Artykuł metodologiczny

Szybka analiza wideomikroskopii w diagnostyce pierwszego rzutu pierwotnej dyskinezy rzęsek

DOI:

10.3791/63292

⸱

19 stycznia 2022

 ,  ,  , 
1Allergy Centre, Tampere University Hospital, 2Department of Pediatrics, Turku University Hospital, 3Turku Bioscience Center, University of Turku and Åbo Akademi University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Szybka analiza mikroskopii wideo jest stosunkowo łatwym do przeprowadzenia, szybkim, opłacalnym i, w doświadczonych rękach, znacznie niezawodnym narzędziem do diagnostyki pierwszego rzutu pierwotnej dyskinezy rzęsek, które powinno być dostępne w każdym ośrodku zajmującym się diagnostyką i leczeniem ciężkich chorób płuc.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pierwotna dyskineza rzęsek (PCD) jest wrodzoną chorobą dziedziczoną głównie w autosomalnej cesywnej charakterystyce. Zaburzenie powoduje zaburzenia ruchu rzęsek, prowadząc do ciężkiego upośledzenia klirensu śluzowo-rzęskowego (MCC). Jeśli nie zostanie zdiagnozowany lub zostanie zdiagnozowany zbyt późno, stan ten prowadzi do rozwoju rozstrzeni oskrzeli i poważnego uszkodzenia płuc w późniejszym życiu. Większość metod diagnozowania PCD jest czasochłonna i wymaga znacznych zasobów ekonomicznych w celu ich ustalenia. Szybka analiza wideomikroskopii (HSVMA) jest jedynym narzędziem diagnostycznym do wizualizacji i analizy żywych komórek układu oddechowego z bijącymi rzęskami in vitro. Jest szybki, ekonomiczny i w doświadczonych rękach bardzo niezawodny jako narzędzie diagnostyczne PCD. Ponadto klasyczne środki diagnostyczne, takie jak transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM), nie mają zastosowania w przypadku niektórych mutacji, ponieważ zmiany morfologiczne są nieobecne.

Ten artykuł opisuje proces pobierania komórek nabłonka oddechowego, dalsze przygotowanie próbki oraz proces HSVMA. Opisujemy również, w jaki sposób szczotkowane komórki mogą być z powodzeniem utrzymywane w stanie nieuszkodzonym i bijącym, przechowując je w pożywce odżywczej do przechowywania i transportu do miejsca badania w przypadkach, gdy klinika nie posiada sprzętu do wykonywania HSVMA. Pokazano również filmy z patologicznymi wzorcami bicia od pacjentów z mutacją w genie 11 łańcucha ciężkiego ramienia dyneiny (DNAH11), których nie można zdiagnozować za pomocą TEM; wynik niejednoznacznego HSVMA z powodu zakażenia górnych dróg oddechowych, a także nieudanego szczotkowania z nałożeniem czerwonych krwinek. Tym artykułem chcielibyśmy zachęcić każdą jednostkę zajmującą się pacjentami pulmonologicznymi i rzadkimi chorobami płuc do wykonywania HSVMA w ramach codziennej rutynowej diagnostyki w kierunku PCD lub wysłania próbek do ośrodka specjalizującego się w wykonywaniu HSVMA.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pierwotna dyskineza rzęsek (PCD) jest rzadką, dziedziczną chorobą genetyczną, która powoduje zaburzenia w ruchu rzęsek bijących. Jeśli nie zostanie zdiagnozowana, prowadzi do poważnego uszkodzenia płuc w późniejszym życiu z powodu ciężkiego upośledzenia MCC. W przeszłości jego rozpowszechnienie szacowano na zakres od 1:4 000 do 50 000. Ze względu na stale poprawiającą się diagnostykę i rosnącą świadomość tego schorzenia, aktualizacje dotyczące częstości występowania PCD sugerują, że może ona być znacznie bardziej powszechna i prawdopodobnie w zakresie od 1:4 000 do 20 000 zamiast1,2. Jednak pacjenci z PCD są nadal niedostatecznie diagnozowani lub diagnozowani zbyt późno1,3. W związku z tym niemowlęta z wrodzoną lokalizacją wrodzoną i/lub heterotaksją lub okołoporodowym wyciekiem z nosa, niewydolnością oddechową noworodków, zatkanym nosem i trudnościami w karmieniu powinny być podejrzane o PCD. W późniejszym życiu przewlekłe zapalenie ucha, nawracające zapalenie płuc, zapalenie zatok przynosowych i zatok przynosowych oraz przewlekły, typowy mokry kaszel spowodowany upośledzonym MCC są charakterystycznymi objawami PCD, które w połączeniu z rozstrzeniem oskrzeli i upośledzoną czynnością płuc utrzymują się w wieku dorosłym2.

Pacjenci z podejrzeniem PCD mogą być diagnozowani za pomocą różnych narzędzi diagnostycznych. W przeszłości TEM był uważany za złoty standard w diagnostyce pierwszego rzutu. Jednak do 30% przypadków PCD nie wykazuje nieprawidłowej ultrastruktury1,3,4,5,6, co wymaga innego podejścia diagnostycznego. Dlatego coraz więcej ośrodków i wytyczne Europejskiego Towarzystwa Chorób Układu Oddechowego (ERS) sugerują połączenie nosowego tlenku azotu (nNO) i HSVMA jako diagnostyki pierwszego rzutu1,7,9,10. HSVMA i nNO są również najbardziej opłacalnymi opcjami identyfikacji pacjenta z PCD11. Jednak nawet gdyby badania genetyczne zostały włączone do diagnostyki, należy pamiętać, że obecnie nie ma samodzielnego testu lub kombinacji testów, które mogłyby wykluczyć PCD ze 100% pewnością8,9,10.

Spośród dostępnych opcji diagnostycznych, HSVMA jest jedynym testem, który skupia się na żywych, pokrytych rzęskami komórkach oddechowych i ocenia wzorzec dudnienia rzęsek (CBP) oraz częstotliwość uderzeń rzęsek (CBF). W przeciwieństwie do TEM, wyniki HSVMA są dostępne szybko, zwykle w dniu badania, podczas gdy wyniki TEM mogą nadejść kilka miesięcy po pobraniu próbki. HSVMA może być stosowany we wszystkich grupach wiekowych, podczas gdy nNO wymaga wysokiego stopnia zgodności; Próby użycia go poniżej 5 roku życia zwykle kończą się niepowodzeniem10. W doświadczonych rękach HSVMA ma doskonałą czułość i swoistość do diagnozowania PCD odpowiednio na poziomie 100% i 96%12.

Ten artykuł opisuje krok po kroku procedurę przeprowadzania HSVMA, w tym pobieranie pokrytych rzęskami komórek oddechowych z dolnej małżowiny nosa, przechowywanie pobranych komórek w pożywce odżywczej dla komórek w celu transportu do miejsca badania, oraz proces mikroskopowej analizy wideo w celu określenia CBF i CBP. Dodatkowo pokazano kilka klipów wideo od pacjentów, porównujących normalne CBP i CBF z nieprawidłową funkcją rzęsek (Wideo 3, Wideo 4, Wideo 5, Wideo 6, Wideo 7 i Wideo 8).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oświadczenie etyczne:

To badanie zostało zatwierdzone przez lokalną komisję etyczną (69/2017) i zostało przeprowadzone zgodnie z deklaracją Helsinek.

1. Pobieranie i transport komórek nabłonka oddechowego

  1. Szczotkowanie
    1. Przed szczotkowaniem należy podać pacjentowi dwutygodniową kurację doustnym kwasem amoksycylinowo-klawulanowym w celu wyeliminowania biofilmów zakłócających funkcję rzęsek. Upewnij się, że antybiotyk został odstawiony na 2 dni przed zabiegiem.
    2. Aby zmniejszyć nakładanie się materiału śluzowego na szczotkowane paski komórek nabłonka, poproś pacjenta o dokładne wydmuchanie nosa. Poproś rodziców, aby pomogli swoim małym dzieciom wydmuchać nos.
    3. Do szczotkowania używaj szczoteczki międzyzębowej o rozmiarze 0,6 mm (patrz Tabela materiałów). Jedną ręką trzymaj głowę pacjenta nieruchomo, a drugą ręką szczotkuj dolną małżowinę uszną obu nozdrzy, aby zebrać wystarczającą ilość pasków komórek nabłonka.
      UWAGA: Niewielki opór występuje zwykle podczas wkładania szczoteczki międzyzębowej głęboko pod dolną małżowinę. Szczotkowanie nosa odbywa się poprzez szybkie obracanie i dłubanie przez około 2 sekundy. Dłuższe i intensywne szczotkowanie może w przeciwnym razie spowodować poważne uszkodzenie nabłonka i późniejszy krwawienie z nosa.
    4. Jeśli bronchoskopia jest planowana z powodów innych niż podejrzenie PCD, należy pobrać próbki podczas bronchoskopii, szczotkując nabłonek carina lub oskrzelowe lub biopsji13.
    5. Wrzuć zebrane paski komórek do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml zawierającej odżywiające komórki zmodyfikowane podłoże orła Dulbecco (DMEM).
      UWAGA: Paski komórek nabłonkowych zwykle łatwiej spadają ze szczotki, podrzucając i obracając szczoteczkę o ściankę rurki.
    6. Zamknij pokrywę probówki do mikrowirówki i przyłóż probówkę do źródła światła. Potrząśnij probówką, aby odkryć zebrane paski komórek i konglomeraty.
  2. Transport próbki
    1. Umieść probówki do mikrowirówek w szczelnie zamkniętym pudełku z polistyrenu i upewnij się, że pokrywka probówek jest prawidłowo zamknięta, a probówki są zamocowane wewnątrz pudełka.
    2. Dodać zimny okład, jednak należy unikać zamrażania próbki.
      UWAGA: Optymalna temperatura do przechowywania próbki przed badaniem wynosi około 4-8 °C (39.2-46.4 °F).
    3. Upewnij się, że zakonserwowane próbki zostaną przeanalizowane w ciągu najbliższych 24 godzin
      UWAGA: W tych eksperymentach średni czas między szczotkowaniem a HSVMA wynosił 3 godziny.

2. Szybka analiza mikroskopii wideo (HSVMA)

  1. Mikroskopia wideo próbek
    1. Po otrzymaniu probówek do mikrowirówek zawierających próbki, podgrzej je do temperatury 37 °C (98,6 °F), aby naśladować optymalne środowisko podobne do środowiska in vivo.
    2. Jeśli mikroskop jest wyposażony w jednostkę grzewczą, umieść rurki pod maską i tam je rozgrzej. Alternatywnie można użyć inkubatora do rozgrzania próbek.
    3. Uruchom kamerę i oprogramowanie modułu wideo na komputerze.
    4. Za pomocą pipety pobrać niewielką ilość próbki i umieścić dwie krople w kuwecie lub naczyniu ze szklanym dnem (patrz tabela materiałów). Przykryj kuwetę lub naczynie pokrywką i umieść je pod mikroskopem.
    5. Do oceny próbek należy użyć mikroskopu różnicowo-interferencyjnego wyposażonego w źródło zimnego światła i kamerę wideo zdolną do nagrywania z dużą prędkością (co najmniej 200 klatek/s). Użyj olejowej soczewki immersyjnej o powiększeniu 100x i nałóż kroplę olejku immersyjnego na powierzchnię optyki.
      UWAGA: Zalecane są mikroskopy z soczewką zbliżającą się od dołu.
    6. Podejdź do dna naczynia z soczewką mikroskopu i poszukaj skupisk komórek bez czerwonych krwinek i o niskiej zawartości śluzu. Po znalezieniu reprezentatywnego regionu zainteresowania (ROI) skup się na jednej konkretnej grupie bijących rzęsek z największymi ruchami rzęsek i nagraj sekwencję wideo. Nagraj komórki z biciem rzęsek na boki i od góry. Następnie wyszukaj inną reprezentatywną grupę komórek i powtórz nagranie.
      UWAGA: Komórki pokryte rzęskami muszą być badane pod powiększeniem 1,000x, a bijące rzęski powinny być rejestrowane za pomocą cyfrowej kamery wideo o dużej szybkości (DHSV) ustawionej na częstotliwość odświeżania 200/s lub większą (256/s w tym protokole). Ponieważ dane uzyskane z nagranych klipów wideo wymagają dużej ilości miejsca na dysku twardym, zalecany jest zewnętrzny dysk twardy SSD.
  2. Analiza sekwencji wideo
    1. Aby określić CBF i CBP, odtwarzaj klipy wideo klatka po klatce.
    2. Aby określić CBF, ustaw liczbę klatek na sekundę w zwolnionym tempie z 15 klatkami/s i policz 10 kolejnych uderzeń.
    3. Zapisz liczbę klatek przechodzących podczas jednego cyklu 10 uderzeń i wstaw wynik do korektora (1). Określ częstość, obliczając średnią ze wszystkich zarejestrowanych cykli uderzenia rzęsek i porównaj wynik z wartościami referencyjnymi dla wieku (patrz Tabela 1)14.
      figure-protocol-1 (1)
      Gdzie X to liczba klatek przechodzących w cyklu 10 uderzeń.
    4. Aby ocenić CBP, obserwuj, czy ruch rzęsek dudniących jest w pełnym zakresie (patrz Rysunek 1) i zsynchronizowany. Niech dwóch niezależnych operatorów oceni CBP, aby zapobiec stronniczości selekcji.
    5. Należy podać, że wyniki analizy HSVMA są zgodne, mało prawdopodobne lub niejednoznaczne z PCD.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wideo 1 i Wideo 2 pokazują normalną kontrolę, gdzie CBF i CBP są w normalnym zakresie (zobacz Rysunek 1). Wideo 3, Wideo 4, Wideo 5 i Wideo 6 reprezentują dwa przypadki pacjentów z PCD z homozygotyczną mutacją w genie DNAH11 (c.2341G > A; p. Glu781Lys)3. Te reprezentatywne filmy zostały wybrane, ponieważ fenotypy mutacji w genie DNAH11...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym miejscu opisano i omówiono proces diagnostyki PCD za pomocą HSVMA w świetle diagnostyki pierwszego rzutu. Pomimo tego, że jest stosunkowo łatwa do ustalenia, opłacalna11 i niezawodna metoda w doświadczonych rękach12, HSVMA nie jest środkiem diagnostycznym pozbawionym pułapek. Nieprawidłowe CBF i CBP mogą być spowodowane wtórnym zakażeniem, prowadzącym do zapalenia nabłonka oskrzelowo-oddechowego15 i z tego samego powodu osoby palące mogą mieć n...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pragniemy wyrazić szczególne podziękowania dla pielęgniarki pediatrycznej, Pani Johanny Juvankoski, za jej doskonałą pomoc przy szczotkowaniu. Szczególne podziękowania kierujemy również do profesora Heymuta Omrana (Klinika Uniwersytecka w Münster, UKM) za udzielenie zgody na wykorzystanie schematycznego rysunku normalnego ruchu rzęsek z ich strony internetowej. Na koniec chcielibyśmy podziękować Panu Alanowi Brownowi BA (z wyróżnieniem), PGCE, za korektę manuskryptu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kwas amoksycylino-klawulanowyOrion Oyj40 mg/kg podzielony na 2 dawki/dobę, dla dorosłych 875/125 mg 1 tabletka x2/dzień
Oprogramowanie kameryHamamatsuHCI
Obraz Zimny pakietdowolnydo konserwacji i transportu
Mikroskop interferencji różnicowejCarl ZeissOdwrócony, mikroskop obserwatora komórek
Digitial High Szybka kamera wideoHamamatsuOrca Flash 4.0, kamera cyfrowa typ C11440
Dulbecco´ s Zmodyfikowana pożywka dohodowli komórkowychEagle Thermo Fisher10565018
Probówka Eppendorf ProbówkaEppendorf301200861,5 ml Naczynie
mikrodołkowe ze szklanym dnemMatTekP35G-1.5-14-Cdo mikroskopii
Jednostka grzewczaCarl Zeiss/PeCon810-450001Elementy inkubacyjne Carl Zeiss z regulatorem
temperatury PeCon TempModule S1Szczoteczka międzyzębowa 0,6 mmDoft872267Szczoteczka międzyzębowa na długim drucie z rączką wielokrotnego użytku i nasadką w woreczku strunowym
ObiektywCarl Zeiss100x/1,46, α Obiektyw Plan-Apochromat DIC
Małe pudełko polistyrenowe z pokrywkądowolnądo transportu
Kuweta

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Werner, C., Onnebrink, J. G., Omran, H. Diagnosis and management of primary ciliary dyskinesia. Cilia. 4 (1), 2(2015).
  2. Mirra, V., Werner, C., Santamaria, F. Primary ciliary dyskinesia: An update on clinical aspects, genetics, diagnosis and future treatment strategies. Frontiers in Pediatrics. 5, 135(2017).
  3. Schultz, R., Elenius, V., Lukkarinen, H., Saarela, T. Two novel mutations in the DNAH11 gene in primary ciliary dyskinesia (CILD7) with considerable variety in the clinical and beating cilia phenotype. BMC Medical Genetics. 21 (1), 237(2020).
  4. Knowles, M. R., et al. Mutations of DNAH11 in patients with primary ciliary dyskinesia with normal ciliary ultrastructure. Thorax. 67 (5), 433-441 (2012).
  5. Boon, M., et al. Primary ciliary dyskinesia: critical evaluation of clinical symptoms and diagnosis in patients with normal and abnormal ultrastructure. Orphanet Journal of Rare Diseases. 9, 11(2014).
  6. Kouis, P., et al. Prevalence of primary ciliary dyskinesia in consecutive referrals of suspected cases and the transmission electron microscopy detection rate: a systematic review and meta-analysis. Pediatric Research. 81 (3), 398-405 (2017).
  7. Marthin, J. K., Nielsen, K. G. Choice of nasal nitric oxide technique as first-line test for primary ciliary dyskinesia. European Respiratory Journal. 37 (3), 559-565 (2011).
  8. Jackson, C. L., Behan, L., Collins, S. A. Accuracy of diagnostic testing in primary ciliary dyskinesia. European Respiratory Journal. 47 (3), 837-848 (2016).
  9. Lucas, J. S., et al. European Respiratory Society guidelines for the diagnosis of primary ciliary dyskinesia. European Respiratory Journal. 49 (1), 1601090(2017).
  10. Shoemark, A., Dell, S., Shapiro, A., Lucas, J. S. ERS and ATS diagnostic guidelines for primary ciliary dyskinesia: similarities and differences in approach to diagnosis. European Respiratory Journal. 54 (3), 1901066(2019).
  11. Kouis, P. Cost-effectiveness analysis of three algorithms for diagnosing primary ciliary dyskinesia: a simulation study. Orphanet Journal of Rare Diseases. 14 (1), 142(2019).
  12. Rubbo, B., et al. Accuracy of high-speed video analysis to diagnose primary ciliary dyskinesia. Chest. 155 (5), 1008-1017 (2019).
  13. Friedman, N. R., Pachigolla, R., Deskin, R. W., Hawkins, H. K. Optimal technique to diagnose primary ciliary dyskinesia. The Laryngoscope. 110 (9), 1548-1551 (2000).
  14. Chilvers, M. A., Rutman, A., O´Callaghan, C. Functional analysis of cilia and ciliated epithelial ultrastructure in healthy children and young adults. Thorax. 58 (4), 333-338 (2003).
  15. Lucas, J. S., Paff, T., Goggin, P., Haarman, E. Diagnostic methods in primary ciliary dyskinesia. Paediatric Respiratory Reviews. 18, 8-17 (2016).
  16. Ballenger, J. J. Experimental effect of cigarette smoke on human respiratory cilia. New England Journal of Medicine. 263, 832-835 (1960).
  17. Stanley, P. J., Wilson, R., Greenstone, M. A., Mac William, L., Cole, P. J. Effect of cigarette smoking on nasal mucociliary clearance and ciliary beat frequency. Thorax. 41 (7), 519-523 (1986).
  18. Kobbernagel, H. E., et al. Efficacy and safety of azithromycin maintenance therapy in primary cilia dyskinesia (BESTCILIA): a multicentre, double-blind, randomised, placebo-controlled phase 3 trial. Lancet Respiratory Medicine. 8 (5), 493-505 (2020).
  19. Takeyama, K., Tamaoki, J., Chiyotani, A., Tagaya, E., Konno, K. Effect of macrolide antibiotics on ciliary motility in rabbit airway epithelium in-vitro. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 45 (8), 756-758 (1993).
  20. Toskala, E., Haataja, J., Shirasaki, H., Rautliainen, M. Culture of cells harvested with nasal brushing: a method for evaluating ciliary function. Rhinology. 43 (2), 121-124 (2005).
  21. Pifferi, M., et al. Simplified cell culture method for the diagnosis of atypical primary ciliary dyskinesia. Thorax. 64 (12), 1077-1081 (2009).
  22. Hirst, R. A., et al. Culture of primary ciliary dyskinesia epithelial cells at air liquid interface can alter ciliary phenotype but remains a robust and informative, diagnostic aid. PLoS One. 9 (2), 89675(2014).
  23. Papon, J. F., et al. Quantitative analysis of ciliary beating in primary ciliary dyskinesia: a pilot study. Orphanet Journal of Rare Diseases. 7 (10), 78(2012).
  24. Smith, C. M., et al. Cilia FA: a research tool for automated, high-throughput measurement of ciliary beat frequency using freely available software. Cilia. 1 (8), 14(2012).
  25. Sampaio, P., et al. Ciliar Move: new software for evaluating ciliary beat frequency helps find novel mutations by a Portuguese multidisciplinary team on primary ciliary dyskinesia. European Respiratory Journal Open Research. 7 (1), 00792(2021).
  26. Mullowney, T., et al. Primary ciliary dyskinesia and neonatal respiratory distress. Pediatrics. 134 (6), 1160-1166 (2014).
  27. Leigh, M. W., et al. Standardizing nasal nitric oxide measurement as a test for primary ciliary dyskinesia. Annals of the American Thoracic Society. 10 (6), 574-581 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Wzorzec bicia rz sekkom rki nab onka oddechowegocz stotliwo bicia rz sekmikroskopia elektronowamikroskopia immunofluorescencyjnamutacja DNAH11oczyszczanie luzowo rz skoweizolacja kom rek rz skowych

Powiązane artykuły