Artykuł metodologiczny

Metody in vitro i in vivo do badania megakariopoezy

702 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63286

⸱

17 listopada 2021

 ,  , 
1Université de Strasbourg, INSERM, EFS Grand Est, BPPS UMR-S 1255, FMTS, F-67065 Strasbourg, France

W tym artykule

Streszczenie

OMÓWIONE ARTYKUŁY:

1. Pongerard, A., Mallo, L., Gachet, C., Lanza, F., Strassel, C. Leukodepletion filtruje komórki CD34 + jako źródło komórek do badania różnicowania megakariocytów i tworzenia płytek krwi. Dziennik Eksperymentów Wizualnych: JoVE. (171), E62499 (2021).

2. Kimmerlin, Q., Tavian, M., Gachet, C., Lanza, F., Brouard, N. Izolacja progenitorów megakariocytów myszy. Dziennik Eksperymentów Wizualnych: JoVE. (171), E62498 (2021).

3. Boscher, J., Gachet, C., Lanza, F., Léon, C. Hodowla megakariocytów w hydrożelu 3D na bazie metylocelulozy w celu poprawy dojrzewania komórek i zbadania wpływu sztywności i ograniczenia. Dziennik Eksperymentów Wizualnych: JoVE. (171), E62511 (2021).

4. Scandola, C., Lanza, F., Gachet, C., Eckly, A. Eksploracja in situ mysiej megakariopoezy za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Dziennik Eksperymentów Wizualnych: JoVE. (171) E62494 (2021).

5. Guinard, I., Gachet, C., Lanza, F., Léon, C., Eckly, A. Dynamika tworzenia propłytek u świeżych eksplantatów szpiku kostnego myszy. Dziennik Eksperymentów Wizualnych: JoVE. (171), E62501 (2021).

6. Bornert, A., Pertuy, F., Gachet, C., Lanza, F., Léon, C. Obrazowanie in vivo dwufotonowe megakariocytów i propłytek krwi w szpiku kostnym czaszki myszy. Dziennik Eksperymentów Wizualnych: JoVE. (171), E62515 (2021)

Artykuł redakcyjny

Płytki krwi to małe, bezjądrzaste komórki krwi, niezbędne do hemostazy, które pochodzą z megakariocytów (MK) w szpiku kostnym (BM). Podczas różnicowania z hematopoetycznymi komórkami macierzystymi, MK przekształcają się w gigantyczne komórki w złożonym procesie różnicowania i dojrzewania, który obejmuje poliploidyzację i dojrzewanie cytoplazmatyczne. W końcowej fazie rozwoju, gdy MK stykają się z komórkami śródbłonka, osiągają dojrzały etap i rozciągają długie przedłużenia cytoplazmatyczne, zwane propłytkami, do naczyń krwionośnych, które następnie rozpadają się, dając początek płytkom krwi 1,2. Mechanizmy regulujące dojrzewanie MK i przezśródbłonkowe tworzenie się propłytek krwi nie są jeszcze w pełni poznane. Celem tej kolekcji jest zebranie uzupełniających się metod, które przyczynią się do lepszego zrozumienia biologii MK in vitro i in vivo.

Ekspansja i różnicowanie MK in vitro jest szeroko stosowane do badania mechanizmów leżących u podstaw biogenezy płytek krwi. W protokole Pongerarda i wsp. autorzy opisują standaryzowany protokół hodowli w celu różnicowania MK od ludzkich komórek progenitorowych hematopoetycznych CD34+. Szczególnie podkreślają, że filtry leukocytów dostępne w centrach krwiodawstwa są wyjątkowym źródłem do pobierania komórek CD34+. Ich artykuł zawiera kilka podstawowych wskazówek, jak ekstrahować komórki CD34+, jak ocenić ich czystość i znaczenie ich gęstości wysiewu. Autorzy proponują również skalibrowaną metodę pipetowania, pięć razy z rzędu, w celu skutecznego uwalniania funkcjonalnych płytek krwi. Interesującymi zastosowaniami tej metody jest możliwość oceny związków farmakologicznych lub genetycznej manipulacji komórkami CD34+ za pomocą metody edycji genomu CRISPR-Cas9 3,4. W badaniach na myszach Kimmerlin i wsp. przedstawiają strategię sortowania komórek w celu oczyszczenia progenitorów MK w wystarczającej liczbie zgodnej z testami molekularnymi i komórkowymi. Autorzy omawiają zalety wykorzystania grzebienia biodrowego jako źródła szpiku kostnego zawierającego dużą liczbę krwiotwórczych komórek progenitorowych oraz przeprowadzenia dwuetapowego magnetycznego zubożenia niechcianych komórek przed sortowaniem komórek przy użyciu kombinacji markerów powierzchni komórki. Główną zaletą tej metody jest zmniejszenie liczby zwierząt potrzebnych do uzyskania wysoko oczyszczonych przodków MK, co może być interesujące np. dla badaczy zajmujących się hierarchią i różnicowaniem się komórek macierzystych hematopoetycznych. W tym kontekście Boscher i in. opisują metodę hodowli przodków w pożywce 3D składającej się z 2% metylocelulozy, aby lepiej naśladować środowisko in vivo. W rzeczywistości autorzy ci wykazali wcześniej, że MK wyhodowane w hydrożelu 3D osiągają większy stan dojrzewania i większą zdolność do tworzenia przodków w porównaniu z tymi hodowanymi w płynnym podłożu5. W protokole tym podkreślono kluczowe etapy, takie jak odpowiednia objętość metylocelulozy w celu uzyskania optymalnej sztywności podłoża, liczba komórek, które powinny być równoważne w każdych warunkach doświadczalnych oraz ryzyko zanieczyszczenia. W celu funkcjonalnej weryfikacji poziomu dojrzewania autorzy wyjaśniają, jak ponownie zawiesić komórki hodowane w żelu w płynnym podłożu w trzecim dniu hodowli i jak utrwalić komórki do przyszłej analizy za pomocą barwienia immunologicznego, cytometrii przepływowej lub mikroskopii elektronowej. Transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM) jest metodą obrazowania z wyboru w celu zapewnienia ultrastruktury MK w wysokiej rozdzielczości. W tym przypadku Scandola i in. dzielą się protokołem do analizy ultrastruktury MK w ich naturalnym środowisku BM oraz do ilościowego określenia ich gęstości komórek i oceny różnych etapów dojrzewania. Autorzy używają TEM do analizy zdarzeń komórkowych, które występują, gdy MK oddziałują ze ścianą sinusoidalną, takich jak ich krótkie inwazyjne wypukłości przypominające podosomy penetrujące śródbłonek6. Ograniczeniem metody jest to, że początkowa faza zaangażowania MK nie może być analizowana ze względu na brak specyficznych cech ultrastrukturalnych tych niedojrzałych komórek. Jak już wspomniano, to podejście do obrazowania ma tę zaletę, że wykorzystuje małe próbki BM, co pozwala na przeprowadzenie wielu badań za pomocą jednej myszy. Na przykład inne próbki szpiku kostnego można wykorzystać do techniki eksplantacji szpiku kostnego, która jest przedstawiona w tej kolekcji przez Guinard i wsp. w celu zbadania dynamicznego wydłużania się propłytek z MK. Siła tej metody polega na wykorzystaniu MK, które rozwinęły się w BM, unikając w ten sposób potencjalnej błędnej interpretacji wynikającej z artefaktów różnicowania komórek w hodowli. Rzeczywiście, zostało to wcześniej udokumentowane u myszy z inaktywacją MYH9 ograniczoną przez MK, gdzie rozbieżne wyniki stwierdzono in vitro i ex vivo7. Autorzy podkreślają również prosty, powtarzalny i szybki charakter tego podejścia. Ciekawostką w ich protokole jest możliwość korzystania z mikroskopów wyposażonych w oprogramowanie nawigacyjne ułatwiające śledzenie/kwantyfikację MK wydłużających propłytki. Metodą uzupełniającą model eksplantatu jest dwufotonowe obrazowanie MK w czaszce myszy. Wyjątkowość tej techniki polega na możliwości badania in vivo dynamicznego zachowania znakowanych fluorescencyjnie MK w szpiku kostnym oraz wizualizacji wydłużenia propłytkowego. Protokół ten ma tę zaletę, że jest minimalnie inwazyjny, z ograniczonymi interwencjami chirurgicznymi, co pozwala uniknąć reakcji zapalnych, które według doniesień wpływają na tworzenie się propłytek. Jak zauważają Bornert i wsp., jednym z ograniczeń tej metody jest niewielka głębokość, którą można zobrazować ze względu na gęstość kości, co również wymusza użycie młodszych myszy. Technika ta może być zastosowana do genetycznie zmodyfikowanych myszy w celu zbadania roli genów będących przedmiotem zainteresowania w tworzeniu płytek krwi in vivo. Na przykład autorzy wykorzystali tę technikę, aby wykazać, że rola mikrotubul w wydłużaniu propłytek krwi różni się w warunkach in vitro i in vivo 8.

Nieprawidłowy rozwój MK i produkcja płytek krwi mogą prowadzić do małopłytkowości lub małopłytkowości, zwiększając odpowiednio ryzyko krwawienia lub zakrzepicy. Nieustanne wysiłki zmierzające do zbadania mechanizmów molekularnych rządzących biogenezą płytek krwi zwiększą naszą zdolność do opracowywania nowych strategii leczenia małopłytkowości i małopłytkowości. W dziedzinie badań nad transfuzjami krwi wysiłki te stworzą podstawy do produkcji kultur płytek krwi jako alternatywy dla transfuzji w wybranych sytuacjach9.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez ARMESA (Association de Recherche et Développement en Médecine et Santé Publique), Unię Europejską za pośrednictwem Europejskiego Funduszu Rozwoju Regionalnego (EFRF) oraz przez grant ANR-17-CE14-Megaplatprod dla H.d.S i ANR-18-CE14-PlatForMechanics dla C.L.

Bibliografia

  1. Boscher, J., et al. Blood platelet formation at a glance. Journal of Cell Science. 133 (20), 244731(2020).
  2. Machlus, K. R., Italiano, J. E. The incredible journey: From megakaryocyte development to platelet formation. The Journal of Cell Biology. 201 (6), 785-796 (2013).
  3. Strassel, C., et al. Aryl hydrocarbon receptor-dependent enrichment of a megakaryocytic precursor with a high potential to produce proplatelets. Blood. 127 (18), 2231-2240 (2016).
  4. Montenont, E., et al. CRISPR-edited megakaryocytes for rapid screening of platelet gene functions. Blood Advances. 5 (9), 2362-2374 (2021).
  5. Aguilar, A., et al. Importance of environmental stiffness for megakaryocyte differentiation and proplatelet formation. Blood. 128 (16), 2022-2032 (2016).
  6. Eckly, A., et al. Megakaryocytes use in vivo podosome-like structures working collectively to penetrate the endothelial barrier of bone marrow sinusoids. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 18 (11), 2987-3001 (2020).
  7. Eckly, A., et al. Proplatelet formation deficit and megakaryocyte death contribute to thrombocytopenia in Myh9 knockout mice. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 8 (10), 2243-2251 (2010).
  8. Bornert, A., et al. Cytoskeletal-based mechanisms differently regulate in vivo and in vitro proplatelet formation. Haematologica. 106 (5), 1368-1380 (2021).
  9. Strassel, C., Gachet, C., Lanza, F. On the way to in vitro platelet production. Transfusion Clinique et Biologique. 25 (3), 220-227 (2018).

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Megakaryocyte DifferentiationPlatelet FormationCD34+ CellsMouse Megakaryocyte Progenitors3D Methylcellulose-based HydrogelCell MaturationMurine MegakaryopoiesisTransmission Electron MicroscopyProplatelet Formation DynamicsTwo-photon ImagingBone Marrow Explants
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.