Artykuł metodologiczny

Wykorzystanie mikroskopii 2-fotonowej do ilościowego określenia wpływu przewlekłej jednostronnej niedrożności moczowodu na procesy kłębuszkowe

2.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63329

⸱

4 marca 2022

 ,  ,  , 
1Department of Medicine, Division of Nephrology, Indiana University School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół z wykorzystaniem mikroskopii 2-fotonowej u szczurów z Monachium Wistar Fromter z powierzchniowymi kłębuszkami nerkowymi w celu ilościowego określenia wpływu przedłużonej niedrożności moczowodu na dynamikę i funkcję kłębuszków nerkowych.

Streszczenie

Zastosowanie nowatorskich metod mikroskopowych do odpowiednich modeli chorób zwierzęcych w celu zbadania dynamicznej fizjologii nerek pozostaje wyzwaniem. Szczury z kłębuszkami powierzchniowymi dają wyjątkową okazję do zbadania procesów fizjologicznych i patofizjologicznych za pomocą przyżyciowej mikroskopii 2-fotonowej. Kwantyfikacja przepływu krwi w kapilarkach kłębuszkowych oraz zwężenie i rozszerzenie naczyń krwionośnych w odpowiedzi na leki, przepuszczalność i stan zapalny to tylko niektóre z procesów, które można badać. Ponadto transgeniczne szczury, tj. podocyty znakowane barwnikami fluorescencyjnymi i innymi metodami biomarkerów molekularnych, zapewniają zwiększoną rozdzielczość do bezpośredniego monitorowania i ilościowego określania interakcji białko-białko oraz skutków określonych zmian molekularnych.

U myszy, które nie mają kłębuszków powierzchniowych po czterech tygodniach, jednostronna niedrożność moczowodu (UUO) przez kilka tygodni była stosowana do wywoływania kłębuszków nerkowych. Ponieważ ten model indukcji nie pozwala na badania wyjściowe, określiliśmy ilościowo wpływ UUO na procesy kłębuszkowe w modelu UUO u szczurów Monachium Wistar Frömter (MWF), które mają kłębuszki powierzchniowe w warunkach fizjologicznych. Model UUO przez pięć tygodni lub dłużej powodował znaczące zmiany w morfologii nerek, mikrokrążeniu okołokanalikowym i kłębuszkowym, a także w strukturze i funkcji nabłonka kanalików. Przepływ kłębuszkowych i okołokanalikowych krwinek czerwonych (RBC) uległ znacznemu zmniejszeniu (p < 0,01), prawdopodobnie z powodu znacznego wzrostu przylegania białych krwinek (WBC) w naczyniach włosowatych kłębuszków nerkowych i okołokanalikowych. Współczynnik przesiewania kłębuszkowego albuminy wzrósł z 0,015 ± 0,002 u nietraktowanych MWF do 0,045 ± 0,05 u 5-tygodniowych szczurów UUO MWF. Dwanaście tygodni UUO spowodowało dalszy wzrost powierzchniowej gęstości kłębuszków nerkowych i współczynnika przesiewania kłębuszków nerkowych (GSC) dla albuminy. Albumina fluorescencyjna przefiltrowana przez kłębuszki nerkowe nie została ponownie wchłonięta przez kanaliki proksymalne. Dane te sugerują, że stosowanie UUO do indukcji kłębuszków nerkowych ogranicza zdolność do badania i interpretowania normalnych procesów kłębuszkowych i zmian chorobowych.

Wprowadzenie

Zrozumienie procesów zachodzących w kłębuszkach nerkowych, zwłaszcza biologii podocytów, było celem od ponad 50 lat. Monachijskie szczury Wistar z kłębuszkami powierzchniowymi odegrały kluczową rolę w tych badaniach, w tym w badaniach mikronakłuć, aby zrozumieć wiele aspektów procesów fizjologicznych i patologicznych1,2,3. Wykorzystanie mikroskopii do śródetapowego badania składników kłębuszków nerkowych było ograniczone ze względu na efekty fototoksyczności do czasu pojawienia się mikroskopii 2-fotonowej, która zminimalizowała tę toksyczną ekspozycję i zwiększyła głębokość penetracji1,2. Wraz z szybkim postępem w sprzęcie komputerowym i oprogramowaniu, pozwoliło to na trójwymiarowe (3D) i czterowymiarowe (czasowe) badania przez wiele godzin w jednym ustawieniu1,4,5.

Kwantyfikacja przepływu krwi w naczyniach włosowatych kłębuszków nerkowych, zwężenie i rozszerzenie naczyń krwionośnych w odpowiedzi na leki, przepuszczalność i wpływ ładunku na przepuszczalność i stan zapalny to tylko niektóre z procesów kłębuszkowych, które zostały zbadane. Ponadto można zidentyfikować segment S1 kanalika proksymalnego, a różnice w zachowaniu nabłonka rurkowego S1 i S2 można określić ilościowo1,4. Badania na myszach, zwłaszcza przy powszechnej dostępności urządzeń transgenicznych u myszy, doprowadziły do szybkiego postępu w zrozumieniu biologii molekularnej procesów chorobowych kłębuszków nerkowych. Poszczególne białka są odpowiedzialne za dysfunkcję kłębuszków nerkowych w badaniach nokautujących, zwłaszcza w odniesieniu do białkomoczu6,7,8. Jednak wykorzystanie modeli mysich do badań obrazowania kłębuszków nerkowych było ograniczone, ponieważ kłębuszki nerkowe znajdują się ponad 100 μm poniżej powierzchni w licznych badanych szczepach9.

To skłoniło badaczy do opracowania i wykorzystania modeli mysich, co zaowocowało powierzchniowymi kłębuszkami nerkowymi, które mogą być badane. Najczęściej spotykanym modelem jest użycie kompletnego UUO10,11,12. Pod koniec przedłużonego okresu UUO w nerkach myszy występują liczne kłębuszki nerkowe, które mogą być i były badane13,14. W tych badaniach na myszach nie przeprowadzono badań wyjściowych ani kontrolnych w celu określenia wpływu przedłużonego UUO na biologię kłębuszków nerkowych. Ponieważ jest to poważny i długotrwały model urazu powodujący szybkie zwłóknienie i zniszczenie kory mózgowej10,11,12, postawiliśmy hipotezę, że będzie to miało wpływ na procesy i funkcje kłębuszków nerkowych. Aby odpowiedzieć na to pytanie, do badania parametrów kontrolnych/wyjściowych wykorzystano szczury Munich Wistar Fromter (MWF) z kłębuszkami powierzchniowymi, a wyniki wyjściowe porównano z badaniami kłębuszkowymi na szczurach MWF po pięciu tygodniach UUO. Badaliśmy również szczury Sprague Dawley (SD), które nie mają kłębuszków powierzchniowych po UUO. Wyniki wskazują, że 5 tygodni UUO u szczurów MWF i SD rzeczywiście zwiększa liczbę kłębuszków nerkowych. Były to jednak nieprawidłowe kłębuszki nerkowe z wyraźnymi zmianami w przepływie krwi w kłębuszkach nerkowych, stanie zapalnym oraz przepuszczalności i wielkości makrocząsteczek.

Protokół

Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Guide for the Care and Use of Laboratory Animals i zostały zatwierdzone przez Animal Care and Use Committee w Indiana University School of Medicine.

1. Przygotowanie szczura rasy Munich Wistar Frömter lub SD do operacji UUO

  1. Zanurz szczura w narkozie z użyciem izofluranu (indukcja 5%, podtrzymanie 1,5-2,5%), następnie kilka razy ogol, umyj i zdezynfekuj obszar operacyjny, wykonując ruchy okrężne za pomocą preparatu do mycia na bazie jodu lub chlorheksydyny oraz alkoholu. W celu uśmierzenia bólu podaj długo działający/powolnie uwalniany lek przeciwbólowy zgodnie z instytucjonalnymi wytycznymi IACUC.
  2. Za pomocą skalpela wykonaj nacięcie wzdłuż linii środkowej; zlokalizuj lewą nerkę i uwolnij ją z otaczających organów otrzewnych.
  3. Ostrożnie zlokalizuj pień nerkowy, który składa się z tętnicy nerkowej, żyły nerkowej i moczowodu. Oddziel moczowód od pozostałych struktur, zachowując ostrożność, aby nie uszkodzić tej delikatnej budowy.
  4. Używając cienkich pinceit, ostrożnie owiń nitkę chirurgiczną 3-0 wokół moczowodu i zawiąż ją, uważając, aby go nie przerwać. Powtórz tę procedurę kilka milimetrów z każdej strony pierwszego węzła, aby zawiązać drugi węzeł i zapewnić całkowitą obstrukcję.
  5. Po zakończeniu procedury ostrożnie zamknij kolejne warstwy mięśni. Przed zamknięciem ostatniej warstwy wstrzyknij do jamy brzusznej 2 mL ciepłej, sterylnej soli fizjologicznej 0,9%, a następnie zamknij ją całkowicie. Skórę zewnętrzną zamknij za pomocą zszywek chirurgicznych.
  6. Podaj długo działający/powolnie uwalniany lek przeciwbólowy w celu uśmierzenia bólu i uważnie obserwuj proces wybudzania zgodnie z instytucjonalnymi wytycznymi IACUC. Następnie prowadź okresowy monitoring i przygotuj zwierzę do obrazowania pod koniec piątego tygodnia.

2. Synteza albuminy surowicy szczura znakowanej Texas Red (TR-RSA)

  1. Odważ 100 mg albuminy surowicy szczura i rozpuść ją w 6,67 mL 0,1 M buforu wodorowęglanu sodu o pH 8,4 w 50 mL probówce stożkowej.
  2. Do fiolki zawierającej 5 mg estru Texas Red-X-sukcynimidylowego dodaj 100 µL dimetyloformamidu (DMF, wysokiej czystości) i mieszaj w wortexie do całkowitego rozpuszczenia barwnika.
  3. Umieść roztwór albuminy surowicy szczura na wortexie przy niskich lub średnich obrotach, tak aby objętość roztworu wirowała znacznie poniżej krawędzi otwartej probówki.
  4. Dodaj rozpuszczony barwnik podczas wortexowania probówki.
  5. Owiń 50 mL probówkę stożkową folią aluminiową, umieść ją na wstrząsarce lub rollerze i inkubuj przy wolnym mieszaniu przez 1 h w temperaturze pokojowej (RT).
  6. W 5 L pojemniku z 0,9% NaCl, przy łagodnym mieszaniu za pomocą mieszadła magnetycznego, zwilż membrany odpowiedniego dializatora o progu odcięcia masy cząsteczkowej 50 kDa (odpowiednie będą membrany z klipsami, zamknięte rurki membranowe lub kasety do dializy).
  7. Przenieś roztwór TR-RSA do systemu membranowego i przymocuj go do pływaków zazwyczaj dołączanych do zestawu. Pozostaw 5 L pojemnik z 0,9% roztworem soli i TR-RSA na noc w temperaturze 4 °C (w chłodni) przy łagodnym mieszaniu na mieszadle magnetycznym. Wymień roztwór do dializy co najmniej trzy razy w ciągu następnych 36 h.
  8. Pęcznienie membrany zwiększy objętość teraz przejrzystego roztworu TR-RSA. Podziel początkową masę 100 mg przez objętość, aby uzyskać przybliżone stężenie; stosunek barwnika do białka wyniesie 1:1. Rozdziel roztwór na odpowiednie aliquoty i liofilizuj w celu długoterminowego przechowywania.

3. Przygotowanie do dwufotonowego obrazowania intravitalnego na mikroskopie odwróconym

  1. Zdejmij pokrywkę z szalki z dnem z lamellki 50 mm (o średnicy lamellki 40 mm) i przyklej 8 kawałków taśmy do autoklawowania na wewnętrznym dnie wzdłuż krawędzi. Utwórz pusty obszar w kształcie piramidy, używając 4 kawałków na stronę, aby zewnętrzna nerka ściśle przylegała do tej przestrzeni, zachowując jednocześnie obwodowy kontakt z taśmą do autoklawowania, co pomoże zminimalizować ruchy. Dostosuj odstępy w zależności od wielkości szczura, aby zapewnić optymalny kontakt z nerką.
  2. Umieść po jednym termopadzie po każdej stronie szalki z dnem z lamellki 50 mm. Upewnij się, że podkładka grzewcza zakrywa stolik.
  3. Użyj obiektywu imersyjnego w wodzie 40x przy powiększeniu (zoom) 0,75x oraz 1,5x, aby uzyskać odpowiednio obrazy 30x i 60x, co pozwoli na uzyskanie obrazów o niskim i wysokim powiększeniu. W razie potrzeby dolej wody do obiektywu za pomocą strzykawki 1 mL z długim odcinkiem rurki PE-200, która może dotrzeć do góry obiektywu pod kątem w dół, aby zapobiec spływaniu kropli wody w dół rurki.
  4. Ustaw transmitancję lasera na 2%, a detektory niebieski, zielony i czerwony na wcześniej określone poziomy, aby zapewnić spójność obrazów pomiędzy badaniami. Ustaw długość fali wzbudzenia na 800 nm na wskazanym laserze (patrz Tabela materiałów), co pozwoli na efektywne wzbudzenie wszystkich fluoroforów użytych w tym badaniu.
    1. Użyj zewnętrznych detektorów (niedeskannowanych) do zbierania emisji niebieskiej za pomocą fotopowielacza (PMT) (420-490 nm, wzmocnienie 950).
    2. Użyj detektora HyD do rejestracji emisji zielonej (500-550 nm, wzmocnienie 100).
    3. Użyj detektora HyD do rejestracji emisji czerwonej (590-660 nm, wzmocnienie 200).
    4. Dostosuj offset w PMT (emisje niebieskie) tak, aby tylko kilka pikseli w pustych obszarach tkanki miało wartość zero.
      UWAGA: Detektory HyD dla emisji zielonej i czerwonej posiadają automatyczną regulację offsetu; można ustawić jedynie wzmocnienie.
    5. Ustaw głębię bitową na 12 bitów, aby obrazy miały skalę intensywności 4 096 między czernią a bielą.
      UWAGA: Konieczne jest ustawienie dolnych limitów detektorów (offset w PMT) w sposób, który nie wyklucza tych wartości, aby zapewnić zbieranie emisji o niskiej intensywności w przestrzeni Bowmana. Jeśli ustawienie czułości będzie zbyt niskie, wskażą to wizualne znaczniki ostrzegawcze; wartości te otrzymują wartość intensywności zero.
  5. Rozcieńcz około 6 mg Texas-Red-X-Rat Serum Albumin do całkowitej objętości 1 mL, nabierz roztwór do strzykawki 1 mL i podłącz do pozostawionego wewnątrz cewnika i.v. w kroku 4.1 po infuzji Hoechst 33342 w kroku 9.1.

4. Przygotowanie chirurgiczne do obrazowania dwufotonowego in vivo

  1. Umieść zpreanestezjowanego szczura z wszczepionym kaniulą do dostępu żylnego (udową lub szyjną) na boku, tak aby ogolony lewy bok był skierowany do góry, a zwierzę leżało płasko i prosto na stole. Upewnij się, że przednie łapy stykają się ze sobą, podobnie jak tylne.
  2. Delikatnie zbadaj palpacyjnie lewy bok tuż poniżej żeber, aby zlokalizować nerkę i określić jej naturalne położenie w jamie brzusznej. W razie potrzeby narysuj markerem permanentnym linię wzdłuż ogolonego obszaru, przecinającą środek nerki w orientacji od nosa do ogona.
  3. Za pomocą pęsety z ząbkami chwyć skórę i unieś ją do góry, aby umożliwić zmiażdżenie linii zaznaczonej markerem za pomocą kleszczyków hemostatycznych w celu zgniecenia podległych naczyń krwionośnych i zapobiegania krwawieniu podczas wykonywania nacięcia nożyczkami chirurgicznymi. Powtórz tę czynność w odniesieniu do cienkiej zewnętrznej warstwy mięśni, aby zminimalizować krwawienie.
  4. Aby wykonać końcowe nacięcie cienkiej wewnętrznej warstwy mięśni brzusznych, ponownie zbadaj palpacyjnie nerkę, aby oszacować jej wielkość i położenie. Ostrożnie unieś wewnętrzną warstwę mięśni pęsetą i za pomocą kleszczyków hemostatycznych zmiażdż linię przecinającą skórę nad nerką, której długość wynosi około 1/3ciej szacowanej wielkości nerki.
  5. Utrzymując chwyt warstwy mięśniowej pęsetą, wykonaj końcowe nacięcie.
    UWAGA: Lepiej wykonać mniejsze nacięcie i poszerzyć je w razie potrzeby, niż wykonać zbyt duże, co będzie wymagało częściowego zamknięcia szwem.
  6. Delikatnie chwyć nerkę za otaczającą ją tkankę tłuszczową. Używając obu rąk z pęsetami, staraj się chwycić tłuszcz na dolnym biegunie nerki, stosując technikę chwytania następującego po sobie (hand-over-hand), aby uchwycić i utrzymać tłuszcz okołonerkowy, przesuwając się w dół.
  7. Mając pewny chwyt tkanki tłuszczowej na dolnym biegunie nerki jedną ręką, delikatnie pociągnij za tłuszcz i, jeśli jest to konieczne, bardzo ostrożnie wysuń nerkę przez nacięcie. Jeśli nerka nie przechodzi łatwo, poszerz nacięcie.

5. Pozycjonowanie szczura do obrazowania

  1. Ostrożnie przyłóż odsłoniętą nerkę do krawędzi szalki, lekko ją obracając tak, aby strona brzuszna nerki stykała się z szkiełkiem nakrywkowym, a strona grzbietowa była skierowana w stronę przeciwną do krawędzi.
  2. Aby dodatkowo zminimalizować ruchy, weź dwa sterylne gaziki 2 x 2, zwilż je solą fizjologiczną i ułóż je przy stronie grzbietowej nerki, wzmacniając kontakt strony brzusznej nerki z krawędzią.
  3. Spójrz przez okular mikroskopu przy oświetleniu epifluorescencyjnym, używając kostki dwupasmowej Rhodamine/FITC. Jeśli stwierdzisz ruch, wprowadź niewielkie korekty położenia i ostrożnie popraw gaziki, upewniając się, że nie wsunęły się pod nerkę. Aby jeszcze bardziej ograniczyć ruchy, lekko obróć szczura, tak aby klatka piersiowa znajdowała się dalej od szalki.

6. Pozyskiwanie obrazów do analizy ilościowej

  1. Skanuj powierzchnię nerki, korzystając z oświetlenia epifluorescencyjnego (krok 5.3), a następnie zaznacz pozycję kłębuszków za pomocą oprogramowania powiązanego z kontrolerem zmotoryzowanego stolika (funkcja dostępna w nowoczesnych systemach).
  2. Dla każdego kanału kolorystycznego przy naświetlaniu dwufotonowym należy pobrać płytką objętość 3D górnej części każdego zaznaczonego kłębuszka, która będzie służyć jako obrazy tła. Należy zastosować paletę pseudokolorów w wyświetl opcję oprogramowania do obrazowania, aby lepiej zwizualizować słabe natężenia fluorescencji tła w pętlach kapilarnych kłębuszków.
  3. Przyjmując powierzchowne naczynie krwionośne jako punkt skupienia, należy powoli infundować fluorescencyjną albuminę, dając czas na zaobserwowanie wzrostu i spadku fluorescencji wynikającego z dystrybucji systemowej. Należy infundować taką ilość TR-RSA, aby uzyskać w naczyniach okołokanalikowych i pętlach kapilarnych intensywność znajdującą się tuż poniżej poziomu nasycenia.
    UWAGA: Przy prawidłowym unaczynieniu nerek zazwyczaj występuje 5-sekundowe opóźnienie między infuzją materiału a jego pojawieniem się w krwiobiegu.
  4. Odczekać około 10 min przed obrazowaniem wolumenów 3D (1 µm przedziały) dla wszystkich oznaczonych i zobrazowanych kłębuszków z kroku 6.2.
    UWAGA: Szczury Munich Wistar linii Simonsena mają mniej kłębuszków powierzchniowych. Jednakże, ponieważ szczury MW linii Frömter mają większą liczbę kłębuszków powierzchniowych, często możliwe jest obrazowanie do 10 kłębuszków.
  5. Uśmierć szczura poprzez przedawkowanie izofluranu po zakończeniu badania. W celu potwierdzenia eutanazji wykonaj obustronną pneumotorakomię.

7. Obliczanie przepuszczalności kłębuszkowej

  1. Używając oprogramowania do przeglądania obrazów powiązanego z systemem mikroskopowym, wyeksportuj obrazy do formatu surowych obrazów 12-bitowych w celu ich przetwarzania i analizy.
  2. Wczytaj trójwymiarowe wolumeny tła oraz surowy wolumen 3D zawierający krążącą fluorescencyjną albuminę. Zlokalizuj w wolumenie 3D płaszczyznę ogniskową z najjaśniejszą powierzchowną pętlą kapilarną w kłębuszkach, zachowując odpowiednią odległość od krawędzi otaczającej torebki Bowmana.
  3. Wykorzystując punkty orientacyjne, zlokalizuj tę samą płaszczyznę ogniskową w wolumenie tła. Wybierz obszar w pętli kapilarnej oraz obszar w przestrzeni Bowmana, odnotowując średnie wartości intensywności dla każdego z nich. Przyjmij te wartości intensywności jako wartości tła.
  4. Obrysuj obszar (o powierzchni co najmniej 20 x 20 pikseli) w przestrzeni Bowmana na obrazie zawierającym albuminę i odnotuj odczyt intensywności (wybierz obszar, który nie sąsiaduje z pętlą kapilarną ani torebką Bowmana, aby zapewnić najczystszy pomiar intensywności przestrzeni Bowmana). Przesuń narysowany obszar na dwa inne regiony, aby wyznaczyć wartość średnią dla intensywności w przestrzeni Bowmana.
  5. Wybierz najjaśniejszą fluorescencyjną intensywność plazmy w przekroju pętli kapilarnej i zakreśl ten obszar. Używając funkcji progowania (threshold), zaznacz jasne wartości (zazwyczaj zlokalizowane na krawędziach ścian pętli kapilarnej), unikając cieni krążących RBC i zapisz tę wartość.
    UWAGA: Ponieważ czynniki obecne we krwi powodują niedoszacowanie poziomów fluorescencji plazmy, ważne jest wybranie najjaśniejszych obszarów.
  6. Wprowadź wartości do arkusza kalkulacyjnego, aby obliczyć GSC za pomocą równania (1):
    GSC = Wzór na równowagę statyczną; równanie przedstawiające metodę obliczania intensywności; proces matematyczny. (1)

8. Obliczanie przepływu erytrocytów w powierzchownych pętlach naczyń włosowatych kłębuszków oraz w naczyniach nerkowych z wykorzystaniem funkcji linii skanowania (linescan)

  1. Znajdź odpowiednie naczynie (pętlę kapilarną lub naczynie okołokanalikowe). Ponieważ funkcja linescan w odniesionym oprogramowaniu do akwizycji obrazu (patrz Tabela materiałów) wymaga, aby naczynie było prostopadłe, obróć obraz za pomocą funkcji rotate.
  2. Po obróceniu naczynia tak, aby leżało poziomo, wybierz funkcję XT w menu acquisition. Ustaw skanowanie na 4 000 linii. Umieść linię w poprzek badanego naczynia; upewnij się, że płaszczyzna ogniskowania znajduje się na maksymalnej średnicy segmentu, który ma zostać zobrazowany.
  3. Kliknij lewym przyciskiem myszy na kolorowym obrazie kompozytowym i wybierz Take Snapshot, aby wygenerować obraz referencyjny obszaru, w którym wykonano skan liniowy. Natychmiast kliknij przycisk Start, aby zarejestrować skan liniowy naczynia.
  4. Aby określić szybkość przepływu RBC, zaimportuj skany liniowe do oprogramowania do przetwarzania obrazów (patrz Tabela materiałów). Otwórz okno dialogowe Show Region Statistics w menu rozwijanym Measure. Wybierz narzędzie single line drawing i narysuj linię zgodną z nachyleniem cieni RBC. Zanotuj wartości szerokości i wysokości.
    UWAGA: Wartości pikseli uzyskane dla szerokości odpowiadają odległości; piksele dla wysokości odpowiadają czasowi.
  5. Użyj następującego wzoru (Równanie (2)), aby obliczyć prędkość.
    Szybkość przepływu RBC w µm/s = Równanie ilustrujące pomiar oparty na pikselach; wzór: (szerokość w pikselach × 0,379 µm) / (wysokość w pikselach × 0,0025 s). (2)
    UWAGA: Odpowiada to parametrom akwizycji przy powiększeniu 60x i częstotliwości skanowania 400 Hz w odniesionym mikroskopie (patrz Tabela materiałów).
    1. Wykonaj co najmniej pięć obliczeń i wyciągnij z nich średnią, aby podać prędkość dla każdego skanu liniowego.
      UWAGA: Parametry te będą zależne od wymiaru piksela i prędkości akwizycji systemu mikroskopowego.

9. Obliczanie niedrożności pętli kapilarnych kłębuszków przez leukocyty (WBC)

  1. Podaj barwnik jądrowy Hoechst 33342 (w dawce ok. 8 µg/kg masy ciała szczura) za pomocą wszczepionego kaniuli dożylnej, aby zidentyfikować leukocyty zatrzymane w pętlach kapilarnych.
    UWAGA: Użyteczna głębokość obrazowania będzie ograniczona ze względu na rozproszenie fotonów i absorpcję przez hemoglobinę, szczególnie w przypadku emisji niebieskich o krótszej długości fali.
  2. Wycentruj kłębuszek w polu obrazowania i wykonaj zestaw danych 3D, zaczynając od powierzchni kłębuszka, a kończąc na głębokości co najmniej 30 do 35 µm. Zastosuj wielkość kroku 1 µm w kierunku Z.
  3. Zidentyfikuj leukocyty, porównując niebieski kanał Hoechst z kanałem Texas Red dla albuminy; szukaj obszarów wykluczenia czerwonego barwnika w pętli kapilarnej oraz odpowiadającego im barwienia jądra, aby jednoznacznie zidentyfikować leukocyty. Zdefiniuj leukocyty jako „przylegające”, jeśli pozostają statyczne przez 3 przekroje optyczne. Wyniki podaj jako liczbę wystąpień na 10 przekrojów optycznych od górnej części kłębuszka, pobranych w odstępach 1 µm.

10. Ocena obecności tworzyw rouleaux w kłębuszkach powierzchniowych

  1. Postępuj zgodnie z instrukcjami z kroku 9.3 i uzyskaj zestaw danych 3D. Poszukuj formacji rouleaux, które objawiają się jako erytrocyty ułożone w stosy odporne na dysocjację podczas przemieszczania się wzdłuż pętli kapilarnych. W celu lepszej wizualizacji struktury na większych głębokościach zastosuj czerwony fluorofor, ponieważ dłuższa fala emisji światła czerwonego wiąże się z mniejszym rozproszeniem fotonów. Wyniki podaj jako liczbę wystąpień/25 sekcji optycznych od góry kłębuszka, wykonanych w odstępach 1 µm.

11. Izolacja kłębuszków

  1. Wyizoluj trzy grupy kłębuszków z nerek świeżych, stosując standardową technikę przesiewania, która pozwala na uzyskanie czystości kłębuszków szczurzych bliskiej 90%15.
    1. Umieść korę nerek w zimnym roztworze soli fosforanowej (PBS) i posiekaj ją za pomocą kilku par drobnych nożyczek lub żyletek.
    2. Przenieś posiekaną tkankę do sterylnego sita komórkowego o oczkach 100 µm i delikatnie przepchnij ją, używając tłoka strzykawki 5 mL oraz 50-100 mL zimnego PBS.
      UWAGA: Większość kanalików zostaje zatrzymana, podczas gdy kłębuszki przechodzą przez sito.
    3. Umieść frakcję wzbogaconą w kłębuszki na filtrze 70 µm i dokładnie wypłucz je zimnym PBS. Przemyj filtr 100-200 mL zimnego PBS, aby usunąć większość pozostałych kanalików.
    4. Zbierz kłębuszki z filtra, używając 1-2 mL zimnego PBS, odwiruj (10 000 × g, 2 min, 4 °C) i zamroź błyskawicznie w ciekłym azocie do momentu izolacji RNA.
      UWAGA: Czystość kłębuszków określona za pomocą mikroskopii kontrastowej wynosi >90%, a wydajność to około 10 mg z 2 nerek.

12. Izolacja RNA z kłębuszków

  1. Zhomogenizować zamrożony osad kłębuszków, dodając odczynnik do izolacji RNA 400 µL odczynnika i rozbicia osadu za pomocą 200 µL końcówką do pipety, a następnie krótkim mieszaniem w wortexie i 5-minutową inkubacją w temperaturze pokojowej16.
  2. Dodaj 40 µL z 1-bromo-3-chloropropanem (BCP), wymieszać w wstrząsarzu wierzchowym (vortex) przez 15 s i inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 min.
  3. Wirować przy 12 000 × g, 15 min, 4 °CUsuń fazę wodną, rozcieńcz dolną fazę równą objętością 70% etanolu i nanieś ją bezpośrednio na kolumnę do wirowania (patrz Tabela materiałów).
  4. Po etapach płukania, z których każdy polegał na dodaniu odpowiedniego roztworu do kolumny, a następnie wirowaniu przy 12 000 x g, 15 s, 26 °C [łącznie 3, pierwsze 2 z 500 µL buforu RPE (autorski łagodny bufor do płukania z etanolem, służący do usuwania śladów soli, 3rd przemyć za pomocą 500 µL [80% EtOH], eluuj RNA poprzez dodanie 15 µL H2odwiruj, analogicznie jak w przypadku etapów przemywania. Sprawdź stężenie i czystość RNA, a następnie przekaż próbki RNA do jednostki centralnej (core facility) w celu przeprowadzenia analizy NanoString.17,18.
    UWAGA: Całkowita wydajność RNA wynosi około 1-2 µgTutaj 24 próbki zawierały 200 ng RNA przy stężeniu 30 ng/µL.

13. Analiza NanoString

UWAGA: Technologia Nanostring opiera się na cyfrowej detekcji i bezpośrednim kodowaniu molekularnym cząsteczek docelowych z wykorzystaniem par sond zakodowanych kolorystycznie. Sonda Capture posiada grupę biotyny na końcu 3', a sonda Reporter przenosi sygnał na swoim końcu 5'.

  1. Przesłać pary sond genowych oraz zestawy CodeSets firmy NanoString do Genomic Core Facility na Uniwersytecie stanowym w Michigan i stosować zgodnie z instrukcjami NanoString.
    UWAGA: Istnieje sześć pozycji dla kodów kolorystycznych, a każda pozycja może przyjąć jeden z czterech kolorów, co umożliwia uzyskanie dużej różnorodności znaczników, z których każdy może zostać indywidualnie rozdzielony i zidentyfikowany podczas gromadzenia danych.
  2. Otrzymać dane zgromadzone przez personel Genomic Core Facility przy użyciu zastrzeżonego analizatora cyfrowego Nanostring nCounter, który rejestruje pola widzenia za pomocą obiektywu mikroskopowego i kamery CCD, a następnie tabuluje i wyświetla liczbę kodów kreskowych.
  3. Zaimportować surowe dane do oprogramowania nSolver firmy Nanostring w celu przeprowadzenia analizy. Znormalizować dane korzystając z domyślnych ustawień programu i porównać dane między grupami zgodnie z opisem w instrukcji obsługi.
    UWAGA: Celem było monitorowanie zmian w ekspresji genów, które wcześniej wykazano jako zmienione w tkance korowej w modelu UUO19 oraz w chorobach nerek17,20,21,22,23,24,25,26. W każdej grupie kłębuszków (CONT, SHAM oraz UUO) przeanalizowano łącznie 126 genów, w tym zalecane kontrole pozytywne i negatywne.

Wyniki

Trzy grupy kłębuszków nerkowych wyizolowano przy użyciu standardowej techniki przesiewania, która pozwala uzyskać blisko 90% czystości kłębuszków szczurzych15. Pierwsza grupa kłębuszków pochodziła z lewej nerki szczurów SD, u których przez 5 tygodni stosowano zacisk moczowodu lewej nerki, UUO (5 samców, 3 samice). Druga grupa kłębuszków została wyizolowana z przeciwległej nerki kontrolnej tego samego szczura, CONT (5 samców, 3 samice). Trzecia grupa kłębuszków została wyizolowana od szczurów SD, u których przeprowadzono operację SHAM; do izolacji kłębuszków po 5 tygodniach wykorzystano lewą nerkę, SHAM (4 samców, 4 samice).

Zmiany morfologiczne
Eksternalizacja niedrożnej nerki w celu obrazowania ujawniła znaczny przerost organu, około czterokrotnie przekraczający normalne rozmiary, z widocznym cienkim nabłonkiem przez wypełnione płynem wnętrze nerki. Przy użyciu obiektywu 20x, oświetlenia epifluorescencyjnego oraz kostki dual-pass FITC/Rhodamine, najbardziej widoczną zmianą było pocienienie nabłonka kanalikowego i jednorodne zapadnięcie się światła kanalików na całej ich długości. Histologia została dobrze opisana i jest nasilona już po jednym tygodniu UUO10,11,12. Liczba kłębuszków widocznych na powierzchni u szczurów MWF i SD wzrosła po pięciu tygodniach jednostronnej obstrukcji moczowodu. Rysunek 1A przedstawia metodę zastosowaną do stworzenia modelu UUO. Prawa nerka pozostaje nienaruszona i zapewnia odpowiedni wskaźnik filtracji kłębuszkowej u szczura. Liczbę kłębuszków w polu widzenia przy użyciu obiektywu 20x (363 µm x 363 µm) policzono i przedstawiono na wykresie na Rysunku 1B. Liczba kłębuszków powierzchniowych u szczurów MWF wzrosła z 1,08 ± 0,11/pole u szczurów nieleczonych do 2,97 ± 0,65/pole w grupie UUO po pięciu tygodniach. U szczurów SD liczba kłębuszków powierzchniowych wzrosła z zera do 2,02 ± 0,37/pole po 5 tygodniach UUO.

Wykonano obrazowanie dwufotonowe in vivo u tych szczurów po wstrzyknięciu TR-RSA (czerwony), dekstranu Cascade Blue o masie 10 kDa (10 kDa-CB) oraz barwnika Hoechst 33342 do znakowania jąder komórkowych (cyjan). Obrazy te przedstawiono dla prawidłowych szczurów MWF (Ryc. 1C), szczurów MWF po pięciu tygodniach UUO (Ryc. 1D) oraz szczurów SD po pięciu tygodniach UUO (Ryc. 1E). Obrazy te uwydatniają gwałtowne zmiany zachodzące w nabłonku cewkowym. Lizosomy kanalików proksymalnych, które u nieleczonych szczurów MWF i SD występują zazwyczaj jako małe, punktowe, pomarańczowe skupiska, przekształcają się w duże, pojedyncze struktury wakuolarne wypełniające większość skurczonej komórki kanalikowej. Jak wynika z obrazowania albuminy TR-RSA, naczynia krwionośne wydawały się wyprostowane, a w wielu z nich brakowało płynących RBC, co wskazywało jedynie na przepływ plazmy. Fixacja nerek wykazała, że kora ścieńczyła się do postaci włóknistej powłoki o grubości nieprzekraczającej jednego milimetra. Obserwacje te są zgodne z wczesną literaturą wykorzystującą ten model3,10,11,12.

Zmiany w dynamice naczyniowej nerek i przepuszczalności kłębuszków
Przepływ krwi nerkowej był znacznie zmniejszony w obu grupach szczurów MWF i SD z pięciotygodniowym UUO w porównaniu do szczurów nieleczonych (Rysunek 2). U szczurów MWF poddanych operacji pozorowanej prędkość przepływu RBC w naczyniach okołokanałkowych wynosiła 885 ± 25 µm/s. Przepływ RBC w naczyniach okołokanałkowych u szczurów MWF i SD z pięciotygodniowym UUO spadł odpowiednio do 250 ± 100 µm/s i 200 ± 125 µm/s. Wartości te obliczono poprzez zbieranie skanów liniowych w poprzek naczyń okołokanałkowych w celu wyznaczenia prędkości RBC. Rysunek 2D przedstawia wykres tych danych.

Prędkość RBC w pętlach naczyń włosowatych kłębuszków była znacznie obniżona u szczurów MWF i SD z pięciotygodniowym UUO w porównaniu do nieleczonych szczurów MWF (Rycina 3). W wielu przypadkach stwierdzono, że pętle naczyń włosowatych kłębuszków były całkowicie pozbawione płynących RBC. Szybkości przepływu RBC w pętlach naczyń włosowatych wynosiły odpowiednio 1 405 ± 425 µm/s, 250 ± 220 µm/s oraz 190 ± 200 µm/s dla nieleczonych szczurów MWF, szczurów MWF z pięciotygodniowym UUO oraz szczurów SD z pięciotygodniowym UUO (Rycina 3D). W pętlach naczyń włosowatych grup z pięciotygodniowym UUO powolny przepływ RBC ujawnił obecność przylegających WBC, które spowalniały lub blokowały przepływ, przy czym poniżej częściowej lub całkowitej niedrożności widoczny był jedynie przepływ plazmy. Aby ilościowo określić to zjawisko, policzono liczbę przylegających WBC w objętości 3D, a następnie znormalizowano ją do występowania na każde 10 µm głębokości objętości 3D. Strukturę przyległych leukocytów można było rozpoznać dzięki fluorescencji cyjanowego barwnika jądrowego Hoechst 33342. Niestety, większe rozproszenie fotonów światła emitującego barwę niebieską ograniczyło wiarygodną identyfikację WBC na podstawie ich jąder do górnych 10 przekrojów optycznych od góry, wykonanych w krokach 1 µm objętości kłębuszka. Nieleczone szczury MWF miały mniej niż 0,125 ± 0,05 WBC / 10 przekrojów optycznych od góry, wykonanych w krokach 1 µm objętości, podczas gdy liczba ta wzrosła do odpowiednio 1,5 ± 0,5 oraz 3,25 ± 0,7 u szczurów MWF i SD z pięciotygodniowym UUO (Rycina 3E).

Inną zmianą naczyniową, która może również wyjaśniać zmniejszony przepływ RBC w grupach UUO po 5 tygodniach, było regularne pojawianie się formacji Rouleaux (zgrupowanych RBC przylegających do siebie w konfiguracji „stosu monet”, patrz wstawka na Rysunku 3F). Formacje Rouleaux płyną wolniej i mogą zostać zatrzymane przez przylegającą WBC. U nieleczonych szczurów WMF w kapilarach kłębuszkowych praktycznie nie występują formacje Rouleaux, odnotowując jedynie 0,05 ± 0,05 wystąpień na 25 przekrojów optycznych od góry, wykonanych w odstępach 1 µm. U szczurów MWF i SD z UUO po pięciu tygodniach odnotowano wyraźny wzrost liczby formacji Rouleaux, odpowiednio 2,27 ± 0,46 i 1,46 ± 0,73 na 25 przekrojów optycznych liczonych od góry, wykonanych w odstępach 1 µm (Rysunek 3F).

Oprócz redukcji szybkości przepływu RBC w kłębuszkach zaobserwowanej przy UUO, odnotowano wzrost przepuszczalności dla albumin. Między kłębuszkami wystąpiła większa heterogeniczność przepuszczalności dla albumin. Sporadycznie akumulacja albumin w przestrzeni Bowmana była na tyle intensywna, że była wyraźnie widoczna (Rysunek 4B, gwiazdka). Kłębuszkowy współczynnik przesiewania albumin wzrósł z 0,015 ± 0,002 w nieleczonych MWFs do 0,045 ± 0,05 w MWF z 5-tygodniowym UUO oraz do 0,052 ± 0,075 u szczurów SD z 5-tygodniowym UUO.

Zmieniona funkcja kanalików bliższych
Co ciekawe, po UUO nie wykryto albumin przefiltrowanych w komórkach kanalików bliższych. Segment S1 normalnie endocytuje duże ilości albuminy27,28,29,30, co pokazano tutaj w warunkach fizjologicznych u nieleczonych szczurów MWF (Rysunek 5A). Tego samego wychwytu nie zaobserwowano w PT szczurów MWF ani SD po 5 tygodniach UUO (Rysunek 5B,C). Kanaliki bliższe otaczające kłębuszki, obrazowane między 45 a 60 min po infuzji TR-RSA, oceniano pod kątem obecności (1) lub braku (0) albuminy. Należy zauważyć, że w warunkach fizjologicznych segment S1 intensywnie wiąże i internalizuje albuminę, przez co do kanalików dalszych lub cewek zbiorczych dociera bardzo mało albuminy lub nie dociera ona wcale. W związku z tym jest oczywiste, że dalsze segmenty kanalików bliższych mogą nie zawierać albuminy, co skutkuje ułamkową dodatniością wychwytu albuminy mniejszą niż 1,0. Rysunek 5D przedstawia wykres z wynikami oceny wychwytu albuminy przez kanaliki bliższe. Nieleczone zwierzęta MWF miały wartość ułamkowego wychwytu w kanalikach bliższych wynoszącą 0,556 ± 0,126. Zarówno szczury MWF, jak i SD po pięciotygodniowym UUO miały znacznie niższe wartości, odpowiednio 0,049 ± 0,126 oraz 0,00 ± 0,00.

Badania przeprowadzono również na szczurach MWF z 12-tygodniowym UUO (Tabela 1). Dwanaście tygodni UUO to standardowy czas stosowany w badaniach na myszach w celu indukowania kłębuszków powierzchniowych. Wykonano obrazowanie u trzech samców szczurów z UUO, przy czym gęstość kłębuszków wzrosła w tych zwierzętach do 6,16 ± 1,83 kłębuszka na pole widzenia 20x. Szybkość przepływu RBC wynosiła 293 ± 67 µm/s, a adhezja WBC 1,47 ± 1,12; obie wartości były zbliżone do danych dla 5-tygodniowego UUO. GSC albuminy również wzrosło w porównaniu ze szczurami z 5-tygodniowym UUO do poziomu 0,109 ± 0,04.

Zmiany mRNA w kłębuszkach indukowane przewlekłym UUO
Tabela 2 przedstawia wszystkie geny (sondy) wraz z ich zgrupowanymi wartościami ekspresji i odchyleniem standardowym. Należy zauważyć, że geny do analizy wybrano na podstawie wcześniejszej dokumentacji dotyczącej zmian w chorobach nerek, w tym UUO, jak opisano w uwadze do sekcji 13 protokołu. Rycina 6 przedstawia mapę ciepła danych, podkreślającą gwałtowne zmiany w ekspresji większości genów w kłębuszkach UUO w porównaniu do kłębuszków kontrolnych lub pozorowanych.

Schemat obrazowania nerek, wykres gęstości kłębuszków i wyniki histologiczne próbek nieleczonych oraz UUO.
Rycina 1: Zwiększenie liczby kłębuszków powierzchniowych i indukcja kłębuszków powierzchniowych u szczurów SD po 5-tygodniowym UUO u szczurów MWF. (A) Schemat chirurgiczny mocznika w lewej nerce, ostrożnie uwolnionego od tętnicy i żyły nerkowej przed zamknięciem za pomocą dwóch wiązań z nici chirurgicznej. (B) Wykres wskazujący wzrost liczby kłębuszków powierzchniowych u szczurów MWF przed i pięć tygodni po UUO, wraz z liczbą kłębuszków powierzchniowych u szczurów SD, które normalnie ich nie posiadają. Liczba kłębuszków powierzchniowych u szczurów MWF wzrosła z 1,08 ± 0,11/pole u szczurów nieleczonych do 2,97 ± 0,65/pole w grupie 5-tygodniowego UUO. Szczury SD przeszły od braku kłębuszków powierzchniowych do 2,02 ± 0,37/pole. Obrazy zrekonstruowane trójwymiarowo przedstawiają powierzchnię nerki dla nieleczonych MWF (C), MWF po 5-tygodniowym UUO (D) oraz SD po pięciotygodniowym UUO (E). Zauważalne jest pojawienie się dużych, pomarańczowych struktur wakuolarnych, które zlały się z małych, pojedynczych lizosomów w duże, nieprawidłowe ciała. 5-tygodniowe UUO u szczurów SD nie doprowadziło do powstania obszarów przypominających normalny nabłonek kanalikowy widoczny w C i częściowo w D. Unaczynienie wydawało się wyprostowane w niektórych regionach, a w wielu występowały częściowe niedrożności, które pozwalały na przepływ plazmy, ale nie RBCs. (n = 3 samce szczurów na grupę) Paski skali = 40 µm. Słupki błędu oznaczają odchylenie standardowe. Skróty: UUO = jednostronne zablokowanie mocznika; SD = Sprague-Dawley; MWF = Munich Wistar Frömter; G = kłębuszek; RBCs = czerwone krwinki. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Mikroskopia mikrokrążenia nerek, analiza przepływu RBC, efekty UUO, porównanie na wykresie słupkowym.
Rycina 2: Zmniejszenie przepływu RBC w naczyniach okołokanalikowych warstwy powierzchownej po 5-tygodniowym UUO. Skanowanie liniowe przeprowadzono w naczyniach krwionośnych okołokanalikowych w celu określenia prędkości przepływu RBC w µm/s. W skrócie, czerwone linie referencyjne pokazane na A, B i C reprezentują niewielki obszar, w którym ten sam obszar o szerokości jednego piksela był wielokrotnie skanowany, a obrazy ułożone w kolumnie, aby zwizualizować zniekształcenie spowodowane przepływającymi RBC, które poruszają się szybciej, niż mikroskop jest w stanie je rejestrować. Kolumna sąsiadująca z figurą referencyjną to skan liniowy, w którym nachylenie zniekształcenia RBC służy do obliczenia prędkości (oś x = odległość, oś y = czas). W tym przypadku progresywnie bardziej strome nachylenia odpowiadają mniejszym prędkościom RBC, ponieważ dłużej pozostają one w obszarze skanu liniowego. Należy zwrócić uwagę na różnicę w wyglądzie RBC u nieleczonych szczurów MWF (A) w porównaniu z obrazami po pięciu tygodniach UUO u szczurów MWF (B) i SD (C). Prędkości przepływu RBC dla trzech grup szczurów przedstawiono na D. Przepływ RBC okołokanalikowych u nieleczonych MWF wynosił średnio 885 ± µm/s. Wartości te spadły znacząco pięć tygodni po UUO u szczurów MWF i SD do odpowiednio 250 ± 100 µm/s i 200 ± 125 µm/s. Pasek skali = 20 µm, n = 3 samce szczurów na grupę. Słupki błędów oznaczają odchylenie standardowe. Skróty: UUO = jednostronna obstrukcja moczowodu; SD = Sprague-Dawley; MWF = Munich Wistar Frömter; RBC = erytrocyt; WBC = leukocyt. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Histologia nerek i schemat blokowy przepływu RBC porównujący MWF i SD przy 5-tygodniowym UUO; analiza za pomocą mikroskopii optycznej.
Rycina 3: Znacząca redukcja przepływu RBC w pętlach kapilar kłębuszkowych i indukowana aktywacja adhezji WBC w wyniku 5-tygodniowego UUO. Do zbadania zmian w przepływie krwi w kapilarach kłębuszkowych zastosowano to samo podejście z wykorzystaniem skanowania liniowego (linescan), które posłużyło do określenia przepływu RBC okołokanałkowego. Panele A, B i C przedstawiają układ podobny do Ryciny 2 i koncentrują się odpowiednio na kłębuszku u szczura MWF z grupy kontrolnej (sham), szczura MWF z 5-tygodniowym UUO oraz szczura SD z 5-tygodniowym UUO. (D) Wykres wykazujący fizjologicznie wysoką prędkość przepływu RBC w pętlach kapilarnych u szczurów MWF z grupy kontrolnej, wynoszącą średnio 1 405 ± 425 µm/s, która spadła do 250 ± 220 µm/s oraz 190 ± 200 µm/s odpowiednio dla szczurów MWF i SD z 5-tygodniowym UUO. Podczas badania pętli kapilarnych kłębuszka, podczas ostrzenia w obrębie kłębuszka, wyraźnie widoczne były przylegające WBC. Wykonano trójwymiarowe przekroje optyczne poszczególnych kłębuszków, a do pomiaru liczby przylegających WBC wykorzystano pierwsze 10 przekrojów optycznych, oddalonych od siebie o 1 µm. U nieleczonych szczurów MWF w ich objętości praktycznie nie stwierdzono widocznych WBC, średnio poniżej 0,125 ± 0,05 WBC/10 przekrojów optycznych od góry, wykonanych w krokach 1 µm. U szczurów MWF i SD z 5-tygodniowym UUO wartości te wzrosły odpowiednio do 1,5 ± 0,5 oraz 3,25 ± 0,7 WBC/10 przekrojów optycznych od góry, wykonanych w krokach 1 µm. Wyniki te przedstawiono na wykresie w panelu E, a kolorowe wstawki pokazują WBC zamykające pętle kapilarne. Formacje rouleaux (strzałki, wstawka w panelu F) przejawiają się jako RBC ściśle związane ze sobą w konfiguracji „stosu monet”, które w dużej mierze zachowują to zgrupowanie nawet w turbulentnym przepływie krwi. Struktury patologiczne te były łatwo dostrzegalne na większych głębokościach w obrębie kłębuszka. U szczurów MWF z grupy kontrolnej struktury te niemal nie występowały, odnotowano jedynie 0,05 ± 0,05 wystąpień na 25 przekrojów optycznych od góry, wykonanych w krokach 1 µm objętości kłębuszka. W przeciwieństwie do nich, w przypadku 5-tygodniowego UUO u szczurów MWF i SD odnotowano wyraźny wzrost formacji rouleaux, z liczbą wystąpień odpowiednio 2,27 ± 0,46 oraz 1,46 ± 0,73 / 25 przekrojów optycznych od góry, wykonanych w krokach 1 µm. Paski skali = 20 µm, n = 3 samce szczurów na grupę. Słupki błędów oznaczają odchylenie standardowe. Skróty: UUO = jednostronna obstrukcja moczowodu; SD = Sprague-Dawley; MWF = Munich Wistar Frömter; RBC = erytrocyt; WBC = leukocyt. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej wraz z wykresem analizującym poziom albuminy w próbkach nerek.
Rysunek 4: Znaczący wzrost przepuszczalności albuminy w kapilarach kłębuszkowych po 5-tygodniowym UUO. Panele A, B oraz C przedstawiają obrazy w pseudokolorach objętości 3D dla kanału albuminy surowicy szczurzej odpowiednio u nieleczonych szczurów MWF, szczurów MWF po 5-tygodniowym UUO oraz szczurów SD po pięciotygodniowym UUO. Obrazy zaprezentowano w palecie pseudokolorów, aby podkreślić znaczną ilość przefiltrowanej albuminy widocznej w przestrzeni Bowmana, szczególnie w panelu B (gwiazdka). (A) Przestrzeń Bowmana (gwiazdka) wykazuje normalny poziom albuminy typowy dla nieleczonych szczurów MWF, nierozpoznawalny dla oka. Obrazy kłębuszków wykonano przed infuzją albuminy, aby odjąć wartości fluorescencji tła od wartości uzyskanych po podaniu albuminy. (D) Wykres przedstawiający współczynnik przesiewania kłębuszkowego dla albuminy u nieleczonych szczurów MWF, który wynosi 0,015 ± 0,002. Wartość ta wzrosła znacząco do 0,045± 0,05 u szczurów MWF po 5-tygodniowym UUO oraz do 0,052 ± 0,075 u szczurów SD po pięciotygodniowym UUO. Parametr ten jest wartością stosunku intensywności fluorescencji w przestrzeni Bowmana do wartości w osoczu i nie posiada przypisanej jednostki miary. Pasek skali = 20 µm, n = 3 samce szczurów na grupę. Skala intensywności pseudokolorów znajduje się poniżej panelu D. Słupki błędu oznaczają odchylenie standardowe. Skróty: UUO = jednostronna niedrożność moczowodu; SD = Sprague-Dawley; MWF = Munich Wistar Frömter; RBC = erytrocyt; WBC = leukocyt. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Porównanie histologii nerek; szczury MWF nieleczone, obrazy po 5-tygodniowym UUO; wykres poziomu albuminy w kanalikach.
Rycina 5: Zmniejszona funkcja kanalików proksymalnych po 5-tygodniowym UUO. (A) Obraz kłębuszka powierzchownego i segmentu S1 od normalnego szczura Munich Wistar Frömter wykonany 40 min po infuzji TR-RSA i dekstranu Cascade Blue. Internali zację TR-RSA można zaobserwować w segmencie S1 i kanaliku proksymalnym. W wyraźnym kontraście szczury MWF (B) oraz szczury SD (C) poddane 5-tygodniowemu UUO wykazują silnie zmienione kanaliki proksymalne z minimalnym lub brakiem wychwytu TR-RSA. Normalnie małe, punktowe autofluorescencyjne lizosomy (A) stają się dużymi, wakuolarnymi strukturami żółto-pomarańczowymi, często z całkowitym zapadnięciem się światła kanalika, czego nie można znaleźć w trójwymiarowych zestawach danych. (C) Kanaliki dystalne, normalnie pozbawione jakiejkolwiek formy autofluorescencji, zawierają teraz złogi autofluorescencyjne. Ocena wychwytu albuminy w kanalikach proksymalnych otaczających kłębuszki na podobnych obrazach wykonanych 45-60 min po infuzji wykazała istotną różnicę między grupą MWF poddaną operacji pozorowanej a obiema grupami z 5-tygodniowym UUO. Nieleczone szczury MWF miały wartość frakcyjnego wychwytu w kanalikach proksymalnych wynoszącą 0,556 ± 0,126. Zarówno szczury MWF, jak i SD po pięciotygodniowym UUO miały istotnie niższe wartości, odpowiednio 0,049 ± 0,126 i 0,00 ±0,00. Pasek skali = 20 µm, n = 3 samce szczurów na grupę. Słupki błędów oznaczają odchylenie standardowe. Skróty: UUO = jednostronna niedrożność moczowodu; SD = Sprague-Dawley; MWF = Munich Wistar Frömter; RBC = erytrocyt; WBC = leukocyt; TR-RSA = albuminy surowicy szczura znakowana Texas Red. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Analiza ekspresji genów w nerkach, wartości log2; wykres i mapa ciepła; warunki CONT, SHAM, UUO.
Rysunek 6: Zmiany w ekspresji genów przy UUO. (A) Mapa ciepła danych. (B) Znormalizowane zmiany ekspresji genów dla wszystkich danych na wykresie rozrzutu. Ekspresję genów w nerkach kontrolnych przedstawiono od niskiej do wysokiej, a geny z nerek w grupach SHAM i UUO porównano z poziomami ekspresji kontrolnej. Punkty danych genów znajdujące się blisko przekątnej genów kontrolnych wskazują na podobne poziomy ekspresji w obu grupach, natomiast punkty powyżej lub poniżej przekątnej wskazują odpowiednio na wyższy lub niższy poziom ekspresji. Należy zauważyć, że geny z grupy SHAM grupują się bliżej przekątnej ekspresji kontrolnej niż geny z grupy UUO, które wykazują większą zmienność. Skrót: UUO = jednostronna obstrukcja moczowodu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Tabela 1: Postęp uszkodzenia od 5. do 12. tygodnia UUO. Porównanie parametrów obrazowania UUO w 5. i 12. tygodniu u trzech samców szczurów MWF oraz trzech samców szczurów SD w każdym punkcie czasowym. Dane z piątego tygodnia są takie same jak na poprzednich rycinach. Należy zwrócić uwagę na wzrost gęstości kłębuszków oraz GSC dla albuminy przy kontynuacji UUO. Skróty: UUO = jednostronna obstrukcja moczowodu; SD = Sprague-Dawley; MWF = Munich Wistar Frömter; GSC = współczynnik przesączania kłębuszkowego. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 2: Analiza markerów stanu zapalnego w kłębuszkach nerkowych szczurów z UUO i grupy kontrolnej. Pary sond genowych oraz CodeSets zostały zaprojektowane i wykorzystane zgodnie z wytycznymi firmy NanoString. Przeanalizowano ponad 100 genów oraz kontrole pozytywne i negatywne zgodnie ze specyfikacją Nanostring. W tabeli przedstawiono wszystkie geny (sondy) wraz z ich zgrupowanymi wartościami ekspresji i wartościami SD. Rysunek 6A przedstawia mapę ciepła tych danych, natomiast Rysunek 6B prezentuje zmiany ekspresji genów dla wszystkich danych na wykresie rozrzutu. Należy zwrócić uwagę na podobieństwa między grupami kontrolną i SHAM oraz wyraźne zmiany dla większości genów w grupie UUO. Skróty: UUO = jednostronne zatorowe zwężenie moczowodu; SD = odchylenie standardowe. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Dyskusja

W badaniach nad fizjologią kłębuszków nerkowych zastosowano wiele różnych podejść, w szczególności zastosowanie mikronakłucia, perfuzji izolowanych kłębuszków nerkowych i mikroskopii. Dostępność kłębuszków powierzchniowych u monachijskich szczurów Wistar, szczepów Fromter i Simonsen, pozwoliła na dynamiczne badania in vivo . Jedną z ważnych uwag dla badaczy stosujących tę technologię jest konieczność ustawienia parametrów akwizycji w celu utrzymania spójnych obrazów między badaniami, tak aby autofluorescencja w tkance pozostała spójna. Wykorzystanie dwuprzebiegowej kostki epifluorescencji fluoresceiny/rodaminy i dostosowanie ustawień wzmocnienia do kanałów emisji zielonej i czerwonej w celu naśladowania na ekranie komputera tego, co jest widziane przez okulary, zapewni spójną sygnaturę kolorów w autofluorescencji nawet między różnymi systemami mikroskopowymi.

Szczep Fromter był szeroko stosowany, ponieważ ma zmniejszoną całkowitą liczbę kłębuszków nerkowych, ~ 75% normalnie, a samce spontanicznie rozwijają nadciśnienie w wieku około 12 tygodni, z postępującym białkomoczem i następnie ogniskowym stwardnieniem kłębuszków nerkowych, ostatecznie umierając z powodu niewydolności nerek12. Wykorzystanie tych szczurów i dodanie mikroskopii 2-fotonowej o zmniejszonej fototoksyczności, zwiększonej głębokości penetracji i możliwości jednoczesnego oglądania wielu sond fluorescencyjnychutorowało drogę do nowych odkryć 1,4,5. Wraz z rozwojem sprzętu komputerowego i oprogramowania, dane ilościowe są obecnie standardem we wszystkich laboratoriach 2-fotonowych. Opracowano wiele technik ilościowych i zastosowano je do kanalików kłębuszkowych, kanalików proksymalnych, procesów naczyniowych i śródmiąższowych w warunkach fizjologicznych i chorobowych 1,4,5,27,28,29,30.

Urządzenia do wytwarzania myszy transgenicznych nadały nowy wymiar badaniom nad fizjologią i patologią nerek i było tylko kwestią czasu, aż zostanie to połączone z mikroskopią 2-fotonową, aby jeszcze bardziej nakreślić znaczenie określonych produktów genowych w strukturze i funkcji nerek. Jednak kłębuszki mysie, z wyjątkiem bardzo młodych myszy, znajdują się ponad 100 μm od powierzchni nerki9. Mikroskopię dwufotonową najlepiej przeprowadza się na głębokości od 20 do 50 μm w rozdzielczości, a intensywność fluorescencji szybko spada z powodu rozpraszania emitowanego światła i absorpcji w wyniku interakcji z hemoglobiną. W związku z tym konieczne było wywołanie kłębuszków nerkowych. Powszechnie stosowanym podejściem jest model przedłużonej jednostronnej obturacji przez 12 tygodni. Ponieważ modele te nie pozwalają na określenie linii bazowej, oddzielenie skutków UUO od badanego procesu nie jest możliwe.

Korzystając ze szczurów MWF, można porównać wyjściową funkcję kłębuszków nerkowych z następującą po UUO. Wiadomo, że ten model UUO wywołuje stan zapalny i szybkie tempo zwłóknienia i był używany do badania PChN i zwłóknienia 10,11,12. Zgodnie z oczekiwaniami nastąpił wzrost liczby kłębuszków nerkowych zarówno u szczurów MWF, jak i SD. Co więcej, wyniki ilościowe uzyskane po UUO dla szczurów MWF i SD były bardzo porównywalne. Odnotowane tutaj zmniejszenie przepływu krwi zostało wcześniej zgłoszone, porównując dane mikroskopowe po UUO z danymi z mikronakłucia3. Wiadomo było również, że histologia kanalików i śródmiąższu jest znacznie zmieniona, a PT są w większości niefunkcjonalne, jak opisano tutaj, z brakiem endocytozy albuminowej. Badania na rycinie 2 i rycinie 3 wykazują dramatyczne zmniejszenie natężenia przepływu krwinek czerwonych w naczyniach włosowatych kłębuszkowych i okołokanalikowych oraz zwiększoną adhezję WBC. Zmniejszenie przepływu jest prawdopodobnie spowodowane zablokowaniem naczyń włosowatych przez adhezję WBC i formacje rouleaux.

Aby dokładniej ocenić stan zapalny, określiliśmy ilościowo przepuszczalność albumin i wykazaliśmy, że wzrasta ona dziesięciokrotnie. Ponadto izolowane kłębuszki wykazały, że ekspresja mRNA wzrosła w przypadku wielu genów, o których wcześniej wiadomo, że są zwiększone w zapaleniu nerek w różnych stanach chorobowychnerek 17,19,20,21,22,23,24,25,26 . Wzrost gęstości powierzchni kłębuszków nerkowych i przepuszczalności albumin był postępujący, jak wykazano w 12-tygodniowych danych UUO. Obecne dane są pierwszymi, które bezpośrednio pokazują, że kłębuszki ulegają znacznym uszkodzeniom strukturalnym, stanom zapalnym i zmianom molekularnym w modelu UUO. Wyniki są zgodne z wcześniejszym badaniem całej tkanki nerkowej, w którym analizowano biopsje nerek owiec po UUO, stwierdzając, że wiele markerów stanu zapalnego jest podwyższonychdo 19. Obecne wyniki wskazują, że w kłębuszkach nerkowych występuje wyraźny stan zapalny, wcześniej znany tylko z tkanki korowej.

Obecne dane różnią się od wcześniejszych badań na myszach, w których nie stwierdzono zmian w ekspresji cząsteczek adhezyjnych, osadzaniu się dopełniacza i infiltracji neutrofili między 12-tygodniowymi kłębuszkami nerkowymi a normalnymi31. Ponadto laboratorium Hickeya wykorzystało 12-tygodniowy model UUO do zbadania reakcji immunologicznych w kłębuszkach nerkowych myszy. Nie znaleźli różnic w nacieku neutrofili między czterotygodniowymi kłębuszkami mysi a kłębuszkami poturacyjnymi32,33. Te późniejsze badania przeprowadzono po tym, jak miednica niedrożnej nerki została odtworzona z moczu. Nie zrobiliśmy tego, ponieważ chcieliśmy określić wpływ UUO na funkcję kłębuszków nerkowych, tak jak to byłoby in vivo, bez sztucznego usuwania płynu powodującego niedrożność. Wreszcie, zastosowanie UUO u myszy jest zastępowane obrazowaniem kłębuszków nerkowych na głębokości większej niż 100 μm pod powierzchnią. Chociaż jest to możliwe, istnieje kompromis między rozdzielczością a intensywnością, przy czym obie te wartości ulegają znacznemu zmniejszeniu po przekroczeniu 50 μm34.

Przedstawione wyniki nie są zaskakujące, jeśli zestawi się dane z istniejącej literatury na temat zmian histologicznych, powstawania kłębuszków jajowych, stanów zapalnych, zwłóknień, hemodynamiki 10,11,12. Przedstawione dane, w tym adhezja WBC, formacje rouleaux, molekularne markery zapalenia kłębuszków nerkowych i zwiększona przepuszczalność albumin, dodatkowo wskazują na rozległy stan zapalny, który trwa w tym modelu UUO nawet po pięciu tygodniach, a także po dwunastu tygodniach. Oczywiste jest, że przewlekłe UUO nie jest stanem fizjologicznym, a użycie UUO do indukowania kłębuszków nerkowych na powierzchni stanowi model urazu. Szczury MWF, które mają kłębuszki powierzchniowe w warunkach fizjologicznych, mogą być badane podłużnie w miarę wystąpienia urazu. Możliwe jest generowanie transgenicznych szczurów, a wielu badaczy tworzy je za pomocą bioczujników, aby zadawać konkretne pytania. W szczególności Medical College of Wisconsin ma obecnie kolonię szczurów MWF i stworzył transgeniczne szczury w celu badania procesów kłębuszkowych w warunkach fizjologicznych i patologicznych. Te szczury MWF oferują doskonałą okazję do badania procesów kłębuszkowych u normalnych, chorych i genetycznie zmienionych szczurów.

Oświadczenia

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases Grants RO1DK091623 i P30DK079312 (dla B.A.M.). Dziękujemy personelowi Genomics Core Facility of the Research Technology Support Facility (RTSF) na Uniwersytecie Stanowym Michigan za przeprowadzenie analizy nanostrun.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
70 &mikro; m sterylny sitko komórkoweCorning#421751
100 µ m sterylne sitko do komórekCorning#421752
CA Mikronożyczki Model 1C300Mikroskopia elektronowa NaukiKat# 72930
Elektryczna poduszka grzewczaSunbeamKroger
Kleszcze manipulacyjneMikroskopia elektronowaNauki Kat# 72962
Kleszcze hemostatyczne Kelly (proste)Nauki o mikroskopii elektronowejKot#72930
Leica Dive SP-8 Wielofotonowy mikroskop odwróconyLeica MicrosystemsUwaga: Wersja 7.1r1
MaiTai DeepSee laser tytanowo-szafirowySpectra-PhysicsNA
Mayo Nożyczki preparacyjneMikroskopia elektronowaNauki Kat# 78180-1C3
Oprogramowanie do przetwarzania obrazów metamorficznychDynamika molekularnaNr kat.# 78266-04
Microsoft ExcelMicrosoft Corportation2007 wersja
Quant-iT Zestaw do oznaczania RNAInvitrogen/ThermoFisherQ33140
Podgrzewacz podzbiornika ReptithermZoomedAmazon
RNeasy MinElute Cleanup Kit (kolumny spinowe)Qiagen74204
Bufor RPEQiagen1018013
Taśma autoklawu Strate-LineFisher ScientificCat# 11-889-1
Odczynnik TRISigmaT9424
Naczynia nakrywkowe Willco-dish Bottoms (50 mm/40 mm szkiełko nakrywkowe)Nauki o mikroskopii elektronowejCat# 70665-07

Bibliografia

  1. Dunn, K. W., Molitoris, B. A., Dagher, P. C. The Indiana O'Brien center for advanced renal microscopic analysis. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 320 (5), 671-682 (2021).
  2. Dunn, K. W., et al. Functional studies of the kidney of living animals using multicolor two-photon microscopy. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 283 (3), 905-916 (2002).
  3. Eisenbach, G., Liew, J., Boylan, J., Manz, N., Muir, P. Effect of angiotensin on the filtration of protein in the rat kidney: a micropuncture study. Kidney International. 8 (2), 80-87 (1975).
  4. Sandoval, R. M., Molitoris, B. A. Intravital multiphoton microscopy as a tool for studying renal physiology and pathophysiology. Methods. 128, 20-32 (2017).
  5. Sandoval, R. M., Molitoris, B. A., Palygin, O. Fluorescent imaging and microscopy for dynamic processes in rats. Methods in Molecular Biology. 2018, 151-175 (2019).
  6. Huber, T., et al. Molecular basis of the functional podocin-nephrin complex: mutations in the NPHS2 gene disrupt nephrin targeting to lipid raft microdomains. Human Molecular Genetics. 12 (24), 3397-3405 (2003).
  7. Kawachi, H., Koike, H., Kurihara, H., Sakai, T., Shimizu, F. Cloning of rat homologue of podocin: expression in proteinuric states and in developing glomeruli. Journal of the American Society of Nephrology JASN. 14 (1), 46-56 (2003).
  8. Roselli, S., et al. Early glomerular filtration defect and severe renal disease in podocin-deficient mice. Molecular and Cellular Biology. 24 (2), 550-560 (2004).
  9. Schießl, I., Bardehle, S., Castrop, H. Superficial nephrons in BALB/c and C57BL/6 mice facilitate in vivo multiphoton microscopy of the kidney. PloS One. 8 (1), 52499(2013).
  10. Chevalier, R., Forbes, M., Thornhill, B. Ureteral obstruction as a model of renal interstitial fibrosis and obstructive nephropathy. Kidney International. 75 (11), 1145-1152 (2009).
  11. Forbes, M., Thornhill, B., Chevalier, R. Proximal tubular injury and rapid formation of atubular glomeruli in mice with unilateral ureteral obstruction: a new look at an old model. American Journal of Physiology. Renal physiology. 301 (1), 110-117 (2011).
  12. Yang, H. -C., Zuo, Y., Fogo, A. B. Models of chronic kidney disease. Drug Discovery Today. Disease Models. 7 (1-2), 13-19 (2010).
  13. Hackl, M. J., et al. Tracking the fate of glomerular epithelial cells in vivo using serial multiphoton imaging in new mouse models with fluorescent lineage tags. Nature Medicine. 19 (12), 1661-1666 (2013).
  14. Kitching, A., Kuligowski, M., Hickey, M. In vivo imaging of leukocyte recruitment to glomeruli in mice using intravital microscopy. Methods in Molecular Biology. 466, 109-117 (2009).
  15. Savin, V. J., Terreros, D. A. Filtration in single isolated mammalian glomeruli. Kidney International. 20 (2), 188-197 (1981).
  16. Chomczynski, P., Sacchi, N. The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction: twenty-something years on. Nature Protocols. 1 (2), 581-585 (2006).
  17. El Karoui, K., et al. Endoplasmic reticulum stress drives proteinuria-induced kidney lesions via Lipocalin 2. Nature Communications. 7, 10330(2016).
  18. VA, M., et al. Multiplexed measurements of gene signatures in different analytes using the Nanostring nCounter Assay System. BMC Research Notes. 2, 80(2009).
  19. Springer, A., et al. A combined transcriptome and bioinformatics approach to unilateral ureteral obstructive uropathy in the fetal sheep model. The Journal of Urology. 187 (2), 751-756 (2012).
  20. Braun, F., Becker, J., Brinkkoetter, P. Live or let die: Is there any cell death in podocytes. Seminars in Nephrology. 36 (3), 208-219 (2016).
  21. Kim, W. The role of angiopoietin-1 in kidney disease. Electrolyte & Blood Pressure E & BP. 6 (1), 22-26 (2008).
  22. Liu, F., Zhuang, S. Role of receptor tyrosine kinase signaling in renal fibrosis. International Journal of Molecular Sciences. 17 (5), 972(2016).
  23. Martini, S., et al. Integrative biology identifies shared transcriptional networks in CKD. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 25 (11), 2559-2572 (2014).
  24. Mühlberger, I., et al. Integrative bioinformatics analysis of proteins associated with the cardiorenal syndrome. International Journal of Nephrology. 2011, 809378(2010).
  25. Satirapoj, B., et al. Periostin: novel tissue and urinary biomarker of progressive renal injury induces a coordinated mesenchymal phenotype in tubular cells. Nephrology, Dialysis, Transplantation. 27 (7), 2702-2711 (2012).
  26. Fengxin, Z., et al. Numb contributes to renal fibrosis by promoting tubular epithelial cell cycle arrest at G2/M. Oncotarget. 7 (18), 25604-25619 (2016).
  27. Sandoval, R. M., Molitoris, B. A. Quantifying glomerular permeability of fluorescent macromolecules using 2-photon microscopy in Munich Wistar rats. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (74), e50052(2013).
  28. Russo, L. M., et al. Impaired tubular uptake explains albuminuria in early diabetic nephropathy. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 20 (3), 489-494 (2009).
  29. Russo, L. M., et al. The normal kidney filters nephrotic levels of albumin retrieved by proximal tubule cells: retrieval is disrupted in nephrotic states. Kidney International. 71 (6), 504-513 (2007).
  30. Sandoval, R. M., Wang, E., Molitoris, B. A. Finding the bottom and using it: Offsets and sensitivity in the detection of low intensity values in vivo with 2-photon microscopy. Intravital. 2 (1), 23674(2014).
  31. Kuligowski, M. P., Kitching, A. R., Hickey, M. J. Leukocyte recruitment to the inflamed glomerulus: a critical role for platelet-derived P-selectin in the absence of rolling. Journal of Immunology. 176 (11), 6991-6999 (2006).
  32. Devi, S., et al. Multiphoton imaging reveals a new leukocyte recruitment paradigm in the glomerulus. Nature Medicine. 19 (1), 107-112 (2013).
  33. Finsterbusch, M., et al. Patrolling monocytes promote intravascular neutrophil activation and glomerular injury in the acutely inflamed glomerulus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (35), 5172-5181 (2016).
  34. Shroff, U. N., Gyarmati, G., Izuhara, A., Deepak, S., Peti-Peterdi, J. A new view of macula densa cell protein synthesis. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 321 (6), 689-704 (2021).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Mikroskopia dwufotonowakłębki nerkowe powierzchnioweprzepływ w naczyniach kapilarnych kłębkówprzepuszczalność dla albuminymikrokrążenie nerekobrazowanie intravitalneszczury Munich Wistarfluorescencyjna albumina
Wykorzystanie mikroskopii 2-fotonowej do ilościowego określenia wpływu przewlekłej jednostronnej niedrożności moczowodu na procesy kłębuszkowe
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.