Artykuł metodologiczny

Analiza mysiego modelu choroby Parkinsona indukowanego przez wektory wirusowe związane z adenowirusem kodujące ludzką α-synukleinę

6.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63313

⸱

29 lipca 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratorio de Neuroinmunología, Fundación Ciencia & Vida, 2Center for Integrative Biology, Universidad Mayor, 3FONDAP Geroscience Center for Brain Health and Metabolism, 4Buck Institute for Research on Ageing, 5Facultad de Medicina y Ciencia, Universidad San Sebastián

W tym artykule

Podsumowanie

Ta praca analizuje dawkę wektora i czas ekspozycji wymagane do wywołania zapalenia nerwów, neurodegeneracji i upośledzenia motorycznego w tym przedklinicznym modelu choroby Parkinsona. Te wektory kodujące ludzką α-synukleinę są dostarczane do istoty czarnej w celu podsumowania patologii synukleiny związanej z chorobą Parkinsona.

Streszczenie

Choroba Parkinsona jest zaburzeniem neurodegeneracyjnym, które polega na obumieraniu neuronów dopaminergicznych szlaku nigrostriatalnym, a w konsekwencji na postępującej utracie kontroli nad ruchami dobrowolnymi. Ten proces neurodegeneracyjny jest wywoływany przez odkładanie się agregatów białkowych w mózgu, które składają się głównie z α-synukleiny. Kilka badań wykazało, że zapalenie nerwów jest wymagane do rozwoju neurodegeneracji związanej z chorobą Parkinsona. Warto zauważyć, że proces neurozapalny obejmuje aktywację mikrogleju, a także infiltrację obwodowych limfocytów T do istoty czarnej (SN). W niniejszej pracy przeanalizowano mysi model choroby Parkinsona, który podsumowuje aktywację mikrogleju, infiltrację komórek T do SN, neurodegenerację neuronów dopaminergicznych nigralnych i upośledzenie motoryczne. Ten mysi model choroby Parkinsona jest indukowany przez stereotaktyczne dostarczanie wektorów wirusowych związanych z adeno, kodujących ludzką α-synukleinę typu dzikiego (AAV-hαSyn) do SN. Prawidłowe dostarczanie wektorów wirusowych do SN potwierdzono za pomocą wektorów kontrolnych kodujących białko zielonej fluorescencji (GFP). Następnie oceniono, w jaki sposób dawka AAV-hαSyn podawana w SN wpłynęła na zakres ekspresji hαSyn, utratę neuronów dopaminergicznych nigralnych i upośledzenie motoryczne. Ponadto określono dynamikę ekspresji hαSyn, aktywacji mikrogleju i infiltracji limfocytów T w całym przebiegu rozwoju choroby. Tak więc badanie to zapewnia krytyczne punkty czasowe, które mogą być przydatne w celowaniu w patologię synukleiny i zapalenie nerwów w tym przedklinicznym modelu choroby Parkinsona.

Wprowadzenie

Po chorobie Alzheimera, choroba Parkinsona jest drugą najbardziej rozpowszechnioną chorobą neurodegeneracyjną na świecie. Pierwotne neurony dotknięte chorobą Parkinsona to neurony szlaku nigrostriatalnego, które wytwarzają dopaminę i kontrolują dobrowolne ruchy. W konsekwencji najbardziej charakterystycznym objawem związanym z tym zaburzeniem jest upośledzenie ruchowe. Ta patologia obejmuje również odkładanie się agregatów białkowych w mózgu, które składają się głównie z α-synukleiny (αSyn)1, cytozolowego białka związanego z zakończeniami presynaptycznymi. Dowody wykazały, że generowanie patogennych inkluzji αSyn jest wywoływane przez nieprawidłowe fałdowanie lub pewne modyfikacje potranslacyjne tego białka2.

Warto zauważyć, że ustalono ścisły związek między patologią αSyn a utratą neuronów dopaminergicznych szlaku nigrostriatal w ludzkiej chorobie Parkinsona i modelach zwierzęcych3,4. Zrozumienie, w jaki sposób generowane są agregaty αSyn i w jaki sposób indukują śmierć neuronów, stanowi poważne wyzwanie w tej dziedzinie. Rosnąca grupa badań wykazała, że dysfunkcja mitochondriów, poprzez wzrost stresu oksydacyjnego, jest jedną z głównych przyczyn powstawania agregów αSyn2. Rzeczywiście, kilka genów związanych z ryzykiem choroby Parkinsona koduje białka zaangażowane w funkcję, morfologię i dynamikę mitochondriów5,6. Ponadto dysfunkcja lizosomów, która skutkuje akumulacją dysfunkcyjnych mitochondriów i nieprawidłowo sfałdowanym αSyn, stanowi kolejne ważne zdarzenie promujące generowanie agregatów αSyn 7.

Pojawiające się dowody wskazują, że po zdeponowaniu agregatów αSyn w mózgu, te patogenne białka stymulują receptory toll-podobne (TLR) na mikrogleju, wywołując w ten sposób aktywację mikrogleju i początkowe środowisko zapalne w istocie czarnej (SN)8,9. Co więcej, dowody wskazują, że agregaty αSyn są wychwytywane i prezentowane przez komórki prezentujące antygen limfocytom T, indukując adaptacyjną odpowiedź immunologiczną specyficzną dla αSyn10,11. Te limfocyty T specyficzne dla αSyn następnie infiltrują mózg i są remumulowane przez aktywowany mikroglej, promując w ten sposób wydzielanie czynników neurotoksycznych, które wywołują śmierć neuronów9,10. Co ciekawe, kilka linii dowodowych sugeruje, że agregaty αSyn są generowane najpierw w jelitowym układzie nerwowym, a następnie transportowane przez nerw błędny do pnia mózgu12.

Kilka zwierzęcych modeli choroby Parkinsona było używanych przez wiele lat, w tym te wywołane przez podawanie substancji neurotoksycznych (tj. 6-hydroksydopaminy, parakwat, rotenon, 1-metylo-4-fenylo-1,2,3,6-tetrahydropirydyna) oraz te związane z chorobami genetycznymi (np. zmutowana α-synukleina, zmutowana anaza powtórzeniowa bogata w leucynę 2)13. Pomimo tego, że modele obejmujące neurodegenerację wywołaną neurotoksynami replikują niektóre aspekty choroby Parkinsona, żaden z nich nie podsumowuje wszystkich istotnych aspektów choroby lub nie jest postępujący13. Z drugiej strony, chociaż genetyczne modele myszy obejmujące ekspresję zmutowanych wersji bogatej w leucynę kinazy powtórzeniowej 2, zmutowanych wersji α-synukleiny lub nadekspresję ludzkiej α-synukleiny typu dzikiego powodują upośledzenie motoryczne, a w niektórych przypadkach także rozwój synukleinopatii, nie odtwarzają one wyraźnej neurodegeneracji neuronów dopaminergicznych nigralnych, co jest istotnym aspektem choroby Parkinsona13,14. Trzeci rodzaj zwierzęcego modelu neurodegeneracji zdołał spełnić większość istotnych aspektów choroby Parkinsona, stereotaktyczne dostarczanie wektorów wirusowych związanych z adenowirusem (AAV) kodujących ludzką α-synukleinę (AAV-hαSyn)14,15. Co ważne, AAV pozwalają na transdukcję neuronów z wysoką skutecznością, a w dłuższej perspektywie w mózgu dorosłych ssaków. Ponadto wykazano, że stereotaktyczne dostarczanie AAV-hαSyn w SN odtwarza wiele istotnych aspektów choroby, w tym patologię αSyn, aktywację mikrogleju, neurodegenerację i upośledzenie motoryczne16,17,18,19,20. W pracy przedstawiono analizę, w jaki sposób dawka wektora wirusowego i czas po dostarczeniu wektora wirusowego wpływają na zakres ekspresji hαSyn, neurodegenerację i zapalenie nerwów w szlaku nigrostriatalnym, a także stopień upośledzenia motorycznego w mysim modelu jednostronnego stereotaktycznego dostarczania hαSyn w SN.

Protokół

Wszystkie badania zostały przeprowadzone w ramach 8. edycji Przewodnika do opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych. Protokoły eksperymentalne zostały zatwierdzone przez IACUC w Fundación Ciencia & Vida (Fundacji Nauka dla Życia), w tym te obejmujące znieczulenie, ból, dystres i eutanazję (zezwolenie nr P-035/2022).

1. Chirurgia stereotaktyczna

  1. Przygotowanie do zabiegu (ok. 1 h)
    1. Aby utrzymać aseptyczne środowisko, podczas całego zabiegu należy nosić odpowiednią odzież chirurgiczną, w tym ochraniacze na buty, maskę chirurgiczną, barierę sanitarną, rękawiczki i czepek chirurgiczny.
    2. Spryskaj 70% etanolem mysz i cały materiał chirurgiczny, aby utrzymać aseptyczne środowisko.
    3. Aby wywołać analgezję, należy wstrzykiwać myszu karprofen w dawce 5 mg/kg podskórnie (s.c.) co 12 godzin21, zaczynając 1 godzinę przed zabiegiem i kontynuując do 3 dni po zabiegu.
    4. Aby znieczulić mysz, umieść zwierzę w komorze indukcyjnej. Otwórz przepływ izofluranu z szybkością 0,5%, a następnie powoli zwiększaj go do 5% przez około 5 minut, aż mysz straci swój odruch prostowania22.
    5. Wyjmij zwierzę z komory indukcyjnej. Natychmiast przenieś zwierzę do obwodu bez ponownego oddychania z stożkiem nosowym o odpowiedniej wielkości. Utrzymuj znieczulenie myszy za pomocą izofluranu 1% przez cały czas trwania zabiegu.
    6. Upewnij się, że mysz jest całkowicie znieczulona, szczypiąc jej ogon i łapy. Gdy mysz nie reaguje na szczypanie ogona i łap, oznacza to, że mysz jest całkowicie znieczulona.
    7. Ogol głowę myszy za pomocą nożyczek. Oczyść skórę myszy za pomocą bawełnianego wacika z chlorheksydyną 2% i usuń wszystkie włosy.
    8. Zamocuj głowę myszy w ramce stereotaktycznej.
    9. Umieść środek ochronny rogówki w obu oczach myszy za pomocą bawełnianego wacika. Aby zapobiec indukcji stresu u innych gryzoni, unikaj obecności innych myszy na sali operacyjnej23.
  2. Zabieg (ok. 30 min)
    1. Oczyść głowę myszy trzema rundami 2% chlorheksydyny, a następnie 70% etanolem. Odsłoń czaszkę za pomocą materiału chirurgicznego i wykonaj cienki otwór wiertłem w następujących współrzędnych: przednio-tylna −2,8 mm i przyśrodkowo-boczna 1,4 mm w stosunku do linii przyśrodkowej.
    2. Umieść igłę strzykawki o pojemności 10 μl w otworze i powoli przesuwaj igłę wewnątrz mózgu, aż dojdziesz do −7,2 mm grzbietowo-brzusznej w stosunku do opony twardej24.
    3. Pozostaw igłę w końcowej pozycji na 2 minuty, aby tkanka nieco się uspokoiła, a następnie wstrzyknij 1 μl AAV5-CBA-hαSyn (AAV-hαSyn), AAV5-CBA-eGFP (AAV-GFP) lub nośnika (PBS przy pH 7,4; operacja pozorowana) do prawej istoty czarnej w ilości 0,2 μL/30 s.
    4. Pozostawić igłę w tej samej pozycji na 5 minut po podaniu wektorów wirusowych, a następnie powoli ją wycofać.
  3. Po zabiegu (ok. 5 min)
    1. Zamknij ranę za pomocą sterylnego, niewchłanialnego szwu w jedwabiu.
    2. Umieść mysz w rozgrzanej klatce domowej, umieszczając ją na podgrzewanym elektrycznie materacu (25 °C).
      UWAGA: Mysz musi być trzymana sama w klatce domowej, dopóki nie będzie w stanie chodzić bez trudności, a rana się nie zagoi.

2. Określanie wydajności silnika za pomocą testu wiązki

  1. Szkolenie (około 15 minut na mysz)
    1. Dwanaście tygodni po operacji stereotaktycznej oceń sprawność motoryczną za pomocą uproszczonej wersji testu wiązki opisanego wcześniej25. W tym celu użyj belki poziomej o długości 25 cm i szerokości 3 cm. Powierzchnia belki musi być pokryta metalową siatką z kwadratami o boku 1 cm i uniesiona 1 cm nad belką.
    2. Obejrzyj film, na którym mysz przechodzi przez belkę o powierzchni siatki od jednego końca do przeciwległego końca belki, gdzie znajduje się klatka domowa. Trenuj mysz przez 2 dni przed określeniem wydajności motorycznej.
    3. Pierwszego dnia wytrenuj mysz, aby pięciokrotnie przechodziła przez belkę bez siatki.
    4. Drugiego dnia wytrenuj mysz, aby pięciokrotnie przechodziła przez belkę w obecności siatki.
  2. Test (około 5 minut na mysz)
    1. Trzeciego dnia oceń wydajność motoryczną. Aby to zrobić, określ ilościowo liczbę błędów popełnionych osobno przez lewe łapy lub prawe łapy, oglądając filmy w trybie zwolnionego tempa.
      UWAGA: Błąd jest definiowany jako sytuacja, w której łapa nie nadepnie prawidłowo na siatkę i w związku z tym staje się widoczna z boku siatki lub między siatką a powierzchnią belki.

3. Przetwarzanie tkanek

  1. Perfuzja przezsercowa (około 15 minut na mysz)
    1. Aby znieczulić mysz, wstrzyknij mieszaninę ketaminy (80 mg/kg) i ksylazyny (10 mg/kg) dootrzewnowo (i.p.) za pomocą strzykawki 1 ml i igły 27 G26.
    2. Gdy mysz jest całkowicie znieczulona (potwierdzona jak w kroku 1.1.6), otwórz klatkę piersiową materiałem chirurgicznym i odsłoń serce.
    3. Następnie wbij igłę 21 G (płaską końcówkę za pomocą wiertła) do lewej komory serca.
    4. Łącząc igłę z rurką, należy wykonać perfuzję 50 ml PBS (pH 7,4) z szybkością 9,5 ml/min za pomocą pompy perystaltycznej.
  2. Naprawa i krioprotekcja mózgu (około 10 minut na mózg)
    1. Usuń mózg za pomocą nożyczek i pęsety, a następnie utrwal go przez zanurzenie w 5 ml 4% paraformaldehydu w PBS (pH 7,4) w temperaturze 4 °C przez 24 godziny.
    2. Następnie umieść unieruchomiony mózg w 15 ml 30% sacharozy w temperaturze 4 °C na 48 godzin.
    3. Następnie umieść mózg w 4 ml roztworu krioprotekcji (20% gliceryny i 2% DMSO w PBS) i zachowaj mózg w temperaturze -80 °C lub użyj go natychmiast w następnym kroku.
  3. Uzyskiwanie wycinków mózgu (około 20 minut na mózg).
    UWAGA: Upewnij się, że mózg jest umieszczony w kriostacie w odpowiedniej pozycji do wykonania cięć koronalnych.
    1. Aby uzyskać warstwy SN, pokrój mózg na odcinki o grubości 40 μm, zaczynając od −2,92 mm i kończąc na −3,64 mm24.
    2. Zbierz każdy plasterek w studzience (zawierającej 1 ml roztworu krioprotekcji) z 24-dołkowej płytki zgodnie z porządkiem przednio-tylnym, jak opisano wcześniej25,27,28.
    3. Aby przeprowadzić analizy immunohistochemiczne (sekcja 4.) i immunofluorescencyjna (sekcja 5.) w SN, wybierz sześć koronalnych odcinków SN pobranych w jednakowych odstępach czasu (120 μm), które obejmują cały zasięg rostrocaudalny jądra (łącznie 720 μm), jak opisano wcześniej25,27,28.
    4. Aby uzyskać plasterki prążkowia, pokrój mózg na odcinki o grubości 40 μm, zaczynając od +1,34 mm i kończąc na −0,26 mm24.
    5. Zbierz każdą kromkę do krioprobówki o pojemności 2 ml (zawierającej 1 ml roztworu krioprotekcji) zgodnie z kolejnością przednio-tylną.
    6. Aby wykonać analizy immunohistochemiczne (sekcja 4.) i immunofluorescencyjna (sekcja 5.) w prążkowiu, należy wybrać pięć koronalnych odcinków prążkowia pobranych w jednakowych odstępach (320 μm), które pokrywają cały zasięg rostrocaudalny jądra (łącznie 1600 μm).

4. Analiza immunohistochemiczna w celu ilościowego określenia neuronów dopaminergicznych i mikrogleju (około 2 dni)

  1. W celu analizy immunohistochemicznej wycinków prążkowia lub wycinków prążkowia należy umieścić zestaw pięciu (prążkowia) lub sześciu (SN) wycinków z tego samego mózgu w jednym dołku 24-dołkowej płytki.
  2. Przemyć skrawki 3x 1 ml PBS, a następnie inkubować z 0,5 ml 0,03% H2O2 w metanolu w temperaturze pokojowej i mieszając przez 30 minut w celu dezaktywacji endogennej aktywności peroksydazy.
  3. Przemyć skrawki 3x 1 ml PBS i inkubować z 0,5 ml roztworu blokującego (4% surowicy koziej, 0,05% Triton X-100 i 4% BSA w PBS) w temperaturze pokojowej i mieszając przez 40 min.
  4. Następnie inkubować z 0,5 ml roztworu blokującego zawierającego przeciwciało pierwszorzędowe (królicza hydroksylaza anty-tyrozynowa [TH] pAb rozcieńczona w stosunku 1:1000 [patrz Tabela 1]; lub królicze przeciwciało anty-Iba1 rozcieńczone 1:1000) w temperaturze pokojowej i z mieszaniem przez noc.
  5. Przemyć skrawki 3x 1 ml PBS i inkubować z 0,5 ml roztworu blokującego zawierającego biotynylowany kozi anty-króliczy pAb (1:500, patrz Tabela 1) w temperaturze pokojowej i z mieszaniem przez 2 godziny.
  6. Następnie przemyć skrawki 3x 1 ml PBS i inkubować z 0,5 ml awidyny sprzężonej z peroksydazą (1:5000, patrz Tabela 1) w roztworze blokującym w temperaturze pokojowej i mieszając przez 90 minut.
  7. Przemyć skrawki 3x 1 ml PBS i inkubować z 0,5 ml roztworu substratu (0,05% diaminobenzydyny w 0,03% buforze H2O2 / Trizma-HCl o pH 7,6). Na tym etapie należy nosić rękawice i fartuch laboratoryjny, ponieważ diaminobenzydyna jest potencjalnym czynnikiem rakotwórczym.
  8. Gdy wyraźne zabarwienie jest widoczne (zwykle 30 sekund dla TH i 5 minut dla Iba1), wyjmij roztwór podłoża i umyj skrawki 3x 1 ml PBS w temperaturze pokojowej i z mieszaniem. Zawsze przeprowadzaj barwienie immunologiczne wycinków wszystkich mózgów biorących udział w tym samym eksperymencie równocześnie.
    UWAGA: Specyficzne zabarwienie TH jest widoczne, gdy barwienie immunologiczne TH pojawia się w obszarze SN, który ma charakterystyczny kształt w mózgu. Specyficzny znak Iba1 jest określony, gdy barwienie immunologiczne Iba1 pojawia się na kontrolnych wycinkach mózgu o typowych kształtach mikrogleju, które są potwierdzone po obserwacji mikroskopowej. W ten sposób dla każdego eksperymentu ustalany jest dokładny czas ekspozycji substratu do analizy IHC.
  9. Zamontuj skrawki mózgu na szkiełkach podstawowych za pomocą roztworu 0,2% żelatyny w 0,05 M Tris (pH 7,6). Umieść każdy zestaw pięciu (prążkowia) lub sześciu (SN) wycinków uzyskanych z tego samego mózgu w kolejności rostrocaudalnej na tym samym szklanym szkiełku.
  10. Określ ilościowo liczbę neuronów TH+ w SN.
    1. Aby określić ilościowo neurony TH+ w SN, uzyskaj zdjęcia sześciu wycinków przy 20-krotnym powiększeniu za pomocą mikroskopu jasnego pola, jak opisano wcześniej25,27,28. Użyj następującej regulacji kolorów: temperatura barwowa 3200 K, cyjan-czerwony 40%, magenta-zielony 39%, żółto-niebieski 54%, gamma 0.5, kontrast 37, jasność 13, nasycenie 5.
    2. Za pomocą oprogramowania Image J wybierz obwód SN pars compacta na analizowanej półkuli. Unikaj selekcji neuronów TH+ z brzusznego obszaru nakrywki (VTA).
    3. Następnie poproś oprogramowanie o obliczenie wybranego obszaru (zwykle 0,04-0,07 mm2 / półkulę, w zależności od pozycji rostrocaudalnej). Następnie, za pomocą narzędzia do tworzenia wielu punktów, oznacz każdy pojedynczy neuron TH+ kropką.
    4. Korzystając z narzędzia punktowego, poproś oprogramowanie o policzenie całkowitej liczby kropek. Na podstawie całkowitej liczby kropek (neuronów TH+) i obszaru SNpc oblicz gęstość neuronów TH+/mm2.
    5. Powtórz to samo obliczenie w obu półkulach na sześciu wycinkach SN, a następnie oblicz średnią neuronów TH+/mm2 po stronie ipsilateralnej i przeciwległej.
  11. Określ ilościowo liczbę aktywowanego mikrogleju w prążkowiu
    1. Aby określić ilościowo aktywowany mikroglej w prążkowiu, uzyskaj dwa zdjęcia w każdej półkuli dla wszystkich pięciu wycinków prążkowia w 20-krotnym powiększeniu za pomocą mikroskopu jasnego pola i tych samych ustawień, które wskazano w kroku 4.10.1. Korzystając z oprogramowania Image J, na każdym zdjęciu (wyświetlającym obszar 660 μm x 877 μm) oznacz kropką każdą pojedynczą komórkę wyrażającą wysoką intensywność Iba1 i kształt ameboidalny za pomocą narzędzia do tworzenia punktów wielopunktowych. Korzystając z narzędzia punktowego, poproś oprogramowanie o policzenie całkowitej liczby kropek.
    2. Na podstawie całkowitej liczby punktów i obszaru zdjęcia oblicz gęstość aktywowanego mikrogleju (wysokie komórki Iba1/mm2), jak wykonano wcześniej29.

powiedział: szt. szt. szt. szt. szt.
Antygen docelowySprzężony zKlonalnośćGatunek hostaReaktywność gatunku*Rozcieńczeniu**
Hydroksylaza tyrozynyN/aPoliklonalnykrólikMysz, Szczur, Człowiek1/200 - 1/1000
Iba1N/aMonoklonalnychkrólikMysz, Szczur, Człowiek1/1000
alfa-synukleinaN/aMonoklonalnychkrólikludzki1/150
Płyta CD4N/aMonoklonalnychszczurmysz1/250
IgG (H+L)Produkt leczniczy biotynowanyPoliklonalnykozakrólik1/500
IgG (H+L)AlexaFluor 546Poliklonalnykozakrólik1/500
IgG (H+L)AlexaFluor 647Poliklonalnykozakrólik1/500
IgG (H+L)AlexaFluor 546Poliklonalnykozaszczur1/500

Tabela 1: Rozcieńczenia przeciwciał. Nie dotyczy, nie dotyczy. *, Określa się tylko wtedy, gdy występują reaktywności u myszy, szczura i człowieka, niezależnie od reaktywności u innych gatunków. **, Określono pojedyncze rozcieńczenie lub zakres rozcieńczeń.

5. Analiza immunofluorescencyjna w celu oceny infiltracji limfocytów T w szlaku nigrostriatal (około 2 dni)

  1. Do analizy immunofluorescencyjnej hαSyn lub TH/GFP na wycinkach prążkowia lub nikralnym, należy połączyć zestaw pięciu (prążkowia) lub sześciu (SN) wycinków z tego samego mózgu w jednym dołku na 24-dołkowej płytce.
    1. Przemyć skrawki 3x 1 ml PBS, a następnie inkubować z 0,5 ml roztworu blokującego (0,3% Triton X-100, 0,05% tween20 i 5% BSA w PBS) w temperaturze pokojowej i mieszać przez 40 min.
    2. Następnie inkubować z 0,5 ml roztworu blokującego zawierającego przeciwciało pierwszorzędowe (królicze przeciwciało anty-TH pAb rozcieńczone w stosunku 1:500; lub królicze przeciwciało anty-hαSyn rozcieńczone w stosunku 1:150, patrz Tabela 1) w temperaturze pokojowej i mieszając przez noc.
  2. Przemyć skrawki 3x 1 ml PBS i inkubować z 0,5 ml roztworu blokującego zawierającego drugorzędowe przeciwciało anty-królicze sprzężone z AlexaFluor546 (1:500, patrz Tabela 1) i 4′,6-diamidyn-2-fenyloindol (DAPI; 1:1000) w temperaturze pokojowej i z mieszaniem przez 2 godziny. Następnie przemyj skrawki 3x 1 ml PBS.
  3. Zamontuj sekcje mózgowe na szkiełkach podstawowych zgodnie z powyższym opisem (krok 4.9.). Obrazy uzyskano za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego sprzężonego z zasilaczem.
  4. Do analizy immunofluorescencyjnej TH / CD4 / GFP (Foxp3) na plasterkach nigral, umieść zestaw sześciu (SN) plasterków z tego samego mózgu w jednym dołku 24-dołkowej płytki. Przemyć skrawki 3x 1 ml PBS, a następnie inkubować z 0,5 ml roztworu blokującego (0,5% Triton X-100, 0,5% żelatyny ze skóry rybiej w PBS) w temperaturze pokojowej i z mieszaniem przez 2 godziny.
  5. Inkubować z 0,5 ml roztworu blokującego zawierającego pierwszorzędowe przeciwciała królicze anty-TH pAb (1:200, patrz Tabela 1) i szczurzego anty-CD4 (1:250) w temperaturze 4 °C i mieszając przez noc.
  6. Przemyć skrawki 3x 1 ml PBS i inkubować z 0,5 ml roztworu blokującego zawierającego środek przeciw królikom sprzężony z AlexaFluor 647 (1:500, patrz Tabela 1) i środek przeciw szczurom sprzężony z AlexaFluor 546 (1:500) w temperaturze pokojowej i z mieszaniem przez 2 godziny. Następnie przemyj skrawki 3x 1 ml PBS.
  7. Umieść każdy zestaw sześciu (SN) wycinków uzyskanych z tego samego mózgu w kolejności rostrocaudalnej na tym samym szklanym szkiełku i zamontuj je za pomocą Fluoromount G. Uzyskaj obrazy za pomocą mikroskopu Leica DMi8. Użyj ustawień mikroskopu konfokalnego wskazanych w Tabeli 2, aby uzyskać obrazy z analizy immunofluorescencyjnej.
Nazwa ChanelsześcianDługość fali emisyjnejNazwa tabeli przeglądowejCzas naświetlaniakorzyśćRozdzielczość XYRozdzielczość Z
Kanał 1Y5700 nmszary1 011,727 msDuża pojemność studni2.237 um24.444 um
Kanał 2Dobra praktyka rolna525 nmzielony326.851 msDuża pojemność studni2.237 um24.444 um
Kanał 3Specyfikacja TXR630 nmczerwony406,344 msDuża pojemność studni2.237 um24.444 um
Kanał 4Dapi powiedział:460 nmniebieski91,501 msDuża pojemność studni2.237 um24.444 um

Tabela 2: Ustawienia mikroskopu konfokalnego używane do pozyskiwania obrazów z analizy immunofluorescencyjnej.

6. Analiza statystyczna

  1. Aby porównać dane uzyskane ze strony ipsilateralnej i przeciwległej, użyj sparowanego dwustronnego testu t-Studenta.
  2. Aby porównać dane uzyskane od myszy otrzymujących AAV-hαSyn i od myszy otrzymujących AAV-GFP lub pozorowaną operację, użyj niesparowanego dwustronnego testu t-Studenta. Rozważ znaczące różnice, gdy wartości P < 0,05.

Wyniki

Walidacja prawidłowego dostarczenia wektorów AAV do neuronów dopaminergicznych szlaku nigrostriatalnego
W celu zbadania procesów neuroinflamacji, neurodegeneracji i zaburzeń ruchowych wywołanych patologią synukleiny, zastosowano model mysi choroby Parkinsona indukowany jednostronnym stereotaksycznym wprowadzeniem do SN wektora AAV kodującego hαSyn16,17,30,31 (patrz schemat doświadczalny na Rysunku uzupełniającym 1). Aby potwierdzić prawidłowe dostarczenie wektorów AAV do neuronów dopaminergicznych szlaku nigrostriatalnego, do SN wstrzyknięto AAV kodujący GFP (AAV-GFP), a po 12 tygodniach przeanalizowano fluorescencję GFP oraz immunoreaktywność tyrozynowej hydroksylazy (TH) w SN i prążkowiu za pomocą immunofluorescencji. Fluorescencja związana z GFP była obserwowana wyłącznie po stronie ipsilateralnej i stwierdzono znaczną kolokalizację z immunoreaktywnością TH zarówno w SN, jak i w prążkowiu, co wskazuje na prawidłowe dostarczenie wektorów AAV do neuronów dopaminergicznych szlaku nigrostriatalnego (Rysunek 1).

Schemat mikroskopii fluorescencyjnej; analiza barwień TH, GFP i DAPI w istocie czarnej oraz prążkowiu.
Rysunek 1: Analiza dostarczenia AAV-GFP do szlaku nigrostriatalnego. Myszy otrzymały AAV-GFP (1 x 1010 vg/mysz), a po 12 tygodniach zostały uśpione, po czym wykonano immunostaining TH w (A) istocie czarnej (paski skali: 118 µm) oraz (B) prążkowiu (paski skali: 100 µm). Fluorescencję związaną z TH i GFP analizowano za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej. Jądra komórkowe barwiono DAPI. Przedstawiono reprezentatywne obrazy barwień pojedynczych lub nałożonych TH (czerwony), GFP (zielony) i DAPI (niebieski). Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Ustalenie dawki wektora wirusowego podawanego w celu wywołania neurodegeneracji i zaburzeń motorycznych w mysim modelu choroby Parkinsona indukowanej AAV-hαSyn
Aby przetestować dawkę AAV-hαSyn niezbędną do wywołania istotnej nadekspresji hαSyn promującej neurodegenerację dopaminergicznych neuronów istoty czarnej, wstrzyknięto różne dawki AAV-hαSyn (1 x 108 genomów wirusowych [vg]/mysz, 1 x 109 vg/mysz lub 1 x 1010 vg/mysz), a po 12 tygodniach oceniono immunoreaktywność hαSyn oraz zakres immunoreaktywności TH w drodze nigrostriatalnej. Chociaż immunoreaktywność hαSyn była widoczna w SN przy wszystkich testowanych dawkach (Rycina 2), tylko myszy otrzymujące 1 x 1010 vg/mysz wykazały wyraźną immunoreaktywność hαSyn w prążkowiu (Rycina 3). Co więcej, myszy otrzymujące 1 x 1010 vg/mysz AAV-hαSyn wykazały znaczną utratę neuronów dopaminergicznych w SN (Rycina 4A,B). Podczas gdy myszy otrzymujące 1 x 1010 vg/mysz AAV-GFP wykazały niski stopień utraty neuronów (~20%) (Rycina 4A,B), myszy otrzymujące taką samą dawkę AAV-hαSyn zaprezentowały znacznie wyższy stopień neurodegeneracji dopaminergicznych neuronów istoty czarnej (Rycina 4C). W związku z tym dalsze eksperymenty przeprowadzono z użyciem dawki 1 x 1010 vg/mysz AAV-hαSyn. Dodatkowo, zakres zaburzeń motorycznych u myszy otrzymujących różne dawki AAV-hαSyn określono za pomocą testu belkowania (Rycina 5A), zgodnie z wcześniejszym opisem25. Znaczną redukcję sprawności motorycznej w teście belkowania wykryto wyłącznie przy dawce 1 x 1010 vg/mysz AAV-hαSyn, zarówno przy porównywaniu liczby błędów popełnionych prawą i lewą łapą (Rycina 5B), jak i przy porównywaniu całkowitej liczby błędów myszy otrzymujących AAV-hαSyn w stosunku do myszy otrzymujących wektor kontrolny AAV-GFP (Rycina 5C). W konsekwencji dalsze eksperymenty przeprowadzono z użyciem 1 x 1010 vg/mysz AAV-hαSyn.

Immunofluorescencja, ekspresja białka, hαSyn, DAPI, obraz z nałożeniem, analiza eksperymentalna, mikroskopia.
Rysunek 2: Analiza ekspresji ludzkiej α-synukleiny w SN myszy traktowanych różnymi dawkami AAV-hαSyn. Myszy otrzymały AAV-hαSyn w dawkach (A) 1 x 1010 vg/mouse, (B) 1 x 109 vg/mouse lub (C) 1 x 108 vg/mouse i zostały uśpione po 12 tygodniach, a ekspresję hαSyn przeanalizowano za pomocą immunofluorescencji w SN przy użyciu mikroskopii epifluorescencyjnej. Jądra komórkowe barwiono DAPI. Przedstawiono reprezentatywne obrazy z nałożeniem lub pojedynczym barwieniem hαSyn (czerwony) lub DAPI (niebieski). Paski skali wynoszą 118 µm. Aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

immunofluorescencja hαSyn, barwienie DAPI, przekroje tkanki mózgowej, ocena dystrybucji wektora wirusowego.
Rycina 3: Analiza ekspresji ludzkiej α-synukleiny w prążkowiu myszy traktowanych różnymi dawkami AAV-hαSyn. Myszy otrzymały AAV-hαSyn w dawkach (A) 1 x 1010 vg/mouse, (B) 1 x 109 vg/mouse lub (C) 1 x 108 vg/mouse), a po 12 tygodniach zostały uśpione, po czym przeanalizowano ekspresję hαSyn w prążkowiu metodą immunofluorescencji przy użyciu mikroskopii epifluorescencyjnej. Jądra komórkowe zabarwiono DAPI. Przedstawiono reprezentatywne obrazy barwień łączonych lub pojedynczych dla hαSyn (czerwony) lub DAPI (niebieski). Paski skali odpowiadają 100 µm. Wstawka w prawym górnym rogu obrazów łączonych przedstawia obszar zainteresowania w większym powiększeniu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Analiza ekspresji genów, wykresy słupkowe; wpływ wektora AAV na gęstość neuronów, wyniki mikroskopowe.
Rycina 4: Utrata neuronów dopaminergicznych SN u myszy leczonych różnymi dawkami AAV-hαSyn lub wektorem kontrolnym. Myszy otrzymały AAV-hαSyn (1 x 1010 vg/mouse, 1 x 109 vg/mouse lub 1 x 108 vg/mouse) lub AAV-GFP (1 x 1010 vg/mouse), a po 12 tygodniach zostały uśpione i przeanalizowano obecność TH w SNpc za pomocą immunohistochemii. (A) Obrazy reprezentatywne. Paski skali, 100 µm. (B,C) Gęstość neuronów określono jako liczbę neuronów TH+/mm2. Dane przedstawiają średnią ± SEM. n = 3–8 myszy na grupę. (B) Porównanie stron ipsilateralnej i kontralateralnej przeprowadzono za pomocą dwustronnego sparowanego testu t Student’a. (C) Przeprowadzono porównanie stron ipsilateralnych u myszy otrzymujących 1 x 1010 vg/mouse AAV-hαSyn lub AAV-GFP. (B,C) Białe słupki wskazują ilościowe oznaczenie neuronów TH+ po stronie ipsilateralnej u myszy otrzymujących AAV-hαSyn, natomiast zielone słupki wskazują ilościowe oznaczenie neuronów TH+ po stronie ipsilateralnej u myszy otrzymujących AAV-GFP. Szare słupki wskazują ilościowe oznaczenie neuronów TH+ po stronie kontralateralnej w odpowiedniej grupie. Porównania wykonano za pomocą dwustronnego niesparowanego testu t Student’a. *p < 0,05; **p < 0,01. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Próba przejścia po belce; motoryka myszy; wykres słupkowy; błędy przeciwstronne vs ipsilateralne; analiza leczenia AAV.
Rysunek 5: Analiza sprawności motorycznej u myszy traktowanych różnymi dawkami AAV-hαSyn. Myszy otrzymały różne dawki (1 x 1010 vg/mysz, 1 x 109 vg/mysz lub 1 x 108 vg/mysz) AAV-hαSyn lub AAV-GFP, a 12 tygodni później oceniono sprawność motoryczną za pomocą próby przejścia po belce. (A) Zdjęcie myszy idącej po belce. (B) Ilość błędów popełnionych przez kończyny lewe (przeciwstronne) w porównaniu do kończyn prawych (ipsilateralnych) została ilościowo określona w grupach myszy otrzymujących AAV-hαSyn. (C) Całkowita liczba błędów została porównana pomiędzy różnymi grupami eksperymentalnymi otrzymującymi tę samą dawkę AAV-hαSyn lub AAV-GFP. Dane przedstawiają średnią ± SEM. n = 3–5 myszy na grupę. Porównania wykonano za pomocą (B) sparowanego dwustronnego testu t Studenta lub (C) niesparowanego dwustronnego testu t Studenta. *p < 0,05; **p < 0,01. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Ustalenie kinetyki modelu choroby Parkinsona indukowanego AAV-αSyn
Po określeniu odpowiedniej dawki AAV-hαSyn niezbędnej do wywołania znaczącego poziomu neurodegeneracji i zaburzeń motorycznych, przeprowadzono eksperymenty w celu zdefiniowania czasu rozpoczęcia nadekspresji hαSyn. W tym celu myszy poddano leczeniu dawką 1 x 1010 vg/mysz AAV-hαSyn lub wykonano operację pozorowaną. Stopień ekspresji hαSyn analizowano w SN raz w tygodniu w tygodniach 2–5 po zabiegu stereotaktycznym (patrz: projekt eksperymentalny na Ryc. uzupełniającej 2). Wyniki pokazują, że mimo wykrycia niskich poziomów ekspresji hαSyn już w 2. tygodniu po operacji, agregaty hαSyn pojawiły się w 5. tygodniu po zabiegu stereotaktycznym (Ryc. 6).

Immunofluorescencja, ekspresja hαSyn, przekroje mózgu, przebieg czasowy, barwienie DAPI, obrazy nałożone.
Rysunek 6Analiza przebiegu czasowego ekspresji ludzkiej α-synukleiny w istocie czarnej myszy traktowanych AAV-hαSyn. Myszy otrzymały AAV-hαSyn (1 x 1010 vg/mysz) lub tylko pozorną operację stereotaktyczną, a następnie przeanalizowano ekspresję hαSyn w SN (A) 2 tygodnie, (B) 3 tygodnie, (C) 4 tygodnie, lub (D) 5 tygodni później za pomocą immunofluorescencji z wykorzystaniem mikroskopii epifluorescencyjnej. Jądra komórkowe barwiono DAPI. Przedstawiono reprezentatywne obrazy z nałożonymi lub pojedynczymi barwieniami hαSyn (czerwony) lub DAPI (niebieski). Paski skali, 100 µmWstawka w prawym górnym rogu złączonych obrazów przedstawia obszar zainteresowania w większym powiększeniu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Następnie przeprowadzono eksperymenty w celu wyznaczenia odpowiednich punktów czasowych do analizy neurostanu zapalnego i infiltracji limfocytów T w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN) po stereotaktycznym podaniu AAV-hαSyn. Aby określić szczyt aktywacji mikrogleju po podaniu myszom AAV-hαSyn, raz w tygodniu w okresie od 2. do 15. tygodnia po zabiegu stereotaktycznym oceniano liczbę komórek wykazujących wysoką ekspresję Iba1 w prążkowiu. Wyniki wskazują na istotny wzrost aktywacji mikrogleju po stronie ipsilateralnej w porównaniu ze stroną kontralateralną u myszy 15 tygodni po podaniu AAV-hαSyn (Rysunek 7). Za pomocą immunofluorescencji i następującej po niej obserwacji mikroskopowej konfokalnej oceniano również liczbę komórek Treg (CD4+ Foxp3+) infiltrujących SNpc w różnych punktach czasowych po stereotaktycznym podaniu AAV-hαSyn. Wyniki pokazują, że szczyt infiltracji komórek Treg do SNpc wystąpił w 11. tygodniu po zabiegu, natomiast stopień infiltracji komórek Treg do tego obszaru mózgu był niższy w 8. i 13. tygodniu po zabiegu (Rysunek 8). Nie stwierdzono infiltracji limfocytów T CD4+ do prążkowia (dane nie przedstawiono). Podsumowując, wyniki te wskazują, że przy zastosowaniu dawki 1 x 1010 vg/mysz AAV-hαSyn, najodpowiedniejszym momentem do analizy stanu zapalnego w układzie nerwowym jest 15. tydzień po zabiegu stereotaktycznym, natomiast właściwym momentem do analizy infiltracji limfocytów T do OUN wydaje się być 11. tydzień po podaniu AAV-hαSyn.

Obrazy histologiczne i wykres słupkowy aktywacji mikrogleju w czasie; analiza przeciwległa i ipsylateralna.
Rysunek 7: Analiza przebiegu czasowego aktywacji mikrogleju u myszy inokulowanych AAV-hαSyn. Myszy otrzymały AAV-hαSyn (1 x 1010 vg/mysz), a aktywację mikrogleju oceniono poprzez analizę immunohistochemiczną Iba1 w prążkowiu w różnych punktach czasowych po operacji. (A) Przedstawiono reprezentatywne obrazy przekrojowe analizy immunohistochemicznej Iba1 z myszy uśpionych 5, 10 lub 15 tygodni po inokulacji AAV-hαSyn. Paski skali, 110 µm. (B) Gęstość aktywowanego mikrogleju określono jako liczbę komórek wykazujących wysoki poziom Iba1 i kształt ameboidalny na jednostkę powierzchni. Dane przedstawiono jako średnia ± SEM. n = 3 myszy na grupę. Do wyznaczenia różnic statystycznych między poziomem Iba1 po stronie ipsylateralnej i przeciwległej w każdej grupie zastosowano dwustronny sparowany test t Student’a. *p < 0.05. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Mikroskopia gęstości komórek CD4 Foxp3 w immunofluorescencji, barwienie TH, wykres tygodni po operacji dla limfocytów T.
Rysunek 8: Analiza przebiegu czasowego infiltracji limfocytów T CD4+ do SN u myszy inokulowanych AAV-hαSyn. Myszy reporterowe Foxp3gfp otrzymały AAV-hαSyn (1 x 1010 vg/mysz). Obecność limfocytów T CD4+ wykazujących ekspresję Foxp3 oraz obecność neuronów TH+ analizowano w różnych punktach czasowych (tydzień 8, tydzień 11 i tydzień 13 po operacji) w SN przy użyciu immunofluorescencji. (A) Przedstawiono reprezentatywne obrazy dla pojedynczego barwienia immunologicznego lub obrazów połączonych. Paski skali: 100 µm. (B) Ilościowo określono liczbę limfocytów T CD4+ Foxp3+ na obszar w SN. Dane przedstawiają średnią ± SEM dla 3 myszy na grupę. *p<0.05, limfocyty T CD4+ Foxp3+ po stronie ipsilateralnej w porównaniu do strony contralateralnej, test t Studenta dla dwóch stron. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rycina uzupełniająca 1: Projekt eksperymentalny służący do oceny wpływu różnych dawek wektorów AAV na patologię synukleiny, neurodegenerację i zaburzenia motoryczne. Samce myszy C57BL/6 typu dzikiego zostały poddane znieczuleniu i stereotaktycznemu wstrzyknięciu różnych dawek (1 x 1010 vg/mysz, 1 x 109 vg/mysz lub 1 x 108 vg/mysz) AAV kodującego ludzką α-synukleinę (AAV-hαSyn) lub eGFP (AAV-GFP) pod kontrolą promotora CBA do prawej istoty czarnej (SN). Po 12 tygodniach oceniono ekspresję GFP i hαSyn w SN i prążkowiu (Str) za pomocą immunofluorescencji (IF), określono liczbę komórek wykazujących obecność tyrozynowej hydroksylazy (TH+) metodą immunohistochemii (IHC) w SN, a sprawność motoryczną oceniono za pomocą testu przejścia po belce. Liczba myszy w każdej grupie eksperymentalnej jest podana w nawiasach. * oznacza grupy, w których jedna mysz padła przed przeprowadzeniem analiz. Przy każdej analizie w nawiasie podano numer ryciny z treści artykułu, na której przedstawiono odpowiadające jej wyniki. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rycina uzupełniająca 2: Projekt eksperymentalny w celu określenia kinetyki infiltracji limfocytów T, neurostanu zapalnego oraz ekspresji hαSyn. Myszy reporterowe Foxp3gfp poddano znieczuleniu i wykonano stereotaktyczną inokulację AAV (1 x 1010 vg/mysz) kodującego ludzką α-synukleinę (AAV-hαSyn) pod kontrolą promotora CBA do prawej istoty czarnej (SN) lub wykonano zabieg pozorowany (PBS). Myszy uśmiercono w różnych punktach czasowych; ekspresję hαSyn w SN i prążkowiu oceniono za pomocą immunofluorescencji (IF), natomiast liczbę komórek GFP (Foxp3), CD4 oraz komórek wykazujących obecność hydroksylazy tyrozynowej (TH+) określono za pomocą IF w SN, a ekspresję Iba1 przeanalizowano metodą immunohistochemii (IHC) w prążkowiu (Str). Podano liczbę myszy w każdej grupie eksperymentalnej. Wskazano zakres punktów czasowych objętych każdą analizą. Przy każdej analizie w nawiasie podano numer ryciny z treści artykułu, w której przedstawiono odpowiadające im wyniki. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Analizowany tutaj mysi model neurodegeneracji może pomóc w badaniu wielu kluczowych aspektów patofizjologii choroby Parkinsona, w tym mechanizmów związanych z patologią αSyn i aktywacją mikrogleju, roli obwodowego układu odpornościowego w regulacji neurostanu zapalnego oraz mechanizmów neurodegeneracji. Do mechanizmów związanych z patologią αSyn należą mechanizmy subkomórkowe związane z dysfunkcją mitochondriów, lizosomów lub proteasomów w obecności nadmiernego obciążenia αSyn w neuronach dopaminergicznych SN2. Należy wziąć pod uwagę, że oprócz ekspresji hαSyn indukowanej transdukcją za pośrednictwem AAV, do całkowitego poziomu ekspresji αSyn przyczynia się również endogenna mysia αSyn. Myszy transgeniczne z nadekspresją mysiej αSyn wykazują podobną patologię synukleiny, neuropatologię i zaburzenia motoryczne, co modele mysie oparte na nadekspresji hαSyn32. W odniesieniu do aktywacji mikrogleju, niniejszy model mysi może być wykorzystany do badania, w jaki sposób różne czynniki molekularne i komórkowe, takie jak cytokiny, neuroprzekaźniki, astrocyty, neurony, bariera krew-mózg i limfocyty T, mogą regulować nabywanie prozapalnych lub przeciwzapalnych fenotypów funkcjonalnych8,10,11. Model ten stanowi również ważne narzędzie do badania roli obwodowego układu odpornościowego, obejmującego nie tylko limfocyty T, ale także makrofagi, monocyty i neutrofile, w procesach neurostanu zapalnego i neurodegeneracji neuronów istotą czarna11,33,34. Wreszcie, ten model mysi stanowi cenny system do badania komórkowych i molekularnych mechanizmów neurodegeneracji in vivo, w tym tych indukowanych przez wewnętrzne procesy komórkowe, takie jak stres oksydacyjny, deficyty energetyczne i uszkodzone organelle 2, lub tych wywieranych przez czynniki zewnętrzne, takie jak czynniki neurotoksyczne produkowane przez komórki mikrogleju, astrocyty i cytotoksyczne limfocyty T8,28,29,35. 

Ograniczeniem tego modelu mysiego jest brak możliwości zbadania, w jaki sposób patologiczna agregacja αSyn w lokalizacjach pozamózgowych może stanowić początkowe etapy rozwoju choroby Parkinsona36. W związku z tym narasta liczba dowodów wskazujących na to, że przed neurodegeneracją neuronów istoty czarnej i wystąpieniem zaburzeń ruchowych, patologia αSyn rozpoczyna się w błonie śluzowej jelit oraz w nabłonku węchowym36, a prawdopodobnie również specyficzna odpowiedź limfocytów T na αSyn12. Następnie agregaty αSyn miałyby migrować przez nerw błędny do pnia mózgu, wywołując neurostan zapalny i neurodegenerację neuronów dopaminergicznych12. Chociaż model AAV-hαSyn odtwarza większość aspektów choroby Parkinsona, w modelu tym nie występuje wyraźne zaangażowanie patologicznej agregacji αSyn w lokalizacjach pozamózgowych. Alternatywnym modelem obejmującym patologię hαSyn, odpowiednim do badania tych aspektów choroby Parkinsona, mogą być myszy transgeniczne z nadekspresją hαSyn pod kontrolą promotora Thy1, czyli model Thy1-SNCA 37, w którym rozwój choroby zależy od mikrobioty jelitowej i wiąże się z wyraźnymi zaburzeniami żлізуjelitowymi38. 

Choć model ten jest pomocny w badaniu różnorodnych procesów związanych z patofizjologią choroby Parkinsona, obecny model mysi obejmuje krytyczne etapy, które należy skrupulatnie sprawdzać, w tym: prawidłowe dostarczenie wektorów wirusowych do odpowiednich współrzędnych przestrzennych, selektywną ekspresję hαSyn w neuronach (która zależy od serotypu AAV i konstrukcji wektora) oraz właściwą dawkę AAV i czas przed analizą fenotypu parkinsonowskiego. Konieczna jest analiza prawidłowego dostarczenia wektorów wirusowych do SN, ponieważ zastosowanie odpowiednich współrzędnych przestrzennych SN może okazać się niewystarczające, gdy igła nie jest całkowicie prosta, co czasem jest niezauważalne dla ludzkiego oka. Ponadto dyfuzja wektorów AAV zależy od serotypu AAV39. Z tych powodów niezbędne jest przeprowadzanie okresowych kontroli jakości w celu sprawdzenia prawidłowego dostarczenia i dyfuzji wstrzykniętych wektorów AAV-GFP poprzez obserwację GFP w przekrojach mózgu zawierających obszar SN.

W odniesieniu do selektywnej ekspresji hαSyn w neuronach, w zasadzie ekspresję hαSyn można by zaprogramować tak, aby była ona kontrolowana przez promotor selektywny dla neuronów lub, jeszcze precyzyjniej, selektywny dla neuronów dopaminergicznych, na przykład poprzez zastosowanie promotora TH w wektorach AAV w celu indukcji selektywnej ekspresji genów w neuronach dopaminergicznych40. Jednak strategia ta nie sprawdza się w sytuacjach, gdy pożądaną cechą jest nadekspresja badanego genu. Z tego powodu w niniejszym modelu niezbędne jest zastosowanie silnego promotora (promotora indukującego wysoką ekspresję genu znajdującego się w dalszej części sekwencji) oraz serotypów AAV o tropizmie neuronalnym. W niniejszej badaniu jako silny promotor indukujący nadekspresję hαSyn zastosowano promotor CBA, a jako wektor wirusowy serotyp AAV5. Serotyp ten był wcześniej wykorzystywany do transdukcji neuronów myszy i szczura41,42. W tym przypadku wyniki wykazały, że 12 tygodni po podaniu AAV5-GFP do SN myszy, fluorescencja zielona występowała selektywnie po stronie ipsilateralnej zarówno w SN, jak i w prążkowiu (Rysunek 1), co wskazuje na efektywną transdukcję neuronów drogi nigrostriatalnej.

Kolejnym krytycznym aspektem tego modelu mysiego choroby Parkinsona jest punkt czasowy wymagany do analizy konkretnego procesu po zabiegu chirurgicznym. W związku z tym niniejsza praca przedstawia badanie kinetyczne różnych procesów zaangażowanych w patologię. Ponieważ kluczowe punkty czasowe zmieniają się w zależności od dawki genomów wirusowych podanej myszy, zastosowanego serotypu AAV, a nawet partii AAV, w pierwszej kolejności przeprowadzono analizę zależności dawka-odpowiedź w celu ustalenia ilości AAV-αSyn wymaganej do wywołania istotnej utraty neuronów TH+ i upośledzenia funkcji motorycznych. Wcześniejsze badania wykazały znaczące upośledzenie motoryczne oraz utratę neuronów TH+ drogi nigrostriatalnej po 12 tygodniach od wstrzyknięć AAV-αSyn u myszy w dawkach od 6 x 108–3 x 1010 genomów wirusowych na mysz16,17,30,31. Odpowiednio, dawka AAV-hαSyn zastosowana w celu indukcji ekspresji hαSyn w drodze nigrostriatalnej, utraty neuronów TH+ i upośledzenia funkcji motorycznych u myszy mieściła się w zakresie 1 x 108–1 x 1010 genomów wirusowych na mysz. Ponadto, aby sprawdzić, czy utrata neuronów TH+ i upośledzenie motoryczne były wywołane nadekspresją hαSyn w SN, a nie infekcją AAV neuronów SN, włączono grupy kontrolne, w których jednostronnie do SN myszy podano AAV kodujący gen reporterowy (AAV-eGFP), a następnie określono stopień neurodegeneracji i upośledzenia funkcji motorycznych. Wyniki wykazały, że 12 tygodni po zabiegu stereotaktycznym dawka 1 x 1010 genomów wirusowych na mysz była odpowiednią dawką AAV5-hαSyn, ponieważ myszy otrzymujące tę dawkę wirusa wykazały znaczną obecność hαSyn w drodze nigrostriatalnej (Rycina 2 i Rycina 3), utratę neuronów TH+ (Rycina 4) oraz upośledzenie funkcji motorycznych (Rycina 5). W przeciwieństwie do tego, niższe dawki AAV5-hαSyn (1 x 108 genomów wirusowych na mysz i 1 x 109 genomów wirusowych na mysz) nie były wystarczająco silne, aby doprowadzić do istotnych zmian we wszystkich tych parametrach jednocześnie (Ryciny 2–4). Należy zauważyć, że podanie AAV-GFP w dawce 1 x 1010 genomów wirusowych na mysz wywołało niewielki (~20%), ale istotny stopień utraty neuronów TH+ wśród dopaminergicznych neuronów prążkowia (Rycina 4A,B). Wynik ten jest zgodny z wcześniejszymi obserwacjami z zastosowaniem tego modelu41 i prawdopodobnie jest konsekwencją niskiego poziomu neurostanu zapalnego wywołanego podaniem wektorów AAV do SN. Niemniej jednak zakres utraty neuronów TH+ był znacząco większy u myszy otrzymujących AAV5-hαSyn w porównaniu do tych otrzymujących tę samą dawkę AAV-GFP (Rycina 4C). Warto zaznaczyć, że kinetyka ekspresji hαSyn zależy nie tylko od wydajności transdukcji, ale także od zakresu dyfuzji AAV39. Ponieważ dyfuzja AAV zależy od serotypu AAV, precyzyjne kluczowe punkty czasowe w tym modelu zwierzęcym mogą się różnić przy zastosowaniu innego serotypu AAV niż AAV5.

Następnie przeprowadzono analizę kinetyczną z użyciem 1 x 1010 ilość genomów wirusowych na mysz w celu określenia kluczowych punktów czasowych w tym modelu mysim. Ponieważ obecne dowody wykazały występowanie niektórych wczesnych objawów pojawiających się przed upośledzeniem funkcji motorycznych, co umożliwiłoby wczesną diagnostykę choroby Parkinsona43,44te eksperymenty miały na celu wyznaczenie punktu czasowego, w którym ekspresja hαSyn była już widoczna, lecz przy jednoczesnym braku zaburzeń ruchowych. Wyniki wskazują, że początek ekspresji hαSyn w SN nastąpił w 5. tygodniu po stereotaktycznym podaniu AAV-hαSyn (Rycina 6). Ten punkt czasowy stanowi interesujący moment rozpoczęcia podawania terapii ukierunkowanych na zatrzymanie procesów neurozapalnych i neurodegeneracyjnych. Innymi kluczowymi punktami czasowymi określonymi w niniejszej pracy były momenty szczytowe dla dwóch krytycznych zdarzeń związanych z procesem neurozapalenia: czas, w którym mikroglej osiąga maksymalny stopień aktywacji, oraz czas maksymalnej infiltracji limfocytów T do SN. Wyniki wykazały krzywą z tendencją do występowania dwóch fal maksymalnej aktywacji mikrogleju – pierwszej w 10. tygodniu po operacji i drugiej w 15. tygodniu po operacji (Rysunek 7). Analiza kinetyczna infiltracji limfocytów T wykazała, że szczytowy czas infiltracji limfocytów Treg do SN nastąpił w 11. tygodniu po zabiegu stereotaksyjnym (Rysunek 8). Co zaskakujące, nie stwierdzono obecności efektorowych limfocytów T (CD4+ Foxp3-) wykryto wnikające do SN w analizowanym przedziale czasowym (tygodnie 8–13 po operacji). Łącznie wyniki te sugerują odpowiedni przedział czasowy na rozpoczęcie podawania terapii ukierunkowanych na zatrzymanie procesu neurozapalenia i osłabienie infiltracji limfocytów T do SN z wykorzystaniem tego modelu przedklinicznego, który obejmuje okres od 5. tygodnia po operacji (początek nadekspresji hαSyn) do 10. tygodnia po operacji (pierwsza fala neurozapalenia i infiltracji limfocytów T) (Rysunek 9).

Harmonogram podawania AAV-hαSyn z fazami aktywacji mikrogleju i leczenia przeciwzapalnego.
Rysunek 9: Podsumowanie kluczowych punktów czasowych ustalonych dla tego modelu zwierzęcego. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Oświadczenia

Autorzy deklarują, że badanie zostało przeprowadzone przy braku jakichkolwiek konkurencyjnych interesów finansowych lub niefinansowych.

Podziękowania

Dziękujemy Dr. Sebastiánowi Valenzueli i Dr. Micaeli Ricca za ich cenną pomoc weterynaryjną w naszym ośrodku dla zwierząt. Prace te były wspierane przez "Financiamiento Basal para Centros Científicos y Tecnológicos de Excelencia de ANID" Centro Ciencia & Vida, FB210008 (Fundación Ciencia & Vida) oraz Geroscience Center for Brain Health and Metabolism, FONDAP-15150012. Praca ta została również sfinansowana z grantów FONDECYT-1210013 (dla R.P.) i FONDECYT-1150766 (dla F.C.) z "Agencia Nacional de Investigación y Desarrollo de Chile (ANID)" oraz MJFF-10332.01 (dla R.P.) i MJFF-17303 (dla F.C.) z Fundacji Michaela J. Foxa na rzecz Badań nad Chorobą Parkinsona.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
ANIMALS AND ANIMAL FOOD
Foxp3-GFP C57BL/6 myszyThe Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME)Nr katalogowy:  023800
Laboratoryjna dieta dla gryzoniLabDietgryzoni 5001Standardowa dieta dla gryzoni
Myszy C57BL/6 typu dzikiegoLaboratorium Jacksona (Bar Harbor, ME)Nr katalogowy: 000664
WEKTORY WIRUSOWE
AAV5-CBA-&alfa; SynUniversity of Iowa Viral Vector Core FacilityN/AStężenie zapasów przy 10E13 vg/mL
AAV5-CBA-eGFPUniversity of Iowa Viral Vector Core FacilityN/AKoncentracja zapasów przy 9,5 x 10E12 vg/mL
znieczulające i przeciwbólowe
IsofluraneBaxter2180821% do chirurgii stereotaktycznej
KetaminaDrag PharmaCHE3070 mg/kg  do chirurgii stereotaktycznej
SevofluraneBaxterVE2L9117Do perfuzji przed perfuzją przezsercową
TramadolDrag PharmaDPH13430 mg/kg co 24 h
XylazineCentrovetEHL409 mg/kg do chirurgii stereotaktycznej
EQUIPMENT
Test belkiDomowadotyczybelki poziomej o długości 25 cm i szerokości 3 cm. Powierzchnię belki pokryto metalową siatką (1 cm2).
Aparat cyfrowy CryostateLeicaCM1520
NikonS2800 CoolpixDo rejestrowania wydajności testu wiązki
MikroskopOlympusBX51Używany do analizy IHC (sekcja 4.4)
MikroskopOlympusIX71Używany do analizy IF (sekcja 5.3)
MikroskopLeicaDMI8Używany do analizy IF (sekcja 5.7)
Nowy standard stereotaktyczny, myszStoelting, Wood Dale, IL, USA51500rama stereotaktyczna do chirurgii
Pompa perystaltycznaMasterflexC-flex L/S16
ZasilaczOlympusU-RFL-TUżywany do analizy IF (sekcja 5.3)
Szew chirurgicznySylkam®, B Strzykawka C0760171
100 UBD324918Do znieczulenia przed perfuzją przezsercową, strzykawka igłowa 29G
RN 5uL SYR BEZ IGŁYHamiltonHA-7641-01Do inokulacji wektorów wirusowych
< silnych > I ODCZYNNIKÓW< / strong>
Aviden, koniugat peroksydazyMerck, Darmstadt, Niemcy189728
Albumina surowicy bydlęcejMerck, Darmstadt, Niemcy9048-46-8
Bufor kriotrotekcyjnyDomowaN/A20% gliceryny i 2% DMSO w PBS
DAPIAbcamab228549
DiaminoferydynaMerck, Darmstadt, NiemcyD8001
Fluoromount -G TMikroskopia elektronowa Science17984-25
ŻelatynaMerck, Darmstadt, Niemcy104078
Normalna surowica koziaJackson ImmunoResearch Laboratory5000121
ParaformaldehydMerck, Darmstadt, Niemcy104005
PBSDomowaprodukcja N/A0,125 M, pH 7,4
Bufor inaktywujący peroksydazęDomowaprodukcja N/A0,03% H2O2 w metanolu
Triton X-100Sigma-Aldrich9036-19-5
Trizma Chlorowodorek Merck, Darmstadt, Niemcy1185-53-1
Tween 20Sigma-Aldrich822184
PRZECIWCIAŁA
Biotin-SP (long spacer) AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch Laboratory111065003
Kozia anty-królicza IgG (H+L)  Alexa Fluor 546ThermoFisher ScientificA11010
Kozia IgG Anty-Królicza (H+L)  Alexa Fluor 647ThermoFisher ScientificA21244
Kozia IgG Anty-Szczura (H+L)  Alexa Fluor 546ThermoFisher ScientificA11081
Królik monoklonalny anty-alfa-synukleinaAbcamab138501
Królik monoklonalny anty-Iba-1AbcamEPR16588
Królik poliklonalny anty-tyrozynowy hydroksylazaMilliporeAB152
Szczur monoklonalny anty-CD4Biolegend100402
< strong>SOFTWARES
GraphPadPrism6.0Analiza statystyk Fos
ImageJNational Institute of HealthN/ADo analizy obrazu
LAS XLeicaN/ADo przechwytywania obrazów za pomocą mikroskopu Leica
ProgRes Capture ProJenoptikN/ADo rejestrowania obrazów za pomocą mikroskopu
Odtwarzacz multimedialny VLCOrganizacja VideoLAN N/ADo analizy testów behawioralnych
dla nie BraunOlympus

Bibliografia

  1. Braak, H., et al. Staging of brain pathology related to sporadic Parkinson's disease. Neurobiology of Aging. 24 (2), 197-211 (2003).
  2. Lim, K. L., Zhang, C. W. Molecular events underlying Parkinson's disease - An interwoven tapestry. Frontiers in Neurology. 4, 33(2013).
  3. Abdelmotilib, H., et al. α-Synuclein fibril-induced inclusion spread in rats and mice correlates with dopaminergic neurodegeneration. Neurobiology of Disease. 105, 84-98 (2017).
  4. Mori, F., et al. Relationship among alpha-synuclein accumulation, dopamine synthesis, and neurodegeneration in Parkinson disease substantia nigra. The Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 65 (8), 808-815 (2006).
  5. Winklhofer, K. F., Haass, C. Mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease. Biochimica et Biophysica Acta. 1802 (1), 29-44 (2010).
  6. Vazquez-Velez, G. E., Zoghbi, H. Y. Parkinson's disease genetics and pathophysiology. Annual Review of Neuroscience. 44, 87-108 (2021).
  7. Dehay, B., et al. Lysosomal impairment in Parkinson's disease. Movement Disorders. 28 (6), 725-732 (2013).
  8. Gonzalez, H., Elgueta, D., Montoya, A., Pacheco, R. Neuroimmune regulation of microglial activity involved in neuroinflammation and neurodegenerative diseases. Journal of Neuroimmunology. 274 (1-2), 1-13 (2014).
  9. Pacheco, R. T-cell based immunotherapies for Parkinson's disease. Exploration of Neuroprotective Therapy. 1 (2), 72-85 (2021).
  10. Gonzalez, H., Contreras, F., Pacheco, R. Regulation of the neurodegenerative process associated to Parkinson's disease by CD4+ T-cells. Journal of Neuroimmune Pharmacology. 10 (4), 561-575 (2015).
  11. Gonzalez, H., Pacheco, R. T-cell-mediated regulation of neuroinflammation involved in neurodegenerative diseases. Journal of Neuroinflammation. 11 (1), 201(2014).
  12. Campos-Acuna, J., Elgueta, D., Pacheco, R. T-cell-driven inflammation as a mediator of the gut-brain axis involved in Parkinson's disease. Frontiers in Immunology. 10, 239(2019).
  13. Blesa, J., Phani, S., Jackson-Lewis, V., Przedborski, S. Classic and new animal models of Parkinson's disease. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012, 845618(2012).
  14. Ulusoy, A., Decressac, M., Kirik, D., Bjorklund, A. Viral vector-mediated overexpression of alpha-synuclein as a progressive model of Parkinson's disease. Progress in Brain Research. 184, 89-111 (2010).
  15. Gomez-Benito, M., et al. Modeling Parkinson's disease with the alpha-synuclein protein. Frontiers in Pharmacology. 11, 356(2020).
  16. Song, L. K., et al. Targeted overexpression of alpha-synuclein by rAAV2/1 vectors induces progressive nigrostriatal degeneration and increases vulnerability to MPTP in mouse. PLoS One. 10 (6), 0131281(2015).
  17. Theodore, S., Cao, S., McLean, P. J., Standaert, D. G. Targeted overexpression of human alpha-synuclein triggers microglial activation and an adaptive immune response in a mouse model of Parkinson disease. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 67 (12), 1149-1158 (2008).
  18. Sanchez-Guajardo, V., Annibali, A., Jensen, P. H., Romero-Ramos, M. alpha-Synuclein vaccination prevents the accumulation of parkinson disease-like pathologic inclusions in striatum in association with regulatory T cell recruitment in a rat model. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 72 (7), 624-645 (2013).
  19. Sanchez-Guajardo, V., Febbraro, F., Kirik, D., Romero-Ramos, M. Microglia acquire distinct activation profiles depending on the degree of alpha-synuclein neuropathology in a rAAV based model of Parkinson's disease. PLoS One. 5 (1), 8784(2010).
  20. Oliveras-Salva, M., et al. rAAV2/7 vector-mediated overexpression of alpha-synuclein in mouse substantia nigra induces protein aggregation and progressive dose-dependent neurodegeneration. Molecular Neurodegeneration. 8, 44(2013).
  21. Cho, C., et al. Evaluating analgesic efficacy and administration route following craniotomy in mice using the grimace scale. Scientific Reports. 9 (1), 359(2019).
  22. Flecknell, P. Laboratory Animal Anaesthesia. 3rd Ed. , ElsevierAcademic Press. Cambridge, MA. (2009).
  23. Bind, R. H., Minney, S. M., Rosenfeld, S., Hallock, R. M. The role of pheromonal responses in rodent behavior: Future directions for the development of laboratory protocols. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 52 (2), 124-129 (2013).
  24. Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press. Cambridge, MA. (2001).
  25. Elgueta, D., et al. Dopamine receptor D3 expression is altered in CD4+ T-cells from Parkinson's disease patients and its pharmacologic inhibition attenuates the motor impairment in a mouse model. Frontiers in Immunology. 10, 981(2019).
  26. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564(2012).
  27. Fernandez-Suarez, D., et al. The monoacylglycerol lipase inhibitor JZL184 is neuroprotective and alters glial cell phenotype in the chronic MPTP mouse model. Neurobiology of Aging. 35 (11), 2603-2616 (2014).
  28. Elgueta, D., et al. Pharmacologic antagonism of dopamine receptor D3 attenuates neurodegeneration and motor impairment in a mouse model of Parkinson's disease. Neuropharmacology. 113, 110-123 (2017).
  29. Montoya, A., et al. Dopamine receptor D3 signalling in astrocytes promotes neuroinflammation. Journal of Neuroinflammation. 16 (1), 258(2019).
  30. Williams, G. P., et al. Targeting of the class II transactivator attenuates inflammation and neurodegeneration in an alpha-synuclein model of Parkinson's disease. Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 244(2018).
  31. Benskey, M. J., et al. Silencing alpha synuclein in mature nigral neurons results in rapid neuroinflammation and subsequent toxicity. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 36(2018).
  32. Rieker, C., et al. Neuropathology in mice expressing mouse alpha-synuclein. PLoS One. 6 (9), 24834(2011).
  33. Harms, A. S., et al. alpha-Synuclein fibrils recruit peripheral immune cells in the rat brain prior to neurodegeneration. Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 85(2017).
  34. Williams, G. P., et al. CD4 T cells mediate brain inflammation and neurodegeneration in a mouse model of Parkinson disease. Brain. 144 (7), 2047-2059 (2021).
  35. Matheoud, D., et al. Intestinal infection triggers Parkinson's disease-like symptoms in Pink1(-/-) mice. Nature. 571 (7766), 565-569 (2019).
  36. Jan, A., Goncalves, N. P., Vaegter, C. B., Jensen, P. H., Ferreira, N. The prion-like spreading of alpha-synuclein in Parkinson's disease: Update on models and hypotheses. International Journal of Molecular Sciences. 22 (15), 8338(2021).
  37. Chesselet, M. F., et al. A progressive mouse model of Parkinson's disease: The Thy1-aSyn ("Line 61") mice. Neurotherapeutics. 9 (2), 297-314 (2012).
  38. Sampson, T. R., et al. Gut microbiota regulate motor deficits and neuroinflammation in a model of Parkinson's disease. Cell. 167 (6), 1469-1480 (2016).
  39. Ciron, C., et al. Human alpha-iduronidase gene transfer mediated by adeno-associated virus types 1, 2, and 5 in the brain of nonhuman primates: Vector diffusion and biodistribution. Human Gene Therapy. 20 (4), 350-360 (2009).
  40. Ben-Shaanan, T. L., et al. Activation of the reward system boosts innate and adaptive immunity. Nature Medicine. 22 (8), 940-944 (2016).
  41. Albert, K., Voutilainen, M. H., Domanskyi, A., Airavaara, M. AAV vector-mediated gene delivery to substantia nigra dopamine neurons: Implications for gene therapy and disease models. Genes. 8 (2), 63(2017).
  42. Bordia, T., Perez, X. A., Heiss, J., Zhang, D., Quik, M. Optogenetic activation of striatal cholinergic interneurons regulates L-dopa-induced dyskinesias. Neurobiology of Disease. 91, 47-58 (2016).
  43. Kim, A., et al. Upgraded methodology for the development of early diagnosis of Parkinson's disease based on searching blood markers in patients and experimental models. Molecular Neurobiology. 56 (5), 3437-3450 (2018).
  44. Lei, H., et al. Parkinson's disease diagnosis via joint learning from multiple modalities and relations. IEEE Journal of Biomedical and Health Informatics. 23 (4), 1437-1449 (2018).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Model choroby Parkinsonaekspresja alfa synukleinydostarczanie stereotaktycznedroga nigrostriatalnaaktywacja mikroglejuinfiltracja limfocyt w Tutrata neuron w dopaminergicznychzaburzenia ruchoweanaliza immunofluorescencyjna

Powiązane artykuły