Artykuł metodologiczny

Szybka izolacja dzikich nicieni za pomocą lejka Baermanna

14K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63287

⸱

31 stycznia 2022

 ,  , 
1Department of Biology and Center for Genomics & Systems Biology, New York University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół przedstawia metodę efektywnego wydobywania żywych nicieni z naturalnych substratów w terenie.

Streszczenie

Poza tym, że są solidnymi eksperymentalnymi organizmami modelowymi, Caenorhabditis elegans i jego krewni są również prawdziwymi zwierzętami żyjącymi w naturze. Badania dzikich nicieni w ich naturalnym środowisku są cenne dla zrozumienia wielu aspektów biologii, w tym reżimów selektywnych, w których ewoluują charakterystyczne cechy genomowe i fenotypowe, genetycznych podstaw złożonej zmienności cech oraz naturalnej różnorodności genetycznej fundamentalnej dla wszystkich populacji zwierząt. Ten manuskrypt opisuje prostą i skuteczną metodę ekstrakcji nicieni z ich naturalnych substratów, w tym gnijących owoców, kwiatów, grzybów, ściółki z liści i gleby. Metoda lejkowa Baermanna, klasyczna technika nematologiczna, selektywnie izoluje aktywne nicienie od ich substratów. Ponieważ technika lejka Baermanna pozwala na odzyskanie rzadkich i wolno rosnących genotypów, które współwystępują z licznymi i szybko rosnącymi genotypami, co może zostać pominięte w metodach ekstrakcji obejmujących wiele pokoleń rozmnażania. Technika ta doskonale nadaje się również do rozwiązywania problemów metagenetycznych, populacyjnie i ekologicznych. Obejmuje jednocześnie całą populację w próbce, umożliwiając bezstronny wgląd w naturalny rozkład wieku, płci i genotypów. Protokół pozwala na wdrożenie na dużą skalę w terenie, szybko przekształcając podłoża w płytki ślimakowe, a autorzy potwierdzili go poprzez prace terenowe na wielu kontynentach.

Wprowadzenie

Cenne spostrzeżenia biologiczne pojawiają się w miarę jak badacze studiujący C. elegans w laboratorium rozszerzają zakres swoich zainteresowań na C. elegans oraz pokrewne nicienie rhabditidy występujące w naturze. Badania nicieni dzikich pozwalają osadzić geny i genomy w ich naturalnym kontekście, ujawniając funkcje, które mogą być maskowane przez warunki laboratoryjne1,2,3,4,5. Badania te dostarczają wiedzy na temat warunku niezbędnego dla samej ewolucji, jakim jest zmienność genetyczna6,7,8,9,10. Naturalna zmienność genetyczna uchwycona w próbkach dzikich stanowi również punkt wyjścia do badania podłoża genetycznego wielu złożonych cech11,12,13.

Podczas projektowania badań wymagających izolacji naturalnych populacji nicieni, zwłaszcza w przypadku prowadzenia prac terenowych w odległych lokalizacjach, kluczowe stają się kwestie praktyczne. Niniejszy protokół ma na celu czystą izolację całych populacji aktywnych nicieni, które mogą być hodowane na OP50, z przynęt lub podłoży naturalnych. Metoda ta jest dobrze dostosowana do ekstrakcji wolnożyjących nicieni z grup rhabditid i diplogasterid, w tym Caenorhabditis, Oscheius oraz Pristionchus.

Istnieje wiele technik izolowania nicieni z ich podłoży14,15. Najprostszym podejściem jest umieszczenie podłoża bezpośrednio na płytce z pożywką dla nicieni i wyłapywanie zwierząt w momencie, gdy z niego wychodzą8,15. Metoda ta wymaga dużych nakładów czasu i pracy, jeżeli celem jest wyizolowanie wszystkich nicieni z próbki. Bardziej zaawansowane techniki wykorzystują masę, rozmiar, mobilność zwierząt lub kombinację tych cech14. Każda metoda ma swoje zalety i wady pod względem przygotowania oraz wydajności. Różnią się one również pod kątem błędów próbkowania i mogą selekcjonować określone nicienie, jeśli zwierzęta w próbce różnią się wzdłuż osi zasady separacji danej metody.

Metoda lejka Baermanna została po raz pierwszy opisana w 1917 roku przez holenderskiego lekarza G. K. T. F. Baermanna, który wynalazł to urządzenie na Jawie podczas badań nad nicieniami glebowymi, w tym nad pasożytniczymi nicieniami haczykowatymi16. Lejek Baermanna działa w oparciu o zasadę mobilności. Substrat umieszcza się w lejku wyłożonym filtrem z tkaniny lub papieru (w niniejszym badaniu zastosowano „Kimwipe”, określany w bieżącym protokole jako „przepiórka bezpyłowa”) i uszczelnia go u dołu. Następnie lejek napełnia się wodą, zanurzając próbkę, podczas gdy filtr oddziela ją od zamkniętego wylotu. Aktywne nicienie znajdujące się w próbce uwalniają się do wody i przepływają przez filtr, ostatecznie osiadając na dnie lejka. Wylot lejka zostaje otwarty, a kropla zawierająca nicienie jest wypuszczana na płytkę (Rycina 1).

Schemat entomologii sądowej, analiza cyklu życia muchówki za pomocą leja Baermanna, badanie ekosystemu rozkładu.
Rycina 1: Podsumowanie techniki leja Baermanna. (A) Pobieranie próbki bogatej w bakterie z wyznaczonego miejsca. (B) Zanurzenie próbki w leju Baermanna i oczekiwanie, aż nicienie wyślizgną się i opadną na dno. (C) Wypuszczenie pojedynczej kropli z leja. (D) Przenoszenie pojedynczych hermafrodytów lub zapłodnionych samic na oddzielne płytki. Ilustracja autorstwa Ramina Rahni. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Lejek Baermanna nie będzie skuteczny dla każdego rodzaju nicieni (alternatywne metody opisano w sekcji Dyskusja) i najlepiej nadaje się do form aktywnych o rozmiarach zbliżonych do Caenorhabditis lub mniejszych14. Jeśli jednak w badaniu można zastosować lejek Baermanna, wiąże się to z wieloma zaletami. Metoda ta jest praktyczna w warunkach terenowych, wymagając minimalnej konfiguracji, czasu pracy oraz nakładów finansowych. Badacz otrzymuje czystą próbkę bez zanieczyszczeń z podłoża na płytce, co ułatwia wyławianie osobników. Zastosowanie filtra zapobiega również kontaminacji płytki larwami owadów lub roztoczami, które mogą niszczyć podłoże lub polować na nicienie w próbce. Co najważniejsze, lejek Baermanna efektywnie ekstrahuje niemal całą populację z podłoża14, co może być wymagane w zależności od projektu badania. Przykładowo, metoda ta może być przydatna dla badaczy zainteresowanych liczeniem rozkładu stadiów rozwojowych lub płci w populacjach dzikich, poszukiwaniem genotypów rzadkich lub wolno rosnących, bądź próbkowaniem nicieni, które nie są przyciągane przez OP50. Jest to odpowiednie dla naukowców badających kwestie ekologiczne17, genetyki populacyjnej18 lub metagenetyczne19, ponieważ schemat próbkowania pozwala na uchwycenie stanu populacji w momencie pobrania próbek.

Niniejszy artykuł opisuje kompletny protokół izolowania populacji nicieni przy użyciu lejka Baermanna oraz tworzenia linii izofemałych i izohermafrodytnych w terenie, z wykorzystaniem sprzętu dobranego pod kątem łatwego transportu. W przypadku badaczy prowadzących prace terenowe w pobliżu swoich laboratoriów, wiele z tych kroków można pominąć lub uprościć.

Protokół

1. Przygotowanie wysianych płytek NGM w terenie

  1. Przed wyjazdem odważ 23,005 g proszku do pożywki Nematode Growth Medium (NGM) (patrz Tabela materiałów) i zapakuj go do szczelnej plastikowej torebki. Przygotuj jedną torebkę na każdy litr pożywki.
    UWAGA: Wstępne pakowanie przed wyjazdem eliminuje konieczność posiadania sprawnej wagi w terenie.
  2. Przed wyjazdem przygotuj 1 mL 1M MgSO4, 1 mL 1M CaCl2 oraz 25 mL 1M buforu fosforanowego potasu na każdy litr pożywki. Aby przygotować 1 L buforu fosforanowego potasu, rozpuść 108,3 g KH2PO4 i 35,6 g K2HPO4 w wodzie, zgodnie z opisem w WormBook20.
  3. Przed wyjazdem przygotuj nocną kulturę OP50 (patrz Tabela materiałów) hodowaną w LB w 37 °C, zgodnie z opisem w WormBook20. Rozdziel kulturę do 50 mL probówek stożkowych i owiń ich górne części folią parafinową, aby zapobiec wyciekom.
  4. W terenie rozpuść zawartość torebki NGM w 973 mL wody podwójnie destylowanej (ddH20) lub najczystszej, najbardziej sterylnej wody dostępnej, w kolbie lub butelce o pojemności 1 L.
  5. Umieść kolbę lub butelkę z pożywką, z luźno zamkniętą zakrętką lub przykrytą folią aluminiową, w kąpieli z wrzącej wody na płycie grzewczej lub kuchence. Mieszaj sporadycznie, aż cały proszek się rozpuści i roztwór stanie się klarowny (zajmuje to ok. 30 min).
    UWAGA: Jeśli dostępna jest magnetyczna płyta grzewcza, magnes mieszający jest doskonałym rozwiązaniem w celu ograniczenia ilości mieszania ręcznego.
  6. Wyjmij pożywkę z kąpieli wodnej i schłodź do ok. 58 °C, sporadycznie wstrząsając lub używając magnesu mieszającego. Po schłodzeniu pożywki do 58 °C użyj pipet serologicznych lub standardowych, aby dodać 25 mL 1M buforu fosforanowego potasu, 1 mL 1M MgSO4 oraz 1 mL 1M CaCl2, dobrze mieszając po każdym kroku.
  7. W najbardziej sterylnym dostępnym środowisku pipetuj lub wlej pożywkę do szalek o pożądanej wielkości i pozostaw do ostygnięcia i zastygnięcia na noc. Przygotuj jedną szalkę 60 mm (~10 mL) dla każdej próbki podłoża. Przygotuj jedną szalkę 35 mm (~3,5 mL) dla każdej linii izofemale; liczbę potrzebnych małych szalek trudno przewidzieć z wyprzedzeniem.
  8. Naniesienie pipetą 50 µL kultury OP50 na każdą szalkę i pozostaw do wyschnięcia i wzrostu na noc przed użyciem.

2. Pobieranie substratów z nicieniami

  1. Zidentyfikuj w terenie podłoże bogate w bakterie. Przykłady obejmują gnijące owoce, kwiaty, grzyby oraz łodygi roślin zielnych. Gleba i ściółka liściowa są również odpowiednie, choć rzadko zawierają Caenorhabditis.
  2. Używając dłoni w rękawiczce, umieść próbkę tego podłoża (1-15 cm3) w szczelnym worku plastikowym (patrz Tabela materiałów) oznaczonym unikalnym identyfikatorem próbki (Rycina 1A).
  3. Zanotuj identyfikator próbki, szerokość i długość geograficzną, datę, opis podłoża oraz wszelkie inne lokalne pomiary środowiskowe istotne dla eksperymentu, w tym temperaturę otoczenia i podłoża, godzinę pobrania, stan podłoża, obecność makrobezkręgowców związanych z podłożem i tak dalej. Do usprawnienia tego procesu dostępna jest aplikacja na smartfona21.

3. Przygotowanie zestawu lejków Baermanna

  1. Dla każdego lejka odciąć nożyczkami fragment gumowej rurki (patrz Tabela materiałów) o długości ok. 3 cm.
  2. Nałożyć fragment rurki na końcówkę plastikowego lejka (patrz Tabela materiałów). Może to wymagać pewnego wysiłku, ponieważ dopasowanie jest bardzo ciasne.
  3. Nasunąć zacisk do rurek na gumową rurkę i zacisnąć go.
  4. Aby wykonać uchwyt na lejki, za pomocą skalpela wyciąć w dnie tekturowej tacy na fiolki do muszek (patrz Tabela materiałów) otwory okrągłe o średnicy 35 mm, zanim taca zostanie złożona z płaskiego opakowania transportowego. Standardowa taca pomieści 12 takich otworów w układzie 3 x 4.
  5. Odwrócić tekturę, raz złożyć boki (nie dwa razy, jak przy tworzeniu tacy na fiolki do muszek) i skleić boki taśmą, aby unieść odwróconą tekturową tacę (Rysunek 2).
  6. Umieścić lejki w otworach, upewniając się najpierw, że zaciski do rurek są w pozycji zamkniętej.

Układ eksperymentu kiełkowania nasion; konstrukcja z tektury z plastikowymi kubkami do uprawy roślin.
Rysunek 2: Przerobione tekturowe tacki do fiolek dla muszek, złożone i docięte tak, aby pomieścić po 12 lejków Baermanna w każdej z nich.Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

4. Przenoszenie próbek do lejków

  1. Wlej wodę (najbardziej sterylną z dostępnych) do każdego lejka, wypełniając go do poziomu około 3 cm poniżej krawędzi. Jeśli w rurkach uwięzły pęcherzyki powietrza, opukaj lejek, aby je usunąć.
  2. W rękawiczkach włóż bezpyłową chusteczkę lub konkretnie Kimwipe (złożoną na pół, aby uzyskać kwadrat) na lejek i dociśnij środek, aby chusteczka została zanurzona w wodzie.
  3. Ręcznie rozdrobnij duże, stałe części substratów naturalnych (owoców, kwiatów, gleby, ściółki liściowej itp.) na mniejsze fragmenty, aby zminimalizować odległość, jaką dżdżownice muszą przebyć, aby wypaść z substratu.
    UWAGA: Ściółkę liściową i próbki o nieregularnych kształtach można poddać wstępnej obróbce w procesorze spożywczym lub blenderze.
  4. Ostrożnie umieść próbkę naturalnego substratu (1-15 cm3) na chusteczce/bezpyłowej ściereczce w lejku, uważając, aby nie przebić chusteczki i aby próbka nie wystawała ponad krawędź.
  5. Oznacz lejek lub tekturę obok lejka identyfikatorem próbki odpowiadającym notatkom z poboru terenowego.
  6. Zawiń rogi chusteczki/bezpyłowej ściereczki nad próbką (Rycina 1B). Należy zadbać o to, aby próbka pozostała zamknięta wewnątrz chusteczki/bezpyłowej ściereczki, tak aby gleba lub zanieczyszczenia nie przedostały się na dno lejka.
    UWAGA: Ten krok ma na celu zapobieganie zwisaniu rogów chusteczki poza krawędź lejka, co mogłoby spowodować odciąganie wody z lejka na zewnątrz.
  7. Ręcznie, za pomocą szpatułki lub końcówki pipety, usuń wszelkie aktywne owady, paciorkowce lub inne zwierzęta, które mogłyby przemieszczać się z lejka do lejka, powodując kontaminację krzyżową próbek. Owiń chusteczkę/bezpyłową ściereczkę całkowicie wokół próbki lub połóż drugą chusteczkę na górze próbki, aby zapobiec kontaminacji krzyżowej.
  8. Dolej wody do lejków tak, aby cała próbka została zanurzona (Rycina 3).

Eksperyment fermentacji herbaty; próbki w kubkach na siatce obserwacyjnej do analizy mikrobiologicznej.
Rysunek 3: Złożone lejki Baermanna. Każda próbka jest owinięta w chusteczkę/przepustkę beztkaninową i zanurzona w wodzie w lejku, który jest szczelnie zamknięty zaciskiem. W ciągu około 12 h nicienie przemieszczą się przez tkaninę na dno lejka. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

5. Ekstrakcja nicieni z lejkow

  1. Odczekać ok. 12 h lub pozostawić przez noc. W tym czasie aktywne nicienie wyślizgną się z podłoża, przejdą przez tkankę/przepustkę beztkankową i opadną na dno zaklampowanego lejka.
    UWAGA: Odczekanie znacznie dłużej niż 12 h grozi śmiercią nicieni z powodu hipoksji lub infekcji patogennej, co może być ryzykiem również przy krótszych odstępach czasu w przypadku próbek szczególnie gęsto zasiedlonych nicieniami i bakteriami.
  2. Zapisać identyfikator próbki z lejka na spodzie 60 mm płytki NGM z wysianą plamką bakterii E. coli OP50. Zdjąć pokrywkę z płytki.
  3. Zdjąć lejek zawierający daną próbkę ze stojaka na lejki. Trzymając jedną ręką lejek pionowo nad otwartą płytką z nicieniami, drugą ręką zwolnić ucisk zacisku na rurce, pozwalając jednej kropli wody spaść z rurki na płytkę (Rysunek 1C). Gdy tylko woda spadnie z lejka, należy go szybko ponownie zacisnąć, aby zapobiec zalaniu płytki NGM.
    UWAGA: Aby wyselekcjonować nicienie przyciągane przez OP50, w tym gatunki Caenorhabditis, należy wypuścić kroplę z dala od lawns bakterii. Gdy woda wniknie w płytkę lub odparuje, nicienie Caenorhabditis wpełzną na lawn bakterii.
  4. Sprzątanie: Wyrzucić zawartość lejków. Umyć lejki gorącą wodą w celu ich ponownego wykorzystania.

6. Zakładanie kultur

  1. Obserwuj wyizolowane nicienie pod stereomikroskopem przy powiększeniu od 5x do 50x. Na szalkach powinny znajdować się nicienie, a z znacznie mniejszą częstotliwością małe pierścienice z grupy oligoset, niesiorców, wrotki i małe skorupiaki (Rysunek 4).
    ​UWAGA: Jeśli lejek został ustawiony prawidłowo, żadne roztocza, owady ani widoczny materiał nieożywiony nie przedostaną się przez niego.

Obraz mikroskopowy nicieni; badanie biologiczne; obserwacja mikroskopowa; analiza organizmu.
Rysunek 4: Zawartość pierwszej kropli zlejonej z lejka Baermanna na płytkę NGM. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

  1. Aby utworzyć linie izohermafrodytyczne lub izofemale, użyj pętliczki do przeniesienia każdego hermafrodyty w stadium L4 lub zapłodnionej dorosłej samicy (rozpoznawalnej po większym rozmiarze ciała i braku charakterystycznego ogona samca22) na oddzielną płytkę NGM o średnicy 35 mm z wysianym szczepem OP50 (Rysunek 1D). Przed i po przenoszeniu nicieni wysterylizuj pętliczkę za pomocą zapalniczki.
  2. Użyj folii parafiny do dokładnego owinięcia płytek przed transportem.

Wyniki

Niniejszy protokół został zastosowany do izolacji nicieni z owoców, kwiatów, grzybów, gleby i łodyg na wyspie Barro Colorado w Panamie, w stacji terenowej Instytutu Badań Tropikalnych Smithsonian w sierpniu 2018 roku. Ze 131 podłoży przetworzonych przez jednego badacza w ciągu czterech dni, 130 podłoży (99,2%) dostarczyło nicieni. Czterdzieści cztery podłoża (33,6%) pozwoliły na wyizolowanie nicieni z rodzaju Caenorhabditis (Rysunek 5). Dalsza analiza kultur ustanowionych z tych czterdziestu czterech podłoży, przeprowadzona za pomocą PCR i testów krzyżowania23, wykazała obecność sześciu różnych gatunków Caenorhabditis – C. becei, C. tropicalis, C. briggsae, C. sp. 24, C. sp. 57 oraz C. panamensis.

Niniejszy protokół został ponownie zastosowany do izolacji nicieni z różnych substratów w Strefie Wykluczenia Czarnobyla na Ukrainie w ciągu czterech dni w sierpniu 2019 roku. Żywe nicienie odzyskano z 62 z 63 próbek gleby, 1 z 17 próbek bezkręgowców, 31 z 75 próbek owoców, 1 z 12 próbek przynęt (patrz sekcja Dyskusja), natomiast nie odzyskano żadnych nicieni z próbek grzybów, trzciny rzecznej ani odchodów wilka (pobrano jedną próbkę każdego z tych materiałów). Następujące sekwencjonowanie rybosomalnego DNA 18S15 pozwoliło zidentyfikować te nicienie jako Oscheius, Panagrolaimus, Acrobeloides, Mesorhabditis, Panagrellus, Pristionchus oraz Pelodera, jednak nie zidentyfikowano żadnych przedstawicieli rodzaju Caenorhabditis (Rycina 5).

Wykres słupkowy porównujący próbki nicieni z Panamy i Ukrainy; analiza nicieni w stosunku do Caenorhabditis.
Rysunek 5: Odsetki sukcesu dwóch wypraw kolekcjonistycznych. Panama w 2018 roku (po lewej) i Ukraina w 2019 roku (po prawej). Aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

Dyskusja

Główną zasadą tej metody jest to, że nicienie przejdą przez tkankę zanurzoną w wodzie, podczas gdy ich podłoże i większe zanieczyszczenia bezkręgowców nie. Krytycznymi etapami protokołu są: (1) zebranie odpowiedniego substratu, (2) zanurzenie substratu, owiniętego w materiał filtrujący, w wodzie, (3) zebranie robaków, które przeszły przez filtr i opadły na dno wody, oraz (4) odizolowanie pojedynczych robaków w celu utworzenia linii izożeńskich lub izohermafrodytowych. Wszystkie inne części metody mogą być modyfikowane w razie potrzeby w zależności od dostępnych zasobów, charakteru substratów lub celów prac terenowych. Oto kilka modyfikacji, które warto rozważyć.

Przynęta na robaki poprzez sadzenie owoców
Jeśli na terenie pola nie ma wystarczającej ilości bogatego w bakterie gnijącego materiału, można przynieść próbkę, taką jak kawałek jabłka lub pomidora, aby pozostawić ją do zgnicia. Dobrze przypnij przynętę kilkoma kołkami, aby większe zwierzęta ich nie usunęły i aby można ją było później łatwo znaleźć do zbioru. Unikaj bezpośredniego światła słonecznego, w którym przynęta może wyschnąć, zanim zgnije.

Konstruowanie aparatury lejkowej z dowolnych dostępnych materiałów
Sprawdzi się każda konstrukcja z otworami wystarczająco dużymi, aby pomieścić zacisk rurki i wystarczająco stabilnymi, aby utrzymać ciężki lejek. W przypadku pojedynczego lejka odpowiednim uchwytem jest szklanka do picia. Można użyć każdego rodzaju chusteczek higienicznych – chusteczki higienicznej, papieru toaletowego lub ręczników papierowych.

Umieszczanie mniejszej ilości materiału w lejkach lub dostosowanie czasu oczekiwania, aby zapobiec niedotlenieniu lub infekcji
Jeśli próbka ma bardzo wysokie stężenie robaków lub bakterii, nicienie mogą zacząć umierać z powodu niedotlenienia lub infekcji przed zakończeniem 12-godzinnej inkubacji. Jeśli jest to powód do niepokoju, badacz może wcześniej sprawdzić lejki lub przygotować dodatkowy lejek z bardzo małą podpróbką wysoce zaludnionego substratu.

Dostosowanie przygotowania płytek NGM do potrzeb i ograniczeń eksperymentalnych
Płytki NGM można przygotować z dowolnymi pożywkami i źródłem pożywienia odpowiednimi dla eksperymentu. Opisany powyżej protokół terenowy ma na celu zminimalizowanie wagi bagażu. W zależności od ograniczeń bagażowych i czasu pracy w terenie, przyniesienie już wylanych płytek NGM – przygotowanych w laboratorium lub zakupionych komercyjnie – może być lepsze niż wylewanie płyt w terenie.

Wykonywanie izolacji lejków w laboratorium
W protokole opisano przeprowadzenie pełnej procedury w warunkach polowych w celu schwytania populacji nicieni występującej w naturze. W przypadku niektórych celów badawczych wystarczające może być wyizolowanie nicieni później, po powrocie do laboratorium z próbkami w szczelnie zamkniętych workach. Nawet wtedy metoda lejkowa Baermanna zapewnia czystszą i kompletną próbkę nicieni, które przeżyły, niż inne metody izolacji. Jednak próbki w szczelnie zamkniętych workach mogą ulec selekcji podczas podróży, ponieważ są narażone na potencjalne ekstremalne temperatury i niedotlenienie. Można to zminimalizować, wykonując izolacje tak szybko, jak to możliwe po pobraniu próbki.

Powszechna metoda alternatywna dla lejka Baermanna polega na umieszczeniu podłoża bezpośrednio na płytce NGM i czekaniu, aż robaki wypełzną, co jest albo bardzo pracochłonne, albo skutkuje niekompletnym zebraniem populacji. Daje również płytki zanieczyszczone roztoczami i larwami owadów. Metoda lejkowa Baermanna to tania, niewymagająca technologii i pracochłonna strategia szybkiego oddzielenia całej populacji aktywnych robaków od ich podłoża.

Metoda lejkowa Baermanna nie ma uniwersalnego zastosowania do zbierania wszystkich rodzajów dzikich nicieni. Niektóre nicienie żyjące w roślinach potrzebują znacznie więcej niż 12 godzin, aby wyłonić się z podłoża i nie będą dostępne w przypadku zbyt wcześnie uwolnionej kropli, podczas gdy niektóre pasożyty owadów będą pełzać na górę lejka, a nie na dół, również unikając zbioru14. Alternatywy dla lejka Baermann wymagają albo bardziej specjalistycznego sprzętu, albo więcej pracy w celu odzyskania robaków. Jednak nadal mogą być preferowane, jeśli powyższe zastrzeżenia stanowią problem dla eksperymentu. Alternatywne opcje, sprawdzone przez van Bezooijen14, obejmują metodę natryskiwania lejka, która zapewnia stałą mgłę wody do lejków, dodając tlen i umożliwiając przelewanie się bakterii w zawiesinie. Pozwala to na wydłużenie okresu ekstrakcji nicieni z roślin. Metoda flotacji odśrodkowej mieszalnika odzyskuje nicienie wolno poruszające się, nieaktywne lub pełzające w górę poprzez oddzielenie ich ciężaru właściwego, elutriator Oostenbrink stosuje prąd podziemny do oddzielenia osadu osadzającego się od zawieszonych nicieni, a metoda Cobba wykorzystuje szereg sit do izolowania nicieni według ich wielkości, kształtu i szybkości sedymentacji14. Jednak do zbierania rabditydów lejek Baermann skutecznie wytwarza czyste próbki szybko i przy minimalnym wysiłku.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez granty NIH R35GM141906 i R21ES031364 oraz stypendium Damona Runyona DRG-2371-19.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Butelka szklana 1 LNANA Krok 1 - naczynie do produkcji pożywek płytkowych
1 ml końcówki do pipetdowolneBRAK DANYCHKrok 1 - dozowanie dodatków do pożywki ślimakowej i płytek nasiennych
Pitter 1 mldowolnyBRAK DANYCHKrok 1 - dozowanie dodatków do pożywki ślimakowej i płytek nasiennych
Płytki ślimakowe 35 mmTritechT3500Krok 1 - płytki ślimakowe
rurka gumowa 4mm IDFisher14178AKrok 3 - część lejka
Płytki ślimakowe 60 mmGreiner628161Krok 1 - płytki ślimakowe
65 mm LejekFisher22170156Krok 3 - część lejka
Chlorek wapniaFisherC79-500Krok 1 - płyta ślimakowa medium
Garnek do gotowaniaNANA Krok 1 - kąpiel wodna do topienia agaru do nalewania talerzy
E. coli szczep OP50Centrum Genetyki CaenorhabditisOP50Krok 1 - pokarm dla robaków
Mikroskop polowyOMAXG223CSKrok 6 - do oglądania robaków w terenie
Tacka do przechowywania fiolek na muchyAzer ScientificES-260TKrok 3 - zbudowanie platformy na 12 lejków
Płyta grzewcza lub piecNANAKrok 1 - podgrzanie łaźni wodnej
KimwipesKimberlyClark34120Krok 4 - filtr do lejków
LB mediaGibco10855021Krok 1 - do uprawy zapalniczki OP50
NANAKrok 6 - wysterylizuj pick do robaków
Siarczan magnezuFisherM63-500Krok 1 - płytka ślimakowa medium
Agar NGM-liteUSBiologicalN1000Krok 1 - płytka ślimakowa medium
Folia do pakowania ParafilmM Fisher13-374-10Krok 6 - zapakuj płytki ślimakowe do podróży
Fosforan potasu dwuzasadowyFisherBP363-500Krok 1 - płytka ślimakowa medium
Fosforan potasu jednozasadowyFisherP285-3Krok 1 - płytka ślimakowa średni
skalpelNANAKrok 3 - wyciąć otwory na lejki
nożyczkiNANAKrok 3 - przeciąć gumową rurkę
TaśmaNANAKrok 3 - sklej uchwyt lejka
taśmą Zaciski do wężyFisher5869Krok 3 - część lejka
Wytrysk ślimakowyNANAKrok 6 - do izolowania pojedynczych robaków
Worki do przechowywania w stylu ziplockNANAKrok 2 - aby zapakować próbkę substratu
,

Bibliografia

  1. Frezal, L., Felix, M. A. C. elegans outside the Petri dish. Elife. 4, 05849(2015).
  2. Greene, J. S., et al. Balancing selection shapes density-dependent foraging behaviour. Nature. 539 (7628), 254-258 (2016).
  3. Reddy, K. C., et al. Antagonistic paralogs control a switch between growth and pathogen resistance in C. elegans. PLOS Pathogens. 15 (1), 1007528(2019).
  4. Schulenburg, H., Felix, M. A. The natural biotic environment of Caenorhabditis elegans. Genetics. 206 (1), 55-86 (2017).
  5. Zhang, F., et al. Caenorhabditis elegans as a model for microbiome research. Frontiers in Microbiology. 8, 485(2017).
  6. Andersen, E. C., et al. Chromosome-scale selective sweeps shape Caenorhabditis elegans genomic diversity. Nature Genetics. 44 (3), 285-290 (2012).
  7. Cook, D. E., Zdraljevic, S., Roberts, J. P., Andersen, E. C. CeNDR, the Caenorhabditis elegans natural diversity resource. Nucleic Acids Research. 45, 650-657 (2017).
  8. Crombie, T. A., et al. Deep sampling of Hawaiian Caenorhabditis elegans reveals high genetic diversity and admixture with global populations. Elife. 8, 50465(2019).
  9. Lee, D., et al. Balancing selection maintains hyper-divergent haplotypes in Caenorhabditis elegans. Nature Ecology & Evolution. 5 (6), 794-807 (2021).
  10. Rockman, M. V., Kruglyak, L. Recombinational landscape and population genomics of Caenorhabditis elegans. PLOS Genetics. 5 (3), 1000419(2009).
  11. Evans, K. S., van Wijk, M. H., McGrath, P. T., Andersen, E. C., Sterken, M. G. From QTL to gene: C. elegans facilitates discoveries of the genetic mechanisms underlying natural variation. Trends in Genetics. 37, 933-947 (2021).
  12. Gaertner, B. E., Phillips, P. C. Caenorhabditis elegans as a platform for molecular quantitative genetics and the systems biology of natural variation. Genetics Research (Cambridge Core). 92 (5-6), 331-348 (2010).
  13. Noble, L. M., Rockman, M. V., Teotonio, H. Gene-level quantitative trait mapping in Caenorhabditis elegans. G3 Genes|Genomes|Genetics. 11 (2), 061(2021).
  14. Van Bezooijen, J. Methods and techniques for nematology. , Wageningen University. (2006).
  15. Barrièrre, A., Félix, M. -A. Isolation of C. elegans. and related nematodes. Wormbook. , wormbook.1.115.2 (2014).
  16. Baermann, G. Eine einfache Methode zur Auffindung von Anklostomum (Nematoden) Larven in Erdproben. Geneeskundig tijdschrift voor Nederlandsch-Indië. 57, 131-137 (1917).
  17. Gray, N. F. Ecology of nematophagous fungi Panagrellus redivivus as the target organism. Plant and Soil. 297, 293-297 (1983).
  18. Mallez, S., Castagnone, C., Espada, M., Viera, P., Eisenback, J., Mota, M., Guillemaud, T., Castagnone-Sereno, P. First insights into the genetic diversity of the pinewood nematode in its native area using new polymorphic microsatellite loci. PLOS ONE. 8 (3), 4-11 (2013).
  19. Kerfahi, D., Tripathi, M. B., Porazinska, L. D., Park, J., Go, R., Adams, M. J. Do tropical rain forest soils have greater nematode diversity than High Arctic tundra? A metagenetic comparison of Malaysia and Svalbard. Global Ecology and Biogeography. 25, 716-728 (2016).
  20. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
  21. Di Bernardo, M., Crombie, T. A., Cook, D. E., Andersen, E. C. easyFulcrum: An R package to process and analyze ecological sampling data generated using the Fulcrum mobile application. PLOS ONE. 16, 0254293(2021).
  22. Lints, R., Hall, D. H. Handbook of C. elegans male anatomy. WormAtlas. , (2005).
  23. Kiontke, K., Félix, M. -A., Ailion, M., Rockman, M. V., Braendle, C., Pénigault, J. -B., Fitch, D. H. A phylogeny and molecular barcodes for Caenorhabditis, with numerous new species from rotting fruits. BMC Evolutionary Biology. 11, 339(2011).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Izolacja dzikich nicieniCaenorhabditis eleganspod o a naturalnegenetyka populacyjnapobieranie pr bek terenowychekstrakcja nicieniprzygotowanie szalek z nicieniamistereomikroskopiar norodno genetyczna
Szybka izolacja dzikich nicieni za pomocą lejka Baermanna
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.