Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Trójwymiarowe obrazowanie unaczynienia opuszki stopy w wysokiej rozdzielczości w mysim modelu zgorzeli kończyn tylnych

3.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63284

⸱

16 marca 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Dewitt Daughtry Family Department of Surgery, University of Miami Miller School of Medicine, 2Vascular Biology Institute, University of Miami Miller School of Medicine, 3University of Miami, 4Analytical Imaging Core Facility, University of Miami

W tym artykule

Podsumowanie

Obecny protokół opisuje unikalny, klinicznie istotny model choroby tętnic obwodowych, który łączy elektrokoagulację tętnicy udowej i żyły z podawaniem inhibitora syntazy tlenku azotu w celu wywołania zgorzeli kończyn tylnych u myszy FVB. Perfuzja DiI dosercowa jest następnie wykorzystywana do trójwymiarowego obrazowania naczyń krwionośnych opuszki stopy w wysokiej rozdzielczości.

Streszczenie

Choroba tętnic obwodowych (PAD) jest istotną przyczyną zachorowalności wynikającej z przewlekłego narażenia na czynniki ryzyka miażdżycy. Pacjenci cierpiący na jego najcięższą postać, przewlekłe niedokrwienie zagrażające kończynom (CLTI), borykają się ze znacznymi upośledzeniami w codziennym życiu, w tym przewlekłym bólem, ograniczonym dystansem chodzenia bez bólu i niegojącymi się ranami. Modele przedkliniczne zostały opracowane na różnych zwierzętach w celu zbadania PAD, ale najczęściej stosowane pozostaje niedokrwienie kończyn tylnych myszy. W tych modelach mogą występować znaczne różnice w odpowiedzi na urazę niedokrwienną w zależności od użytego szczepu myszy oraz miejsca, liczby i sposobów przerwania tętnic. Protokół ten opisuje unikalną metodę łączącą elektrokoagulację tętnicy udowej i żyły z podawaniem inhibitora syntazy tlenku azotu (NOS) w celu niezawodnego wywołania zgorzeli opuszki stopy u myszy z wirusem Friend Virus B (FVB), która przypomina utratę tkanki CLTI. Podczas gdy nadal zalecane są tradycyjne metody oceny reperfuzji, takie jak laserowe obrazowanie perfuzji dopplerowskiej (LDPI), do oznaczania naczyń krwionośnych stosuje się dosercową perfuzję barwnika lipofilowego nadchloranu 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetrametyloindokarbocyjaniny (DiI). Późniejsza konfokalna laserowa mikroskopia skaningowa pozwala na trójwymiarową (3D) rekonstrukcję sieci naczyniowych opuszki stopy w wysokiej rozdzielczości, która uzupełnia tradycyjne metody oceny reperfuzji w modelach niedokrwienia kończyn tylnych.

Wprowadzenie

Choroba tętnic obwodowych (PAD), charakteryzująca się zmniejszonym przepływem krwi do kończyn z powodu miażdżycy, dotyka 6,5 miliona ludzi w Stanach Zjednoczonych i 200 milionów ludzi na całym świecie1. Pacjenci z PAD doświadczają obniżonej funkcji kończyn i jakości życia, a ci z CLTI, najcięższą postacią PAD, są narażeni na zwiększone ryzyko amputacji i śmierci, a 5-letnia śmiertelność zbliża się do 50%2. W praktyce klinicznej uważa się, że pacjenci ze wskaźnikiem stawu skokowo-ramiennego (ABI) <0,9 mają PAD, a ci z ABI <0,4 związanym z bólem spoczynkowym lub utratą tkanek mają CLTI3. Objawy różnią się u pacjentów z podobnymi ABI w zależności od codziennej aktywności, tolerancji mięśni na niedokrwienie, różnic anatomicznych i różnic w rozwoju pobocznym4. Zgorzel palców i kończyn jest najcięższym objawem wszystkich chorób okluzyjnych naczyń krwionośnych, które prowadzą do CLTI. Jest to forma suchej martwicy, która mumifikuje tkanki miękkie. Oprócz miażdżycowego PAD można go również zaobserwować u pacjentów z cukrzycą, zapaleniami naczyń krwionośnych, takimi jak choroba Buergera i zjawisko Raynauda, lub kalcyfilaksją w schyłkowej niewydolności nerek5,6.

Kilka modeli przedklinicznych zostało opracowanych do badania patogenezy PAD/CLTI i testowania skuteczności potencjalnych metod leczenia, z których najczęstszym pozostaje niedokrwienie tylnych kończyn myszy. Wywołanie niedokrwienia kończyn tylnych u myszy jest zwykle osiągane przez zablokowanie przepływu krwi z tętnic biodrowych lub udowych, albo przez podwiązanie szwów, elektrokoagulację, albo w inny sposób zwężania pożądanego naczynia7. Techniki te drastycznie zmniejszają perfuzję do kończyny tylnej i stymulują neowaskularyzację w mięśniach ud i łydek. Istnieją jednak zasadnicze różnice we wrażliwości na uraz niedokrwienny, zależne od szczepu myszy, częściowo wynikające z anatomicznych różnic w dystrybucji pobocznej8,9. Na przykład myszy C57BL/6 są stosunkowo odporne na niedokrwienie kończyn tylnych, wykazując zmniejszoną funkcję kończyn, ale generalnie nie wykazując oznak gangreny w opuszku stopy. Z drugiej strony, myszy BALB/c mają z natury słabą zdolność do powrotu do zdrowia po niedokrwieniu i zazwyczaj rozwijają autoamputację stopy lub dolnej części nogi po samym podwiązaniu tętnicy udowej. Ta ciężka odpowiedź na niedokrwienie zawęża okno terapeutyczne i może uniemożliwić podłużną ocenę reperfuzji i funkcji kończyny. Co ciekawe, różnice genetyczne w pojedynczym locus cechy ilościowej zlokalizowanym na mysim chromosomie 7 są związane z tą różnicową podatnością myszy C57BL/6 i BALB/c na martwicę tkanek i reperfuzję kończyn10.

W porównaniu do szczepów C57BL/6 i BALB/c, myszy FVB wykazują pośrednią, ale niespójną odpowiedź na samo podwiązanie tętnicy udowej. U niektórych zwierząt rozwija się zgorzel opuszki stopy w postaci czarnych niedokrwiennych paznokci lub zmumifikowanych palców, jeszcze inne nie wykazują żadnych widocznych oznak niedokrwienia11. Jednoczesne podawanie chlorowodorku estru metylowego N ω-nitro-L-argininy (L-NAME), inhibitora syntazy tlenku azotu (NOS)12, zapobiega kompensacyjnym mechanizmom rozszerzania naczyń krwionośnych i dodatkowo zwiększa stres oksydacyjny w tkance kończyn tylnych. W połączeniu z podwiązaniem lub koagulacją tętnicy udowej, podejście to konsekwentnie powoduje utratę tkanki opuszki stopy u myszy FVB, która przypomina zmiany zanikowe CLTI, ale rzadko postępuje do automatycznej amputacji kończyny11. Stres oksydacyjny jest jedną z cech charakterystycznych PAD/CLTI i jest propagowany przez dysfunkcję śródbłonka i zmniejszoną biodostępność tlenku azotu (NO)13,14. NO jest cząsteczką pluripotencjalną, która zwykle wywiera korzystny wpływ na przepływ krwi tętniczej i kapilarnej, adhezję i agregację płytek krwi oraz rekrutację i aktywację leukocytów13. Wykazano również, że obniżony poziom NOS aktywuje enzym konwertujący angiotensynę, który indukuje stres oksydacyjny i przyspiesza postęp miażdżycy15.

Po ustaleniu modelu niedokrwienia kończyn tylnych, konieczne jest również monitorowanie kolejnej reperfuzji kończyn i efektu terapeutycznego ewentualnych metod leczenia. W proponowanym modelu zgorzeli myszy stopień ubytku tkanki można najpierw określić ilościowo za pomocą skali Fabera w celu oceny ogólnego wyglądu stopy (0: normalny, 1-5: utrata paznokci, gdzie wynik oznacza liczbę dotkniętych paznokci, 6-10: zanik palców, gdzie wynik oznacza liczbę dotkniętych palców, 11-12: częściowy i całkowity zanik stopy, odpowiednio)9. Ilościowe pomiary perfuzji kończyn tylnych są następnie zwykle wykonywane przy użyciu LDPI, który opiera się na interakcjach dopplerowskich między światłem lasera a czerwonymi krwinkami, aby wskazać perfuzję na poziomie pikseli w obszarze zainteresowania (ROI)16. Chociaż ta technika jest ilościowa, nieinwazyjna i idealna do powtarzania pomiarów, nie zapewnia szczegółowych szczegółów anatomicznych unaczynienia kończyn tylnych16. Inne metody obrazowania, takie jak mikrotomografia komputerowa (mikro-CT), angiografia rezonansu magnetycznego (MRA) i mikroangiografia rentgenowska, okazują się albo kosztowne, wymagają wyrafinowanego oprzyrządowania, albo w inny sposób stanowią wyzwanie techniczne16. W 2008 roku Li i in. opisali technikę znakowania naczyń krwionośnych w siatkówce lipofilowym barwnikiem karbocyjaninowym DiI17. DiI wbudowuje się w komórki śródbłonka i poprzez bezpośrednią dyfuzję barwi struktury błon naczyniowych, takie jak pędy angiogenne i wyrostki pseudopodalne17,18. Ze względu na bezpośrednie dostarczanie do komórek śródbłonka i wysoce fluorescencyjny charakter barwnika, procedura ta zapewnia intensywne i długotrwałe znakowanie naczyń krwionośnych. W 2012 roku Boden i wsp. dostosowali technikę perfuzji DiI do mysiego modelu niedokrwienia kończyn tylnych poprzez obrazowanie całości pobranych mięśni przywodzicieli uda po podwiązaniu tętnicy udowej19.

Obecna metoda zapewnia stosunkowo tani i technicznie wykonalny sposób oceny neowaskularyzacji w odpowiedzi na niedokrwienie kończyn tylnych oraz terapie oparte na genach lub komórkach. W dalszej adaptacji protokół ten opisuje zastosowanie perfuzji DiI do obrazowania unaczynienia opuszki stopy w wysokiej rozdzielczości i 3D w mysim modelu zgorzeli kończyn tylnych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach opisane w protokole zostały zatwierdzone przez University of Miami Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Do badania wykorzystano myszy FVB, zarówno samce, jak i samice, w wieku 8-12 tygodni.

1. Przygotowanie roztworu L-NAME

  1. W sterylnych warunkach w okapie z przepływem laminarnym przygotować roztwór podstawowy L-NAME, rozpuszczając 1 g proszku L-NAME (patrz tabela materiałów) w 20 ml sterylnej wody, aby uzyskać 50 mg/ml roztworu. Roztwór podstawowy należy przechowywać w porcjach o objętości 300-500 μl w temperaturze -20 °C przez okres do 3 miesięcy.
  2. Aby uzyskać roboczy roztwór L-NAME, należy rozmrozić podwielokrotność roztworu podstawowego L-NAME i rozcieńczyć PBS (1:4) w sterylnych warunkach, aby uzyskać końcowe stężenie 10 mg/ml.
  3. Aby przygotować PBS (pH 7,4), rozpuść 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na2HPO4 i 0,23 g NaH2PO4 w 800 ml wody destylowanej. Dostosuj pH do 7,4 za pomocą HCl. Dodaj wodę do całkowitej objętości 1,000 ml i przefiltruj przez filtr butelkowy 0,22 μm.
    UWAGA: Dootrzewnowe (IP) wstrzyknięcie 4 μl/g roztworu roboczego L-NAME jest równoważne pożądanej dawce 40 mg/kg L-NAME. Roztwór roboczy L-NAME należy przechowywać na lodzie podczas stosowania, a nowe rozcieńczenia należy sporządzać codziennie, używając świeżo rozmrożonych porcji roztworu podstawowego.

2. Chemiczna i chirurgiczna indukcja zgorzeli kończyn tylnych

  1. Myszy FVB w wieku 8-12 tygodni należy pozyskać od hodowcy lub wyhodowane w placówce (patrz Tabela materiałów). Na 2 godziny przed zabiegiem należy podać dawkę 40 mg/kg IP L-NAME.
  2. Znieczulić myszy wstrzyknięciem IP 100 mg/kg ketaminy i 10 mg/kg ksylazyny (patrz tabela materiałów) rozcieńczonych w PBS. Potwierdź odpowiednią sedację poprzez brak odruchu szczypania palców u nóg i kontynuuj monitorowanie częstości oddechów podczas zabiegu.
    1. Usuń włosy z obustronnych kończyn tylnych i pachwin za pomocą nożyc i/lub kremu do depilacji. Umieść zwierzę pod mikroskopem chirurgicznym na wznak; Rozciągnij i przyklej kończyny na miejscu. Wysterylizuj pole operacyjne, nakładając obwodowo roztwór powidonu i jodu na miejsce operowane.
  3. W powiększeniu 10-20x użyj nożyczek lub skalpela, aby wykonać 1 cm nacięcie wzdłuż zgięcia pachwiny tuż poniżej więzadła pachwinowego. Użyj cienkich kleszczyków i sterylnego aplikatora z bawełnianą końcówką, aby tępo wyciąć pachwinową poduszeczkę tłuszczową bocznie od więzadła pachwinowego i odsłonić leżącą pod spodem osłonkę kości udowej, tak aby tętnica udowa, żyła i nerw były wyraźnie zidentyfikowane (Rysunek 1).
  4. Za pomocą cienkich kleszczy przekłuj pochewkę kości udowej. Ostrożnie odsuń nerw udowy od tętnicy udowej. Zidentyfikuj start bocznej gałęzi obwodowej tętnicy udowej (LCFA) głęboko do nerwu udowego (Rysunek 1).
    1. Kontynuuj elektrokoagulację tętnicy i żyły udowej tuż proksymalnie do LCFA, aktywując urządzenie do kauteryzacji (patrz Tabela materiałów) i delikatnie dotykając naczyń ruchem na boki, upewniając się, że nerw udowy jest dobrze izolowany i pozostaje chroniony przed uszkodzeniem termicznym. Podziel zakrzepły segment naczynia nożyczkami.
  5. Kontynuuj odsłanianie dystalnej tętnicy udowej i żyły, mobilizując przyśrodkowo pachwinową poduszkę tłuszczową. Zidentyfikuj powierzchowną tętnicę nadbrzusza i połączenie saphenopodkolanowe bardziej dystalnie.
    1. Przebij pochewkę kości udowej między tymi dwoma miejscami i ostrożnie wypreparuj nerw udowy z dala od naczyń udowych. Kontynuuj koagulację i przecięcie tętnicy i żyły udowej zgodnie z opisem w kroku 2.4.1.
  6. Przepłukać pole operacyjne za pomocą strzykawki wypełnionej sterylnym PBS. Uzyskaj hemostazę, delikatnie uciskając aplikatorem z bawełnianą końcówką przez 3-5 minut na dowolne obszary krwawienia.
    1. Kontynuuj zamykanie nacięcia za pomocą wchłanialnego szwu 5-0 w prosty, ciągły sposób. Należy podać podskórnie dawkę 1 mg/kg buprenorfiny o przedłużonym uwalnianiu (patrz tabela materiałów) w celu złagodzenia bólu pooperacyjnego.
  7. Potwierdzić utratę perfuzji opuszki stopy w podwiązanej kończynie tylnej za pomocą LDPI (patrz tabela materiałów). Będąc jeszcze znieczulonym, umieść zwierzę na ciemnej podkładce piankowej w pozycji leżącej pod maszyną LDPI i użyj pętli z taśmy izolacyjnej, aby zabezpieczyć stopy na miejscu.
    1. Kontynuuj z LDPI obustronnych stóp. Po zakończeniu skanowania narysuj ROI wokół każdej podkładki stopy i uzyskaj średnie wartości strumienia.
    2. Obliczyć wskaźnik perfuzji jako stosunek średnich wartości strumienia od podwiązanej do niepodwiązanej poduszki stopy. Upewnij się, że wskaźnik perfuzji jest mniejszy niż 0,1.
  8. Przenieś zwierzę z powrotem do czystej klatki z poduszką grzewczą lub górną lampą, aby utrzymać temperaturę ciała. Upewnij się, że myszy całkowicie wyzdrowieją ze znieczulenia przed przeniesieniem myszy z powrotem do obiektu dla zwierząt.

3. Pooperacyjne podawanie L-NAME i monitorowanie zgorzeli kończyn tylnych

  1. W 1-3 dniu po operacji należy podać każdemu zwierzęciu dodatkową dawkę 40 mg/kg IP L-NAME. W tym samym czasie dokładnie oceń stopę od kończyny niedokrwiennej.
  2. Określ ilościowo stopień niedokrwienia kończyn tylnych i zgorzeli za pomocą skali niedokrwienia kończyn tylnych Faber9. Wyniki 1-5: liczba gwoździ niedokrwiennych; wyniki 6-10: 1-5 cyfr niedokrwiennych; Wyniki 11 i 12: częściowy i całkowity zanik stopy. Zapisuj wyniki Faber w dniach 1-3 po operacji, a następnie co tydzień.

4. Przygotowanie DiI i roztworów roboczych do perfuzji zwierzęcej

  1. Aby przygotować roztwór podstawowy DiI, rozpuść 100 mg kryształów DiI (patrz tabela materiałów) w 16,7 ml 100% etanolu. Przykryj folią aluminiową i pozostaw na noc na bujanej platformie w ciemności w temperaturze pokojowej.
  2. Aby przygotować rozcieńczalnik, rozpuść 50 g glukozy w 1000 ml wody destylowanej, aby uzyskać 5% roztwór glukozy. Przefiltruj przez filtr butelkowy 0,22 μm. Wymieszaj PBS i 5% roztwory glukozy w stosunku 1:4, aby przygotować działający roztwór rozcieńczalnika.

5. Konfiguracja sprzętu i perfuzja DiI

  1. Przygotować roztwór roboczy DiI, dodając 200 μl roztworu podstawowego DiI do 10 ml roztworu rozcieńczalnika roboczego (przygotowanego w kroku 4.2) bezpośrednio przed użyciem. Wstrząśnij ręką, aby dobrze wymieszać.
  2. Połącz szeregowo dwa lub trzy 3-drogowe zawory odcinające i igłę motylkową 25 G. Przygotuj strzykawki o pojemności 10 ml z 4 ml PBS, 10 ml roztworu DiI i 10 ml 10% neutralnej buforowanej formaliny (patrz tabela materiałów).
  3. Podłączyć strzykawkę z formaliną do bliższego portu dopływu i wstrzyknąć roztwór, aby wypłukać powietrze z linii; przekręcić kurek, aby zamknąć port. Powtórz tę samą procedurę sekwencyjnie, łącząc strzykawki z DiI, a następnie PBS odpowiednio do środkowego i dystalnego portu dopływowego, uważając, aby przepłukać wszystkie pęcherzyki powietrza przez zespół kurka.
    UWAGA: Upewnij się, że w żadnej części zespołu kranu lub rurki nie ma pęcherzyków powietrza. Pęcherzyki powietrza mogą zamykać małe tętnice podczas perfuzji, powodując słabą wewnątrznaczyniową dystrybucję DiI i pogorszone wyniki obrazowania.
  4. Po zakończeniu konfiguracji należy poddać zwierzę eutanazji przez przedawkowanie CO2 w komorze indukcyjnej.
  5. Umieść zwierzę przeznaczone do perfuzji w pozycji leżącej na podkładce chłonnej i zabezpiecz pachy i kończyny dolne igłami.
  6. Za pomocą nożyczek wykonaj poprzeczne nacięcie, aby otworzyć jamę brzuszną. Odsłoń, a następnie podziel lewą i prawą przeponę, aby uzyskać dostęp do jamy klatki piersiowej.
    1. Przetnij ścianę klatki piersiowej po obu stronach mostka od dolnych żeber do pierwszego lub drugiego żebra, unikając przyśrodkowo tętnic piersiowych wewnętrznych (sutkowych). Użyj hemostatu (patrz Tabela materiałów), aby chwycić dolny koniec mostka i odbić go w kierunku głowy zwierzęcia, aby odsłonić jamę piersiową.
  7. Zidentyfikuj lewą komorę, która wydaje się jaśniejsza niż prawa komora. Delikatnie chwyć serce kleszczami i włóż igłę motylkową do lewej komory.
    1. Użyj nożyczek lub igły 18 G, aby przebić prawy przedsionek, umożliwiając powrót krwi i roztworów perfuzyjnych do serca w celu odpływu. Ustabilizuj igłę jedną lub dwiema rękami, uważając, aby przypadkowo nie przebić prawej komory i nie doprowadzić do perfuzji krążenia płucnego, a nie ogólnoustrojowego.
  8. Otwórz port do strzykawki z PBS i ręcznie wstrzyknij 2-4 ml z szybkością 1-2 ml/min przez 1-2 minuty, aby wypłukać krew z układu naczyniowego. Upewnij się, że perfuzja zakończy się pomyślnie, obserwując krwawienie z prawego przedsionka. Po wstrzyknięciu należy zamknąć port strzykawki PBS.
  9. Otwórz port do strzykawki z DiI i wstrzyknij 5-10 ml z szybkością 1-2 ml/min przez 5 minut. Monitoruj uszy, nos i dłonie, które powinny zmienić kolor na lekko różowy po wstrzyknięciu roztworu DiI. Po wstrzyknięciu należy zamknąć port strzykawki DiI i odczekać 2 minuty, aby umożliwić wprowadzenie barwnika przed wstrzyknięciem utrwalacza.
  10. Otworzyć port do strzykawki z formaliną i wstrzykiwać 5-10 ml z szybkością 1-2 ml/min przez 5 minut. Po wstrzyknięciu należy wyjąć igłę z lewej komory i przystąpić do pobierania interesujących nas tkanek.
  11. Za pomocą ciężkich nożyczek zwichnij kość piszczelową w kostce, całkowicie oddzielając lewą i prawą stopę od podudzi. Umieść zebrane stopy w 6- lub 12-dołkowej płytce z 1-2 ml 10% roztworu formaliny. Owinąć talerz folią i przechowywać w temperaturze 4 °C przez noc.

6. Przygotowanie tkanki opuszki stopy do konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej

  1. Następnego dnia zastąp roztwór utrwalający na płytce 6- lub 12-dołkowej 1-2 ml PBS na dołek.
  2. Aby oskórować stopę, najpierw wykonaj podłużne nacięcie skalpelem na podeszwowej i grzbietowej stronie stopy. Następnie za pomocą ząbkowanych kleszczyków i małego hemostatu ostrożnie usuń całą skórę ze stopy i palców, nie uszkadzając leżących pod nią tkanek miękkich.
  3. Przystąp do montowania i obrazowania tkanek, najlepiej w ciągu 1-2 dni od perfuzji i pobrania. Alternatywnie, należy umieścić podkładki pod stopy na płytkach 6- lub 12-dołkowych z 1-2 ml PBS; Przykryj folią i przechowuj w temperaturze 4 °C do utrzymania fluorescencji do 1 miesiąca.
  4. Aby zamontować tkanki, należy indywidualnie umieścić stopy między dwoma szklanymi szkiełkami mikroskopowymi z piankową podkładką biopsyjną złożoną na siebie (raz lub dwa razy w zależności od grubości tkanki) na każdym końcu (patrz Tabela materiałów). Użyj dwóch małych spinaczy do segregatora, aby ścisnąć szkiełka szkiełkowe razem na każdym końcu (ostateczna grubość około 1 mm).
    UWAGA: Grubsze tkanki będą wymagały dłuższego czasu skanowania. Oskórowaną opuszkę stopy można ścisnąć między szklanymi szkiełkami na dzień przed obrazowaniem w celu zmniejszenia grubości tkanki.

7. Konfokalna laserowa mikroskopia skaningowa

  1. Przygotuj się do sesji obrazowania: włącz system obrazowania i uruchom oprogramowanie do akwizycji (patrz Tabela materiałów). Użyj obiektywu o małym powiększeniu/małej aperturze numerycznej (np. x5/0,15) do robienia zdjęć, ponieważ obiektywy o mniejszym powiększeniu zwykle mają większe odległości robocze wymagane w tym eksperymencie.
  2. Kliknij Tak, aby wyświetlić okno dialogowe Aktywuj etap. Aktywuj laser 561 nm w zakładce Konfiguracja. Na ekranie głównym aktywuj widoczną ścieżkę wiązki, klikając przycisk Widoczny. Ustaw detektor w zakresie 570-600 nm, klikając odpowiednie pole wyboru Aktywny.
  3. Wybierz ikonę Tile Scan (Skanowanie kafelków) na karcie Acquire > Acquisition (Pobieranie ) i ustaw żądaną rozdzielczość (512 x 512 lub 1024 x 1024).
  4. Umieść zamontowaną na sucho (bez dodatku wody lub PBS) próbkę tkanki ściśniętą między szklanymi szkiełkami na stoliku mikroskopu i ustaw ostrość tkanki.
  5. Aby ustawić granice skanowania, przejdź do lewego lub prawego górnego rogu próbki. Na karcie Akwizycja, w menu Skanowanie kafelków, kliknij przycisk Oznacz pozycję. Przejdź do przeciwległego rogu (odpowiednio w prawym lub lewym dolnym rogu) i ponownie kliknij przycisk Oznacz pozycję.
  6. Aby ustawić głębokość stosu Z, kliknij przycisk Live w lewym dolnym rogu ekranu i przejdź do środka próbki. Użyj pokrętła osi z, aby przewinąć do dołu próbki.
  7. Na karcie Akwizycja, w menu Z-Stack, kliknij przycisk Rozpocznij. Przewiń do górnej części próbki i kliknij przycisk Zakończ. Kliknij Rozmiar kroku Z i ustaw żądaną wartość (np. 50 μm).
  8. W prawym dolnym rogu ekranu kliknij Start, aby rozpocząć pobieranie obrazu.

8. Analiza ilościowa i rekonstrukcja 3D unaczynienia opuszki stopy

  1. Pobierz i zainstaluj najnowszą wersję Fiji (ImageJ) oraz wtyczkę do analizy statków20. Otwórz pliki obrazów mikroskopowych w Fidżi, które połączą poszczególne serie Z w stosy Z, które można wyświetlić w osi Z za pomocą suwaka u dołu obrazu.
  2. Wybierz złożony obraz stosu Z, a następnie w menu Obraz wybierz pozycję Stosy > Z Projekt, aby utworzyć projekcję dwuwymiarową. Następnie przekonwertuj projekcję Z na binarną w obszarze Process > Binary > Create Binary.
  3. Uruchom wtyczkę Vascular Density w obszarze Plugins > Vascular Density. Po wyświetleniu monitu użyj kursora, aby prześledzić ROI na obwodzie podnóżka i cyfr. Zwróć uwagę na podawaną gęstość naczyń, która jest wyrażona jako procent ROI (frakcja obszaru naczyniowego).
  4. Aby utworzyć rekonstrukcje 3D na Fidżi, wybierz Stosy > Projekcie 3D i ustaw żądaną oś obrotu, kąt i prędkość w menu Obraz. Alternatywnie wybierz Podgląd woluminów w menu Wtyczki, aby wizualizować obrazy jako plasterki lub manipulować rekonstrukcją w żądanych osiach.
  5. W przypadku bardziej skomplikowanego renderowania 3D należy użyć alternatywnego oprogramowania do analizy i przetwarzania obrazów (patrz tabela materiałów). Konwertuj pliki do żądanego formatu oprogramowania i łącz poszczególne skany płytek za pomocą funkcji łączenia płytek.
  6. Po złączeniu ze sobą skanów poszczególnych kafelków otwórz plik kompozytowy i kontynuuj renderowanie powierzchni objętościowej. Kliknij Dodaj nową powierzchnię, aby otworzyć Kreatora tworzenia powierzchni i użyj strzałek, aby przełączać się między menu, w szczególności ustawiając ROI i intensywność progową. Po uzyskaniu satysfakcji z renderowania powierzchni wykorzystaj funkcję animacji, aby utworzyć filmy z przetworzonym obrazem.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Niniejszy protokół szczegółowo opisuje niezawodną metodę indukowania niedokrwienia i utraty tkanek w poduszce stopy myszy u podatnych myszy szczepu FVB, poprzez połączenie koagulacji tętnicy i żyły udowej z podawaniem L-NAME, inhibitora syntazy tlenku azotu. Rysunek 1 przedstawia anatomię naczyń krwionośnych kończyny tylnej myszy i wskazuje miejsca koagulacji tętnicy i żyły udowej (żółte X), bezpośrednio proksymalnie względem tętnicy obocznej bocznej uda (LCFA) oraz proksymalnie względem złą...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Podczas gdy niedokrwienie kończyn tylnych myszy jest najczęściej stosowanym modelem przedklinicznym do badania neowaskularyzacji w PAD i CLTI, istnieje znaczna różnica w nasileniu niedokrwienia i powrocie do zdrowia w zależności od konkretnego zastosowanego szczepu myszy oraz miejsca, liczby i metody przerwania tętnic. Połączenie podwiązania tętnicy udowej i podawania IP L-NAME może niezawodnie indukować zgorzel kończyn tylnych u myszy FVB11. To samo leczenie powoduje niedokrwienie kończyn tylnych...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez granty dla Z-J L i OC V z National Institutes of Health [R01HL149452 i VITA (NHLBl-CSB-HV-2017-01-JS)]. Dziękujemy również Zakładowi Mikroskopii i Obrazowania w ramach Miami Project to Cure Paralysis przy University of Miami School of Medicine za zapewnienie dostępu do oprogramowania do analizy i przetwarzania obrazów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Spinki do segregatorów (małe)z artykułami biurowymi
Buprenorfina (o przedłużonym uwalnianiu)
Igła motylkowa (25 G z Luer-Lok)VWR10148-584
Konfokalny laserowy mikroskop skaningowyLeicaTCS SP5
DiI (nadchloran 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetrametyloindokarbocyjaniny)InvitrogenD282
Urządzenie do elektrokoagulacjiGemini System kauteryzacji5917
Etanol (100%)VWR89370-084
Fidżi (ImageJ) oprogramowanieNIHUżywana wersja 2.1.0. Bezpłatne pobieranie, licencja nie jest wymagana.
Piankowe podkładki do biopsjiFisher Scientific22-038-221
Formalina (neutralnie buforowana, 10%)VWR89370-094
Myszy FVBJackson Laboratory001800
GlukozaSigma-AldrichG7528
HCl (1 M)Sigma-Aldrich13-1700
Oprogramowanie ImarisOxford InstrumentsUżywana wersja 9.6.0.
IsofluranePivetalNDC 46066-755-04
KClSigma-AldrichP9333
Ketamina
L-NAME (chlorowodorek estru metylowego Nω--Nitro-L-argininy)Sigma-AldrichN5751
Laserowy obrazownik perfuzyjny DopplerMoorLDImoorLDI2-HIRUżywane oprogramowanie moorLDI V5.
Szkiełka mikroskopowe (25 x 75 x 1 mm)VWR48311-703
Na2HPO4Sigma-AldrichS7907
NaClSigma-AldrichS7653
NaH2PO4Sigma-AldrichS8282
NaOHSigma-AldrichS8263
Igły (27 G)BD305109
wacik jodowy z powidonem (10%)MedlineMDS093901ZZ
Narzędzia chirurgiczneRoboz SurgicalZalecane są cienkie kleszcze, igłownik, nożyczki sprężynowe i hemostat.
Szew (wchłanialny 5-0)DemeTECHG275017B0P
(10 ml)BD305482
Trójdrożne kranyCole-Parmer19406-49
WtyczkaBezpłatne pobieranie, licencja nie jest wymagana. Zobacz odniesienie: Elfarnawany (2015).
Ksylazyna
Sklep Strzykawki do analizy naczyniowej

Bibliografia

  1. Virani, S. S., et al. Heart disease and stroke statistics-2020 update: A report from the American Heart Association. Circulation. 141 (9), 139(2020).
  2. Duff, S., Mafilios, M. S., Bhounsule, P., Hasegawa, J. T. The burden of critical limb ischemia: A review of recent literature. Vascular Health and Risk Management. 15, 187-208 (2019).
  3. Mills, J. L., et al. The society for vascular surgery lower extremity threatened limb classification system: Risk stratification based on Wound, Ischemia, and foot Infection (WIfI). Journal of Vascular Surgery. 59 (1), 220-234 (2014).
  4. Conte, M. S., et al. Global vascular guidelines on the management of chronic limb-threatening ischemia. Journal of Vascular Surgery. 69 (6), (2019).
  5. Yeager, R. A. Relationship of hemodialysis access to finger gangrene in patients with end-stage renal disease. Journal of Vascular Surgery. 36 (2), 245-249 (2002).
  6. Al Wahbi, A. Autoamputation of diabetic toe with dry gangrene: A myth or a fact. Diabetes, Metabolic Syndrome and Obesity: Targets and Therapy. 11, 255-264 (2018).
  7. Niiyama, H., Huang, N. F., Rollins, M. D., Cooke, J. P. Murine model of hindlimb ischemia. Journal of Visualized Experiments. (23), e1035(2009).
  8. Hellingman, A. A., et al. Variations in surgical procedures for hind limb ischaemia mouse models result in differences in collateral formation. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 40 (6), 796-803 (2010).
  9. Chalothorn, D., Clayton, J. A., Zhang, H., Pomp, D., Faber, J. E. Collateral density, remodeling, and VEGF-A expression differ widely between mouse strains. Physiological Genomics. 30 (2), 179-191 (2007).
  10. Dokun, A. O., et al. A quantitative trait locus (LSq-1) on mouse chromosome 7 is linked to the absence of tissue loss after surgical hindlimb ischemia. Circulation. 117 (9), 1207-1215 (2008).
  11. Parikh, P. P., et al. A Reliable Mouse Model of Hind limb Gangrene. Annals of Vascular Surgery. 48, 222-232 (2018).
  12. Kopincová, J., Púzserová, A., Bernátová, I. L-NAME in the cardiovascular system - nitric oxide synthase activator. Pharmacological Reports. 64 (3), 511-520 (2012).
  13. Soiza, R. L., Donaldson, A. I. C., Myint, P. K. Pathophysiology of chronic peripheral ischemia: new perspectives. Therapeutic Advances in Chronic Disease. 11, 1-15 (2020).
  14. McDermott, M. M., et al. Skeletal muscle pathology in peripheral artery disease a brief review. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 40 (11), 2577-2585 (2020).
  15. Usui, M., et al. Pathogenic role of oxidative stress in vascular angiotensin-converting enzyme activation in long-term blockade of nitric oxide synthesis in rats. Hypertension. 34 (4), 546-551 (1999).
  16. Aref, Z., de Vries, M. R., Quax, P. H. A. Variations in surgical procedures for inducing hind limb ischemia in mice and the impact of these variations on neovascularization assessment. International Journal of Molecular Sciences. 20 (15), 1-14 (2019).
  17. Li, Y., Song, Y., Zhao, L., Gaidosh, G., Laties, A. M., Wen, R. Direct labeling and visualization of blood vessels with lipophilic carbocyanine dye DiI. Nature Protocols. 3 (11), 1703-1708 (2008).
  18. Honig, M. G., Hume, R. I. Dil and DiO: Versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing. Trends in Neurosciences. 12 (9), 333-341 (1989).
  19. Boden, J., et al. Whole-mount imaging of the mouse hindlimb vasculature using the lipophilic carbocyanine dye DiI. BioTechniques. 53 (1), 3-6 (2012).
  20. Elfarnawany, M. H. Signal processing methods for quantitative power doppler microvascular angiography. Electronic Thesis and Dissertation Repository. , 3106(2015).
  21. Matic, M., Matic, A., Djuran, V., Gajinov, Z., Prcic, S., Golusin, Z. Frequency of peripheral arterial disease in patients with chronic venous insufficiency. Iranian Red Crescent Medical Journal. 18 (1), 1-6 (2016).
  22. Ammermann, F., et al. Concomitant chronic venous insufficiency in patients with peripheral artery disease: Insights from MR angiography. European Radiology. 30 (7), 3908-3914 (2020).
  23. Yang, Y., et al. Cellular and molecular mechanism regulating blood flow recovery in acute versus gradual femoral artery occlusion are distinct in the mouse. Journal of Vascular Surgery. 48 (6), 1546-1558 (2008).
  24. Padgett, M. E., McCord, T. J., McClung, J. M., Kontos, C. D. Methods for acute and subacute murine hindlimb ischemia. Journal of Visualized Experiments. (112), e54166(2016).
  25. Nowak-Sliwinska, P., et al. Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays. Angiogenesis. 21 (3), 425-432 (2018).
  26. Greco, A., et al. Repeatability, reproducibility and standardisation of a laser doppler imaging technique for the evaluation of normal mouse hindlimb perfusion. Sensors. 13 (1), 500-515 (2013).
  27. Kochi, T., et al. Characterization of the arterial anatomy of the murine hindlimb: Functional role in the design and understanding of ischemia models. PLoS ONE. 8 (12), 84047(2013).
  28. Hlushchuk, R., Haberthür, D., Djonov, V. Ex vivo microangioCT: Advances in microvascular imaging. Vascular Pharmacology. 112, 2-7 (2019).
  29. Robertson, R. T., et al. Use of labeled tomato lectin for imaging vasculature structures. Histochemistry and Cell Biology. 143 (2), 225-234 (2015).
  30. Lee, J. J., et al. Systematic interrogation of angiogenesis in the ischemic mouse hind limb: Vulnerabilities and quality assurance. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 40, 2454-2467 (2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

choroba tętnic obwodowychniedokrwienie kończynperfuzja DiImikroskopia konfokalnakoagulacja tętnicy udowejinhibitor syntazy tlenku azoturekonstrukcja naczyniowa
Trójwymiarowe obrazowanie unaczynienia opuszki stopy w wysokiej rozdzielczości w mysim modelu zgorzeli kończyn tylnych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.