (4), 118636(2020).
  34. Wellard, S. R., Hopkins, J., Jordan, P. W. A seminiferous tubule squash technique for the cytological analysis of spermatogenesis using the mouse model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56453(2018).
  35. Sato, M., Ishikawa, A., Kimura, M. Direct injection of foreign DNA into mouse testis as a possible in vivo gene transfer system via epididymal spermatozoa. Molecular Reproduction and Development. 61 (1), 49-56 (2002).
  36. Coward, K., et al. Expression of a fluorescent recombinant form of sperm protein phospholipase C zeta in mouse epididymal sperm by in vivo gene transfer into the testis. Fertility and Sterility. 85, 1281-1289 (2006).
  37. Davis, S., et al. Potent inhibition of microRNA in vivo without degradation. Nucleic Acids Research. 37 (1), 70-77 (2009).
  38. Zhao, H. T., et al. LRRK2 antisense oligonucleotides ameliorate α-Synuclein inclusion formation in a Parkinson's Disease mouse model. Molecular Therapy-Nucleic Acids. 8, 508-519 (2017).
  39. Shahzad, K., et al. CHOP-ASO Ameliorates Glomerular and Tubular Damage on Top of ACE Inhibition in Diabetic Kidney Disease. Journal of the American Society of Nephrology. 3, 2021040431(2021).
  40. Kang, K., Niu, B., Wu, C., Hua, J., Wu, J. The construction and application of lentiviral overexpression vector of goat miR-204 in testis. Research in Veterinary Science. 130, 52-58 (2020).
  41. Karabasheva, D., Smyth, J. T. Preparation of Drosophila larval and pupal testes for analysis of cell division in live, intact tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60961(2020).
  42. Wiltshire, T., Park, C., Caldwell, K. A., Handel, M. A. Induced premature G2/M-phase transition in pachytene spermatocytes includes events unique to meiosis. Developmental Biology. 169 (2), 557-567 (1995).
  43. Cobb, J., Cargile, B., Handel, M. A. Acquisition of competence to condense metaphase I chromosomes during spermatogenesis. Developmental Biology. 205 (1), 49-64 (1999).
  44. Cobb, J., Reddy, R. K., Park, C., Handel, M. A. Analysis of expression and function of topoisomerase I and II during meiosis in male mice. Molecular Reproduction and Development. 46 (4), 489-498 (1997).
  45. Inselman, A., Handel, M. A. Mitogen-activated protein kinase dynamics during the meiotic G2/MI transition of mouse spermatocytes. Biology of Reproduction. 71 (2), 570-578 (2004).
  46. Muramatsu, T., Shibata, O., Ryoki, S., Ohmori, Y., Okumura, J. Foreign gene expression in the mouse testis by localized in vivo gene transfer. Biochemical and Biophysical Research Communications. 233 (1), 45-49 (1997).
  47. Yamazaki, Y., et al. In vivo gene transfer to mouse spermatogenic cells by deoxyribonucleic acid injection into seminiferous tubules and subsequent electroporation. Biology of Reproduction. 59 (6), 1439-1444 (1998).
  48. Yamazaki, Y., Yagi, T., Ozaki, T., Imoto, K. In vivo gene transfer to mouse spermatogenic cells using green fluorescent protein as a marker. The Journal of Experimental Zoology. 286 (2), 212-218 (2000).
  49. Coward, K., Kubota, H., Parrington, J. In vivo gene transfer into testis and sperm: developments and future application. Archives of Andrology. 53 (4), 187-197 (2007).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Inhibicja CENP Espermatocyty mysiechirurgia jamy brzusznejwstrzykiwanie do j derbarwienie immunofluorescencyjnesegregacja chromosom wmonta wrzecionatransmisyjna mikroskopia elektronowa

Powiązane artykuły