Obecny protokół opisuje unikalny, klinicznie istotny model choroby tętnic obwodowych, który łączy elektrokoagulację tętnicy udowej i żyły z podawaniem inhibitora syntazy tlenku azotu w celu wywołania zgorzeli kończyn tylnych u myszy FVB. Perfuzja DiI dosercowa jest następnie wykorzystywana do trójwymiarowego obrazowania naczyń krwionośnych opuszki stopy w wysokiej rozdzielczości.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Trójwymiarowe obrazowanie unaczynienia opuszki stopy w wysokiej rozdzielczości w mysim modelu zgorzeli kończyn tylnych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Choroba tętnic obwodowych (PAD) jest istotną przyczyną zachorowalności wynikającej z przewlekłego narażenia na czynniki ryzyka miażdżycy. Pacjenci cierpiący na jego najcięższą postać, przewlekłe niedokrwienie zagrażające kończynom (CLTI), borykają się ze znacznymi upośledzeniami w codziennym życiu, w tym przewlekłym bólem, ograniczonym dystansem chodzenia bez bólu i niegojącymi się ranami. Modele przedkliniczne zostały opracowane na różnych zwierzętach w celu zbadania PAD, ale najczęściej stosowane pozostaje niedokrwienie kończyn tylnych myszy. W tych modelach mogą występować znaczne różnice w odpowiedzi na urazę niedokrwienną w zależności od użytego szczepu myszy oraz miejsca, liczby i sposobów przerwania tętnic. Protokół ten opisuje unikalną metodę łączącą elektrokoagulację tętnicy udowej i żyły z podawaniem inhibitora syntazy tlenku azotu (NOS) w celu niezawodnego wywołania zgorzeli opuszki stopy u myszy z wirusem Friend Virus B (FVB), która przypomina utratę tkanki CLTI. Podczas gdy nadal zalecane są tradycyjne metody oceny reperfuzji, takie jak laserowe obrazowanie perfuzji dopplerowskiej (LDPI), do oznaczania naczyń krwionośnych stosuje się dosercową perfuzję barwnika lipofilowego nadchloranu 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetrametyloindokarbocyjaniny (DiI). Późniejsza konfokalna laserowa mikroskopia skaningowa pozwala na trójwymiarową (3D) rekonstrukcję sieci naczyniowych opuszki stopy w wysokiej rozdzielczości, która uzupełnia tradycyjne metody oceny reperfuzji w modelach niedokrwienia kończyn tylnych.
Wprowadzenie
Choroba tętnic obwodowych (PAD), charakteryzująca się zmniejszonym przepływem krwi do kończyn z powodu miażdżycy, dotyka 6,5 miliona ludzi w Stanach Zjednoczonych i 200 milionów ludzi na całym świecie1. Pacjenci z PAD doświadczają obniżonej funkcji kończyn i jakości życia, a ci z CLTI, najcięższą postacią PAD, są narażeni na zwiększone ryzyko amputacji i śmierci, a 5-letnia śmiertelność zbliża się do 50%2. W praktyce klinicznej uważa się, że pacjenci ze wskaźnikiem stawu skokowo-ramiennego (ABI) <0,9 mają PAD, a ci z ABI <0,4 związanym z bólem spoczynkowym lub utratą tkanek mają CLTI3. Objawy różn....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie eksperymenty na zwierzętach opisane w protokole zostały zatwierdzone przez University of Miami Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Do badania wykorzystano myszy FVB, zarówno samce, jak i samice, w wieku 8-12 tygodni.
1. Przygotowanie roztworu L-NAME
- W sterylnych warunkach w okapie z przepływem laminarnym przygotować roztwór podstawowy L-NAME, rozpuszczając 1 g proszku L-NAME (patrz tabela materiałów) w 20 ml sterylnej wody, aby uzyskać 50 mg/ml roztworu. Roztwór podstawowy należy przechowywać w porcjach o objętości 300-500 μl w temperaturze -20 °C przez okres do 3 mies....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Niniejszy protokół szczegółowo opisuje niezawodną metodę indukowania niedokrwienia i utraty tkanek w poduszce stopy myszy u podatnych myszy szczepu FVB, poprzez połączenie koagulacji tętnicy i żyły udowej z podawaniem L-NAME, inhibitora syntazy tlenku azotu. Rysunek 1 przedstawia anatomię naczyń krwionośnych kończyny tylnej myszy i wskazuje miejsca koagulacji tętnicy i żyły udowej (żółte X), bezpośrednio proksymalnie względem tętnicy obocznej bocznej uda (LCFA) oraz proksymalnie względem złą.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Podczas gdy niedokrwienie kończyn tylnych myszy jest najczęściej stosowanym modelem przedklinicznym do badania neowaskularyzacji w PAD i CLTI, istnieje znaczna różnica w nasileniu niedokrwienia i powrocie do zdrowia w zależności od konkretnego zastosowanego szczepu myszy oraz miejsca, liczby i metody przerwania tętnic. Połączenie podwiązania tętnicy udowej i podawania IP L-NAME może niezawodnie indukować zgorzel kończyn tylnych u myszy FVB11. To samo leczenie powoduje niedokrwienie kończyn tylnych.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez granty dla Z-J L i OC V z National Institutes of Health [R01HL149452 i VITA (NHLBl-CSB-HV-2017-01-JS)]. Dziękujemy również Zakładowi Mikroskopii i Obrazowania w ramach Miami Project to Cure Paralysis przy University of Miami School of Medicine za zapewnienie dostępu do oprogramowania do analizy i przetwarzania obrazów.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Spinki do segregatorów (małe) | z artykułami biurowymi | ||
| Buprenorfina (o przedłużonym uwalnianiu) | |||
| Igła motylkowa (25 G z Luer-Lok) | VWR | 10148-584 | |
| Konfokalny laserowy mikroskop skaningowy | Leica | TCS SP5 | |
| DiI (nadchloran 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetrametyloindokarbocyjaniny) | Invitrogen | D282 | |
| Urządzenie do elektrokoagulacji | Gemini System kauteryzacji | 5917 | |
| Etanol (100%) | VWR | 89370-084 | |
| Fidżi (ImageJ) oprogramowanie | NIH | Używana wersja 2.1.0. Bezpłatne pobieranie, licencja nie jest wymagana. | |
| Piankowe podkładki do biopsji | Fisher Scientific | 22-038-221 | |
| Formalina (neutralnie buforowana, 10%) | VWR | 89370-094 | |
| Myszy FVB | Jackson Laboratory | 001800 | |
| Glukoza | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| HCl (1 M) | Sigma-Aldrich | 13-1700 | |
| Oprogramowanie Imaris | Oxford Instruments | Używana wersja 9.6.0. | |
| Isoflurane | Pivetal | NDC 46066-755-04 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Ketamina | |||
| L-NAME (chlorowodorek estru metylowego Nω--Nitro-L-argininy) | Sigma-Aldrich | N5751 | |
| Laserowy obrazownik perfuzyjny Doppler | MoorLDI | moorLDI2-HIR | Używane oprogramowanie moorLDI V5. |
| Szkiełka mikroskopowe (25 x 75 x 1 mm) | VWR | 48311-703 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S7907 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S8282 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S8263 | |
| Igły (27 G) | BD | 305109 | |
| wacik jodowy z powidonem (10%) | Medline | MDS093901ZZ | |
| Narzędzia chirurgiczne | Roboz Surgical | Zalecane są cienkie kleszcze, igłownik, nożyczki sprężynowe i hemostat. | |
| Szew (wchłanialny 5-0) | DemeTECH | G275017B0P | |
| (10 ml) | BD | 305482 | |
| Trójdrożne krany | Cole-Parmer | 19406-49 | |
| Wtyczka | Bezpłatne pobieranie, licencja nie jest wymagana. Zobacz odniesienie: Elfarnawany (2015). | ||
| Ksylazyna |
Bibliografia
- Virani, S. S., et al. Heart disease and stroke statistics-2020 update: A report from the American Heart Association. Circulation. 141 (9), 139(2020).
- Duff, S., Mafilios, M. S., Bhounsule, P., Hasegawa, J. T. The burden of ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
