Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Szybka analiza wideomikroskopii w diagnostyce pierwszego rzutu pierwotnej dyskinezy rzęsek

5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63292

⸱

19 stycznia 2022

 ,  ,  , 
1Allergy Centre, Tampere University Hospital, 2Department of Pediatrics, Turku University Hospital, 3Turku Bioscience Center, University of Turku and Åbo Akademi University

W tym artykule

Podsumowanie

Szybka analiza mikroskopii wideo jest stosunkowo łatwym do przeprowadzenia, szybkim, opłacalnym i, w doświadczonych rękach, znacznie niezawodnym narzędziem do diagnostyki pierwszego rzutu pierwotnej dyskinezy rzęsek, które powinno być dostępne w każdym ośrodku zajmującym się diagnostyką i leczeniem ciężkich chorób płuc.

Streszczenie

Pierwotna dyskineza rzęsek (PCD) jest wrodzoną chorobą dziedziczoną głównie w autosomalnej cesywnej charakterystyce. Zaburzenie powoduje zaburzenia ruchu rzęsek, prowadząc do ciężkiego upośledzenia klirensu śluzowo-rzęskowego (MCC). Jeśli nie zostanie zdiagnozowany lub zostanie zdiagnozowany zbyt późno, stan ten prowadzi do rozwoju rozstrzeni oskrzeli i poważnego uszkodzenia płuc w późniejszym życiu. Większość metod diagnozowania PCD jest czasochłonna i wymaga znacznych zasobów ekonomicznych w celu ich ustalenia. Szybka analiza wideomikroskopii (HSVMA) jest jedynym narzędziem diagnostycznym do wizualizacji i analizy żywych komórek układu oddechowego z bijącymi rzęskami in vitro. Jest szybki, ekonomiczny i w doświadczonych rękach bardzo niezawodny jako narzędzie diagnostyczne PCD. Ponadto klasyczne środki diagnostyczne, takie jak transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM), nie mają zastosowania w przypadku niektórych mutacji, ponieważ zmiany morfologiczne są nieobecne.

Ten artykuł opisuje proces pobierania komórek nabłonka oddechowego, dalsze przygotowanie próbki oraz proces HSVMA. Opisujemy również, w jaki sposób szczotkowane komórki mogą być z powodzeniem utrzymywane w stanie nieuszkodzonym i bijącym, przechowując je w pożywce odżywczej do przechowywania i transportu do miejsca badania w przypadkach, gdy klinika nie posiada sprzętu do wykonywania HSVMA. Pokazano również filmy z patologicznymi wzorcami bicia od pacjentów z mutacją w genie 11 łańcucha ciężkiego ramienia dyneiny (DNAH11), których nie można zdiagnozować za pomocą TEM; wynik niejednoznacznego HSVMA z powodu zakażenia górnych dróg oddechowych, a także nieudanego szczotkowania z nałożeniem czerwonych krwinek. Tym artykułem chcielibyśmy zachęcić każdą jednostkę zajmującą się pacjentami pulmonologicznymi i rzadkimi chorobami płuc do wykonywania HSVMA w ramach codziennej rutynowej diagnostyki w kierunku PCD lub wysłania próbek do ośrodka specjalizującego się w wykonywaniu HSVMA.

Wprowadzenie

Pierwotna dyskineza rzęsek (PCD) jest rzadką, dziedziczną chorobą genetyczną, która powoduje zaburzenia w ruchu rzęsek bijących. Jeśli nie zostanie zdiagnozowana, prowadzi do poważnego uszkodzenia płuc w późniejszym życiu z powodu ciężkiego upośledzenia MCC. W przeszłości jego rozpowszechnienie szacowano na zakres od 1:4 000 do 50 000. Ze względu na stale poprawiającą się diagnostykę i rosnącą świadomość tego schorzenia, aktualizacje dotyczące częstości występowania PCD sugerują, że może ona być znacznie bardziej powszechna i prawdopodobnie w zakresie od 1:4 000 do 20 000 zamiast1,2. Jednak pacjenci z PCD są nadal niedostatecznie diagnozowani lub diagnozowani zbyt późno1,3. W związku z tym niemowlęta z wrodzoną lokalizacją wrodzoną i/lub heterotaksją lub okołoporodowym wyciekiem z nosa, niewydolnością oddechową noworodków, zatkanym nosem i trudnościami w karmieniu powinny być podejrzane o PCD. W późniejszym życiu przewlekłe zapalenie ucha, nawracające zapalenie płuc, zapalenie zatok przynosowych i zatok przynosowych oraz przewlekły, typowy mokry kaszel spowodowany upośledzonym MCC są charakterystycznymi objawami PCD, które w połączeniu z rozstrzeniem oskrzeli i upośledzoną czynnością płuc utrzymują się w wieku dorosłym2.

Pacjenci z podejrzeniem PCD mogą być diagnozowani za pomocą różnych narzędzi diagnostycznych. W przeszłości TEM był uważany za złoty standard w diagnostyce pierwszego rzutu. Jednak do 30% przypadków PCD nie wykazuje nieprawidłowej ultrastruktury1,3,4,5,6, co wymaga innego podejścia diagnostycznego. Dlatego coraz więcej ośrodków i wytyczne Europejskiego Towarzystwa Chorób Układu Oddechowego (ERS) sugerują połączenie nosowego tlenku azotu (nNO) i HSVMA jako diagnostyki pierwszego rzutu1,7,9,10. HSVMA i nNO są również najbardziej opłacalnymi opcjami identyfikacji pacjenta z PCD11. Jednak nawet gdyby badania genetyczne zostały włączone do diagnostyki, należy pamiętać, że obecnie nie ma samodzielnego testu lub kombinacji testów, które mogłyby wykluczyć PCD ze 100% pewnością8,9,10.

Spośród dostępnych opcji diagnostycznych, HSVMA jest jedynym testem, który skupia się na żywych, pokrytych rzęskami komórkach oddechowych i ocenia wzorzec dudnienia rzęsek (CBP) oraz częstotliwość uderzeń rzęsek (CBF). W przeciwieństwie do TEM, wyniki HSVMA są dostępne szybko, zwykle w dniu badania, podczas gdy wyniki TEM mogą nadejść kilka miesięcy po pobraniu próbki. HSVMA może być stosowany we wszystkich grupach wiekowych, podczas gdy nNO wymaga wysokiego stopnia zgodności; Próby użycia go poniżej 5 roku życia zwykle kończą się niepowodzeniem10. W doświadczonych rękach HSVMA ma doskonałą czułość i swoistość do diagnozowania PCD odpowiednio na poziomie 100% i 96%12.

Ten artykuł opisuje krok po kroku procedurę przeprowadzania HSVMA, w tym pobieranie pokrytych rzęskami komórek oddechowych z dolnej małżowiny nosa, przechowywanie pobranych komórek w pożywce odżywczej dla komórek w celu transportu do miejsca badania, oraz proces mikroskopowej analizy wideo w celu określenia CBF i CBP. Dodatkowo pokazano kilka klipów wideo od pacjentów, porównujących normalne CBP i CBF z nieprawidłową funkcją rzęsek (Wideo 3, Wideo 4, Wideo 5, Wideo 6, Wideo 7 i Wideo 8).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Oświadczenie etyczne:

Badanie to zostało zatwierdzone przez lokalną komisję etyczną (69/2017) i przeprowadzono je zgodnie z deklaracją helsińską.

1. Pobieranie i transport komórek nabłonka dróg oddechowych

  1. Szczotkowanie
    1. Przed szczotkowaniem podaj pacjentowi dwutygodniową dawkę doustnego amoksycyliny z kwasem klawulanowym w celu wyeliminowania biofilmu zakłócającego funkcję rzęsek. Upewnij się, że antybiotykoterapia zostanie zakończona 2 dni przed procedurą.
    2. Aby zmniejszyć ilość warstwy materiału śluzowego na pobranych pasmach komórek nabłonkowych, poproś pacjenta o dokładne wydmuchanie nosa. W przypadku małych dzieci poproś rodziców o pomoc w wydmuchaniu nosa.
    3. Do szczotkowania użyj szczoteczki międzyzębowej o rozmiarze 0,6 mm (patrz Tabela Materiałów). Jedną ręką unieruchom głowę pacjenta, a drugą szczotkuj małżowinę nosową dolną w obu nozdrzach, aby zebrać wystarczającą ilość pasm komórek nabłonkowych.
      UWAGA: Podczas głębokiego wprowadzania szczoteczki międzyzębowej pod małżowinę dolną zazwyczaj odczuwalny jest lekki opór. Szczotkowanie nosa wykonuje się poprzez szybkie obracanie i pobieranie przez około 2 s. Dłuższe i intensywne szczotkowanie mogłoby spowodować poważne uszkodzenie nabłonka i następujący po nim epistaxis.
    4. Jeśli planowana jest bronchoskopia z przyczyn innych niż podejrzenie PCD, pobierz próbki podczas bronchoskopii poprzez szczotkowanie karyny lub nabłonka oskrzeli lub poprzez biopsję13.
    5. Umieść pobrane pasma komórek w probówce do mikrowirowania o pojemności 1,5 mL zawierającej pożywkę Dulbecco´s Modified Eagle Medium (DMEM).
      UWAGA: Pasma komórek nabłonkowych zazwyczaj łatwiej oddzielają się od szczoteczki poprzez potrząsanie i obracanie szczoteczki o ściankę probówki.
    6. Zamknij pokrywkę probówki do mikrowirowania i przyłóż ją do źródła światła. Potrząśnij probówką, aby zidentyfikować pobrane pasma i konglomeraty komórek.
  2. Transport materiału
    1. Umieść probówki do mikrowirowania w szczelnie zamkniętym pudełku polistyrenowym; upewnij się, że pokrywki probówek są prawidłowo zamknięte, a probówki są stabilne wewnątrz pudełka.
    2. Dodaj wkład chłodzący, unikając jednak zamrażania materiału.
      UWAGA: Optymalna temperatura przechowywania materiału przed badaniem wynosi około 4-8 °C (39,2-46,4 °F).
    3. Upewnij się, że zabezpieczone próbki zostaną poddane analizie w ciągu następnych 24 h.
      UWAGA: W tych eksperymentach średni czas pomiędzy szczotkowaniem a HSVMA wynosił 3 h.

2. Analiza za pomocą szybkozdejmującej mikroskopii wideo (HSVMA)

  1. Mikroskopia wideo próbek
    1. Po otrzymaniu probówek do mikrowirówki zawierających próbki, ogrzej je do 37 °C (98.6 °F), aby odtworzyć optymalne warunki zbliżone do in vivo.
    2. Jeśli mikroskop jest wyposażony w moduł grzewczy, umieść probówki pod osłoną i ogrzej je w tym miejscu. Alternatywnie, do ogrzania próbek można użyć inkubatora.
    3. Uruchom kamerę oraz oprogramowanie jednostki wideo na komputerze PC.
    4. Za pomocą pipety pobierz niewielką ilość próbki i nanieś dwie krople do kuwety lub szkiełka nakrywkowe z dna szklanego (patrz Tabela materiałów). Przykryj kuwetę lub szkiełko pokrywką i umieść pod mikroskopem.
    5. Do oceny próbek użyj mikroskopu z kontrastem różnicowym (DIC), wyposażonego w chłodne źródło światła i kamerę wideo zdolną do rejestracji z wysoką prędkością (co najmniej 200 klatek/s). Użyj obiektywu imersyjnego o powiększeniu 100x i nanieś kroplę oleju imersyjnego na powierzchnię optyki.
      UWAGA: Zaleca się stosowanie mikroskopów z obiektywem zbliżającym się od dołu.
    6. Zbliż obiektyw mikroskopu do dna szkiełka i wyszukaj skupiska komórek pozbawione erytrocytów i o niskiej zawartości śluzu. Po znalezieniu reprezentatywnego obszaru zainteresowania (ROI), ustaw ostrość na jedną konkretną grupę bijących rzęsek z najsilniejszymi ruchami i zarejestruj sekwencję wideo. Nagraj komórki z bijącymi rzęskami z boku oraz z góry. Następnie wyszukaj kolejne reprezentatywne skupisko komórek i powtórz nagrywanie.
      UWAGA: Komórki pokryte rzęskami należy badać przy powiększeniu 1,000x, a bijące rzęski należy rejestrować za pomocą cyfrowej kamery wideo o wysokiej prędkości (DHSV) ustawionej na częstotliwość od 200 klatek/s wzwyż (w tym protokole 256/s). Ponieważ dane uzyskane z nagranych klipów wideo wymagają dużej ilości miejsca na dysku twardym, zaleca się stosowanie zewnętrznego dysku SSD.
  2. Analiza sekwencji wideo
    1. Aby wyznaczyć CBF i CBP, odtwórz klipy wideo klatka po klatce.
    2. Aby wyznaczyć CBF, ustaw prędkość odtwarzania w zwolnionym tempie na 15 klatek/s i odlicz 10 kolejnych uderzeń.
    3. Zapisz liczbę klatek, które upłynęły podczas jednego cyklu 10 uderzeń, i podstaw wynik do równania (1). Wyznacz częstotliwość obliczając średnią ze wszystkich zarejestrowanych cykli uderzeń rzęsek i porównaj wynik z wartościami referencyjnymi dla wieku (patrz Tabela 1)14.
      Wzór na Hz, Hz=10/(X/256), wyrażenie matematyczne, obliczenia fizyczne, zastosowanie edukacyjne. (1)
      Gdzie X to liczba klatek, które upłynęły podczas cyklu 10 uderzeń.
    4. W celu oceny CBP sprawdź, czy ruch bijących rzęsek odbywa się w pełnym zakresie (patrz Rysunek 1) i jest zsynchronizowany. Aby zapobiec błędowi selekcji, oceny CBP powinni dokonać dwaj niezależni operatorzy.
    5. Wyniki analizy HSVMA należy zaraportować jako zgodne, mało prawdopodobne lub niejednoznaczne w kontekście PCD.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wideo 1 i Wideo 2 przedstawiają normalną kontrolę, w której CBF i CBP mieszczą się w normie (patrz Rysunek 1). Wideo 3, Wideo 4, Wideo 5 i Wideo 6 reprezentują dwa przypadki pacjentów z PCD z homozygotyczną mutacją w genie DNAH11 (c.2341G > A; p. Glu781Lys)3. Te reprezentatywne nagrania wybrano ze względu na fakt, że fenotypy mutacji w gen...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym miejscu opisano i omówiono proces diagnostyki PCD za pomocą HSVMA w świetle diagnostyki pierwszego rzutu. Pomimo tego, że jest stosunkowo łatwa do ustalenia, opłacalna11 i niezawodna metoda w doświadczonych rękach12, HSVMA nie jest środkiem diagnostycznym pozbawionym pułapek. Nieprawidłowe CBF i CBP mogą być spowodowane wtórnym zakażeniem, prowadzącym do zapalenia nabłonka oskrzelowo-oddechowego15 i z tego samego powodu osoby palące mogą mieć n...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Pragniemy wyrazić szczególne podziękowania dla pielęgniarki pediatrycznej, Pani Johanny Juvankoski, za jej doskonałą pomoc przy szczotkowaniu. Szczególne podziękowania kierujemy również do profesora Heymuta Omrana (Klinika Uniwersytecka w Münster, UKM) za udzielenie zgody na wykorzystanie schematycznego rysunku normalnego ruchu rzęsek z ich strony internetowej. Na koniec chcielibyśmy podziękować Panu Alanowi Brownowi BA (z wyróżnieniem), PGCE, za korektę manuskryptu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kwas amoksycylino-klawulanowyOrion Oyj40 mg/kg podzielony na 2 dawki/dobę, dla dorosłych 875/125 mg 1 tabletka x2/dzień
Oprogramowanie kameryHamamatsuHCI
Obraz Zimny pakietdowolnydo konserwacji i transportu
Mikroskop interferencji różnicowejCarl ZeissOdwrócony, mikroskop obserwatora komórek
Digitial High Szybka kamera wideoHamamatsuOrca Flash 4.0, kamera cyfrowa typ C11440
Dulbecco´ s Zmodyfikowana pożywka dohodowli komórkowychEagle Thermo Fisher10565018
Probówka Eppendorf ProbówkaEppendorf301200861,5 ml Naczynie
mikrodołkowe ze szklanym dnemMatTekP35G-1.5-14-Cdo mikroskopii
Jednostka grzewczaCarl Zeiss/PeCon810-450001Elementy inkubacyjne Carl Zeiss z regulatorem
temperatury PeCon TempModule S1Szczoteczka międzyzębowa 0,6 mmDoft872267Szczoteczka międzyzębowa na długim drucie z rączką wielokrotnego użytku i nasadką w woreczku strunowym
ObiektywCarl Zeiss100x/1,46, α Obiektyw Plan-Apochromat DIC
Małe pudełko polistyrenowe z pokrywkądowolnądo transportu
Kuweta

Bibliografia

  1. Werner, C., Onnebrink, J. G., Omran, H. Diagnosis and management of primary ciliary dyskinesia. Cilia. 4 (1), 2(2015).
  2. Mirra, V., Werner, C., Santamaria, F. Primary ciliary dyskinesia: An update on clinical aspects, genetics, diagnosis and future treatment strategies. Frontiers in Pediatrics. 5, 135(2017).
  3. Schultz, R., Elenius, V., Lukkarinen, H., Saarela, T. Two novel mutations in the DNAH11 gene in primary ciliary dyskinesia (CILD7) with considerable variety in the clinical and beating cilia phenotype. BMC Medical Genetics. 21 (1), 237(2020).
  4. Knowles, M. R., et al. Mutations of DNAH11 in patients with primary ciliary dyskinesia with normal ciliary ultrastructure. Thorax. 67 (5), 433-441 (2012).
  5. Boon, M., et al. Primary ciliary dyskinesia: critical evaluation of clinical symptoms and diagnosis in patients with normal and abnormal ultrastructure. Orphanet Journal of Rare Diseases. 9, 11(2014).
  6. Kouis, P., et al. Prevalence of primary ciliary dyskinesia in consecutive referrals of suspected cases and the transmission electron microscopy detection rate: a systematic review and meta-analysis. Pediatric Research. 81 (3), 398-405 (2017).
  7. Marthin, J. K., Nielsen, K. G. Choice of nasal nitric oxide technique as first-line test for primary ciliary dyskinesia. European Respiratory Journal. 37 (3), 559-565 (2011).
  8. Jackson, C. L., Behan, L., Collins, S. A. Accuracy of diagnostic testing in primary ciliary dyskinesia. European Respiratory Journal. 47 (3), 837-848 (2016).
  9. Lucas, J. S., et al. European Respiratory Society guidelines for the diagnosis of primary ciliary dyskinesia. European Respiratory Journal. 49 (1), 1601090(2017).
  10. Shoemark, A., Dell, S., Shapiro, A., Lucas, J. S. ERS and ATS diagnostic guidelines for primary ciliary dyskinesia: similarities and differences in approach to diagnosis. European Respiratory Journal. 54 (3), 1901066(2019).
  11. Kouis, P. Cost-effectiveness analysis of three algorithms for diagnosing primary ciliary dyskinesia: a simulation study. Orphanet Journal of Rare Diseases. 14 (1), 142(2019).
  12. Rubbo, B., et al. Accuracy of high-speed video analysis to diagnose primary ciliary dyskinesia. Chest. 155 (5), 1008-1017 (2019).
  13. Friedman, N. R., Pachigolla, R., Deskin, R. W., Hawkins, H. K. Optimal technique to diagnose primary ciliary dyskinesia. The Laryngoscope. 110 (9), 1548-1551 (2000).
  14. Chilvers, M. A., Rutman, A., O´Callaghan, C. Functional analysis of cilia and ciliated epithelial ultrastructure in healthy children and young adults. Thorax. 58 (4), 333-338 (2003).
  15. Lucas, J. S., Paff, T., Goggin, P., Haarman, E. Diagnostic methods in primary ciliary dyskinesia. Paediatric Respiratory Reviews. 18, 8-17 (2016).
  16. Ballenger, J. J. Experimental effect of cigarette smoke on human respiratory cilia. New England Journal of Medicine. 263, 832-835 (1960).
  17. Stanley, P. J., Wilson, R., Greenstone, M. A., Mac William, L., Cole, P. J. Effect of cigarette smoking on nasal mucociliary clearance and ciliary beat frequency. Thorax. 41 (7), 519-523 (1986).
  18. Kobbernagel, H. E., et al. Efficacy and safety of azithromycin maintenance therapy in primary cilia dyskinesia (BESTCILIA): a multicentre, double-blind, randomised, placebo-controlled phase 3 trial. Lancet Respiratory Medicine. 8 (5), 493-505 (2020).
  19. Takeyama, K., Tamaoki, J., Chiyotani, A., Tagaya, E., Konno, K. Effect of macrolide antibiotics on ciliary motility in rabbit airway epithelium in-vitro. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 45 (8), 756-758 (1993).
  20. Toskala, E., Haataja, J., Shirasaki, H., Rautliainen, M. Culture of cells harvested with nasal brushing: a method for evaluating ciliary function. Rhinology. 43 (2), 121-124 (2005).
  21. Pifferi, M., et al. Simplified cell culture method for the diagnosis of atypical primary ciliary dyskinesia. Thorax. 64 (12), 1077-1081 (2009).
  22. Hirst, R. A., et al. Culture of primary ciliary dyskinesia epithelial cells at air liquid interface can alter ciliary phenotype but remains a robust and informative, diagnostic aid. PLoS One. 9 (2), 89675(2014).
  23. Papon, J. F., et al. Quantitative analysis of ciliary beating in primary ciliary dyskinesia: a pilot study. Orphanet Journal of Rare Diseases. 7 (10), 78(2012).
  24. Smith, C. M., et al. Cilia FA: a research tool for automated, high-throughput measurement of ciliary beat frequency using freely available software. Cilia. 1 (8), 14(2012).
  25. Sampaio, P., et al. Ciliar Move: new software for evaluating ciliary beat frequency helps find novel mutations by a Portuguese multidisciplinary team on primary ciliary dyskinesia. European Respiratory Journal Open Research. 7 (1), 00792(2021).
  26. Mullowney, T., et al. Primary ciliary dyskinesia and neonatal respiratory distress. Pediatrics. 134 (6), 1160-1166 (2014).
  27. Leigh, M. W., et al. Standardizing nasal nitric oxide measurement as a test for primary ciliary dyskinesia. Annals of the American Thoracic Society. 10 (6), 574-581 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Wzorzec bicia rz sekkom rki nab onka oddechowegocz stotliwo bicia rz sekmikroskopia elektronowamikroskopia immunofluorescencyjnamutacja DNAH11oczyszczanie luzowo rz skoweizolacja kom rek rz skowych
Szybka analiza wideomikroskopii w diagnostyce pierwszego rzutu pierwotnej dyskinezy rzęsek
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.