Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Rejestracja stanów przejściowych wapnia w mysim połączeniu nerwowo-mięśniowym z wysoką rozdzielczością czasową przy użyciu mikroskopii konfokalnej

1.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63308

⸱

1 grudnia 2021

 ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Biophysics of Synaptic Processes, Kazan Institute of Biochemistry and Biophysics, FRC Kazan Scientific Center of RAS, 2Department of Radiophotonics and Microwave Technologies, Kazan National Research Technical University named after A.N. Tupolev, 3Department of Normal Physiology, Kazan State Medical University

W tym artykule

Podsumowanie

Protokół opisuje metodę ładowania fluorescencyjnego barwnika wapniowego przez przecięty nerw do zakończeń nerwu ruchowego myszy. Ponadto przedstawiono unikalną metodę rejestracji szybkich stanów przejściowych wapnia w zakończeniach nerwów obwodowych za pomocą mikroskopii konfokalnej.

Streszczenie

Oszacowanie poziomu wapnia w presynaptycznych jest kluczowym zadaniem w badaniu transmisji synaptycznej, ponieważ wejście wapnia do komórki presynaptycznej uruchamia kaskadę zdarzeń prowadzących do uwolnienia neuroprzekaźnika. Co więcej, zmiany w presynaptycznym poziomie wapnia pośredniczą w aktywności wielu białek wewnątrzkomórkowych i odgrywają ważną rolę w plastyczności synaptycznej. Badanie sygnalizacji wapniowej jest również ważne dla znalezienia sposobów leczenia chorób neurodegeneracyjnych. Połączenie nerwowo-mięśniowe jest odpowiednim modelem do badania plastyczności synaptycznej, ponieważ ma tylko jeden typ neuroprzekaźnika. W tym artykule opisano metodę ładowania wrażliwego na wapń barwnika przez przecięty pęczek nerwowy do zakończeń nerwów ruchowych myszy. Metoda ta pozwala na oszacowanie wszystkich parametrów związanych z wewnątrzkomórkowymi zmianami wapnia, takich jak podstawowy poziom wapnia i stan przejściowy wapnia. Ponieważ napływ wapnia z zewnątrz komórki do zakończeń nerwowych i jego wiązanie/rozwiązywanie z barwnikiem wrażliwym na wapń zachodzi w ciągu kilku milisekund, do zarejestrowania tych zdarzeń potrzebny jest szybki system obrazowania. Rzeczywiście, kamery szybkoobrotowe są powszechnie stosowane do rejestracji szybkich zmian wapnia, ale mają niskie parametry rozdzielczości obrazu. Przedstawiony tutaj protokół rejestracji stanów przejściowych wapnia pozwala na wyjątkowo dobrą rozdzielczość przestrzenno-czasową zapewnianą przez mikroskopię konfokalną.

Wprowadzenie

Problem pomiaru szybkich fal wapniowych w komórkach pobudliwych jest jednym z najważniejszych i najtrudniejszych aspektów badania transmisji sygnałów w ośrodkowym i obwodowym układzie nerwowym. Jony wapnia odgrywają ważną rolę w wyzwalaniu uwalniania neuroprzekaźników, plastyczności synaptycznej i modulacji aktywności różnych białek wewnątrzkomórkowych1,2,3,4,5. Badanie sygnalizacji wapniowej jest również ważne dla znalezienia sposobów leczenia chorób neurodegeneracyjnych6. Do pomiaru zmian poziomu wapnia powszechnie stosuje się fluorescencyjne barwniki wrażliwe na wapń, a zmiany ich poziomu fluorescencji są analizowane7,8,9.

Ładowanie barwników wapniowych do komórek można osiągnąć na różne sposoby. Głównie stosuje się barwniki przepuszczalne dla komórek10,11. Jednak w takim przypadku nie tylko trudno jest kontrolować stężenie barwnika wewnątrz komórki, ale także trudno jest wybrać komórki docelowe do obciążenia. Metoda ta nie ma zastosowania do badania zakończeń nerwów obwodowych, ponieważ barwnik dostaje się do komórek postsynaptycznych. Zamiast tego barwniki nieprzepuszczalne dla komórek są bardziej odpowiednie dla takich preparatów. W tym przypadku barwniki są dostarczane do komórek za pomocą mikroiniekcji lub pipety krostowej12,13,14. Istnieje również metoda ładowania przez kikut nerwu. Ta ostatnia metoda jest najbardziej odpowiednia dla preparatów połączeń nerwowo-mięśniowych15,16,17,18,19,20. Pozwala na wykonanie barwienia tylko dla interesujących komórek. Chociaż metoda ta nie zapewnia dokładnej oceny stężenia barwnika w komórce docelowej, stężenie można oszacować w przybliżeniu, porównując poziom fluorescencji komórek w spoczynku w roztworach o znanym stężeniu wapnia21. W pracy przedstawiono modyfikację tej metody zastosowanej do synaps ssaków.

Wprowadzanie wapnia podczas fazy depolaryzacji potencjału czynnościowego jest szybkim procesem, szczególnie w połączeniu nerwowo-mięśniowym; dlatego do jego rejestracji wymagany jest odpowiedni sprzęt1. Niedawne badanie z użyciem wrażliwego na napięcie barwnika fluorescencyjnego wykazało, że czas trwania potencjału czynnościowego w synapsie obwodowej myszy wynosi około 300 μs22. Przemijający wapń, oceniany za pomocą barwników wrażliwych na wapń w synapsach obwodowych żaby, ma dłuższy czas trwania: czas narastania wynosi około 2-6 ms, a czas rozpadu około 30-90 ms, w zależności od użytego barwnika wapniowego23,24. Do pomiaru szybkich procesów za pomocą barwników fluorescencyjnych zwykle stosuje się kamery CCD lub CMOS z szybkimi i czułymi matrycami CCD. Kamery te mają jednak tę wadę, że mają niską rozdzielczość, ograniczoną rozmiarem wrażliwych elementów matrycy25,26,27,28. Najszybsze kamery o wystarczającej czułości do rejestrowania zarówno potencjałów czynnościowych, jak i stanów przejściowych wapnia w odpowiedzi na stymulację komórek niską częstotliwością mają częstotliwość skanowania 2 000 Hz i matrycę o wymiarze 80 x 8029. Aby uzyskać sygnały o wyższej rozdzielczości przestrzennej, stosuje się mikroskopię konfokalną, zwłaszcza jeśli konieczna jest ocena pewnych zmian objętościowych w sygnale30,31,32. Należy jednak pamiętać, że mikroskopia konfokalna ma dużą prędkość skanowania w trybie skanowania liniowego, ale nadal istnieją znaczne ograniczenia dotyczące szybkości zapisu szybkich procesów podczas budowania obrazu przestrzennego33. Istnieją mikroskopy konfokalne oparte na obrotowych dyskach Nipkowa (mikroskopia ze skaningiem szczelinowym) oraz skanery wielopunktowe, które charakteryzują się większą prędkością skanowania. Jednocześnie są gorsze od klasycznych mikroskopów konfokalnych pod względem konfokalnego filtrowania obrazu (przesłuchy otworkowe dla mikroskopów z dyskiem Nipkowa)32,34,35. Obrazowanie konfokalne ze skanowaniem rezonansowym może również zapewnić wysoką rozdzielczość czasoprzestrzenną wymaganą do pomiarów o wysokiej rozdzielczości czasowej36. Należy jednak wziąć pod uwagę, że rejestracja słabych odpowiedzi fluorescencyjnych przy dużej prędkości skanowania przy użyciu skanerów rezonansowych wymaga bardzo czułych detektorów, takich jak detektory hybrydowe36.

Ten artykuł przedstawia metodę zwiększania rozdzielczości czasowej sygnałów zarejestrowanych za pomocą Laserowej Skaningowej Mikroskopii Konfokalnej (LSCM) przy jednoczesnym zachowaniu rozdzielczości przestrzennej37. Obecna metoda jest dalszym rozwinięciem metod opisanych wcześniej i przeniesionych na platformę LSCM38,39,40. Podejście to nie wymaga zmian w sprzęcie mikroskopowym i opiera się na zastosowaniu algorytmu do rejestracji okresowo wywoływanych sygnałów fluorescencyjnych z przesunięciem w czasie względem momentu stymulacji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Doświadczenia przeprowadzono na izolowanych preparatach nerwowo-mięśniowych mięśnia levator auris longus (m. LAL) myszy BALB/C (20-23 g, wiek 2-3 miesiące)41. Procedury eksperymentalne przeprowadzono zgodnie z wytycznymi dotyczącymi wykorzystania zwierząt laboratoryjnych Uniwersytetu Federalnego w Kazaniu oraz Uniwersytetu Medycznego w Kazaniu, zgodnie z wytycznymi NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Protokół eksperymentalny spełniał wymagania dyrektywy Rady Wspólnot Europejskich 86/609/EEC i został zatwierdzony przez Komisję Etyczną Uniwersytetu Medycznego w Kazaniu.

1. Przygotowanie roztworów Ringera i roztworów do wypełniania

  1. Przygotować roztwór Ringera dla mięśni ssaków, mieszając następujące składniki: NaCl (137 mM), KCl (5 mM), CaCl2 (2 mM), MgCl2 (1 mM), NaH2PO4 (1 mM), NaHCO3 (11,9 mM) oraz glukozę (11 mM). Przemknąć roztwór mieszaniną 95% O2 i 5% CO2 i w razie potrzeby skorygować pH do wartości 7,2-7,4, dodając HCl/NaOH.
  2. Przygotować roztwór do wprowadzania barwnika.
    1. Przygotować roztwór HEPES (10 mM) o pH w zakresie 7,2-7,4. 500 µg komercyjnego barwnika znajduje się w fiolce o pojemności 500 µL. Rozpuścić barwnik w 14 µL roztworu HEPES, aby uzyskać stężenie barwnika 30 mM. Dobrze wstrząsnąć i wirować do całkowitego rozpuszczenia.
    2. Rozcieńczyć roztwór wskaźnika Ca2+ roztworem HEPES do stężenia 1 mM. Przechowywać w zamrażarce (-20 °C) i chronić przed światłem.

2. Procedura ładowania barwnika

UWAGA: Procedura wprowadzania barwnika jest wykonywana zgodnie z protokołem wprowadzania przez pień nerwu, zaadaptowanym z wcześniej opublikowanych protokołów19,42,43,44,45,46.

  1. Przeprowadź sekcję mięśnia LAL zgodnie z procedurą sekcyjną dla tego preparatu, opisaną w wcześniej opublikowanych protokołach47,48.
    1. Utrwal tkankę w lekko rozciągniętej pozycji (nie więcej niż 30% długości początkowej) w pokrytej elastomerem szalce Petriego za pomocą cienkich stalowych pinów i dodaj roztwór Ringera, aż mięsień zostanie całkowicie przykryty.
      UWAGA: Szalka Petriego została uprzednio wypełniona elastomerem zgodnie z instrukcją producenta (patrz Tabela materiałów).
  2. Przygotuj pipetę do napełniania
    1. Za pomocą wyciągacza mikropipet (patrz Tabela materiałów) przygotuj mikropipetę z jak najostrzejszą cienką końcówką do rejestracji wewnątrzkomórkowych. Użyj kapilar bez wewnętrznych włókien (średnica zewnętrzna 1,5 mm i średnica wewnętrzna 0,86 lub 1,10 mm).
    2. Odłam końcówkę mikropipety po nacięciu stożka materiałem ściernym, pozostawiając otwór o średnicy około 100 µm. Wygładź końcówkę ogniem do momentu, aż średnica wewnętrzna zmniejszy się z >80 µm do 12-13 µm. Do jednego końca pipety do napełniania przyłącz rurkę silikonową, a do drugiego strzykawkę (bez igły).
  3. Pod stereomikroskopem odnajdź miejsce, w którym pień nerwowy rozdziela się na poszczególne gałęzie nerwowe. Przymocuj pipetę do napełniania wraz z zamontowaną rurką i strzykawką do szalki Petriego za pomocą wosku. Przesuń końcówkę pipety, aż znajdzie się ona nad nerwem.
  4. Za pomocą cienkich nożyczek przetnij nerw blisko włókna mięśniowego, pozostawiając krótki fragment kikuta nerwu o długości około 1 mm. Delikatnie wciągnij kikut nerwu wraz z niewielką ilością roztworu Ringera, nie ściskając go, do końcówki pipety do napełniania. Usuń rurkę silikonową z pipety do napełniania.
  5. Pobierz pewną ilość roztworu ładującego barwnika (~0,3 µL) za pomocą strzykawki z długim włóknem. Objętość ta odpowiada w przybliżeniu 3 cm włókna.
    UWAGA: Wstępnie należy wykonać włókno z końcówki pipety o objętości 10 µL, wyciągając ją nad ogniem lampy alkoholowej lub palnika gazowego.
  6. Delikatnie wprowadź końcówkę włókna z roztworem ładującym do pipety do napełniania. Podaj mieszaninę bezpośrednio na kikut nerwu. Inkubuj preparat w temperaturze pokojowej w ciemności przez 30 min.
  7. Następnie przepłucz preparat świeżym roztworem Ringera i inkubuj w temperaturze 25 °C przez maksymalnie 2 h w szklanym zlewce z 50 mL (lub więcej) roztworu Ringera (preparat musi być całkowicie przykryty roztworem). W tym czasie barwnik dotrze do synaps.

3. Rejestracja obrazu w mikroskopii konfokalnej

UWAGA: Rejestracja przejściowych zmian stężenia wapnia jest przeprowadzana za pomocą konfokalnego mikroskopu skaningowego (LSCM) (patrz Tabela Materiałów). W celu rejestracji szybkich przejściowych zmian stężenia wapnia zastosowano oryginalny protokół, który umożliwiał zapisywanie sygnałów z wystarczającą rozdzielczością przestrzenną i czasową. Metoda ta została szczegółowo opisana w publikacji Arkhipov i wsp.37. Mikroskop był wyposażony w obiektyw imersyjny wodny 20x (1.00 NA). Linię lasera 488 nm osłabiono do 10% intensywności, a fluorescencję emisyjną zbierano w zakresie od 503 do 558 nm.

  1. Zamocuj preparat w komorze eksperymentalnej powlekanej elastomerem silikonowym i unieruchom go, lekko rozciągając, za pomocą zestawu stalowych mikroigieł. Obficie przemyj preparat roztworem Ringera.
    UWAGA: Prosta, wykonana na zamówienie komora perfuzyjna do eksperymentów, wykonana z pleksiglasu, której dno pokryte jest elastomerem (przygotowanym zgodnie z instrukcjami producenta; patrz Tabela materiałów) został wykorzystany. Komora posiada rurkę doprowadzającą roztwór. Roztwór jest wypompowywany poprzez igła strzykawki zamocowana na uchwycie magnetycznym (patrz Tabela materiałów). Jako komorę eksperymentalną można wykorzystać szalkę Petriego (taką samą, jak ta użyta do inkubacji preparatu), ale z dołączonymi rurkami doprowadzającymi i ssącymi.
  2. Zainstaluj elektrodę ssącą, która będzie służyć do stymulacji nerwu.
    UWAGA: Konstrukcja elektrody jest zbliżona do opisanej w publikacji Kazakova i wsp. z 2015 roku49Umieść i zamocuj elektrodę, używając wosku obok kąpieli. Przesuń końcówkę blisko kikutu nerwu i wciągnij go do wnętrza elektrody.
  3. Zamocuj komorę preparacyjną na stoliku mikroskopu, a następnie wprowadź do komory złączki wlotową i wylotową.
  4. Aby przeprowadzić perfuzję preparatu, należy zastosować prosty system oparty na przepływie grawitacyjnym. Włącz pompę ssącą perfuzyjną, aby usunąć nadmiar roztworu.
  5. Podłącz stymulującą elektrodę ssącą do stymulatora elektrycznego i upewnij się, że po podaniu impulsów występują skurcze mięśni. Warunki stymulacji oraz rejestracji opisano w sekcji 3.9-3.12.
  6. Napełnić system perfuzyjny roztworem Ringera z d-tubokurariną (10 µM).
    UWAGA: Roztwór ten zapobiega skurczom mięśniowym. D-tubokuraryna lub specyficzne blokery receptorów nikotynowych acetylocholiny na błonie postsynaptycznej, takie jak alfa-bungaratoksyna, całkowicie lub częściowo hamują skurcze mięśni.50Ponadto, w celu zapobiegania skurczom mięśni stosuje się specyficzne blokery postsynaptycznych kanałów sodowych, takie jak µ-można by zastosować konotoksynę GIIIB51.
  7. Włącz pompę ssącą do perfuzji i rozpocznij perfuzję preparatu roztworem Ringera zawierającym d-tubokurarinę.
  8. Ustaw parametry obrazowania w oprogramowaniu LSCM w następujący sposób.
    1. W oprogramowaniu LSCM (LAS AF; patrz Tabela materiałów), wybierz Elektrofizjologia.
      UWAGA: W tym trybie, podczas rejestrowania obrazu w danym punkcie czasowym, za pomocą modułu wyzwalającego (trigger box) do stymulatora wysyłany jest impuls synchronizujący. Powoduje to generowanie potencjałów czynnościowych w preparacie (Rycina 1; jednostka stymulująca).
    2. Wybierz Tryb akwizycjiAby wyzwolić stymulator za pomocą impulsu synchronizacyjnego mikroskopu, w Zadanie ustawienia menu, wybierz Wyzwalacz ustawienia. Ustawie Sygnał wyzwalający wyjściowy w klatce pole do wyjście1 kanał
    3. Użyj następujących ustawień: Tryb skanowaniaXYT, Częstotliwość skanowania1400 Hz, Współczynnik powiększenia: 6.1, Otwór światłowodowy (pinhole)całkowicie otwarte. Upewnij się, że włączony jest tryb Bidirectional X dla sekwencyjnego przesyłu.
    4. Ustaw minimalny czas formowania klatki na 52 ms oraz liczbę klatek do zebrania w surowym filmie na 20 klatek.
      UWAGA: Powyższe ustawienia umożliwiają rejestrację obrazów o rozdzielczości 128 x 128 pikseli przy przechwytywaniu pojedynczej klatki co 52 ms.
    5. Ustaw długość fali wzbudzenia lasera argonowego na 488 nm przy 8% mocy wyjściowej.

Schemat systemu mikroskopowego do wzbudzenia optycznego; obejmuje układ analizy spektroskopowej i rejestracji danych.
Rysunek 1: Schemat układu eksperymentalnego. 1. Laserowy skaningowy mikroskop konfokalny (LSCM). 2. Moduł synchronizacji LSCM (pudełko wyzwalające). 3. Stymulator. 4. Jednostka izolacyjna. 5. Próbka biologiczna. 6. Elektroda ssąca do stymulacji elektrycznej nerwu. 7. Systemy perfuzyjne (7a: zbiornik z perfuzatem, 7b: kroplownik, 7c: regulator przepływu, 7d: kolba próżniowa). Strzałki wskazują kierunek propagacji impulsu synchronizującego. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

  1. Naciśnij przycisk Live Mode, aby przełączyć urządzenie w tryb na żywo, co pozwala na wstępny podgląd zakończeń nerwowych załadowanych barwnikiem.

Obraz z mikroskopii fluorescencyjnej rozgałęzień neuronów, wizualizujący strukturę komórkową, pasek skali 0-75μm.
Rysunek 2: Nerw i zakończenia nerwowe myszy z obciążonym wskaźnikiem Ca2+. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

  1. Jednostka stymulująca
    UWAGA: W niniejszej pracy zastosowano stymulator opisany w artykule autorstwa Land i wsp.52 zostało zastosowane. Urządzenie to umożliwia ustawienie parametrów czasowych stymulacji poprzez oprogramowanie MatLab.
    1. Utwórz nowy plik, wklej kod z wyżej wspomnianego artykułu do okna kodu MatLab i zapisz plik. Kliknij Uruchomieniewówczas pojawi się okno z parametrami stymulacji. Należy ustawić czas opóźnienia oraz czas trwania bodźca.
      UWAGA: Opóźnienie określa rozdzielczość czasową zrekonstruowanego sygnału fluorescencyjnego. Impuls elektryczny o czasie trwania 0,2 ms jest opóźniany, a następnie przesyłany do jednostki izolacyjnej. Ta ostatnia formuje amplitudę i polaryzację impulsu stymulującego oraz izoluje elektrycznie obiekt biologiczny od aparatury rejestrującej.
    2. Aby pobudzić nerw, należy wybrać nadmaksymalną amplitudę impulsu stymulującego (o 25%–50% większą od maksymalnej intensywności stymulacji niezbędnej do aktywacji wszystkich włókien nerwowych).
      UWAGA: Przedstawiona metoda opiera się na specjalnym algorytmie rejestracji pojedynczych szybkich sygnałów fluorescencyjnych przy użyciu LSCM z zminimalizowanym przesuwaniem (sweep). Na każdym etapie opracowanego algorytmu zarejestrowany sygnał fluorescencyjny jest przesunięty względem poprzedniego o odstęp czasu krótszy niż czas przesuwu mikroskopu. Wartość przesunięć czasowych określa rozdzielczość czasową wymaganego sygnału. Liczba kroków (przesunięć) w algorytmie zależy od wymaganej rozdzielczości czasowej oraz rozdzielczości czasowej pierwotnej. Przy tej metodzie rejestracji stymulacja preparatu jest prowadzona z częstotliwością 0,25 Hz.
  2. W trybie Live odnaleźć obszar ROI i uzyskać optymalną ostrość. Uruchomić oprogramowanie do akwizycji danych.
  3. Zmniejsz opóźnienie w stymulatorze o 2 ms względem poprzedniej wartości i uruchom oprogramowanie do akwizycji danych.
  4. Powtórz krok 3.11 26 razy, aby uzyskać 26 sekwencji, z których każda jest przesunięta o 2 ms względem poprzedniej.

4. Przetwarzanie wideo

UWAGA: Seria obrazów wideo uzyskana za pomocą mikroskopu konfokalnego jest eksportowana w formacie TIFF przy użyciu bezpłatnego oprogramowania LAS X (patrz Tabela materiałów). Seria ta została podzielona na klatki i wyeksportowana do folderu. Do generowania sekwencji obrazów o wyższej rozdzielczości czasowej wykorzystano oprogramowanie ImageJ, które posiada otwarty kod źródłowy do analizy i przetwarzania danych. Schemat algorytmu przetwarzania sygnałów przedstawiono w Rysunek 3.

Schemat rekurencyjnej sieci neuronowej z wykresami sekwencji czasowej dla analizy wzorców czasowych.
Rycina 3: Schemat kompilacji pliku wideo o wysokiej rozdzielczości czasowej (2 ms na klatkę) z oryginalnych plików wideo o niskiej rozdzielczości czasowej (52 ms na klatkę). Oryginalne pliki wideo i odpowiadające im sygnały są zaznaczone kolorami czarnym, magenta i zielonym. Skompilowany plik wideo i wynikowy sygnał są zaznaczone na czerwono. Schemat po prawej stronie, linia po linii, przedstawia obrazy wideo uzyskane za pomocą mikroskopu konfokalnego. Po lewej stronie znajdują się odpowiadające im sygnały zmian fluorescencji z wybranego ROI. Górna linia jest tworzona klatka po klatce z otrzymanych klatek zgodnie ze schematem. Wynikiem jest obraz wideo składający się z całego zbioru klatek w taki sposób, że czas opóźnienia między klatkami wynosi 2 ms zamiast 52 ms. Każda linia odpowiada przesunięciu sygnału stymulacji o (n - 1) * t, gdzie t to przesunięcie czasowe (2 ms), a n to liczba iteracji przesunięcia. k oznacza liczbę klatek w oryginalnych plikach wideo (linie 2-4) i zależy od czasu trwania zarejestrowanego sygnału. W tym przypadku, aby zarejestrować sygnał o czasie trwania 1 s, konieczny jest wybór k = 20 (52 ms * 20 = 1040 ms). t0 to wymagane opóźnienie przed stymulacją. Aby obliczyć liczbę iteracji przesunięcia n, początkową rozdzielczość czasową między klatkami (52 ms) należy podzielić przez wymaganą rozdzielczość czasową (2 ms). W tym przypadku n = 26, co odpowiada 26 zarejestrowanym pomiarom. W wyniku przeprowadzonych operacji uzyskano obraz wideo składający się z n * k = 520 klatek. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

  1. Uruchom oprogramowanie LAS X. Otwórz projekt utworzony podczas przeprowadzania eksperymentu. Kliknij Export, a następnie Save As, aby zapisać klatki w formacie .tiff w folderze docelowym.
  2. Uruchom oprogramowanie ImageJ. Kliknij File > Import > Image Sequence.
  3. W oknie Open Image Sequence wybierz folder docelowy i otwórz pierwszą klatkę.
  4. W oknie Sequence Options, w polu Starting Image, ustaw numer klatki na 1 dla pierwszej klatki. W polu Increment ustaw wartość równą liczbie klatek w początkowym zapisie sygnału (w niniejszym przypadku 20) i kliknij OK.
  5. Aby zapisać wygenerowany plik złożonych pierwszych klatek w osobnym folderze, kliknij File > Save > Folder.
  6. Powtórz kroki 4.3-4.5 dla kolejnych 19 klatek. W oknie Sequence Options ustaw odpowiedni numer klatki w polu Starting Image.
  7. Aby wygenerować pełny film o wysokiej rozdzielczości czasowej, połącz wszystkie klatki. W tym celu kliknij File > Import > Image Sequence i wybierz wartość 1 w polach Starting Image oraz Increment. Wynikiem będzie finalny film ze zwiększoną rozdzielczością czasową. Zapisz plik w formacie .tiff lub innym odpowiednim formacie.

5. Analiza wideo

UWAGA: W programie ImageJ zaznacz ROI oraz tło. Odejmij tło od ROI. Dane są przedstawione jako stosunek, (ΔF / F0 - 1) * 100%, gdzie F0 to intensywność fluorescencji w stanie spoczynku, a ΔF to intensywność fluorescencji podczas stymulacji.

  1. Kliknij w Obraz > Stosy > Narzędzia > Sortownik stosowyNastępnie kliknij Analiza > Narzędzia > Menedżer ROI.
  2. Przeciągnij i upuść plik .tiff zapisany w kroku 4.7 do okna programu ImageJ. Powiększ obraz, aby uzyskać lepszy widok. W celu poprawy wizualizacji obrazu kliknij Obraz > Dostosować > Jasność/Kontrast > AutoTen krok nie wpłynie na dane.
  3. Wyznacz tło w pobliżu zakończenia nerwowego poprzez narysowanie obszaru ROI. Dodaj go do menedżera ROI. Oblicz wartość tła, klikając w Więcej > Pomiar wielokrotnySkopiuj wartości średnie, wklej je do programu arkusza kalkulacyjnego i oblicz średnią.
  4. Odejmij obliczoną wartość średnią od stosów, klikając w Proces > Główny > OdejmijWprowadź wartość.
  5. Wyznacz obszar ROI wokół zakończenia nerwowego poprzez linię wielokata. Dodaj ją do menedżera ROI.
  6. Zmierz intensywność zakończenia nerwowego: Kliknij w Więcej > Pomiar wielokrotnySkopiuj wartości średnie i wklej je do programu arkusza kalkulacyjnego.
  7. Oblicz średnie przesunięcie sygnałów.
    UWAGA: Należy użyć odpowiednich punktów w zależności od czasu opóźnienia przed stymulacją. Ten krok pozwala wyznaczyć F0 wartość, która zostanie wykorzystana w późniejszych obliczeniach.
  8. Podziel wartości sygnału przez średnią wartość przesunięcia.
    UWAGA: Po tym kroku sygnał nie zawiera wkładu tła oraz surowej fluorescencji w wartościach amplitudy dla wybranego ROI.
  9. Od wartości uzyskanych w kroku 5.8 należy odjąć 1, a następnie pomnożyć wynik przez 100%.
  10. Narysuj wykres stężenia Ca2+- stan przejściowy i obliczyć amplitudę.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Po załadowaniu preparatu barwnikiem zgodnie z przedstawioną techniką, większość synaps znajdujących się blisko kikutu nerwu wykazała wystarczający poziom fluorescencji (patrz Rysunek 2). Po załadowaniu preparatu barwnikiem i zastosowaniu opisanego sposobu rejestracji oraz przetwarzania obrazu, uzyskano przejścia wapniowe o pożądanej rozdzielczości przestrzennej i czasowej (patrz Rysunek 4). Przejście wapniowe zostało odzyskaną za pomocą proponowanej metody (patr...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W artykule przedstawiono metodę ładowania barwnika wrażliwego na Ca2+ do zakończeń nerwowych myszy przez kikut nerwowy i rejestrowania szybkiego stanu przejściowego wapnia za pomocą mikroskopu konfokalnego. W wyniku zastosowania tej metody obciążenia, większość synaps zlokalizowanych w pobliżu kikuta nerwowego miała wystarczający poziom fluorescencji, aby umożliwić rejestrację wejścia wapnia do zakończeń nerwowych w odpowiedzi na stymulację nerwu ruchowego o niskiej częstotliwości.

...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Badania fluorescencyjne tej pracy zostały przeprowadzone dzięki finansowemu wsparciu Grantu Rosyjskiej Fundacji Naukowej (nr projektu 19-15-00329). Metoda została opracowana w ramach finansowania z zadania rządowego dla FRC Kazańskie Centrum Naukowe RAS ААААА-А8-118022790083-9. Badania zostały opracowane z wykorzystaniem aparatury Federalnego Centrum Badawczego "Kazańskie Centrum Naukowe RAS". Autorzy pragną podziękować dr Wiktorowi I. Iljinowi za krytyczną lekturę tego manuskryptu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Szkło kapilarneClark Instrumenty elektromedyczne, Wielka BrytaniaGC150-10
System mikroskopu konfokalnego i wielofotonowego Leica TCS SP5 MPLeica Microsystems , Heidelberg, Niemcy
Ściągacz do mikropipet płomieniowo-brązowych P 97Sutter Instrument, USAP-97
Regulator przepływuKD Medical GmbH Produkty szpitalne, NiemcyKD REGJednorazowy zestaw infuzyjny z regulatorem przepływu
HEPESSigma-Aldrich, USAH0887100mL
System oświetlenia Leica CLS 150XLeica Microsystems, Niemcy
ImageJNational Institutes of Health, USAhttp://rsb.info.nih.gov/ij/download.html
Oprogramowanie Las AFLeica Microsystems, Heidelberg, Niemcy
Oprogramowanie Las XLeica Microsystems, Heidelberg, Niemcyhttps://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/
Uchwyt magnetyczny z rurką ssącąBIOSCIENCE TOOLS, USAMTH-S
Microspin FV 2400Biosan, ŁotwaBS-010201-AAA
Minutien PinsFine Science Tools, Kanada26002-20
Multi-spin MSC 3000Biosan, ŁotwaBS-010205-AAN
Oregon Green 488 BAPTA-1 sól pentapotasowaSondy molekularne, USAO6806500 μ g
PipetaBiohit, Rosja7202100,5-10 &mikro; L
Końcówka do pipetBiohit, Rosja78134910 & mikro; L
Plastelinalokalny producent
Jednorazowe igły podskórneBbraun100 Sterican0,4 razy; Program
arkusza kalkulacyjnego40 mm Microsoft, Stany ZjednoczoneMicrosoft Office Excel
Mikroskop stereoskopowy, Leica M80Leica Microsystems , Niemcy
Elektroda ssącaKazakov A. PROSTA ELEKTRODA SSĄCA DO ELEKTRYCZNEJ STYMULACJI OBIEKTÓW BIOLOGICZNYCH / A. Kazakov, M. Alexandrov, N. V. Zhilyakov et al. // Międzynarodowy dziennik naukowy. - 2015. - Nr 9 (40) Część 3. - Str. 13-16.http://research-journal.org/biology/prostoj-vsasyvayushhij-elektrod-dlya-elektricheskoj-stimulyacii-biologicheskix-obektov/
Sylgard 184 elastomerDow Corning, USA
Strzykawkalokalnego producenta0,5 ml
Strzykawkalokalnego producenta60 ml

Bibliografia

  1. Llinas, R., Steinberg, I. Z., Walton, K. Presynaptic calcium currents and their relation to synaptic transmission: voltage clamp study in squid giant synapse and theoretical model for the calcium gate. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 73 (8), 2918-2922 (1976).
  2. Augustine, G. J. How does calcium trigger neurotransmitter release. Current Opinion in Neurobiology. 11 (3), 320-326 (2001).
  3. Burnashev, N., Rozov, A. Presynaptic Ca2+ dynamics, Ca2+ buffers and synaptic efficacy. Cell Calcium. 37 (5), 489-495 (2005).
  4. Schneggenburger, R., Neher, E. Presynaptic calcium and control of vesicle fusion. Current Opinion in Neurobiology. 15 (3), 266-274 (2005).
  5. Pang, Z. P., Südhof, T. C. Cell biology of Ca2+-triggered exocytosis. Current Opinion in Cell Biology. 22 (4), 496-505 (2010).
  6. Leal, S. S., Gomes, C. M. Calcium dysregulation links ALS defective proteins and motor neuron selective vulnerability. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 225(2015).
  7. Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. Journal of Biological Chemistry. 260 (6), 3440-3450 (1985).
  8. Tsien, R. Y. Fluorescent indicators of ion concentrations. Methods in Cell Biology. 30, 127-156 (1989).
  9. Adams, S. R. How calcium indicators work. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (3), (2010).
  10. Macleod, G. T. Topical application of indicators for calcium imaging at the Drosophila larval neuromuscular junction. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (7), 786-790 (2012).
  11. Regehr, W. G. Monitoring presynaptic calcium dynamics with membrane-permeant indicators. Imaging in Neuroscience and Development: A Laboratory Manual. , 307-314 (2005).
  12. Eilers, J., Konnerth, A. Dye loading with patch pipettes. Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (4), 5201(2009).
  13. Coleman, W. L., et al. Synapsin II and calcium regulate vesicle docking and the cross-talk between vesicle pools at the mouse motor terminals. Journal of Physiology. 586 (19), 4649-4673 (2008).
  14. Macleod, G. T. Direct injection of indicators for calcium imaging at the drosophila larval neuromuscular junction. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (7), 797-801 (2012).
  15. Peng, Y. Y., Zucker, R. S. Release of LHRH is linearly related to the time integral of presynaptic Ca+ elevation above a threshold level in bullfrog sympathetic ganglia. Neuron. 10 (3), 465-473 (1993).
  16. Tsang, C. W., Elrick, D. B., Charlton, M. P. α-Latrotoxin releases calcium in frog motor nerve terminals. The Journal of Neuroscience. 20 (23), 8685-8692 (2000).
  17. Newman, Z., et al. Endocannabinoids mediate muscarine-induced synaptic depression at the vertebrate neuromuscular junction. The European Journal of Neuroscience. 25 (6), 1619-1630 (2007).
  18. Macleod, G. T. Forward-filling of dextran-conjugated indicators for calcium imaging at the drosophila larval neuromuscular junction. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (7), 791-796 (2012).
  19. Rossano, A. J., Macleod, G. T. Loading drosophila nerve terminals with calcium indicators. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (6), e250(2007).
  20. Wu, L. G., Betz, W. J. Nerve activity but not intracellular calcium determines the time course of endocytosis at the frog neuromuscular junction. Neuron. 17 (4), 769-779 (1996).
  21. Suzuki, S., et al. Ca2+ dynamics at the frog motor nerve terminal. Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. 440 (3), 351-365 (2000).
  22. Ojala, K. S., et al. A high-affinity, partial antagonist effect of 3,4-diaminopyridine mediates action potential broadening and enhancement of transmitter release at NMJs. Journal of Biological Chemistry. 296, 100302(2021).
  23. Samigullin, D., et al. Estimation of presynaptic calcium currents and endogenous calcium buffers at the frog neuromuscular junction with two different calcium fluorescent dyes. Frontiers in Synaptic Neuroscience. 6, 29(2015).
  24. DiGregorio, D. A., Vergara, J. L. Localized detection of action potential-induced presynaptic calcium transients at a Xenopus neuromuscular junction. The Journal of Physiology. 505, 585-592 (1997).
  25. Bullen, A., Patel, S. S., Saggau, P. High-speed, random-access fluorescence microscopy: I. High-resolution optical recording with voltage-sensitive dyes and ion indicators. Biophysical Journal. 73 (1), 477-491 (1997).
  26. Bullen, A., Saggau, P. High-speed, random-access fluorescence microscopy: II. Fast quantitative measurements with voltage-sensitive dyes. Biophysical Journal. 76 (4), 2272-2287 (1999).
  27. Bullen, A., Saggau, P. Optical recording from individual neurons in culture. Modern Techniques in Neuroscience Research. (4), 89-126 (1999).
  28. Bullen, A., Saggau, P. Indicators and optical configuration for simultaneous high-resolution recording of membrane potential and intracellular calcium using laser scanning microscopy. Pflugers Archiv European Journal of Physiology. 436 (5), 788-796 (1998).
  29. Redshirt Imaging. , Available from: http://www.redshirtimaging.com/redshirt_neuro/hardware_overview.htm (2021).
  30. Wilson, T. Optical aspects of confocal microscopy. Confocal Microscopy. , 93-141 (1990).
  31. Cox, G. Biological confocal microscopy. Materials Today. 5 (3), 34-41 (2002).
  32. Mukhitov, A., Arkhipova, S., Nikolsky, E. Modern Light Microscopy in Biological and Medical Research. Nauka. , Moscow. (2011).
  33. Mertz, J. Optical sectioning microscopy with planar or structured illumination. Nature Methods. 8 (10), 811-819 (2011).
  34. Webb, R. H. Confocal optical microscopy. Reports on Progress in Physics. 59 (3), 427-471 (1996).
  35. Toomre, D., Pawley, J. B. Disk-scanning confocal microscopy. Handbook of Biological Confocal Microscopy: Third Edition. , 221-238 (2006).
  36. Venkateswarlu, K., et al. Three-dimensional imaging and quantification of real-time cytosolic calcium oscillations in microglial cells cultured on electrospun matrices using laser scanning confocal microscopy. Biotechnology and Bioengineering. 117 (10), 3108-3123 (2020).
  37. Arkhipov, A. Y., Khaziev, E. F., Skorinkin, A. I., Bukharaeva, E. A., Samigullin, D. V. Enhancement of the temporal resolution of fluorescent signals acquired by the confocal microscope. Microscopy and Microanalysis. 26 (2), 204-210 (2020).
  38. Rama, S. Shift and mean algorithm for functional imaging with high spatio-temporal resolution. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, (2015).
  39. Chan, K. G., Streichan, S. J., Trinh, L. A., Liebling, M. Simultaneous temporal superresolution and denoising for cardiac fluorescence microscopy. IEEE Transactions on Computational Imaging. 2 (3), 348-358 (2016).
  40. Veeraraghavan, A., Reddy, D., Raskar, R. Coded strobing photography: compressive sensing of high speed periodic videos. IEEE Transactions on Pattern Analysis and Machine Intelligence. 33 (4), 671-686 (2011).
  41. Angaut-Petit, D., Molgo, J., Connold, A. L., Faille, L. The levator auris longus muscle of the mouse: A convenient preparation for studies of short- and long-term presynaptic effects of drugs or toxins. Neuroscience Letters. 82 (1), 83-88 (1987).
  42. Macleod, G. T. Calcium imaging at the Drosophila larval neuromuscular junction. Cold Spring Harbor Protocols. 7 (7), 758-766 (2012).
  43. Samigullin, D. V., Khaziev, E. F., Zhilyakov, N. V., Bukharaeva, E. A., Nikolsky, E. E. Loading a calcium dye into frog nerve endings through the nerve stump: calcium transient registration in the frog neuromuscular junction. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (125), e55122(2017).
  44. Samigullin, D. V., et al. Calcium transient registration in response to single stimulation and during train of pulses in mouse neuromuscular junction. BioNanoScience. 7 (1), 162-166 (2017).
  45. Luo, F., Dittrich, M., Stiles, J. R., Meriney, S. D. single-pixel optical fluctuation analysis of calcium channel function in active zones of motor nerve terminals. Journal of Neuroscience. 31 (31), 11268-11281 (2011).
  46. Luo, F., Dittrich, M., Cho, S., Stiles, J. R., Meriney, S. D. Transmitter release is evoked with low probability predominately by calcium flux through single channel openings at the frog neuromuscular junction. Journal of Neurophysiology. 113 (7), 2480-2489 (2015).
  47. Wright, M., Kim, A., Son, Y. -J. Subcutaneous administration of muscarinic antagonists and triple-immunostaining of the levator auris longus muscle in mice. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (55), e3124(2011).
  48. Burke, S. R. A., Reed, E. J., Romer, S. H., Voss, A. A. Levator Auris Longus preparation for examination of mammalian neuromuscular transmission under voltage clamp conditions. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (135), e57482(2018).
  49. Kazakov, A., Alexandrov, M., Zhilyakov, N. V., Khaziev, E. F., Samigullin, D. V. A simple suction electrode for electrical stimulation of biological objects. Meždunarodnyj naučno-issledovatel'skij žurnal (International Research Journal). 9 (40), 13-16 (2015).
  50. Bowman, W. C. Neuromuscular block. British Journal of Pharmacology. 147, 277-286 (2006).
  51. Hill, J. M., Alewood, P. F., Craik, D. J. Three-dimensional solution structure of µ-conotoxin GIIIB, a specific blocker of skeletal muscle sodium channels. Biochemistry. 35 (27), 8824-8835 (1996).
  52. Land, B. R., Johnson, B. R., Wyttenbach, R. A., Hoy, R. R. Tools for physiology labs: Inexpensive equipment for physiological stimulation. Journal of Undergraduate Neuroscience Education. 3 (1), 30-35 (2004).
  53. Samigullin, D. V., Zhilyakov, N. V., Khaziev, E. F., Bukharaeva, E. A., Nikolsky, E. E. Calcium transient and quantal release in mouse neuromuscular junction under extracellular calcium concentration change. BioNanoScience. 8 (4), 984-987 (2018).
  54. Khaziev, E., et al. acetylcholine-induced inhibition of presynaptic calcium signals and transmitter release in the frog neuromuscular junction. Frontiers in Physiology. 7, 621(2016).
  55. Zhilyakov, N., Arkhipov, A., Malomouzh, A., Samigullin, D. Activation of neuronal nicotinic receptors inhibits acetylcholine release in the neuromuscular junction by increasing ca2+ flux through cav1 channels. International Journal of Molecular Sciences. 22 (16), 9031(2021).
  56. Sabatini, B. L., Regehr, W. G. Optical measurement of presynaptic calcium currents. Biophysical Journal. 74 (3), 1549-1563 (1998).
  57. McArdle, J. J., et al. Advantages of the triangularis sterni muscle of the mouse for investigations of synaptic phenomena. Journal of Neuroscience Methods. 4 (2), 109-115 (1981).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Sygnalizacja wapniowawap presynaptycznytransmisja synaptycznatechnika adowania barwnikiemzako czenia nerw w ruchowychuwalnianie neuroprzeka nik w
Rejestracja stanów przejściowych wapnia w mysim połączeniu nerwowo-mięśniowym z wysoką rozdzielczością czasową przy użyciu mikroskopii konfokalnej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.