Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wieloaspektowe badania neuropeptydów metodą spektrometrii mas u Callinectes sapidus

2.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63322

⸱

31 maja 2022

 ,  , 
1Department of Chemistry, University of Wisconsin-Madison, 2School of Pharmacy, University of Wisconsin-Madison

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Charakterystyka spektrometryczna mas neuropeptydów dostarcza informacji o sekwencji, kwantyfikacji i lokalizacji. Ten zoptymalizowany przepływ pracy jest przydatny nie tylko w badaniach neuropeptydów, ale także innych endogennych peptydów. Przedstawione tutaj protokoły opisują przygotowanie próbki, akwizycję MS, analizę MS i generowanie bazy danych neuropeptydów za pomocą LC-ESI-MS, MALDI-MS spotting i obrazowania MALDI-MS.

Streszczenie

Neuropeptydy to cząsteczki sygnałowe, które regulują prawie wszystkie procesy fizjologiczne i behawioralne, takie jak rozwój, rozmnażanie, przyjmowanie pokarmu i reagowanie na zewnętrzne czynniki stresogenne. Jednak mechanizmy biochemiczne i pełny zestaw neuropeptydów oraz ich funkcjonalne role pozostają słabo poznane. Charakterystyka tych endogennych peptydów jest utrudniona przez ogromną różnorodność w tej klasie cząsteczek sygnałowych. Dodatkowo neuropeptydy są bioaktywne w stężeniach 100x - 1000x niższych niż neuroprzekaźniki i są podatne na degradację enzymatyczną po uwolnieniu synaptycznym. Spektrometria mas (MS) to bardzo czułe narzędzie analityczne, które może identyfikować, określać ilościowo i lokalizować anality bez kompleksowej wiedzy a priori. Doskonale nadaje się do globalnego profilowania neuropeptydów i pomocy w odkrywaniu nowych peptydów. Ze względu na niską liczebność i dużą różnorodność chemiczną tej klasy peptydów, kilka metod przygotowania próbek, parametrów akwizycji MS i strategii analizy danych zostało zaadaptowanych z technik proteomicznych, aby umożliwić optymalną charakterystykę neuropeptydów. W tym miejscu opisano metody izolowania neuropeptydów ze złożonych tkanek biologicznych w celu charakterystyki sekwencji, oceny ilościowej i lokalizacji przy użyciu chromatografii cieczowej (LC)-MS i desorpcji/jonizacji laserowej wspomaganej matrycą (MALDI)-MS. Dołączono protokół przygotowania bazy danych neuropeptydów z kraba błękitnego, Callinectes sapidus, organizmu bez wyczerpujących informacji genomicznych. Te przepływy pracy można dostosować do badania innych klas endogennych peptydów u różnych gatunków przy użyciu różnych instrumentów.

Wprowadzenie

Układ nerwowy jest złożony i wymaga sieci neuronów do przekazywania sygnałów w całym organizmie. Układ nerwowy koordynuje informacje sensoryczne i reakcję biologiczną. Skomplikowane i zawiłe interakcje związane z transmisją sygnału wymagają wielu różnych cząsteczek sygnałowych, takich jak neuroprzekaźniki, steroidy i neuropeptydy. Ponieważ neuropeptydy są najbardziej zróżnicowanymi i najsilniejszymi cząsteczkami sygnałowymi, które odgrywają kluczową rolę w aktywacji reakcji fizjologicznych na stres i inne bodźce, interesujące jest określenie ich specyficznej roli w tych procesach fizjologicznych. Funkcja neuropeptydów jest związana z ich strukturą aminokwasową, która determinuje ruchliwość, interakcję z receptorem i powinowactwo1. Techniki takie jak histochemia, która jest ważna, ponieważ neuropeptydy mogą być syntetyzowane, przechowywane i uwalniane w różnych regionach tkanki, oraz elektrofizjologia zostały wykorzystane do zbadania struktury i funkcji neuropeptydu2,3,4, ale te metody są ograniczone przepustowością i swoistością, aby rozwiązać ogromną różnorodność sekwencji neuropeptydów.

Spektrometria mas (MS) umożliwia wysokoprzepustową analizę struktury i obfitości neuropeptydów. Można to przeprowadzić za pomocą różnych technik MS, najczęściej chromatografii cieczowej z jonizacją elektrorozpylającą MS (LC-ESI-MS)5 i matrycowo wspomaganej desorpcji/jonizacji laserowej MS (MALDI-MS)6. Wykorzystując wysoką dokładność pomiarów masy i fragmentację MS, MS zapewnia możliwość przypisywania sekwencji aminokwasów i statusu modyfikacji potranslacyjnej (PTM) neuropeptydom ze złożonych mieszanin bez wiedzy a priori, aby pomóc w ustaleniu ich funkcji7,8. Oprócz informacji jakościowych, MS umożliwia ilościowe informacje o neuropeptydach za pomocą bezznacznikowej kwantyfikacji (LFQ) lub metod opartych na znacznikach, takich jak znakowanie izotopowe lub izobaryczne9. Główne zalety LFQ to jego prostota, niski koszt analizy i zmniejszone etapy przygotowania próbki, co może zminimalizować straty próbki. Do wad LFQ należy jednak zwiększenie kosztów czasu pracy urządzenia, ponieważ wymaga on wielu powtórzeń technicznych w celu wyeliminowania błędu ilościowego wynikającego ze zmienności między seriami. Prowadzi to również do zmniejszenia zdolności do dokładnego ilościowego określania małych zmian. Metody oparte na znakach podlegają mniej systematycznym zmianom, ponieważ wiele próbek może być znakowanych różnicowo przy użyciu różnych stabilnych izotopów, łączonych w jedną próbkę i jednocześnie analizowanych za pomocą spektrometrii mas. Zwiększa to również przepustowość, chociaż synteza lub zakup etykiet izotopowych może być czasochłonny i kosztowny. Złożoność spektralna widm masowych pełnego skanowania (MS1) również wzrasta wraz ze wzrostem multipleksowania, co zmniejsza liczbę unikalnych neuropeptydów, które można fragmentować, a tym samym identyfikować. I odwrotnie, znakowanie izobaryczne nie zwiększa złożoności spektralnej na poziomie MS1, chociaż wprowadza wyzwania dla analitów o niskiej obfitości, takich jak neuropeptydy. Ponieważ ilościowe oznaczanie izobaryczne przeprowadza się na poziomie widm masowych jonów fragmentacyjnych (MS2), neuropeptydy o niskiej liczebności mogą nie być możliwe do ilościowego określenia, ponieważ do fragmentacji można wybrać bardziej obfite składniki matrycy, a te wybrane mogą nie mieć wystarczająco wysokiej obfitości, aby można je było określić ilościowo. Dzięki znakowaniu izotopowemu można przeprowadzić ocenę ilościową każdego zidentyfikowanego peptydu.

Oprócz identyfikacji i kwantyfikacji, informacje o lokalizacji mogą być uzyskane przez MS za pomocą obrazowania MALDI-MS (MALDI-MSI)10. Poprzez rasterowanie laserem na powierzchni próbki, widma MS można skompilować w obraz mapy cieplnej dla każdej wartości m/z. Mapowanie intensywności sygnału przejściowego neuropeptydu w różnych regionach w różnych warunkach może dostarczyć cennych informacji do określenia funkcji11. Lokalizacja neuropeptydów jest szczególnie ważna, ponieważ funkcja neuropeptydu może się różnić w zależności od lokalizacji12.

Neuropeptydy występują w mniejszej obfitości in vivo niż inne cząsteczki sygnałowe, takie jak neuroprzekaźniki, i dlatego wymagają czułych metod wykrywania13. Można to osiągnąć poprzez usunięcie składników macierzy o wyższej obfitości, takich jak lipids11,14. W porównaniu z powszechnymi procesami pracy w proteomice należy wziąć pod uwagę dodatkowe względy dotyczące analizy neuropeptydów, głównie dlatego, że większość analiz neuropeptydomicznych pomija trawienie enzymatyczne. Ogranicza to możliwości oprogramowania do analizy danych neuropeptydowych, ponieważ większość z nich została zbudowana przy użyciu algorytmów opartych na danych proteomicznych i dopasowaniach białek opartych na wykrywaniu peptydów. Jednak wiele programów, takich jak PEAKS15, jest bardziej odpowiednich do analizy neuropeptydów ze względu na ich możliwości sekwencjonowania de novo. Przy analizie neuropeptydów należy wziąć pod uwagę kilka czynników, począwszy od metody ekstrakcji, a skończywszy na analizie danych MS.

Opisane tutaj protokoły obejmują metody przygotowania próbek i znakowania izotopów dimetylu, pozyskiwania danych i analizy danych neuropeptydów przez LC-ESI-MS, MALDI-MS i MALDI-MSI. Dzięki reprezentatywnym wynikom kilku eksperymentów wykazano użyteczność i zdolność tych metod do identyfikacji, kwantyfikacji i lokalizacji neuropeptydów z niebieskich krabów, Callinectes sapidus. Aby lepiej zrozumieć układ nerwowy, powszechnie stosuje się systemy modelowe. Wiele organizmów nie ma dostępnego w pełni zsekwencjonowanego genomu, co uniemożliwia kompleksowe odkrycie neuropeptydów na poziomie peptydów. Aby złagodzić to wyzwanie, dołączono protokół identyfikacji nowych neuropeptydów i eksploracji transkryptomu w celu wygenerowania baz danych dla organizmów bez pełnych informacji o genomie. Wszystkie przedstawione tutaj protokoły mogą być zoptymalizowane pod kątem próbek neuropeptydów od dowolnego gatunku, a także stosowane do analizy dowolnych endogennych peptydów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie opisane próbki tkanek zostały wykonane zgodnie z wytycznymi Uniwersytetu Wisconsin-Madison.

1. Analiza neuropeptydów metodą LC-ESI-MS

  1. Ekstrakcja i odsalanie neuropeptydów
    1. Przed pobraniem tkanek należy przygotować zakwaszony metanol (acMeOH) (90:9:1 MeOH:woda:kwas octowy) zgodnie z opisem w16.
    2. Zbierz tkankę mózgową ze skorupiaka17 i za pomocą kleszczy natychmiast umieść po jednej tkance w probówce 0,6 ml zawierającej 20 μl acMeOH.
      UWAGA: Protokoły preparacji tkanek różnią się znacznie dla różnych zwierząt i różnych typów tkanek. Czytelnik jest odsyłany do protocol17 w celu uzyskania szczegółowego opisu, jak przeprowadzić sekcję tkanki mózgowej i wielu innych typów tkanek skorupiaka. Próbki można przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu użycia (najlepiej w ciągu 6 miesięcy). Opisane tomy są używane dla pojedynczego mózgu z Callinectes sapidus. Objętości powinny być skalowane w zależności od wielkości tkanki. Tkanka może zostać natychmiast zamrożona bez rozpuszczalnika, chociaż nie jest to zalecane, ponieważ endogenne enzymy proteolityczne nie zostaną zahamowane i pozostaną aktywne, choć w wolniejszym tempie, gdy są zimne.
    3. Dodać 150 μl acMeOH do próbki. Ustaw całkowity czas sonikacji na 24 s, czas impulsu na 8 s, czas pauzy na 15 s i amplitudę na 50% na homogenizatorze ultradźwiękowym i homogenizuj próbki na lodzie.
      UWAGA: Dostępne są różne systemy homogenizacji. Dostosuj ustawienia i warunki do przykładu próbki i wyposażenia.
    4. Odwirować próbkę w temperaturze 4 °C i przy 20 000 x g przez 20 minut. Za pomocą pipety przenieść supernatant do probówki i wysuszyć go w koncentratorze próżniowym (266 x g, 1 x 10-4 Torr) w temperaturze około 35 °C.
      UWAGA: Wysuszone próbki można przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu użycia (najlepiej w ciągu 6 miesięcy). Podgrzewanie koncentratora próżniowego należy wykonywać ostrożnie. Podczas gdy ciepło skraca czas schnięcia, próbkę należy wyjąć z koncentratora natychmiast po odparowaniu całej cieczy, aby zminimalizować degradację peptydów. Aby tego uniknąć, ogrzewanie można pominąć w tym i wszystkich kolejnych krokach.
    5. W celu odsalania ekstrahowaną próbkę tkanki rozpuścić w 20 μl 0,1% kwasu mrówkowego (FA), dobrze odwirować i poddać sonikacji w łaźni wodnej w temperaturze pokojowej przez 1 min.
      UWAGA: Dostępne są różne materiały do odsalania. Dostosuj roztwory i objętości zgodnie z tożsamością żywicy i ilością neuropeptydu. Całkowitą ilość peptydu można oszacować za pomocą dostępnego w handlu testu ilościowego peptydów (patrz tabela materiałów).
    6. Nałożyć 0,5 μl próbki na pasek pH, aby potwierdzić, że pH < 4. Jeśli pH jest wyższe, dodać 1 μl porcji 10% FA, aż pH < 4.
    7. Postępuj zgodnie z protokołem producenta dotyczącym odsalania18. Przygotować roztwór zwilżający zawierający 100 μl 50% acetonitrylu (ACN), roztwór równoważący zawierający 100 μl 0,1% FA, roztwór płuczący zawierający 100 μL 0,1% FA i roztwory elucyjne zawierające 20 μL 25% ACN/0,1% FA, 20 μL 50% ACN/0,1% FA i 20 μL 75% ACN/0,1% FA.
    8. Zaopatrzyć się w końcówkę odsalającą o pojemności 10 μl z żywicą C18 (patrz tabela materiałów).
    9. Umieść końcówkę odsalającą na pipecie o pojemności 20 μl ustawionej na 15 μl. Gdy końcówka do odsalania jest mokra, zapobiegaj przedostawaniu się powietrza, przytrzymując pipetę wciśniętą, gdy nie ma roztworu, aż zostanie wyrzucona.
    10. Zassać końcówkę 3x roztworem zwilżającym i 3x roztworem równoważącym. Odessać próbkę 10x, a następnie przemyć 3x w roztworze do mycia, odrzucając każde przemycie. Elutę przez zasysanie 10x w każdym z roztworów elucyjnych w kolejności wzrostu ACN.
      UWAGA: Frakcje elucyjne mogą być przechowywane oddzielnie lub łączone w celu dalszych analiz.
    11. Wyrzuć zużytą końcówkę odsalającą i wysusz eluowane neuropeptydy w koncentratorze próżniowym (266 x g, 1 x 10-4 Torr) w temperaturze około 35 °C.
      UWAGA: Można go przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu użycia (najlepiej w ciągu 6 miesięcy).
  2. Znakowanie izotopowe neuropeptydów w ekstrakcie tkankowym
    UWAGA: Ten krok jest opcjonalny i używany tylko wtedy, gdy pożądana jest kwantyfikacja.
    1. Przygotować 2-plex izotopowy roztwór do znakowania dimetylu w dygestorium: 1% CH2OH2 (13,5 μL produktu podstawowego 37 procent wagowo-wagowy (% wag.) w roztworze wodnym w 486,5 μL wody), 1% CH2OD2 (25 μL podstawowego 20 % wag. roztworu w 475 μL wody), i 0,03 M boran pirydyna (3,75 μl podstawowego 8 M roztworu w 996,25 μl wody).
      UWAGA: Formaldehyd jest toksyczny, dlatego wszystkie roztwory należy przechowywać w przewiewnym kapturze. Nosić rękawice, fartuch laboratoryjny, okulary ochronne i nieprzepuszczalne obuwie. Podczas pracy z tym materiałem nie należy nosić soczewek kontaktowych.
      UWAGA: Istnieją różne odczynniki izotopowe; Wybierz odpowiednie w zależności od rodzaju próbki i żądanej liczby kanałów etykietowania.
    2. Rozpuścić surowy ekstrakt neuropeptydowy w 10 μl wody i sonikować przez 10 min.
    3. Dodać 10 μl innego izotopowego roztworu formaldehydu (tj. CH2OH, 2,CH2,OD2 itd.) do każdego innego warunku doświadczalnego, który ma być mierzony ilościowo. Odwirować, aby dobrze wymieszać i krótko odwirować każdą próbkę przy 2 000 x g.
    4. Dodać 10 μl 0,03 M boranu pirydyny do każdej probówki z próbką. Odwirować, aby dobrze wymieszać i krótko odwirować każdą próbkę przy 2 000 x g.
    5. Inkubować próbki przez 15 minut w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej.
    6. Wyjąć próbki z łaźni wodnej i dodać 10 μl 100 mM wodorowęglanu amonu. Odwirować, aby dobrze wymieszać i krótko odwirować każdą próbkę przy 2 000 x g.
    7. Połączyć oznakowane próbki w jedną próbkę 2-plex i wysuszyć neuropeptydy w koncentratorze próżniowym (266 x g, 1 x 10-4 Torr) w temperaturze około 35 °C.
    8. Odsolić znakowane neuropeptydy, ponownie wykonując kroki 1.1.5 - 1.1.10 i przechowywać je do momentu, gdy będą gotowe do pobrania danych.
  3. Akwizycja danych
    1. Rozpuść wysuszone odsolone neuropeptydy w 12 μl 3% ACN/0,1% FA, dobrze odwirować, poddać sonikacji w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 1 minutę i krótko odwirować przy 2 000 x g. Przenieść każdą próbkę do fiolki z automatycznym podajnikiem próbek.
      UWAGA: Dostosuj objętość próbki w zależności od ilości neuropeptydu do stężenia ~1 μg peptydu na μl. Całkowitą ilość peptydu można oszacować za pomocą komercyjnego testu ilościowego peptydów (patrz Tabela materiałów).
    2. Za pomocą automatycznego podajnika próbek wstrzyknąć 1 μl próbki do przyrządu nano-LC-MS/MS o wysokiej rozdzielczości (patrz tabela materiałów).
    3. Użyć kolumny C18 o długości około 15 cm z odwróconą fazą (RP) (patrz tabela materiałów) do przeprowadzenia próbki z 0,1% FA w wodzie jako faza ruchoma A i 0,1% FA w ACN jako faza ruchoma B. Próbki należy badać z gradientem 3% - 95% B z szybkością 300 nL/min przez ponad 11 minut.
    4. W przypadku zastosowanego tutaj przyrządu MS należy zastosować typowe warunki MS 2.00 kV dla napięcia rozpylania i 275 °C dla temperatury kapilary.
    5. Pozyskiwanie widm MS w zakresie 200 - 2 000 m/z rozdzielczością 60 000, celem automatycznej kontroli wzmocnienia (AGC) 1 x 106 i maksymalnym czasem wtrysku jonów (IT) 150 ms.
    6. Wybierz 15 najbardziej intensywnych jonów (minimalna intensywność 3,2 x 104) dla fragmentacji dysocjacji zderzeń o wyższej energii (HCD) przy użyciu znormalizowanej energii zderzenia 30, okna izolacji 2,0 m/z, rozdzielczości 15 000, celu AGC 2 x 105 i maksymalnego IT 250 ms.
    7. Ustaw dynamiczne okno wykluczenia na 30 s. Wyklucz jony o ładunku 1 lub ≥ 8 oraz jony o nierozpoznanych stanach ładunku.
  4. Identyfikacja i oznaczanie ilościowe neuropeptydów
    UWAGA: Dostępnych jest wiele programów do przeszukiwania baz danych i oznaczania ilościowego peptydów (zarówno open-source, jak i komercyjnych). W tym przypadku zostanie użyte PEAKS Studio (oprogramowanie proteomiczne)15.
    1. Przeszukaj bazę danych, wykonując czynności opisane w punktach 1.4.2 - 1.4.6.
    2. Utwórz nowy projekt i dodaj dane LC-MS, wybierając opcję Brak dla enzymu, Orbitrap dla instrumentu, HCD dla fragmentu i akwizycję zależną od danych (DDA) dla akwizycji.
      UWAGA: Wybierz odpowiednie parametry na podstawie parametrów akwizycji danych.
    3. Wybierz Identyfikacje i wybierz Poprawny prekursor [DDA] i Tylko masa.
    4. Wybierz opcję Wyszukiwanie w bazie danych i ustaw tolerancję błędu 20,0 ppm przy użyciu masy monoizotopowej dla masy prekursora i 0,02 Da dla masy jonów fragmentowych, Brak dla typu enzymu, Niespecyficzny dla trybu trawienia, 100 dla maksymalnych pominiętych rozszczepień oraz następujące zmienne PTM z maksymalną dozwoloną zmienną PTM na peptyd wynoszącą 3: Amidacja, Utlenianie (M), Pyro-glu z Eoraz Pyro-glu z Q.
    5. Wybierz bazę danych neuropeptydów, oszacuj współczynnik fałszywych wykryć (FDR) za pomocą decoy-fusion.
      UWAGA: Błąd tolerancji masy należy skorygować, aby odpowiadał zebranym danym. Użyj odpowiedniej bazy danych dla typu próbki. Jeśli żaden enzym nie zostanie wybrany, parametr max missed splites nie ma wpływu na wyszukiwanie. Jednak duża liczba pominiętych rozszczepień jest wymagana, jeśli oprogramowanie nie ma opcji Nieokreślony tryb skrótu.
    6. Jeśli wymagana jest kwantyfikacja bez etykiet, wybierz opcję Kwantyfikacja, wybierz opcję Bez etykiet i ustaw tolerancję błędu 20,0 ppm i tolerancję czasu przechowywania na 1,0 min.
    7. Przeprowadzić kwantyfikację jonów prekursorowych, jeśli wykonano krok 1.2 dla znakowania izotopowego.
      1. Wybierz opcję Kwantyfikacja, wybierz opcję Kwantyfikacja jonów prekursora, użyj zakresu czasu przechowywania 1,0 min i użyj progu FDR wynoszącego 1%.
      2. Wybierz wstępnie ustawioną lub niestandardową metodę kwantyfikacji z menu rozwijanego Wybierz metodę.
      3. Aby utworzyć nową metodę niestandardową, kliknij Okno > Konfiguracja > Etykieta metody Q > Nowa. Nazwij nową metodę i wybierz opcję Oznaczanie ilościowe jonów prekursorowych jako Typ metody. Wybierz pozycję Dodaj wiersz i wybierz modyfikację z listy Opcje PTM.
      4. Dodaj dane LC-MS i wybierz Warunek odniesienia, który ma być modyfikacją neuropeptydów z warunku kontrolnego eksperymentu.
    8. Oceń wyniki wyszukiwania zgodnie z opisem w krokach 1.4.9 - 1.4.11.
    9. Przefiltruj wyniki za pomocą karty podsumowania dla peptydów i białek o ≥ -10lgP 20, wybierz ≥ 1 unikalny peptyd i zaznacz pole oznaczone Ze znaczącymi peptydami.
    10. Oceń wyniki wyszukiwania w bazie danych, gdzie Protein.csv reprezentuje identyfikacje neuropeptydów, a Peptide.csv reprezentuje identyfikacje fragmentów neuropeptydu.
    11. Sprawdź bazę danych, aby uzyskać wyniki białek i peptydów, dokładność masy i pokrycie sekwencji.
      UWAGA: Każde oprogramowanie do przeszukiwania baz danych wykorzystuje unikalne algorytmy punktacji i może być konieczne odpowiednie oszacowanie. Identyfikacje można ocenić, ręcznie sprawdzając obserwowane widma pod kątem zidentyfikowanych peptydów zawierających pełną serię jonów fragmentowych.

2. Analiza plam neuropeptydów metodą MALDI-MS

  1. Przygotowanie próbki
    1. Postępuj zgodnie z krokiem 1.1 lub krokami 1.1 - 1.2, jeśli pożądane jest określenie ilościowe, z wyłączeniem kroku 1.2.8 (odsalanie po znakowaniu izotopowym nie jest wymagane przed analizą MALDI-MS).
    2. Rozpuść wysuszone odsolone neuropeptydy w 5 μl 0,1% FA, dobrze zwirować, poddać sonikacji w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 1 minutę i krótko odwirować przy 2 000 x g.
    3. Do plamienia neuropeptydów w tkankach skorupiaków należy przygotować 150 mg/ml kwasu 2,5-dihydroksybenzoesowego (DHB) w 50% metanolu (MeOH)/0,1% FA (v/v) jako matrycę.
    4. Pobrać pipetę z kroplą próbki o objętości 3 μl na folię hydrofobową (zob. tabela materiałów) i odpipetować 3 μl matrycy bezpośrednio na kroplę próbki. Pipetować w górę i w dół, aby wymieszać.
    5. Odpipetować 1 μl próbki w stosunku 1:1: mieszanina matrycowa do studzienki płytki tarczowej MALDI ze stali nierdzewnej. Za pomocą końcówki pipety rozprowadzić każdą mieszaninę na krawędziach dołka próbki. Próbka musi dotykać krawędzi grawerunku studni, aby ułatwić równomierne rozprowadzenie (Rysunek 4A).
    6. Umieść 1 μl mieszaniny kalibru 1:1 (komercyjna lub niestandardowa mieszanka kalibracyjna, materiały polimerowe (tj. czerwony fosfor rozpuszczony w MeOH) lub wspólne jony klastrowe matrycy)12 do studzienki w pobliżu próbki.
      UWAGA: Fosfor czerwony nie musi być mieszany z matrycą przed plamieniem.
  2. Akwizycja danych
    1. Włożyć płytkę celowniczą zawierającą wysuszone plamki próbek do przyrządu MALDI Tandem Time-of-Flight (TOF/TOF) (patrz Tabela Materiałów).
    2. W przypadku matrycy DHB ustaw moc lasera na 95%, wybierz Automatyczne optymalne wzmocnienie detektora i tryb ruchu Smart - Complete Sample Carrier (Inteligentny - Kompletny nośnik próbki). Uzyskaj widma MS w zakresie 200 - 3200 m/z i dodaj wiele widm z każdego miejsca, aby zwiększyć stosunek sygnału do szumu neuropeptydu.
      UWAGA: Zoptymalizuj procentową moc lasera, wzmocnienie detektora i wybierz odpowiedni tryb ruchu nośnika próbki, tak aby każda akwizycja obejmowała mniej więcej całe miejsce, a kolejne akwizycje nie przechodziły do poprzednich pozycji.
    3. Skalibruj przyrząd.
      UWAGA: Dostosuj zakres masy, aby objąć żądany zakres neuropeptydów.
  3. analiza danych
    1. Otwórz plik MALDI-MS w oprogramowaniu do analizy danych (patrz Spis materiałów) i kliknij opcję Odejmowanie linii bazowej dla używanego tutaj oprogramowania.
    2. Pobranie wartości szczytowych należy wykonać, klikając przycisk Znajdź listę mas. Jeśli pików jest za mało, edytuj listę mas ręcznie, wybierając opcję Edytuj listę mas i kliknij piki w widmie, aby dodać je do listy mas.
    3. Wykonaj dokładne dopasowanie masy, porównując listę mas z bazą danych neuropeptydów zawierającą wartości [M+H]+ m/z (błąd ± 200 ppm).
      UWAGA: Zwykłe addukty soli, takie jak [M+K]+, [M+Na]+ i [M+NH4]+, powinny być również uwzględnione na dokładnej liście docelowej dopasowania masy.
    4. Aby zweryfikować zidentyfikowane piki, wygeneruj listę interesujących nas m/z i wykonaj eksperymenty MS/MS.

3. Analiza obrazowa neuropeptydów metodą MALDI-MS

  1. Przygotowanie próbki
    UWAGA: Etapy osadzania i cięcia nie są konieczne w przypadku tkanek, które są zbyt cienkie, aby można je było pokroić.
    1. Napełnij pół kubka kriostatu żelatyną (37 °C, 100 mg/ml w wodzie dejonizowanej) i pozwól mu zestalić się w temperaturze pokojowej. Resztki płynnej żelatyny należy przechowywać w cieple w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
    2. Zbierz pożądaną tkankę neuronalną od zwierzęcia i użyj kleszczy, aby natychmiast zanurzyć tkankę w probówce o pojemności 0,6 ml zawierającej wodę dejonizowaną na 1 s.
      UWAGA: Patrz Krok 1.1.2 UWAGA dotycząca sekcji tkanki neuronalnej.
    3. Umieść tkankę na wierzchu stałej żelatyny i napełnij resztę kubka kriostatu płynną żelatyną. Użyj kleszczy, aby ustawić tkankę.
    4. Umieść kubek kriostatu na płaskiej powierzchni i zamroź suchym lodem.
      UWAGA: Próbki należy przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu użycia (najlepiej w ciągu 6 miesięcy).
    5. W celu przygotowania do cięcia należy oddzielić próbkę zatopioną w żelatynie od formy kriostatu, odcinając formę.
    6. Zamontuj osadzoną tkankę na uchwycie kriostatu, pipetując kroplę 1 ml wody dejonizowanej na uchwyt i natychmiast dociskając osadzoną tkankę do kropli.
    7. Po zamrożeniu odpipetuj więcej dejonizowanej wody wokół tkanki, aby dodatkowo przymocować ją do uchwytu. Wykonaj te czynności w pojemniku kriostatu (patrz Tabela materiałów) ustawionym na -20 °C.
    8. Tkankę należy podzielić na sekcje o przybliżonej grubości jednej komórki (8-20 μm w zależności od typu próbki) i rozmrozić Zamontuj każdą sekcję na szkiełku pokrytym tlenkiem indu cyny (ITO), umieszczając jedną stronę szkiełka w pobliżu sekcji i kładąc palec po drugiej stronie szkiełka, aby powoli ogrzać szkło i pozwolić, aby sekcja przykleiła się do szkiełka.
      UWAGA: Skrawki tkanki można również rozmrozić, podnosząc jedną krawędź żelatyny pęsetą (schłodzoną do -20 °C), umieszczając ją na szkiełku podstawowym pokrytym ITO i kładąc palec po drugiej stronie szkiełka, aby powoli ogrzać szkło i pozwolić, aby fragment przykleił się do szkiełka.
    9. Odnaleźć próbkę, która ma być użyta jako kalibert (patrz krok 2.1.6 w celu zapoznania się z opcjami kalibru), rysując mały okrąg w pobliżu przekroju tkanki za pomocą hydrofobowego pisaka i dostrzegając kalibert wewnątrz koła.
    10. Zaznacz każdy róg slajdu pisakiem wybielającym o małym kształcie zawierającym ostre krawędzie (tj. x), które mają być używane jako punkty uczenia.
    11. Umieść szkiełko w płytce adaptera suwaka MALDI i wykonaj skanowanie optyczne w wysokiej rozdzielczości (≥2400 DPI) za pomocą skanera.
    12. Rozpylić matrycę na wycinek tkanki za pomocą automatycznego rozpylacza (szczegóły i instrukcje dotyczące rozpylacza znajdują się w Tabeli materiałów).
    13. W przypadku MSI neuropeptydów w tkankach skorupiaków należy użyć 40 mg/ml DHB w 50% metanolu/0,1% FA (v/v) jako matrycy, ustawić temperaturę dyszy na 80 °C, prędkość na 1,250 mm/min, natężenie przepływu na 0,1 ml/min, liczbę przejść na 12 i 30 s między każdym przejściem dla automatycznego opryskiwacza.
  2. Akwizycja danych
    1. Włożyć całkowicie wysuszoną płytkę docelową zawierającą rozmrożone skrawki tkanki, które zostały spryskane matrycą.
    2. Skonfiguruj parametry pliku akwizycji obrazowania MS w taki sposób, aby średnica lasera była mniejsza niż rozmiar kroku rastra.
    3. Załaduj zeskanowany obraz optyczny i skalibruj płytkę próbki za pomocą x punktów uczenia. Zdefiniuj obszary tkanki będącej przedmiotem zainteresowania, które mają być mierzone nieco większe niż rzeczywisty przekrój tkanki, aby uwzględnić również obszary zawierające tylko matrycę.
    4. Skalibruj przyrząd i uzyskaj widma w zakresie 200 - 3200 m/z. Dostosuj zakres mas, aby objąć żądany zakres neuropeptydów.
  3. analiza danych
    1. Aby przetworzyć dane, zaimportuj zestaw danych obrazowania MS do żądanego oprogramowania, wybierz algorytm usuwania linii bazowej i znormalizuj dane za pomocą całkowitej liczby jonów.
      UWAGA: Wybór różnych algorytmów normalizacji, takich jak mediana, wartość średniej kwadratowej (RMS) lub intensywność referencyjnej wartości m/z, prawdopodobnie zmieni rozkład przestrzenny wielu wartości m/z. Wybierz algorytm normalizacji najlepiej dopasowany do pożądanych analitów.
    2. Aby wygenerować obraz dla każdej wartości m/z z teoretycznej listy pików, prześlij plik z wartościami rozdzielanymi przecinkami (CSV) zawierający neuropeptyd [M+H]+, [M+Na]+, [M+NH4]+ itd. Uzyskaj wartości m/z, klikając Plik > Importuj > listę pików. Nazwij listę szczytów.
    3. Aby oszacować odpowiedni próg błędu ppm, należy najpierw ręcznie zidentyfikować pik neuropeptydu w widmie MS i porównać go z teoretyczną masą neuropeptydu. Oblicz błąd ppm i kliknij Plik > Właściwości pliku > Szerokość interwału i błąd wejściowy ppm.
    4. Wybierz listę szczytów z menu rozwijanego i kliknij Utwórz obrazy m/z dla każdego interwału listy szczytów.
    5. Zapisz każdy obraz m/z, klikając Zapisz zrzut ekranu każdego obrazu m/z.
      UWAGA: Przypuszczalną identyfikację neuropeptydu można przeprowadzić, identyfikując obrazy m/z, w których sygnał analitu jest zlokalizowany tylko w tkance, a nie w otaczającej macierzy.
    6. Aby zweryfikować tożsamość szczytu, wygeneruj listę m/z zainteresowania i wykonaj eksperymenty MS/MS.

4. Odkrywanie nowych przypuszczalnych neuropeptydów za pomocą sekwencjonowania de novo

  1. Wykonaj kroki 1.4.2 - 1.4.5.
  2. Eksport de novo tylko peptides.csv z oprogramowania PEAKS ze średnim wynikiem lokalnego poziomu ufności (ALC) ≥ 75,
    UWAGA: Dostępnych jest wiele programów do sekwencjonowania de novo, z których każde ma własne algorytmy punktacji i powinno być odpowiednio oceniane.
  3. Przeszukaj listę peptydów w poszukiwaniu znanych motywów sekwencji wskazujących na neuropeptydy należące do określonych rodzin neuropeptydów19.
    UWAGA: Chociaż motywy są zwykle dobrze zachowane u różnych gatunków, poszukiwane motywy powinny być wybierane z uwzględnieniem próbnego organizmu.

5. Eksploracja transkryptomu dla przewidywanych sekwencji neuropeptydów

UWAGA: Ten krok jest opcjonalny i służy tylko do dodania do istniejącej bazy danych neuropeptydów lub zbudowania nowej bazy danych neuropeptydów.

  1. Wybierz znaną sekwencję aminokwasów preprohormonów, która Cię interesuje i użyj tBLASTn (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=tblastn&BLAST_PROGRAMS=tblastn&PAGE
    _TYPE=BlastSearch&SHOW_DEFAULTS=włączony&LINK
    _LOC=blasthome) w celu wyszukania sekwencji preprohormonów w bazach danych, w tym nr/nt, Refseq_genomes, EST i TSA.
    UWAGA: Aby przeszukać sekwencje zapytań w bazie danych białek, użyj BLASTp (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastp&BLAST_PROGRAMS=blastp&PAGE
    _TYPE=BlastSearch&SHOW_DEFAULTS=włączony&BLAST
    _SPEC=&LINK_LOC=blasttab&LAST_PAGE=tblastn).
    1. Wybierz organizm docelowy (identyfikator podatkowy) i zmień parametry algorytmu Próg oczekiwania na 1000, aby uwzględnić dopasowania o niskim wyniku.
    2. Uruchom program BLAST, a następnie sprawdź wyniki pod kątem wysokich wyników homologii między sekwencjami zapytań i tematów, które dają znaczące wyrównania. Zapisz plik FASTA zawierający sekwencję nukleotydów.
      UWAGA: Jeśli istnieje kilka sekwencji tematycznych o podobnych wynikach homologii, przeprowadź wyrównanie MAFFT, aby zawęzić przypuszczalne sekwencje20,21.
  2. Przetłumacz sekwencję nukleotydów preprohormonowych na sekwencje peptydów preprohormonowych za pomocą narzędzia Expasy Translate (https://web.expasy.org/translate/). W przypadku C. sapidus wybierz Mitochondria bezkręgowców jako kod genetyczny.
  3. Sprawdź sekwencję peptydów sygnałowych i miejsca rozszczepienia prohormonów w sekwencjach peptydowych za pomocą SignalP (https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP).
    UWAGA: Homologia do znanych schematów przetwarzania preprohormonów może być również wykorzystana do identyfikacji miejsc rozszczepienia prohormonów. W razie potrzeby można przewidzieć możliwe modyfikacje potranslacyjne peptydów sygnałowych. Sulfinator (https://web.expasy.org/sulfinator/) może być używany do przewidywania stanu zasiarczenia reszt tyrozyny. DiANNA (http://clavius.bc.edu/~clotelab/DiANNA/) może być wykorzystana do przewidywania połączeń wiązań dwusiarczkowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Przebieg przygotowania próbek i analizy MS przedstawiono na Rysunku 1. Po wycięciu tkanki neuronalnej przeprowadzane są homogenizacja, ekstrakcja i odsalanie w celu oczyszczenia próbek neuropeptydów. Jeśli wymagana jest kwantyfikacja oparta na znakowaniu izotopowym, próbki są następnie znakowane i ponownie odsalane. Otrzymaną próbkę analizuje się za pomocą LC-MS/MS w celu identyfikacji i kwantyfikacji neuropeptydów.

Neuropeptydy zidentyfikowane za pomocą oprogramo...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Dokładna identyfikacja, kwantyfikacja i lokalizacja neuropeptydów i endogennych peptydów znajdujących się w układzie nerwowym ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia ich funkcji23,24. Spektrometria mas to potężna technika, która może pozwolić na osiągnięcie tego wszystkiego, nawet w organizmach bez w pełni zsekwencjonowanego genomu. Wykazano zdolność tego protokołu do wykrywania, ilościowego i lokalizowania neuropeptydów z tkanki pobranej z C. sapidus popr...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

To badanie było wspierane przez National Science Foundation (CHE-1710140 i CHE-2108223) oraz National Institutes of Health (NIH) poprzez granty R01DK071801. A.P. było częściowo wspierane przez NIH Chemistry-Biology Interface Training Grant (T32 GM008505). N.V.Q. było częściowo wspierane przez National Institutes of Health, w ramach nagrody Ruth L. Kirschstein National Research Service Award od National Heart Lung and Blood Institute dla University of Wisconsin-Madison Centrum Badań Sercowo-Naczyniowych (T32 HL007936). L.L. pragnie podziękować NIH przyznaje R56 MH110215, S10RR029531 i S10OD025084, a także wsparcie finansowe z profesury Vilas Distinguished Achievement Professorship i Charlesa Melbourne Johnsona z finansowaniem zapewnionym przez Wisconsin Alumni Research Foundation i University of Wisconsin-Madison School of Pharmacy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Chemikalia, odczynniki i materiały eksploatacyjne
matryca kwasu 2,5-dihydroksybenzoesowego (DHB)Supelco39319
Kwas octowyFisher ChemicalA38S-500
Acetonitryl Optima LC/MS klasyFisher ChemicalA955-500
Wodorowęglan amonuSigma-Aldrich9830
Boran pirydynaSigma-Aldrich179752
Bruker peptyd mieszanka kalibracyjnaBruker DaltonicsNC9846988
KapilarnaPolymicro 1068150019do wykonania kolumny nanoprzepływowej (75 &mikro; m średnica wewnętrzna x 360 &mikro; m średnica zewnętrzna)
Kubek kriostatuSigma-AldrichE6032każdy kubek lub forma powinna działać
  Probówki do mikrowirówekEppendorf30108434
FormaldehydSigma-Aldrich252549
Formaldehyd - D2Sigma-Aldrich492620
Kwas mrówkowy Optima LC/MS gradeFisher ChemicalA117-50
ŻelatynaDifco214340miejsce w 37 ° C kąpiel wodna do stopienia
Hydrofobowy długopisbarierowy Vector Labs15553953
Szkiełka szklane powlekane tlenkiem indu i cyny (ITO)Delta TechnologiesCB-90IN-S10725 mm x 75 mm x 0,8 mm (szerokość x długość x grubość)
Fiolki LC-MSThermoTFMSCERT5000-30LVW
Metanol Optima LC/MS GradeFisher ChemicalA456-500
ParafilmSigma-AldrichP7793Folia hydrofobowa
Paski wskaźnikowe pHSupelco109450
Klastry czerwonego fosforuSigma-Aldrich343242
Materiał C18 z odwróconą faząWody186002350ręcznie pakowane w kolumnę nanoflow
Długopis WiteoutBIC150810
ZipTipMilliporeZ720070
Przyrządy i narzędzia
Automatyczny system opryskiwania matrycowego- Wirówka M5HTX Technologies, LLC
- 5424 REppendorf05-401-205
Kriostat- HM 550Thermo Fisher Scientific956564A
Środek osuszający2088701
KleszczeWPI501764
Tarcza celownicza ze stali nierdzewnej MALDIBruker Daltonics8280781
Pipet-Lite XLSRainin17014391200 µ L
Q Exactive Plus Hybrid Quadrupole-OrbitrapThermo Fisher ScientificIQLAAEGAAPFALGMBDK
RapifleX MALDI-TOF/TOFBruker Daltonics
SpeedVac - SVC100SavantSVC-100D
Myjka ultradźwiękowaBransonic2510R-MTHdo sonikacji
Homogenizator ultradźwiękowyFisher ScientificFB120110FB120 Dysmembrator soniczny z sondą CL-18
Pompa próżniowa - Alcatel 2008Idealne produkty próżnioweP10976ciśnienie końcowe = 1 x 10-4 Mikser Torr
VortexCorning6775
Łaźnia wodna (37C) - Isotemp 110Fisher Scientific15-460-10
Oprogramowanie do analizy danych
Expasyhttps://web.expasy.org/translate/
FlexAnalysisBruker Daltonics
FlexControlBruker Daltonics
FlexImagingBruker Daltonics
PEAKS StudioBioinformatics Solutions, Inc.
SCiLS Labhttps://scils.de/
SignalP 5.0https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-5.0
tBLASTnhttp://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=tblastn&BLAST_
PROGRAMY=tblastn& PAGE_
TYPE=BlastSearch& SHOW_
DEFAULTS=włączone i LINK_LOC
=blasthome

Bibliografia

  1. Hökfelt, T., et al. Neuropeptides - an overview. Neuropharmacology. 39 (8), 1337-1356 (2000).
  2. Radhakrishnan, V., Henry, J. L. Electrophysiology of neuropeptides in the sensory spinal cord. Progress in Brain Research. 104, 175-195 (1995).
  3. Nässel, D. R., Ekström, P. Detection of neuropeptides by immunocytochemistry. Methods in Molecular Biology. 72, clifton, N.J. 71-101 (1997).
  4. Martins, J., et al. Activation of Neuropeptide Y Receptors Modulates Retinal Ganglion Cell Physiology and Exerts Neuroprotective Actions In Vitro. ASN Neuro. 7 (4), 1759091415598292(2015).
  5. Racaityte, K., Lutz, E. S. M., Unger, K. K., Lubda, D., Boos, K. S. Analysis of neuropeptide Y and its metabolites by high-performance liquid chromatography-electrospray ionization mass spectrometry and integrated sample clean-up with a novel restricted-access sulphonic acid cation exchanger. Journal of Chromatography. A. 890 (1), 135-144 (2000).
  6. Salisbury, J. P., et al. A rapid MALDI-TOF mass spectrometry workflow for Drosophila melanogaster differential neuropeptidomics. Molecular Brain. 6, 60(2013).
  7. Schmerberg, C. M., Li, L. Function-driven discovery of neuropeptides with mass spectrometry-based tools. Protein and Peptide Letters. 20 (6), 681-694 (2013).
  8. Lee, J. E. Neuropeptidomics: Mass Spectrometry-Based Identification and Quantitation of Neuropeptides. Genomics & Informatics. 14 (1), 12-19 (2016).
  9. Sauer, C. S., Phetsanthad, A., Riusech, O. L., Li, L. Developing mass spectrometry for the quantitative analysis of neuropeptides. Expert Review of Proteomics. 18 (7), 607-621 (2021).
  10. Pratavieira, M., et al. MALDI Imaging Analysis of Neuropeptides in Africanized Honeybee ( Apis mellifera) Brain: Effect of Aggressiveness. Journal of Proteome Research. 17 (7), 2358-2369 (2018).
  11. Buchberger, A. R., Vu, N. Q., Johnson, J., DeLaney, K., Li, L. A Simple and Effective Sample Preparation Strategy for MALDI-MS Imaging of Neuropeptide Changes in the Crustacean Brain Due to Hypoxia and Hypercapnia Stress. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 31 (5), 1058-1065 (2020).
  12. Vu, N. Q., DeLaney, K., Li, L. Neuropeptidomics: Improvements in Mass Spectrometry Imaging Analysis and Recent Advancements. Current Protein & Peptide Science. 22 (2), 158-169 (2021).
  13. Li, L., Sweedler, J. V. Peptides in the brain: mass spectrometry-based measurement approaches and challenges. Annual Review of Analytical Chemistry (Palo Alto, Calif). 1, 451-483 (2008).
  14. Li, N., et al. Sequential Precipitation and Delipidation Enables Efficient Enrichment of Low-Molecular Weight Proteins and Peptides from Human Plasma. Journal of Proteome Research. 19 (8), 3340-3351 (2020).
  15. Zhang, J., et al. PEAKS DB: de novo sequencing assisted database search for sensitive and accurate peptide identification. Molecular & Cellular Proteomics : MCP. 11 (4), (2012).
  16. Sturm, R. M., Greer, T., Woodards, N., Gemperline, E., Li, L. Mass spectrometric evaluation of neuropeptidomic profiles upon heat stabilization treatment of neuroendocrine tissues in crustaceans. Journal of Proteome Research. 12 (2), 743-752 (2013).
  17. Gutierrez, G. J., Grashow, R. G. Cancer borealis stomatogastric nervous system dissection. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (25), e1207(2009).
  18. Sample Preparation for Mass Spectrometry. Merck. , Available from: http://www.millipore.com/catalogue/module/c5737 (2021).
  19. DeLaney, K., et al. PRESnovo: Prescreening Prior to de novo Sequencing to Improve Accuracy and Sensitivity of Neuropeptide Identification. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 31 (7), 1358-1371 (2020).
  20. Oleisky, E. R., Stanhope, M. E., Hull, J. J., Christie, A. E., Dickinson, P. S. Differential neuropeptide modulation of premotor and motor neurons in the lobster cardiac ganglion. Journal of Neurophysiology. 124 (4), 1241-1256 (2020).
  21. Ma, M., et al. Combining in silico transcriptome mining and biological mass spectrometry for neuropeptide discovery in the Pacific white shrimp Litopenaeus vannamei. Peptides. 31 (1), 27-43 (2010).
  22. Christie, A. E., Stemmler, E. A., Dickinson, P. S. Crustacean neuropeptides. Cellular and Molecular Life Sciences : CMLS. 67 (24), 4135-4169 (2010).
  23. DeLaney, K., et al. New techniques, applications and perspectives in neuropeptide research. The Journal of Experimental Biology. 221, Pt 3 (2018).
  24. Habenstein, J., et al. Transcriptomic, peptidomic, and mass spectrometry imaging analysis of the brain in the ant Cataglyphis nodus. Journal of Neurochemistry. 158 (2), 391-412 (2021).
  25. Maes, K., et al. Improved sensitivity of the nano ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometric analysis of low-concentrated neuropeptides by reducing aspecific adsorption and optimizing the injection solvent. Journal of Chromatography. A. 1360, 217-228 (2014).
  26. Li, G., et al. Nanosecond photochemically promoted click chemistry for enhanced neuropeptide visualization and rapid protein labeling. Nature Communications. 10 (1), 4697(2019).
  27. Corbière, A., et al. Strategies for the Identification of Bioactive Neuropeptides in Vertebrates. Frontiers in Neuroscience. 13, 948(2019).
  28. Chen, R., Ma, M., Hui, L., Zhang, J., Li, L. Measurement of neuropeptides in crustacean hemolymph via MALDI mass spectrometry. Journal of American Society for Mass Spectrometry. 20 (4), 708-718 (2009).
  29. Fridjonsdottir, E., Nilsson, A., Wadensten, H., Andrén, P. E. Brain Tissue Sample Stabilization and Extraction Strategies for Neuropeptidomics. Peptidomics: Methods and Strategies. , Springer Protocols. New York,NY. 41-49 (2018).
  30. Buchberger, A. R., DeLaney, K., Johnson, J., Li, L. Mass Spectrometry Imaging: A Review of Emerging Advancements and Future Insights. Analytical Chemistry. 90 (1), 240-265 (2018).
  31. Phetsanthad, A., et al. Recent advances in mass spectrometry analysis of neuropeptides. Mass Spectrometry Reviews. , 21734(2021).
  32. Pérez-Cova, M., Bedia, C., Stoll, D. R., Tauler, R., Jaumot, J. MSroi: A pre-processing tool for mass spectrometry-based studies. Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems. 215, 104333(2021).
  33. Christie, A. E., Chi, M. Prediction of the neuropeptidomes of members of the Astacidea (Crustacea, Decapoda) using publicly accessible transcriptome shotgun assembly (TSA) sequence data. General and Comparative Endocrinology. 224, 38-60 (2015).
  34. Livnat, I., et al. A d-Amino Acid-Containing Neuropeptide Discovery Funnel. Analytical Chemistry. 88 (23), 11868-11876 (2016).
  35. Lehrer, R. I., Ganz, T. Defensins: endogenous antibiotic peptides from human leukocytes. Ciba Foundation Symposium. 171, 276-290 (1992).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Charakterystyka neuropeptydówspektrometria maspeptydy endogenneMALDI MSchromatografia cieczowa sprzężona ze spektrometrią masoznaczanie ilości peptydówekstrakcja z tkanekodkrywanie biomarkerówsekwencjonowanie de novo
Wieloaspektowe badania neuropeptydów metodą spektrometrii mas u Callinectes sapidus
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.