Wykorzystanie mikroskopii 2-fotonowej do ilościowego określenia wpływu przewlekłej jednostronnej niedrożności moczowodu na procesy kłębuszkowe

Summary

Tutaj prezentujemy protokół z wykorzystaniem mikroskopii 2-fotonowej u szczurów z Monachium Wistar Fromter z powierzchniowymi kłębuszkami nerkowymi w celu ilościowego określenia wpływu przedłużonej niedrożności moczowodu na dynamikę i funkcję kłębuszków nerkowych.

Abstract

Zastosowanie nowatorskich metod mikroskopowych do odpowiednich modeli chorób zwierzęcych w celu zbadania dynamicznej fizjologii nerek pozostaje wyzwaniem. Szczury z kłębuszkami powierzchniowymi dają wyjątkową okazję do zbadania procesów fizjologicznych i patofizjologicznych za pomocą przyżyciowej mikroskopii 2-fotonowej. Kwantyfikacja przepływu krwi w kapilarkach kłębuszkowych oraz zwężenie i rozszerzenie naczyń krwionośnych w odpowiedzi na leki, przepuszczalność i stan zapalny to tylko niektóre z procesów, które można badać. Ponadto transgeniczne szczury, tj. podocyty znakowane barwnikami fluorescencyjnymi i innymi metodami biomarkerów molekularnych, zapewniają zwiększoną rozdzielczość do bezpośredniego monitorowania i ilościowego określania interakcji białko-białko oraz skutków określonych zmian molekularnych.

U myszy, które nie mają kłębuszków powierzchniowych po czterech tygodniach, jednostronna niedrożność moczowodu (UUO) przez kilka tygodni była stosowana do wywoływania kłębuszków nerkowych. Ponieważ ten model indukcji nie pozwala na badania wyjściowe, określiliśmy ilościowo wpływ UUO na procesy kłębuszkowe w modelu UUO u szczurów Monachium Wistar Frömter (MWF), które mają kłębuszki powierzchniowe w warunkach fizjologicznych. Model UUO przez pięć tygodni lub dłużej powodował znaczące zmiany w morfologii nerek, mikrokrążeniu okołokanalikowym i kłębuszkowym, a także w strukturze i funkcji nabłonka kanalików. Przepływ kłębuszkowych i okołokanalikowych krwinek czerwonych (RBC) uległ znacznemu zmniejszeniu (p < 0,01), prawdopodobnie z powodu znacznego wzrostu przylegania białych krwinek (WBC) w naczyniach włosowatych kłębuszków nerkowych i okołokanalikowych. Współczynnik przesiewania kłębuszkowego albuminy wzrósł z 0,015 ± 0,002 u nietraktowanych MWF do 0,045 ± 0,05 u 5-tygodniowych szczurów UUO MWF. Dwanaście tygodni UUO spowodowało dalszy wzrost powierzchniowej gęstości kłębuszków nerkowych i współczynnika przesiewania kłębuszków nerkowych (GSC) dla albuminy. Albumina fluorescencyjna przefiltrowana przez kłębuszki nerkowe nie została ponownie wchłonięta przez kanaliki proksymalne. Dane te sugerują, że stosowanie UUO do indukcji kłębuszków nerkowych ogranicza zdolność do badania i interpretowania normalnych procesów kłębuszkowych i zmian chorobowych.

Introduction

Zrozumienie procesów zachodzących w kłębuszkach nerkowych, zwłaszcza biologii podocytów, było celem od ponad 50 lat. Monachijskie szczury Wistar z kłębuszkami powierzchniowymi odegrały kluczową rolę w tych badaniach, w tym w badaniach mikronakłuć, aby zrozumieć wiele aspektów procesów fizjologicznych i patologicznych^1,2,3. Wykorzystanie mikroskopii do śródetapowego badania składników kłębuszków nerkowych było ograniczone ze względu na efekty fototoksyczności do czasu pojawienia się mikroskopii 2-fotonowej, która zminimalizowała tę toksyczną ekspozycję i zwiększyła głębokość penetracji^1,2. Wraz z szybkim postępem w sprzęcie komputerowym i oprogramowaniu, pozwoliło to na trójwymiarowe (3D) i czterowymiarowe (czasowe) badania przez wiele godzin w jednym ustawieniu^1,4,5.

Kwantyfikacja przepływu krwi w naczyniach włosowatych kłębuszków nerkowych, zwężenie i rozszerzenie naczyń krwionośnych w odpowiedzi na leki, przepuszczalność i wpływ ładunku na przepuszczalność i stan zapalny to tylko niektóre z procesów kłębuszkowych, które zostały zbadane. Ponadto można zidentyfikować segment S1 kanalika proksymalnego, a różnice w zachowaniu nabłonka rurkowego S1 i S2 można określić ilościowo^1,4. Badania na myszach, zwłaszcza przy powszechnej dostępności urządzeń transgenicznych u myszy, doprowadziły do szybkiego postępu w zrozumieniu biologii molekularnej procesów chorobowych kłębuszków nerkowych. Poszczególne białka są odpowiedzialne za dysfunkcję kłębuszków nerkowych w badaniach nokautujących, zwłaszcza w odniesieniu do białkomoczu^6,7,8. Jednak wykorzystanie modeli mysich do badań obrazowania kłębuszków nerkowych było ograniczone, ponieważ kłębuszki nerkowe znajdują się ponad 100 μm poniżej powierzchni w licznych badanych szczepach⁹.

To skłoniło badaczy do opracowania i wykorzystania modeli mysich, co zaowocowało powierzchniowymi kłębuszkami nerkowymi, które mogą być badane. Najczęściej spotykanym modelem jest użycie kompletnego UUO^10,11,12. Pod koniec przedłużonego okresu UUO w nerkach myszy występują liczne kłębuszki nerkowe, które mogą być i były badane^13,14. W tych badaniach na myszach nie przeprowadzono badań wyjściowych ani kontrolnych w celu określenia wpływu przedłużonego UUO na biologię kłębuszków nerkowych. Ponieważ jest to poważny i długotrwały model urazu powodujący szybkie zwłóknienie i zniszczenie kory mózgowej^10,11,12, postawiliśmy hipotezę, że będzie to miało wpływ na procesy i funkcje kłębuszków nerkowych. Aby odpowiedzieć na to pytanie, do badania parametrów kontrolnych/wyjściowych wykorzystano szczury Munich Wistar Fromter (MWF) z kłębuszkami powierzchniowymi, a wyniki wyjściowe porównano z badaniami kłębuszkowymi na szczurach MWF po pięciu tygodniach UUO. Badaliśmy również szczury Sprague Dawley (SD), które nie mają kłębuszków powierzchniowych po UUO. Wyniki wskazują, że 5 tygodni UUO u szczurów MWF i SD rzeczywiście zwiększa liczbę kłębuszków nerkowych. Były to jednak nieprawidłowe kłębuszki nerkowe z wyraźnymi zmianami w przepływie krwi w kłębuszkach nerkowych, stanie zapalnym oraz przepuszczalności i wielkości makrocząsteczek.

Protocol

Wszystkie eksperymenty były zgodne z Przewodnikiem dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych i zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt w Indiana University School of Medicine.

1. Przygotowanie monachijczyka Wistar Frömter lub szczura SD do operacji UUO

1. Znieczulij szczura za pomocą izofluoranu (5% indukcji, 1,5-2,5% konserwacji), a następnie ogol, umyj i zdezynfekuj obszar chirurgiczny kilka razy okrężnymi ruchami za pomocą peelingu na bazie jodu lub chlorheksydyny i alkoholu. Stosować leki przeciwbólowe o przedłużonym działaniu/o spowolnionym uwalnianiu w celu leczenia bólu zgodnie z wytycznymi IACUC.
2. Wykonaj nacięcie wzdłuż linii środkowej za pomocą skalpela; zlokalizuj lewą nerkę i uwolnij ją od otaczających narządów otrzewnej.
3. Ostrożnie zlokalizuj szypułkę nerkową, która składa się z tętnicy nerkowej, żyły nerkowej i moczowodu. Oddziel moczowód od innych struktur, zachowując środki ostrożności, aby nie uszkodzić delikatnej struktury.
4. Za pomocą cienkich kleszczy ostrożnie owiń szew 3-0 wokół moczowodu i zwiąż go, uważając, aby go nie rozerwać . Powtórz tę procedurę kilka milimetrów po obu stronach pierwszego węzła, aby zawiązać drugi węzeł i zapewnić całkowitą niedrożność.
5. Po zakończeniu zabiegu należy ostrożnie zamknąć kolejne warstwy mięśniowe. Przed zamknięciem ostatniej warstwy dodaj 2 ml ciepłej, sterylnej 0,9% soli fizjologicznej do jamy brzusznej przed całkowitym zamknięciem. Zamknij zewnętrzną skórę zszywkami chirurgicznymi.
6. Stosuj leki przeciwbólowe o przedłużonym działaniu/o spowolnionym uwalnianiu w celu leczenia bólu i uważnie obserwuj powrót do zdrowia zgodnie z wytycznymi IACUC. Następnie należy okresowo monitorować i przygotować się do obrazowania pod koniec piątego tygodnia.

2. Synteza albuminy surowicy szczura Texas Red (TR-RSA)

1. Odważyć 100 mg albuminy surowicy szczura i rozpuścić ją w 6,67 ml 0,1 M buforu wodorowęglanu sodu o pH 8,4 w stożkowej probówce o pojemności 50 ml.
2. Do fiolki z 5 mg estru Texas Red-X-sukcynimidylu dodać 100 μl dimetyloformamidu (DMF, wysokiej jakości) i mieszać, aż cały barwnik się rozpuści.
3. Umieść roztwór albuminy surowicy szczura na wirze w niskim/średnim ustawieniu, tak aby objętość roztworu wirowała znacznie poniżej górnej części otwartej probówki.
4. Dodaj rozpuszczony barwnik, gdy probówka jest wirowana.
5. Weź stożkową probówkę o pojemności 50 ml, zawiń ją w folię, umieść probówkę na dowolnym wahaczu lub wałku i powoli mieszaj przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej (RT).
6. W wiadrze o pojemności 5 l zawierającym 0,9% NaCl z mieszadłem i delikatnie mieszając, zwilż membrany odpowiedniego dializatora odcinającego o masie cząsteczkowej 50 kDa (odpowiednia jest membrana z klipsami, zamknięte rurki membranowe lub kasety do dializy).
7. Załaduj roztwór TR-RSA do systemu membranowego i przymocuj go do nasadek flotacyjnych zwykle dołączonych do systemu. Umieścić 5-litrowy pojemnik z 0,9% roztworem soli fizjologicznej/TR-RSA na noc w temperaturze 4 °C (w chłodnym pomieszczeniu), delikatnie mieszając, na płytce mieszającej. Roztwór do dializy należy zmienić co najmniej trzy razy w ciągu następnych 36 godzin.
8. Pęcznienie membrany zwiększy objętość teraz przezroczystego roztworu TR-RSA. Podzielić pierwotne 100 mg przez objętość, aby uzyskać przybliżone stężenie: stosunek barwnika do białka wyniesie 1:1. Podwielokrotność do odpowiednich objętości i liofilizować do długotrwałego przechowywania.

3. Przygotowanie do 2-fotonowego obrazowania intravital na odwróconym mikroskopie

1. Zdejmij pokrywę dolnego naczynia z szkiełka nakrywkowego o średnicy 50 mm (o średnicy szkiełka nakrywkowego 40 mm) i umieść 8 kawałków taśmy autoklawu na wewnętrznym dnie wzdłuż krawędzi. Wykonaj puste okno w kształcie piramidy, używając 4 kawałków z każdej strony, aby zewnętrzna nerka dobrze pasowała do tej przestrzeni, jednocześnie utrzymując kontakt obwodowy z taśmą autoklawową, pomagając w ten sposób zminimalizować ruch. Dostosuj odstępy do wielkości szczura, aby zapewnić najlepszy kontakt z nerką.
2. Umieść 1 podkładkę termiczną z każdej strony dolnego naczynia szkiełka nakrywkowego o średnicy 50 mm. Upewnij się, że podkładka rozgrzewająca zakrywa scenę.
3. Użyj 40-krotnego obiektywu zanurzonego w wodzie z zoomem 0,75x i zoomem 1,5x, aby generować obrazy odpowiednio 30x i 60x, co pozwala na uzyskanie obrazów o mniejszym i większym powiększeniu. W razie potrzeby dolamy wody do obiektywu za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml z długim kawałkiem rurki PE-200, która może sięgać do górnej części obiektywu pod kątem w dół, aby zapobiec przedostawaniu się kropli wody do rurki.
4. Użyj 2% przepuszczalności lasera, z detektorami niebieskim, zielonym i czerwonym ustawionymi na wstępnie określone poziomy, aby zapewnić spójność obrazów między badaniami. Ustaw długość fali wzbudzenia na 800 nm w referencyjnym laserze (patrz Tabela materiałów), który skutecznie wzbudzi wszystkie fluorofory użyte w tym badaniu.
   1. Użyj zewnętrznych (nieoczernionych) detektorów do zbierania niebieskich emisji za pomocą fotopowielacza (PMT) (420-490 nm, zysk 950).
   2. Użyj detektora Hyd do wychwytywania emisji zielonych (500-550 nm, wzmocnienie 100).
   3. Użyj detektora Hyd, aby wychwycić czerwone emisje (590-660 nm, wzmocnienie 200).
   4. Dostosuj przesunięcie w PMT (emisja niebieska) tak, aby tylko kilka pikseli w pustych obszarach tkanki miało wartość zero.
      UWAGA: Detektory HyD dla emisji zielonej i czerwonej mają automatyczną regulację przesunięcia; Można ustawić tylko wzmocnienie.
   5. Ustaw głębię bitową na 12 bitów, aby nadać obrazom skalę intensywności 4 096 między czernią a bielą.
      UWAGA: Konieczne jest ustawienie dolnych limitów detektorów (przesunięcie w PMT), aby nie wykluczać tych wartości, aby zapewnić zbieranie emisji o niskiej intensywności w przestrzeni Bowmana. Jeśli ustawienie czułości jest zbyt niskie, wskazują to wizualne znaczniki ostrzegawcze; Wartości te mają wartość intensywności równą zero.
5. Rozcieńczyć około 6 mg albuminy surowicy Texas-Red-X-Rat do całkowitej objętości 1 ml, załadować roztwór do strzykawki o pojemności 1 ml i umieścić na cewniku dożylnym na stałe w kroku 4.1 po infuzji Hoechst 33342 w kroku 9.1.

4. Przygotowanie chirurgiczne do przyżyciowego obrazowania 2-fotonowego

1. Umieść wstępnie znieczulonego szczura z linią dostępu żylnego (udową lub szyjną) na boku, z ogolonym lewym bokiem skierowanym do góry płasko i prosto na stole. Upewnij się, że przednie łapy stykają się ze sobą, tak jak tylne łapy.
2. Delikatnie dotykaj lewego boku tuż pod żebrami, aby wyczuć, czy nerka określa naturalną pozycję w jamie brzusznej. W razie potrzeby narysuj linię za pomocą trwałego markera wzdłuż ogolonego obszaru, przecinając środek nerki na pół w orientacji od nosa do ogona.
3. Za pomocą kleszczy zębatych chwyć skórę i unieś ją do góry, aby ułatwić uszczypnięcie trwałej linii markera za pomocą pary hemostatów, aby zmiażdżyć leżące poniżej naczynia krwionośne i zapobiec krwawieniu podczas wykonywania nacięcia nożyczkami chirurgicznymi. Powtórz to dla cienkiej zewnętrznej warstwy mięśni, aby zminimalizować krwawienie.
4. Aby wykonać ostatnie nacięcie cienkiej wewnętrznej warstwy mięśni brzucha, ponownie obmacuj nerkę, aby oszacować rozmiar i położenie. Ostrożnie podnieś wewnętrzną warstwę mięśni za pomocą kleszczy i zmiażdż linię, która przecina skórę nad nerką hemostatykami, co stanowi około 1/3 szacowanej wielkości nerki.
5. Utrzymując chwyt na warstwie mięśniowej za pomocą kleszczy, wykonaj ostatnie nacięcie.
   UWAGA: Lepiej jest wykonać mniejsze nacięcie i rozszerzyć je w razie potrzeby, niż zrobić je zbyt dużym, co będzie wymagało częściowego zamknięcia szwem.
6. Delikatnie chwyć nerkę za otaczający tłuszcz. Używając obu rąk z kleszczami w każdej ręce, pracuj, aby chwycić tłuszcz w dolnym biegunie nerki, używając techniki ręka nad ręką, aby chwycić i przytrzymać tłuszcz nerkowy, pracując w dół.
7. Trzymając jedną ręką mocno tłuszcz w dolnym biegunie nerki, delikatnie pociągnij tłuszcz i, jeśli to konieczne, bardzo delikatnie przeciśnij nerkę przez nacięcie. Jeśli nerka nie przechodzi łatwo, poszerz nacięcie.

5. Pozycjonowanie szczura do obrazowania

1. Ostrożnie przyłóż odsłoniętą nerkę do krawędzi naczynia, lekko obracając tak, aby brzuszna strona nerki stykała się ze szkiełkiem nakrywkowym, a strona grzbietowa była odwrócona od krawędzi.
2. Aby jeszcze bardziej zminimalizować ruch, weź dwie sterylne gaziki 2 x 2, zwilż je solą fizjologiczną i przyłóż do grzbietowej strony nerki, wzmacniając kontakt brzusznej strony nerki z krawędzią.
3. Spójrz przez okular mikroskopu w oświetleniu epifluorescencyjnym za pomocą dwuprzebiegowej kostki Rhodamine/FITC. Jeśli zostanie wykryty ruch, dokonaj drobnych korekt pozycji i ostrożnie wyreguluj gazę, upewniając się, że nie wciska się pod nerkę. Aby jeszcze bardziej ograniczyć ruch, przewróć szczura lekko, tak aby klatka piersiowa znajdowała się dalej od naczynia.

6. Akwizycja obrazu do analizy ilościowej

1. Zeskanuj powierzchnię nerki za pomocą oświetlenia epifluorescencyjnego (krok 5.3) i zaznacz pozycję (pozycje) kłębuszków nerkowych za pomocą oprogramowania powiązanego z zmotoryzowanym sterownikiem stopnia (funkcja nowoczesnych systemów).
2. Dla każdego kanału koloru w oświetleniu 2-fotonowym należy wykonać płytką objętość 3D górnej części każdego zaznaczonego kłębuszka nerkowego, która posłuży jako obrazy tła. Użyj palety pseudokolorów w opcji wyświetlania oprogramowania do obrazowania, aby lepiej zobrazować słabe intensywności fluorescencji tła pętli naczyń włosowatych kłębuszków nerkowych.
3. Używając powierzchownego naczynia krwionośnego jako punktu centralnego, powoli wlewaj albuminę fluorescencyjną, dając czas na obserwację wzrostu i spadku fluorescencji spowodowanej dystrybucją ogólnoustrojową. Wlej wystarczającą ilość TR-RSA, aby osiągnąć intensywność w naczyniach okołonakanoidalnych i pętlach naczyń włosowatych, która jest tuż poniżej nasycenia.
   UWAGA: Zazwyczaj występuje 5-sekundowe opóźnienie między infuzją materiału a jego pojawieniem się w krwiobiegu, gdy perfuzja nerek jest normalna.
4. Odczekaj około 10 minut przed uzyskaniem objętości 3D (w odstępach 1 μm) dla wszystkich oznaczonych i zobrazowanych kłębuszków nerkowych z kroku 6.2.
   UWAGA: Szczury Simonsena Munich Wistar mają mniej kłębuszków nerkowych na powierzchni. Ponieważ jednak szczep Frömter szczurów MW ma większą liczbę kłębuszków nerkowych na powierzchni, często można zobrazować do 10 kłębuszków nerkowych.
5. Poddaj szczura eutanazji poprzez przedawkowanie izofluranu pod koniec badania. Wykonaj podwójną odmę opłucnową, aby zapewnić eutanazję.

7. Obliczanie przepuszczalności kłębuszków nerkowych

1. Korzystając z oprogramowania do przeglądania obrazów powiązanego z systemem mikroskopowym, wyeksportuj obrazy do 12-bitowych obrazów RAW w celu przetworzenia i analizy.
2. Załaduj woluminy 3D tła i surowy wolumin 3D zawierający krążącą albuminę fluorescencyjną. Zlokalizuj płaszczyznę ogniskową w objętości 3D z najjaśniejszą powierzchowną pętlą kapilarną w kłębuszkach nerkowych z wystarczającą ilością miejsca do krawędzi otaczającej kapsuły Bowmana.
3. Korzystając z wizualnych punktów orientacyjnych, zlokalizuj tę samą płaszczyznę ogniskowej, która znajduje się w objętości tła. Wybierz obszar w pętli kapilarnej i jeden w przestrzeni Bowmana, zwracając uwagę na średnie wartości intensywności każdego z nich. Użyj tych wartości intensywności jako wartości tła.
4. Nakreśl obszar (co najmniej 20 x 20 pikseli w obszarze) w przestrzeni Bowmana na obrazie zawierającym albuminę i zanotuj odczyt intensywności (wybierz obszar, który nie przylega do pętli kapilarnej lub kapsuły Bowmana, aby zapewnić najczystszy pomiar intensywności przestrzeni Bowmana). Przesuń narysowany region nad dwoma innymi obszarami, aby przyjąć średnią wartość średniej intensywności w przestrzeni Bowmana.
5. Wybierz najjaśniejszą intensywność fluorescencji plazmy w sekcji pętli kapilarnej i zakreśl ten obszar. Korzystając z funkcji progowej, podświetl jasne wartości (zwykle znajdujące się na krawędziach ścianek pętli kapilarnej), unikaj krążących cieni RBC i zapisz wartość.
   UWAGA: Ponieważ czynniki we krwi powodują niedoszacowanie poziomu fluorescencji w osoczu, ważne jest, aby wybrać najjaśniejsze obszary.
6. Wprowadź wartości w arkuszu kalkulacyjnym, aby obliczyć GSC za pomocą równania (1):
   GSC = (1)

8. Obliczanie przepływu czerwonych krwinek w powierzchniowych pętlach naczyń włosowatych kłębuszków nerkowych i unaczynieniu nerek za pomocą funkcji linecan

1. Znajdź odpowiednie naczynie (pętlę kapilarną lub naczynie okołorurkowe). Ponieważ funkcja skanowania linii w oprogramowaniu do akwizycji obrazu odniesienia (patrz tabela materiałów) wymaga, aby naczynie było prostopadłe, obróć obraz za pomocą funkcji obracania.
2. Gdy naczynie zostanie obrócone i leży płasko, wybierz funkcję XT w menu akwizycji. Skonfiguruj skanowanie 4 000 wierszy. Umieścić linę w poprzek statku, który ma być badany; Upewnij się, że płaszczyzna ogniskowej znajduje się na maksymalnej średnicy segmentu, który ma być obrazowany.
3. Kliknij lewym przyciskiem myszy kolorowy obraz kompozytowy i wybierz opcję Zrób migawkę, aby wygenerować obraz referencyjny obszaru, w którym wykonano skanowanie linii. Natychmiast kliknij przycisk Start, aby przechwycić skan linii statku.
4. Aby określić natężenie przepływu RBC, należy zaimportować szkice liniowe do oprogramowania do przetwarzania obrazu (patrz tabela materiałów). Otwórz okno dialogowe Pokaż statystyki regionu w menu rozwijanym Miara. Wybierz narzędzie do rysowania pojedynczej linii i narysuj linię odpowiadającą nachyleniu cieni RBC. Zwróć uwagę na wartości szerokości i wysokości.
   UWAGA: Wartości pikseli uzyskane dla szerokości będą odpowiadać odległości; Piksele wysokości odpowiadają czasowi.
5. Użyj następującego wzoru (Równanie (2)), aby obliczyć prędkość.
   Natężenie przepływu RBC w μm/s = (2)
   UWAGA: Odpowiada to parametrom akwizycji przy 60-krotnym powiększeniu i częstotliwości skanowania 400 Hz za pomocą mikroskopu referencyjnego (patrz tabela materiałów).
   1. Wykonaj co najmniej pięć obliczeń i uśrednij je, aby podać prędkość dla każdej linii.
      UWAGA: Parametry te będą zależeć od wymiaru pikseli i szybkości akwizycji systemu mikroskopu.

9. Obliczanie okluzji WBC w kłębuszkowych pętlach kapilarnych

1. Podaj barwnik jądrowy Hoechst 33342 (przy ~ 8 μg/kg masy szczura) przez linię dostępu żylnego w celu identyfikacji WBC osadzonych w pętlach kapilarnych.
   UWAGA: Głębokość użytkowa będzie ograniczona ze względu na rozproszenie fotonów i absorpcję przez hemoglobinę, szczególnie w przypadku emisji niebieskich o krótszej długości fali.
2. Wyśrodkuj kłębuszek nerkowy w polu obrazowania i weź zestaw danych 3D, zaczynając od powierzchni kłębuszków nerkowych i kończąc dane co najmniej 30 do 35 μm. Użyj kroku o wielkości 1 μm w kierunku Z.
3. Zidentyfikuj WBC, porównując niebieski kanał Hoechsta z kanałem albuminy Texas Red; poszukaj wykluczenia czerwonego barwnika w pętli kapilarnej i odpowiadającego mu barwienia jądrowego, aby pozytywnie zidentyfikować WBC. Zdefiniuj białe krwinki jako "przylegające", jeśli wydają się statyczne w 3 sekcjach optycznych. Podać wartości jako występowanie/10 przekrojów optycznych od szczytu kłębuszka nerkowego, pobrane w odstępach 1 μm.

10. Ocena obecności formacji Rouleaux w kłębuszkach nerkowych na powierzchni

1. Postępuj zgodnie z tymi samymi wskazówkami dla kroku 9.3 i uzyskaj zestaw danych 3D. Szukaj formacji Rouleaux pojawiających się jako erytrocyty ułożone w pakiety, które są odporne na dysocjację, gdy poruszają się wzdłuż pętli kapilarnych. Użyj czerwonego fluoroforu, aby uzyskać lepszą wizualizację struktury na większych głębokościach ze względu na mniejsze rozproszenie fotonów dla dłuższych emisji czerwonych. Podać wartości jako występowanie/25 odcinków optycznych od górnej części kłębuszków nerkowych, pobrane w odstępach 1 μm.

11. Izolacja kłębuszków nerkowych

1. Wyizoluj trzy grupy kłębuszków nerkowych ze świeżych nerek przy użyciu standardowej techniki przesiewania, która daje blisko 90% czystości kłębuszków nerkowych szczurów¹⁵.
   1. Umieść korę nerkową w zimnym roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i zmiel ją za pomocą wielu cienkich nożyczek lub żyletek.
   2. Dodaj zmieloną tkankę do sterylnego sitka komórkowego o wielkości 100 μm i delikatnie przeciśnij je za pomocą tłoka strzykawki o pojemności 5 ml i 50-100 ml zimnego PBS.
      UWAGA: Większość kanalików jest zatrzymywana, gdy kłębuszki nerkowe przechodzą przez nie.
   3. Umieścić wzbogaconą frakcję kłębuszków nerkowych na filtrze o wielkości 70 μm i dokładnie przemyć zimnym PBS. Umyj filtr 100-200 ml zimnego PBS, aby usunąć większość pozostałych kanalików.
   4. Zebrać kłębuszki nerkowe z filtra za pomocą 1-2 ml zimnego PBS, odwirować (10 000 × g, 2 min, 4 °C) i zamrozić je w ciekłym azocie do momentu izolacji RNA.
      UWAGA: Czystość kłębuszków nerkowych określona za pomocą mikroskopii z kontrastem fazowym wynosi >90%, a wydajność wynosi około 10 mg z 2 nerek.

12. Izolacja RNA kłębuszków nerkowych

1. Homogenizować zamrożone osady kłębuszków nerkowych za pomocą odczynnika izolującego RNA, dodając 400 μl odczynnika i rozbijając osad za pomocą końcówki pipety o pojemności 200 μl, a następnie następuje krótkie wirowanie i 5 minut inkubacji w RT¹⁶.
2. Dodać 40 μl 1-bromo-3-chloropropanu (BCP), wirować przez 15 s i trzymać w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
3. Odwirować w temperaturze 12 000 × g, 15 min, 4 °C. Usunąć warstwę wodną, rozcieńczyć dolną warstwę równą objętością 70% etanolu i załadować ją bezpośrednio na kolumnę wirową (patrz tabela materiałów).
4. Po przemyciach, z których każde polega na dodaniu odpowiedniego roztworu do kolumny, a następnie odwirowaniu w temperaturze 12 000 x g, 15 s, 26 °C [łącznie 3, pierwsze 2 z 500 μL RPE (zastrzeżony łagodny bufor płuczący z etanolem w celu usunięcia śladów soli, trzecie płukanie 500 μL 80% EtOH], eluować RNA przez dodanie 15 μl_H2Oi odwirować, jak w przypadku płukania. Sprawdź stężenie i czystość RNA i przetransportuj próbki RNA do głównego obiektu w celu analizy nanociągów^17,18.
   UWAGA: Całkowita wydajność RNA wynosi około 1-2 μg. W tym przypadku 24 próbki zawierały 200 ng RNA o stężeniu 30 ng/μl.

13. Analiza nanostrun

UWAGA: Technologia nanostring opiera się na cyfrowym wykrywaniu i bezpośrednim molekularnym kodowaniu molekularnym docelowych cząsteczek, które wykorzystują pary sond oznaczone kolorami. Sonda Capture przenosi ugrupowanie biotyny na końcu 3', a sonda Reporter przenosi sygnał na końcu 5'.

1. Wyślij pary sond genowych Nanostring i zestawy kodowe do Genomic Core Facility stanu Michigan i użyj zgodnie z zaleceniami NanoString.
   UWAGA: Istnieje sześć pozycji dla kodów kolorów, a każda pozycja może być jednym z czterech kolorów, co umożliwia dużą różnorodność znaczników, z których każdy może być indywidualnie rozpoznawany i identyfikowany podczas zbierania danych.
2. Uzyskaj dane zebrane przez personel placówki Genomic Core za pomocą opatentowanego analizatora Nanostring nCounter Digital, który zbiera pola widzenia za pomocą obiektywu mikroskopowego i kamery CCD oraz zestawia tabelaryzację i wyświetla liczbę kodów kreskowych.
3. Zaimportuj surowe dane do oprogramowania nSolver firmy Nanostring w celu analizy. Znormalizuj dane znormalizowane przy użyciu ich ustawień domyślnych i porównaj dane między grupami zgodnie z opisem w ich podręczniku.
   UWAGA: Celem było monitorowanie zmian w genach, które wcześniej okazały się być zmienione w tkance korowej z modelu UUO¹⁹, choroba nerek^{17,20,21,22,23,24,25,26}. W sumie przeanalizowano 126 genów, w tym zalecane kontrole pozytywne i negatywne, w każdej grupie kłębuszków nerkowych (CONT, SHAM I UUO).

Results

Trzy grupy kłębuszków zostały wyizolowane przy użyciu standardowej techniki przesiewania, która daje blisko 90% czystość kłębuszków nerkowych szczurów¹⁵. Pierwsza grupa kłębuszków nerkowych pochodziła z lewej nerki szczurów SD, które przeszły zacisk lewego moczowodu nerki przez 5 tygodni, UUO (5 samców, 3 samice). Druga grupa kłębuszków nerkowych została wyizolowana z przeciwległej nerki kontrolnej od tego samego szczura, CONT (5 samców, 3 samice). Trzecią grupę kłębuszków wyizolowano od szczurów SD, które przeszły operację SHAM, a lewą nerkę wykorzystano do izolacji kłębuszków nerkowych po 5 tygodniach, SHAM (4 samce, 4 samice).

Zmiany morfologiczne<br /> Eksternalizacja niedrożnej nerki do obrazowania ujawniła znacznie powiększoną nerkę, około czterokrotnie większą niż normalnie, z cienkim nabłonkiem widocznym przez wypełnione płynem wnętrze nerki. Dzięki obiektywowi 20x, wykorzystującemu oświetlenie epifluorescencyjne i dwuprzebiegową kostkę FITC/Rhodamine, najbardziej widoczną zmianą było ścieńczenie nabłonka rurkowego i równomierne zapadanie się światła rurki na całej długości rurki. Histologia została dobrze opisana i jest ciężka przez tydzień UUO^10,11,12. Liczba kłębuszków nerkowych widocznych na powierzchni u szczurów MWF i SD zwiększyła się po pięciu tygodniach jednostronnej niedrożności moczowodu. Rysunek 1A pokazuje metodę użytą do stworzenia modelu UUO. Prawa nerka jest nietknięta i zapewnia szczurowi odpowiednią szybkość filtracji kłębuszkowej. Liczba kłębuszków nerkowych na pole przy użyciu obiektywu 20x (363 μm x 363 μm) została policzona i pokazana na wykresie w Rysunek 1B. Liczba kłębuszków powierzchniowych u szczurów MWF wzrosła z 1,08 ± 0,11 / pole u szczurów nieleczonych do 2,97 ± 0,65 / pole w pięciotygodniowej grupie UUO. Szczury SD przeszły od braku kłębuszków powierzchniowych do 2,02 ± 0,37 / pole po 5 tygodniach UUO.

Wykonano przyżyciowe obrazy 2-fotonowe tych szczurów po wstrzyknięciu TR-RSA (czerwony), 10 kDa Cascade Blue dextran (10 kDa-CB) i Hoechst 33342 w celu oznaczenia jąder (cyjan). Są one pokazane dla normalnych szczurów MWF (Rysunek 1C), szczurów MWF po pięciu tygodniach UUO (Rysunek 1D) i szczurów SD po pięciu tygodniach UUO (Rysunek 1E). Obrazy te podkreślają dramatyczne zmiany zachodzące w nabłonku kanalikowym. Lizosomy kanalików proksymalnych, które zwykle są małymi, punktowymi, pomarańczowymi nagromadzeniami u nieleczonych szczurów MWF i SD, stają się dużymi, pojedynczymi strukturami wakuolarnymi, które wypełniają większość skurczonej komórki kanalikowatej. Jak zaznaczono w albuminie TR-RSA, układ naczyniowy wydawał się wyprostowany, a w wielu naczyniach pozbawionych płynących erytrocytów, wykazywał tylko strumienie osocza. Unieruchomienie nerek ujawniło, że kora rozrzedziła się, tworząc włóknistą skórę nie grubszą niż milimetr. Obserwacje te zgadzają się z wczesną literaturą używającą tego modelu^3,10,11,12.

Zmiany w dynamice naczyń nerkowych i przepuszczalności kłębuszków nerkowych
Przepływ krwi przez nerki był znacznie zmniejszony zarówno w pięciotygodniowej grupie UUO MWF, jak i SD w porównaniu z nieleczonymi szczurami (Rycina 2). Szczury MWF operowane pozorami miały okołorurkowy przepływ RBC wynoszący 885 ± 25 μm/s. Okołonakaniczny przepływ RBC u pięciotygodniowych szczurów UUO, MWF i SD zmniejszył się odpowiednio do 250 ± 100 μm/s i 200 ± 125 μm/s. Wartości te zostały obliczone poprzez zebranie skanów linii w naczyniach okołorurkowych w celu obliczenia prędkości RBC. Rysunek 2D przedstawia wykres tych danych.

Prędkość RBC w kłębuszkowych pętlach kapilarnych została znacznie zmniejszona u szczurów z pięciotygodniowym UUO, MWF i SD w porównaniu do nieleczonych MWF (Rysunek 3). W wielu przypadkach stwierdzono, że kłębuszki nerkowe mają pętle kapilarne całkowicie pozbawione płynących krwinek czerwonych. Natężenia przepływu krwinek czerwonych w pętli kapilarnej wynosiły odpowiednio 1 405 ± 425 μm / s, 250 ± 220 μm / s ± i 190 ± 200 μm / s lub nieleczone szczury MWF, pięciotygodniowe UUO MWF i pięciotygodniowe szczury UUO SD (Rysunek 3D). W pętlach kapilarnych pięciotygodniowych grup UUO, powolny przepływ erytrocytów ujawnił obecność przylegających WBC, spowalniających przepływ lub blokujących go, przy czym tylko przepływ plazmy był wizualizowany poniżej częściowej lub całkowitej niedrożności. Aby określić ilościowo tę obserwację, policzono liczbę przylegających WBC znalezionych w objętości 3D, a następnie znormalizowano ją do występowania na każde 10 μm głębokości objętości 3D. Strukturę przylegającej białej krwinki można było rozpoznać za pomocą cyjanowej fluorescencji barwnika jądrowego z Hoechst 33342. Niestety, większy rozproszenie fotonów w światłach emitujących światło niebieskie ograniczyło wiarygodną identyfikację WBC na podstawie ich jąder do górnych 10 sekcji optycznych od góry, wykonanych w krokach co 1 μm objętości kłębuszków nerkowych. Nieleczone szczury MWF miały mniej niż 0,125 ± 0,05 WBC / 10 sekcji optycznych od góry, pobranych w krokach co 1 μm objętości, podczas gdy liczba ta wzrosła do 1,5 ± 0,5 i 3,25 ± 0,7 odpowiednio u 5-tygodniowych szczurów UUO MWF i 5-tygodniowych UUO SD (Ryc. 3E).

Inną zmianą naczyniową, która może również odpowiadać za zmniejszony przepływ RBC w 5-tygodniowych grupach UUO, było regularne pojawianie się formacji Rouleaux (pogrupowane RBC, które są przylegające w konfiguracji "ułożonej monety", zobacz wstawkę Rysunek 3F). Formacje Rouleaux płyną wolniej i mogą być zatrzymane przez przylegający WBC. Nieleczone szczury WMF praktycznie nie mają formacji Rouleaux w naczyniach włosowatych kłębuszków nerkowych, mając tylko 0,05 ± 0,05 wystąpienia na 25 odcinków optycznych od góry, pobrane w krokach co 1 μm. Pięciotygodniowe szczury UUO, MWF i SD wykazały wyraźny wzrost formacji Rouleaux 2,27 ± 0,46 i 1,46 ± 0,73 na 25 sekcji optycznych, zaczynając od góry, mierzonych odpowiednio w krokach co 1 μm (Ryc. 3F).

Oprócz zmniejszenia szybkości przepływu krwinek czerwonych w kłębuszkach nerkowych obserwowanego w przypadku UUO, zaobserwowano wzrost przepuszczalności albuminy. Stwierdzono większą niejednorodność przepuszczalności albumin między kłębuszkami nerkowymi. Sporadycznie akumulacja albuminy w przestrzeni Bowmana była na tyle intensywna, że można ją było wyraźnie dostrzec (Ryc. 4B, gwiazdka). Współczynnik przesiewania kłębuszkowego albuminy wzrósł z 0,015 ± 0,002 u nieleczonych MWF do 0,045 ± 0,05 u 5-tygodniowych UUO MWF i 0,052 ± 0,075 u pięciotygodniowych szczurów UUO SD.

Zmieniona funkcja kanalików proksymalnych
Co ciekawe, przefiltrowanej albuminy nie można było wykryć w komórkach kanalików proksymalnych po UUO. Segment S1 normalnie endocytozuje duże ilości albuminy^27,28,29,30, jak pokazano tutaj w warunkach fizjologicznych u nieleczonych szczurów MWF (Rysunek 5A). Tego samego wychwytu nie można było zaobserwować w MWF lub SD PT po 5 tygodniach UUO (Rysunek 5B, C). Kanaliki proksymalne otaczające kłębuszki nerkowe obrazowane między 45 a 60 minutami po infuzji TR-RSA oceniano pod kątem obecności (1) lub braku (0) albuminy. Ważne jest, aby pamiętać, że w warunkach fizjologicznych segment S1 zachłannie wiąże i internalizuje albuminę, a niewielka ilość albuminy dociera do kanalików dystalnych lub przewodów zbiorczych. Dlatego ma się rozumieć, że ostatnie segmenty kanalików proksymalnych mogą nie zawierać albuminy, co skutkuje ułamkowym dodatnim wychwytem albuminy mniejszym niż 1,0. Rysunek 5D pokazuje wykres z wynikami oceny wychwytu albuminy kanalików proksymalnych. Nieleczony MWF miał wartość frakcyjnego wychwytu kanalików proksymalnych wynoszącą 0,556 ± 0,126. Zarówno pięciotygodniowe szczury UUO MWF, jak i SD miały znacznie niższe wartości odpowiednio 0,049 ± 0,126 i 0,00 ±0,00.

Badania zostały również zakończone na 12-tygodniowych szczurach UUO MWF (Tabela 1). Dwanaście tygodni UUO to standardowy czas stosowany w badaniach na myszach w celu wywołania kłębuszków nerkowych. Zobrazowano trzy samce szczurów UUO, a gęstość kłębuszków nerkowych wzrosła dalej do 6,16 ± 1,83 kłębuszków nerkowych na 20-krotne pole u tych szczurów. Natężenie przepływu RBC wynosiło 293 ± 67 μm/s, adhezja WBC wynosiła 1,47 ± 1,12, w obu przypadkach podobnie jak w przypadku 5-tygodniowych danych UUO. GSC albuminy również wzrosło w porównaniu z 5-tygodniowymi szczurami UUO do 0,109 ± 0,04.

Zmiany mRNA kłębuszkowe wywołane przez przewlekłe UUO
Tabela 2 przedstawia wszystkie geny (sondy) wraz z ich pogrupowaną ekspresją i wartościami odchylenia standardowego. Należy zauważyć, że geny zostały wybrane do analizy na podstawie wcześniejszej dokumentacji zmian w chorobie nerek, w tym UUO, jak opisano w notatce 13 sekcji protokołu. Rysunek 6 to mapa cieplna danych podkreślająca dramatyczne zmiany w ekspresji genów dla większości genów w kłębuszkach nerkowych UUO w porównaniu do kłębuszków kontrolnych lub pozorowanych.

Rysunek 1: Wzrost liczby kłębuszków powierzchniowych i indukcja powierzchniowych kłębuszków nerkowych u szczurów SD po 5-tygodniowym UUO u szczurów MWF. (A) Schemat chirurgiczny moczowodu na lewej nerce ostrożnie uwolniony z tętnicy nerkowej i żyły przed zamknięciem dwóch wiązań za pomocą szwu chirurgicznego. (B) Wykres wskazujący na wzrost liczby kłębuszków powierzchniowych obecnych u szczurów MWF przed i pięć tygodni po UUO, wraz z liczbą kłębuszków powierzchniowych u szczurów SD, które normalnie nie mają kłębuszków powierzchniowych. Liczba kłębuszków nerkowych u szczurów MWF wzrosła z 1,08 ± 0,11 / pole u szczurów nieleczonych do 2,97 ± 0,65 / pole w grupie 5-tygodniowej UUO. Szczury SD przeszły od braku kłębuszków powierzchniowych do 2,02 ± 0,37 na pole. Trójwymiarowe zrekonstruowane obrazy pokazują powierzchnię nerki dla nieleczonego MWF (C), MWF po 5-tygodniowym UUO (D) i SD po pięciotygodniowym UUO (E). Zwróć uwagę na pojawienie się dużych, pomarańczowych struktur wakuolarnych, które połączyły się z małych pojedynczych lizosomów w duże nieprawidłowe ciała. 5-tygodniowy UUO u szczurów SD nie spowodował obszarów przypominających normalny nabłonek kanalików obserwowanych w C i częściowo w D. Układ naczyniowy wydawał się wyprostowany w niektórych regionach, a w wielu miał częściowe okluzje, które umożliwiały przepływ osocza, ale nie erytrocytów. (n = 3 samce szczurów w grupie) Podziałka = 40 μm. Słupki błędów wskazują odchylenie standardowe. Skróty: UUO = jednostronna niedrożność moczowodu; SD = Sprague-Dawley; MWF = Monachium Wistar Frömter; G = kłębuszki nerkowe; Erytrocyty = czerwone krwinki. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Zmniejszenie przepływu RBC w obrębie powierzchownego naczynia okołokanaczyniowego po 5 tygodniach UUO. W okołokanalikowatych naczyniach krwionośnych pobrano linecansy w celu określenia prędkości przepływu RBC w μm/s. Krótko mówiąc, czerwone linie odniesienia pokazane w A, B i C reprezentują mały obszar, w którym ten sam obszar o szerokości piksela był wielokrotnie skanowany, a obrazy ułożone w kolumnie, aby uwidocznić zniekształcenia spowodowane przez przepływające erytrocyty, które poruszają się szybciej niż mikroskop może je uzyskać. Kolumna przylegająca do rysunku odniesienia to linia, przy czym nachylenie zniekształcenia RBC służy do obliczania prędkości (oś x = odległość, a oś y = czas). W tym przypadku stopniowo strome zbocza odpowiadają wolniejszym prędkościom RBC, ponieważ pozostają one dłużej w obszarze skanowania linii. Zwróć uwagę na różnicę w wyglądzie erytrocytów u nieleczonych szczurów MWF (A) w porównaniu z pięciotygodniowymi obrazami UUO dla szczurów MWF (B) i SD (C). Prędkości przepływu RBC dla trzech grup szczurów są pokazane w D. Okołorurkowy przepływ RBC w nieleczonych MWF wynosił średnio 885 ± μm/s. Wartości te znacznie spadły pięć tygodni po UUO u szczurów MWF i SD odpowiednio do 250 ± 100 μm/s i 200 ± 125 μm/s. Podziałka = 20 μm, n = 3 samce szczurów w grupie. Słupki błędów wskazują odchylenie standardowe. Skróty: UUO = jednostronna niedrożność moczowodu; SD = Sprague-Dawley; MWF = Monachium Wistar Frömter; RBC = czerwona krwinka; WBC = białe krwinki. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Znaczne zmniejszenie przepływu RBC w pętli kapilar kłębuszkowych i indukowana aktywacja adhezji WBC przez 5 tygodni UUO. To samo podejście liniowe, które zastosowano do określenia okołonakanalikowego przepływu RBC, zastosowano do zbadania zmian w przepływie krwi włośniczkowej w kłębuszkach nerkowych. Panele A, B i C pokazują podobny układ do Rysunek 2 i skupiają się na kłębuszku nerkowym odpowiednio w fikcyjnych MWF, pięciotygodniowych UUO MWF i pięciotygodniowych UUO SD. (D) Wykres ujawniający fizjologicznie wysokie natężenie przepływu RBC w pętlach kapilarnych od szczurów MWF operowanych pozorami, wynoszące średnio 1 405 ± 425 μm/s ± 425, zmniejszone do 250 ± 220 μm/s i 190 ± 200 μm/s odpowiednio dla 5-tygodniowych szczurów UUO MWF i 5-tygodniowych UUO SD. Podczas badania pętli naczyń włosowatych kłębuszków nerkowych przylegające WBC były łatwo widoczne podczas ogniskowania przez kłębuszki nerkowe. Pobrano trójwymiarowe przekroje optyczne poszczególnych kłębuszków nerkowych, a pierwsze 10 odcinków optycznych, oddalonych od siebie o 1 μm, wykorzystano do zmierzenia liczby przylegających WBC. Nieleczone szczury MWF praktycznie nie miały widocznych WBC w swoich objętościach, średnio mniej niż 0,125 ± 0,05 WBC/10 odcinków optycznych od góry, pobranych w krokach co 1 μm. U 5-tygodniowych szczurów UUO MWF i SD liczby te wzrosły do 1,5 ± 0,5 i 3,25 ± 0,7 WBC/10 sekcji optycznych od góry, wykonanych odpowiednio w krokach co 1 μm. Wyniki te są pokazane na wykresie w panelu E, z kolorowymi wstawkami pokazującymi WBC zasłaniające pętle kapilarne. Formacje Rouleaux (strzałki, wstawka w panelu F) pojawiają się jako erytrocyty ściśle związane ze sobą w konfiguracji "ułożonej monety", która w dużej mierze zachowuje swoje zgrupowane zgrupowanie nawet w zawirowaniach przepływu krwi. Te patologiczne struktury były łatwo dostrzegalne na większych głębokościach w kłębuszku nerkowym. Szczury MWF operowane pozorami były w dużej mierze pozbawione tych struktur, mając tylko 0,05 ± 0,05 wystąpienia 25 odcinków optycznych od góry, wykonanych w krokach co 1 μm objętości kłębuszków nerkowych. W przeciwieństwie do tego, 5-tygodniowe UUO zarówno u szczurów MWF, jak i SD miały wyraźny wzrost formacji Rouleaux z występowaniem 2,27± 0,46 i 1,46 ± 0,73/25 sekcji optycznych od góry, pobranych odpowiednio w krokach co 1 μm. Podziałka = 20 μm, n = 3 samce szczurów w grupie. Słupki błędów wskazują odchylenie standardowe. Skróty: UUO = jednostronna niedrożność moczowodu; SD = Sprague-Dawley; MWF = Monachium Wistar Frömter; RBC = czerwona krwinka; WBC = białe krwinki. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Znaczący wzrost przepuszczalności albumin kapilarnych kłębuszków nerkowych po 5-tygodniowym UUO. Panele A, B i C pokazują pseudokolorowe obrazy objętości 3D dla kanału albuminy surowicy szczura odpowiednio u nieleczonych szczurów MWF, 5-tygodniowych UUO MWF i pięciotygodniowych szczurów UUO SD. Obrazy są przedstawione w pseudokolorowej palecie, aby podkreślić znaczną ilość przefiltrowanej albuminy widocznej w przestrzeni Bowmana, szczególnie w panelu B (gwiazdka). (A) Przestrzeń Bowmana (gwiazdka) pokazuje normalny poziom albuminy zwykle obserwowany u nieleczonych szczurów MWF, niedostrzegalny dla oka. Obrazy kłębuszków nerkowych wykonano przed infuzją albuminy w celu odjęcia wartości fluorescencji tła od tych wykonanych po podaniu albuminy. (D) Wykres ze współczynnikiem przesiewania kłębuszków nerkowych dla albuminy u nieleczonych szczurów MWF, o wartości 0,015 ± 0,002. Wartość ta wzrosła znacznie do 0,045± 0,05 u 5-tygodniowych szczurów UUO MWF i 0,052 ± 0,075 u pięciotygodniowych szczurów UUO SD. Ten parametr jest proporcjonalną wartością intensywności fluorescencji przestrzeni Bowmana podzieloną przez wartość plazmy i nie ma powiązanej jednostki miary. Podziałka = 20 μm, n = 3 samce szczurów w grupie. Skala intensywności pseudokolorów znajduje się pod panelem D. Słupki błędów wskazują odchylenie standardowe. Skróty: UUO = jednostronna niedrożność moczowodu; SD = Sprague-Dawley; MWF = Monachium Wistar Frömter; RBC = czerwona krwinka; WBC = białe krwinki. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Zmniejszona funkcja kanalików proksymalnych po 5-tygodniowym UUO. (A) Zdjęcie powierzchownego kłębuszka nerkowego i segmentu S1 od normalnego szczura Monachium Wistar Frömter wykonane 40 minut po infuzji TR-RSA i dekstranu Cascade Blue. Internalizację TR-RSA można zaobserwować w segmencie S1 i kanaliku proksymalnym. W przeciwieństwie do tego, szczury MWF (B) i szczury SD (C), poddane 5-tygodniowemu UUO, wykazują poważnie zmienione kanaliki proksymalne z minimalnym lub żadnym wychwytem TR-RSA. Normalnie małe, punktowe lizosomy autofluorescencyjne (A) stają się dużymi i wakuolarnymi żółto-pomarańczowymi strukturami, często z całkowitym zapadnięciem się światła rurkowego, którego nie można znaleźć w trójwymiarowych zestawach danych. (C) Kanaliki dystalne normalnie pozbawione jakiejkolwiek formy autofluorescencji zawierają teraz nagromadzenia autofluorescencyjne. Ocena kanalików proksymalnych otaczających kłębuszki nerkowe na podobnych obrazach wykonanych 45-60 minut po infuzji, w celu wychwytu albuminy, wykazała istotną różnicę między grupą pozorowanego MWF a obiema 5-tygodniowymi grupami UUO. Nieleczone szczury MWF miały wartość frakcyjnego wychwytu kanalików proksymalnych wynoszącą 0,556 ± 0,126. Zarówno pięciotygodniowe szczury UUO MWF, jak i SD miały znacznie niższe wartości odpowiednio 0,049 ± 0,126 i 0,00 ±0,00. Podziałka = 20 μm, n = 3 samce szczurów w grupie. Słupki błędów wskazują odchylenie standardowe. Skróty: UUO = jednostronna niedrożność moczowodu; SD = Sprague-Dawley; MWF = Monachium Wistar Frömter; RBC = czerwona krwinka; WBC = białe krwinki; TR-RSA = albumina surowicy szczura Texas Red. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6: Zmiany ekspresji genów za pomocą UUO. (A) Mapa cieplna danych. (B) Znormalizowane zmiany genów dla wszystkich danych na wykresie punktowym. Ekspresję genów w nerkach kontrolnych wykreślono od niskiej do wysokiej ekspresji, a geny zarówno z nerek SHAM, jak i UUO porównano z kontrolnymi poziomami ekspresji. Punkty danych genów przypadające blisko wartości przekątnej genów kontrolnych wskazują na podobne poziomy ekspresji dla obu grup, podczas gdy punkty danych powyżej lub poniżej przekątnej wskazują odpowiednio wyższe lub niższe poziomy ekspresji. Należy zauważyć, że geny SHAM skupiają się bliżej kontrolnej ekspresji diagonalnej niż geny UUO, które są bardziej zmienne. Skrót: UUO = jednostronna niedrożność moczowodu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1: Postęp kontuzji od 5 do 12 tygodni UUO. Porównanie 5- i 12-tygodniowych parametrów obrazowania UUO u trzech samców szczurów MWF i trzech samców szczurów SD w każdym punkcie czasowym. Dane z pięciu tygodni są takie same jak na poprzednich wykresach. Należy zwrócić uwagę na wzrost gęstości kłębuszków nerkowych i GSC dla albuminy przy kontynuacji UUO. Skróty: UUO = jednostronna niedrożność moczowodu; SD = Sprague-Dawley; MWF = Monachium Wistar Frömter; GSC = współczynnik przesiewania kłębuszkowego. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 2: Analiza markerów stanu zapalnego w kłębuszkach nerkowych od szczurów UUO i kontrolnych. Pary sond genowych i zestawy kodowe zostały zaprojektowane i wykorzystane zgodnie z zaleceniami firmy NanoString. Przeanalizowano ponad 100 genów oraz kontrole pozytywne i ujemne określone przez Nanostring. Wszystkie geny (sondy) wraz z ich pogrupowaną ekspresją i wartościami SD są pokazane w tabeli. Rysunek 6A to mapa cieplna danych, natomiast Rysunek 6B przedstawia zmiany genów dla wszystkich danych na wykresie punktowym. Zwróć uwagę na podobieństwa między grupą kontrolną a SHAM oraz wyraźne zmiany dla większości genów w UUO. Skróty: UUO = jednostronna niedrożność moczowodu; SD = odchylenie standardowe. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Discussion

W badaniach nad fizjologią kłębuszków nerkowych zastosowano wiele różnych podejść, w szczególności zastosowanie mikronakłucia, perfuzji izolowanych kłębuszków nerkowych i mikroskopii. Dostępność kłębuszków powierzchniowych u monachijskich szczurów Wistar, szczepów Fromter i Simonsen, pozwoliła na dynamiczne badania in vivo . Jedną z ważnych uwag dla badaczy stosujących tę technologię jest konieczność ustawienia parametrów akwizycji w celu utrzymania spójnych obrazów między badaniami, tak aby autofluorescencja w tkance pozostała spójna. Wykorzystanie dwuprzebiegowej kostki epifluorescencji fluoresceiny/rodaminy i dostosowanie ustawień wzmocnienia do kanałów emisji zielonej i czerwonej w celu naśladowania na ekranie komputera tego, co jest widziane przez okulary, zapewni spójną sygnaturę kolorów w autofluorescencji nawet między różnymi systemami mikroskopowymi.

Szczep Fromter był szeroko stosowany, ponieważ ma zmniejszoną całkowitą liczbę kłębuszków nerkowych, ~ 75% normalnie, a samce spontanicznie rozwijają nadciśnienie w wieku około 12 tygodni, z postępującym białkomoczem i następnie ogniskowym stwardnieniem kłębuszków nerkowych, ostatecznie umierając z powodu niewydolności nerek¹². Wykorzystanie tych szczurów i dodanie mikroskopii 2-fotonowej o zmniejszonej fototoksyczności, zwiększonej głębokości penetracji i możliwości jednoczesnego oglądania wielu sond fluorescencyjnych^utorowało drogę do nowych odkryć ^1,4,5. Wraz z rozwojem sprzętu komputerowego i oprogramowania, dane ilościowe są obecnie standardem we wszystkich laboratoriach 2-fotonowych. Opracowano wiele technik ilościowych i zastosowano je do kanalików kłębuszkowych, kanalików proksymalnych, procesów naczyniowych i śródmiąższowych w warunkach fizjologicznych i chorobowych 1,4,5,27,28,29,30.

Urządzenia do wytwarzania myszy transgenicznych nadały nowy wymiar badaniom nad fizjologią i patologią nerek i było tylko kwestią czasu, aż zostanie to połączone z mikroskopią 2-fotonową, aby jeszcze bardziej nakreślić znaczenie określonych produktów genowych w strukturze i funkcji nerek. Jednak kłębuszki mysie, z wyjątkiem bardzo młodych myszy, znajdują się ponad 100 μm od powierzchni nerki⁹. Mikroskopię dwufotonową najlepiej przeprowadza się na głębokości od 20 do 50 μm w rozdzielczości, a intensywność fluorescencji szybko spada z powodu rozpraszania emitowanego światła i absorpcji w wyniku interakcji z hemoglobiną. W związku z tym konieczne było wywołanie kłębuszków nerkowych. Powszechnie stosowanym podejściem jest model przedłużonej jednostronnej obturacji przez 12 tygodni. Ponieważ modele te nie pozwalają na określenie linii bazowej, oddzielenie skutków UUO od badanego procesu nie jest możliwe.

Korzystając ze szczurów MWF, można porównać wyjściową funkcję kłębuszków nerkowych z następującą po UUO. Wiadomo, że ten model UUO wywołuje stan zapalny i szybkie tempo zwłóknienia i był używany do badania PChN i zwłóknienia 10,11,12. Zgodnie z oczekiwaniami nastąpił wzrost liczby kłębuszków nerkowych zarówno u szczurów MWF, jak i SD. Co więcej, wyniki ilościowe uzyskane po UUO dla szczurów MWF i SD były bardzo porównywalne. Odnotowane tutaj zmniejszenie przepływu krwi zostało wcześniej zgłoszone, porównując dane mikroskopowe po UUO z danymi z mikronakłucia³. Wiadomo było również, że histologia kanalików i śródmiąższu jest znacznie zmieniona, a PT są w większości niefunkcjonalne, jak opisano tutaj, z brakiem endocytozy albuminowej. Badania na rycinie 2 i rycinie 3 wykazują dramatyczne zmniejszenie natężenia przepływu krwinek czerwonych w naczyniach włosowatych kłębuszkowych i okołokanalikowych oraz zwiększoną adhezję WBC. Zmniejszenie przepływu jest prawdopodobnie spowodowane zablokowaniem naczyń włosowatych przez adhezję WBC i formacje rouleaux.

Aby dokładniej ocenić stan zapalny, określiliśmy ilościowo przepuszczalność albumin i wykazaliśmy, że wzrasta ona dziesięciokrotnie. Ponadto izolowane kłębuszki wykazały, że ekspresja mRNA wzrosła w przypadku wielu genów, o których wcześniej wiadomo, że są zwiększone w zapaleniu nerek w różnych stanach chorobowych^nerek 17,19,20,21,22,23,24,25,26 . Wzrost gęstości powierzchni kłębuszków nerkowych i przepuszczalności albumin był postępujący, jak wykazano w 12-tygodniowych danych UUO. Obecne dane są pierwszymi, które bezpośrednio pokazują, że kłębuszki ulegają znacznym uszkodzeniom strukturalnym, stanom zapalnym i zmianom molekularnym w modelu UUO. Wyniki są zgodne z wcześniejszym badaniem całej tkanki nerkowej, w którym analizowano biopsje nerek owiec po UUO, stwierdzając, że wiele markerów stanu zapalnego jest podwyższonych^{do 19}. Obecne wyniki wskazują, że w kłębuszkach nerkowych występuje wyraźny stan zapalny, wcześniej znany tylko z tkanki korowej.

Obecne dane różnią się od wcześniejszych badań na myszach, w których nie stwierdzono zmian w ekspresji cząsteczek adhezyjnych, osadzaniu się dopełniacza i infiltracji neutrofili między 12-tygodniowymi kłębuszkami nerkowymi a normalnymi³¹. Ponadto laboratorium Hickeya wykorzystało 12-tygodniowy model UUO do zbadania reakcji immunologicznych w kłębuszkach nerkowych myszy. Nie znaleźli różnic w nacieku neutrofili między czterotygodniowymi kłębuszkami mysi a kłębuszkami poturacyjnymi^32,33. Te późniejsze badania przeprowadzono po tym, jak miednica niedrożnej nerki została odtworzona z moczu. Nie zrobiliśmy tego, ponieważ chcieliśmy określić wpływ UUO na funkcję kłębuszków nerkowych, tak jak to byłoby in vivo, bez sztucznego usuwania płynu powodującego niedrożność. Wreszcie, zastosowanie UUO u myszy jest zastępowane obrazowaniem kłębuszków nerkowych na głębokości większej niż 100 μm pod powierzchnią. Chociaż jest to możliwe, istnieje kompromis między rozdzielczością a intensywnością, przy czym obie te wartości ulegają znacznemu zmniejszeniu po przekroczeniu 50 μm³⁴.

Przedstawione wyniki nie są zaskakujące, jeśli zestawi się dane z istniejącej literatury na temat zmian histologicznych, powstawania kłębuszków jajowych, stanów zapalnych, zwłóknień, hemodynamiki 10,11,12. Przedstawione dane, w tym adhezja WBC, formacje rouleaux, molekularne markery zapalenia kłębuszków nerkowych i zwiększona przepuszczalność albumin, dodatkowo wskazują na rozległy stan zapalny, który trwa w tym modelu UUO nawet po pięciu tygodniach, a także po dwunastu tygodniach. Oczywiste jest, że przewlekłe UUO nie jest stanem fizjologicznym, a użycie UUO do indukowania kłębuszków nerkowych na powierzchni stanowi model urazu. Szczury MWF, które mają kłębuszki powierzchniowe w warunkach fizjologicznych, mogą być badane podłużnie w miarę wystąpienia urazu. Możliwe jest generowanie transgenicznych szczurów, a wielu badaczy tworzy je za pomocą bioczujników, aby zadawać konkretne pytania. W szczególności Medical College of Wisconsin ma obecnie kolonię szczurów MWF i stworzył transgeniczne szczury w celu badania procesów kłębuszkowych w warunkach fizjologicznych i patologicznych. Te szczury MWF oferują doskonałą okazję do badania procesów kłębuszkowych u normalnych, chorych i genetycznie zmienionych szczurów.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
70 &mikro; m sterylny sitko komórkowe	Corning	#421751
100 µ m sterylne sitko do komórek	Corning	#421752
CA Mikronożyczki Model 1C300	Mikroskopia elektronowa Nauki	Kat# 72930
Elektryczna poduszka grzewcza	Sunbeam	Kroger
Kleszcze manipulacyjne	Mikroskopia elektronowa	Nauki Kat# 72962
Kleszcze hemostatyczne Kelly (proste)	Nauki o mikroskopii elektronowej	Kot#72930
Leica Dive SP-8 Wielofotonowy mikroskop odwrócony	Leica Microsystems	Uwaga: Wersja 7.1r1
MaiTai DeepSee laser tytanowo-szafirowy	Spectra-Physics	NA
Mayo Nożyczki preparacyjne	Mikroskopia elektronowa	Nauki Kat# 78180-1C3
Oprogramowanie do przetwarzania obrazów metamorficznych	Dynamika molekularna	Nr kat.# 78266-04
Microsoft Excel	Microsoft Corportation	2007 wersja
Quant-iT Zestaw do oznaczania RNA	Invitrogen/ThermoFisher	Q33140
Podgrzewacz podzbiornika Reptitherm	Zoomed	Amazon
RNeasy MinElute Cleanup Kit (kolumny spinowe)	Qiagen	74204
Bufor RPE	Qiagen	1018013
Taśma autoklawu Strate-Line	Fisher Scientific	Cat# 11-889-1
Odczynnik TRI	Sigma	T9424
Naczynia nakrywkowe Willco-dish Bottoms (50 mm/40 mm szkiełko nakrywkowe)	Nauki o mikroskopii elektronowej	Cat# 70665-07