Artykuł metodologiczny

Wizualizacja zmian w obwodzie neuron-glej za pomocą techniki obrazowania wapnia

4.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63338

⸱

8 kwietnia 2022

 ,  ,  , 
1Laboratory of Neurochemistry, Institute of Biophysics Carlos Chagas Filho, Universidade Federal do Rio de Janeiro, 2Laboratory of Neuroenergetics and Inborn Errors of Metabolism, Institute of Medical Biochemistry Leopoldo de Meis, Universidade Federal do Rio de Janeiro, 3Laboratory of Neurochemistry and Cell Biology, Institute of Life Sciences, Universidade Federal da Bahia

W tym artykule

Podsumowanie

Obrazowanie wapnia w komórkach jest wszechstronną metodologią do badania dynamicznej sygnalizacji pojedynczych komórek, na mieszanych populacjach w kulturze, a nawet na przebudzonych zwierzętach, w oparciu o ekspresję przepuszczalnych dla wapnia kanałów/receptorów, które dają unikalne sygnatury funkcjonalne.

Streszczenie

Tutaj opisujemy selektywne modele in vitro obwodów opartych na gleju (astrocyty, oligodendrocyty i mikroglej) i/lub neuronach z tkanek obwodowych (zwoje korzenia grzbietowego) i centralnych (kora, strefa podkomorowa, organoid), które są dynamicznie badane pod kątem przesunięć wapnia. Modelem wybranym do zilustrowania wyników jest siatkówka, prosta tkanka ze złożonymi interakcjami komórkowymi. Wapń jest uniwersalnym przekaźnikiem zaangażowanym w większość ważnych ról komórkowych. Wyjaśniamy krok po kroku, w jaki sposób można przygotować i ocenić komórki neuronalno-glejowe siatkówki w hodowli, przewidując zmiany wapnia. W tym modelu różnicujemy neurony z gleju na podstawie ich selektywnej odpowiedzi na KCl i ATP. Receptory i kanały przepuszczalne dla wapnia ulegają selektywnej ekspresji w różnych przedziałach. Do analizy odpowiedzi wapnia używamy ratiometrycznych matryc fluorescencyjnych, takich jak Fura-2. Sonda ta określa ilościowo stężenie wolnego Ca2+ w oparciu o formy wolne od Ca2+ i związane z Ca2+, prezentując dwa różne piki, oparte na intensywności fluorescencji postrzeganej na dwóch długościach fal.

Wprowadzenie

Ze względu na uniwersalne właściwości wapnia jako drugiego posłańca, jon ten bierze udział w ogromnej liczbie działań sygnalizacyjnych: transkrypcji genów, narodzin i śmierci, proliferacji, migracji i różnicowania, transmisji synaptycznej i plastyczności. W związku z tym metoda zdolna do śledzenia dynamiki aktywacji wapnia z dokładnością i zwinnością zapewniłaby sposób na obserwację unikalnych reakcji przestrzenno-czasowych. Taką metodą jest technika obrazowania wapnia komórkowego, która koreluje dane funkcjonalne dotyczące przesunięć wapnia z określonymi fenotypami komórek w oparciu o ich odrębne odpowiedzi.

Ca2+ sondy zostały po raz pierwszy opracowane w latach 80-tych, z późniejszymi ulepszeniami pozwalającymi na wykorzystanie tych cząsteczek w testach na żywych komórkach1. Jako wskaźnik chemiczny Fura-2 jest uważany za standard dla pomiarów ilościowych [Ca2+]i. Ester acetoksymetylowy (AM) tego wskaźnika (tj. Fura-2 AM) łatwo przenika przez błonę komórkową i może osiągnąć stężenia wewnątrzkomórkowe 20-krotnie większe niż rozcieńczenie inkubacyjne (np. [5 μM]o/[100 μM]i). Kolejną zaletą Fura-2 jest to, że ma dobrą odporność na fotowybielanie; Tak więc obrazowanie tego wskaźnika przez dłuższy czas nie wpłynie znacząco na jego zdolności fluorescencyjne. Wreszcie, Fura-2 jest wrażliwa na szeroki zakres poziomów wapnia, od ~100 nM do ~100 μM, i ma Kd ~145 nM, co jest porównywalne z spoczynkową [Ca2+]i2. Później opracowano obrazowanie wapnia w komórkach przy użyciu lepszych mikroskopów fluorescencyjnych i metod obliczeniowych, a także sond ratiometrycznych, na które nie ma wpływu obciążenie barwnikiem.

Każda komórka wyraża różne urządzenia wapniowe (pompy, transportery, receptory i kanały), które przyczyniają się do końcowej odpowiedzi jako szczególna sygnatura. Ważną wskazówką jest znalezienie selektywnych odpowiedzi różnych typów komórek skorelowanych z ich ekspresją fenotypową. W związku z tym istnieją co najmniej dwa różne receptory, które działają poprzez przesunięcia wapnia: receptory jonotropowe, które przenikają Ca2 + w trybie szybkim i powolne receptory metabotropowe sprzężone ze szlakami sygnałowymi i zapasy wewnątrzkomórkowe, które uwalniają Ca2 + aktywowane przez drugie przekaźniki, takie jak trifosforan inozytolu i cykliczna ADP-ryboza3.

Na przykład, komórki progenitorowe wyrażają gniazdo w niedojrzałej siatkówce i wykazują receptoryGABA A zdepolaryzowane przez GABA (lub muscymol)4. Dzieje się tak z powodu gradientu elektrochemicznego Cl- z wysokimi wewnątrzkomórkowymi poziomami Cl−; w miarę rozwoju tkanki transportery KCC2 przełączają się z pobudzenia na progenitorach na hamowanie na dojrzałych neuronach GABAergicznych5. Z drugiej strony, komórki macierzyste, które wyrażają sox-2 w niedojrzałej strefie podkomorowej (SVZ) gryzoni po urodzeniu, wykazują również metabotropowe receptory H1 aktywowane przez histaminę, zwiększając Ca2+ w powolny sposób6. Drugi receptor metabotropowy z rodziny receptorów aktywowanych proteazą-1 (PAR-1), aktywowany przez trombinę i w dół do G (q / 11) i fosfolipazy C (PLC), powoduje powolne przesunięcia Ca2 + w oligodendrocytach (które wyrażają O4 i PLP) generowanych z multipotencjalnych nerwowych komórek macierzystych SVZ7.

Ogólnie, neurony wyrażają zależne od napięcia kanały wapniowe, jak również główne receptory neuroprzekaźników przepuszczalne dla Ca2+, takie jak receptory glutaminergiczne (AMPA, NMDA, kainian) oraz obwodowe i ośrodkowe receptory nikotynowe. Chlorek potasu jest zwykle stosowany jako środek depolaryzujący do aktywacji neuronów obwodowych, takich jak neurony zwoju korzenia grzbietowego8 lub neurony centralne, jak ze strefy podkomorowej9 lub retina10. Z drugiej strony, ATP jest uznawany za główny przekaźnik glejowy (oprócz D-seryny), który aktywuje selektywne przepuszczalne dla Ca2+ składniki P2X, takie jak P2X7 i P2X4. Oba receptory prezentują równoważne prądy Ca2+, podobne do tych wykazywanych przez receptory NMDA uznane za największe prądy Ca2+ aktywowane przez nadajniki11. Receptory P2X7 są silnie eksprymowane na mikrogleju, ale w mniejszej gęstości na astrocytach i oligodendrocytach, odgrywając rolę w uwalnianiu cytokin prozapalnych12. Receptory P2X7 ulegają również ekspresji na komórkach Schwanna13 i gleju Müllera w siatkówce14,15.

Siatkówka znana jest z tego, że pokazuje prawie wszystkie przekaźniki widoczne w mózgu. Na przykład oś pionowa (fotoreceptory, komórki dwubiegunowe i zwojowe siatkówki) jest głównie glutaminergiczne, z przepuszczalnymi dla wapnia receptorami AMPA lub kainianowymi ulegającymi ekspresji w komórkach OFF-bipolarnych i mgluR6 ulegającym ekspresji w komórkach ON-bipolarnych16. Co ciekawe, wszystkie trzy receptory znajdują się również w gleju Müllera, które są sprzężone ze szlakami trifosforanu wapnia i inozytolu17,18. Pozioma oś hamująca, wytwarzana przez komórki poziome i amakrynowe, wydziela nie tylko GABA, ale także dopaminę, acetylocholinę i inne klasyczne neuroprzekaźniki. Komórki amakrynowe są głównymi typami komórek występujących w hodowlach siatkówki ptaków, wykazującymi kilka typów kanałów obsługiwanych przez wapń, takich jak kanały glutaminergiczne, purynergiczne, nikotynowe i zależne od napięcia. Z tego powodu jest to doskonały model do oceny różnych właściwości przesunięć wapnia między neuronami i glejem.

Dlatego połączenie różnych receptorów i kanałów sumowanych do selektywnych markerów fenotypowych podczas rozwoju z wyraźnymi wzorcami odpowiedzi agonistycznych pozwala na unikalne sygnatury w pniu, prekursorze, neuronie, astrocytach, oligodendrocytach i mikrogleju, które działają poprzez selektywne urządzenia sygnalizacyjne.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie eksperymenty z udziałem zwierząt zostały zatwierdzone i przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Federalnego w Rio de Janeiro, zgodnie z "Zasadami Opieki nad Zwierzętami Laboratoryjnymi" (NIH, Bethesda, USA); numer zezwolenia IBCCF-035 dla zapłodnionych jaj kurzych White Leghorn.

1. Przygotowanie roztworów

  1. Przygotuj roztwór Krebsa: (132 mM NaCl, 4 mM KCl, 1,4 mM MgCl2, 2,5 mM CaCl2, 6 mM glukozy, 10 mM HEPES, pH 7,4, 373 mOsm).
  2. Przygotuj bufor soli fizjologicznej (roztwór wolny od Ca2+ i Mg2+ - CMF): 76,55 g/L NaCl, 3,05 g/L KCl, 1,65 g/L Na2HPO4, 0,610 g/L KH2PO4, 21,95 g/L glukozy i 7,90 g/L NaHCO3.
  3. Przygotować roztwór inkubacyjny (z Fura-2 w roztworze Krebsa:) 5 μM estru fura-2-acetoksymetylowego (Fura-2), 0,1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) wolnej od kwasów tłuszczowych i 0,02% Poloxameru 407.
  4. W przypadku populacji mieszanej lub hodowli glejowej należy przygotować DMEM/F12 z 10% płodową surowicą cielęcą (FCS) i 40 mg/l gentamycyny jako pożywką.
  5. Do hodowli wzbogaconej neuronami należy przygotować DMEM/F12 z 1% FCS, suplementem do hodowli komórek neuronalnych, 40 mg/L i gentamycyną jako pożywką.

2. Sekcja siatkówki i przygotowanie hodowli komórkowej

  1. Otwórz jajo 8-dniowego zarodka pisklęcia (E8), w którym znajduje się komórka powietrzna.
  2. Wyjmij zawartość jaja na szalkę Petriego i przystąp do eutanazji zarodka poprzez ścięcie głowy za pomocą pęsety.
  3. Przynieś głowę na czystą szalkę Petriego i wlej trochę roztworu wolnego od wapnia i magnezu (CMF), aby ją umyć.
  4. Zdejmij oczy, uważając, aby ich przy tym nie uszkodzić.
    UWAGA: Staraj się unikać przecinania lub rozdrabniania warstw oka przed usunięciem go z jamy oka.
  5. Przyłóż oczy do czystej szalki Petriego zawierającej CMF.
  6. Rozpocznij sekcję oka od zdjęcia soczewki.
  7. Wykonaj 3 lub 4 podłużne nacięcia w oku, zaczynając od otworu pozostawionego przez soczewkę. Wykonuj cięcia, ciągnąc za pęsetę, trzymając twardówkę oka w przeciwnych kierunkach.
  8. Ostrożnie usuń przezroczysty korpus ciała szklistego, upewniając się, że siatkówka nie jest z nim związana.
  9. Odłącz siatkówkę od pigmentowanego nabłonka i usuń pozostałą tkankę.
  10. Pokrój przezroczystą siatkówkę na małe kawałki.
  11. Przenieś siatkówkę do innego biorcy i krótko odwiruj (~1,800 x g przez 1 minutę) w celu usunięcia CMF.
  12. Enzymatycznie dysocjować siatkówkę za pomocą 1 ml 0,25% trypsyny, inkubując ją w temperaturze 37 °C przez 10 minut.
  13. Zatrzymać reakcję, dodając 1 ml pożywki zawierającej 10% FCS.
  14. Przemyj siatkówkę 2 lub 3 razy pożywką. Mycie składa się z cykli dodawania pożywki i usuwania jej przez odwirowanie (~1 800 x g przez 1 min).
  15. Dodać 2 ml kompletnej pożywki na siatkówkę i delikatnie mechanicznie rozdzielić siatkówkę, pipetując ją w górę i w dół.
    UWAGA: Tutaj badacze mogą wybrać, jaki rodzaj kultury zostanie przygotowany. Aby uzyskać wzbogaconą hodowlę neuronów, użyj DMEM-F12 + suplement neuronalny + 1% FCS + antybiotyki. W przypadku populacji mieszanej lub oczyszczonego gleju należy stosować DMEM-F12 + 10% FCS + antybiotyki.
  16. Policz komórki i rozcieńcz je do pożądanej gęstości.
    UWAGA: Idealnie powinna to być kultura o niskiej gęstości z ~ 2 x 106 komórkami lub mniej.
  17. Dodać 50 μl zawiesiny komórek do każdego szkiełka nakrywkowego.
  18. Leczenie szkiełek nakrywkowych
    1. Szkiełka nakrywkowe inkubować przez co najmniej 1 godzinę (najlepiej przez noc) w 1 ml 10-50 μg/ml poli-L-lizyny w wysterylizowanej oczyszczonej wodzie o temperaturze 37 °C.
    2. Usuń roztwór poli-L-lizyny i umyj szkiełka nakrywkowe wysterylizowaną oczyszczoną wodą 2-3 razy.
    3. Pozostaw szkiełka nakrywkowe do wyschnięcia w szafce bezpieczeństwa z włączonymi światłami UV. W tym momencie należy je przechowywać w szczelnie zamkniętym pojemniku w temperaturze 4 °C przez okres do 1 miesiąca.
    4. Etap opcjonalny: W przypadku kultur wzbogaconych w neurony dodać 50 μl lamininy o stężeniu 10-20 ng/ml w PBS lub pożywce do każdego szkiełka nakrywkowego przez 2 godziny w temperaturze 37 °C. Po inkubacji usunąć nadmiar roztworu lamininy i szkiełko nakrywkowe jest gotowe do użycia.
  19. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w atmosferze 5%CO2 aż do momentu, gdy przyczepią się do szkła. Powinno to zająć około 1-2 godzin.
  20. Dodać 1 ml kompletnej pożywki do każdej studzienki i umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze do dnia eksperymentu. W razie potrzeby zmieniaj podłoże co 2-3 dni.

3. Wczytywanie komórek za pomocą Fura-2 AM

  1. Rozpuścić rozpuszczenie w fiolce 50 μg leku Fura-2 AM w 50 μl DMSO.
  2. Aby przygotować działający roztwór Fura-2 AM, dodać 3 μl 10% Poloxameru 407, 7,5 μL Fura-2 AM w DMSO i roztworze Krebsa q.s.p. do 1,5 ml.
  3. Sonikować mieszaninę przez 7 minut w łaźni wodnej.
  4. Przemyć szkiełko nakrywkowe kulturą komórkową 3x roztworem Krebsa przed inkubacją w Fura-2.
  5. Inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 30 minut.
  6. Po inkubacji umyj go ponownie 3x i przenieś do innego pojemnika zawierającego Krebsa i chronionego przed światłem.
    UWAGA: Działający roztwór Fura-2 AM pozostaje stabilny przez 24 godziny, jeśli jest chroniony przed światłem.

4. Obrazowanie komórek wapniowych

  1. Przed każdym uruchomieniem dodaj silikon do wspornika szkiełka nakrywkowego i komory, aby uniknąć wycieku podczas eksperymentu.
  2. Umyj spód szkiełka nakrywkowego wodą destylowaną, aby uniknąć krystalizacji soli na soczewce mikroskopu.
  3. Połóż szkiełko nakrywkowe na podporze, delikatnie dociskając brzegi.
  4. Przymocuj podporę i komorę do mikroskopu i rozpocznij perfuzję komórek roztworem Krebsa.
    UWAGA: Perfuzja komórek podczas eksperymentów obrazowania wapnia w pojedynczych komórkach jest kalibrowana do szybkości przepływu 0,5 ml / min, a pełna wymiana roztworu platformy zajmuje 8-10 s.
  5. Spójrz na komórki i wybierz odpowiednie pole widzenia.
  6. Ręcznie wybierz ciała komórek na podstawie ich odrębnej morfologii.
  7. Przed zastosowaniem jakiegokolwiek bodźca poczekaj na stabilizację linii bazowej. Każdy bodziec powinien trwać około 30 sekund.
    UWAGA: Przygotuj wszystkie roztwory bezpośrednio przed każdym eksperymentem.
  8. Ocenić zmiany w [Ca2 + ]i, określając ilościowo stosunek fluorescencji emitowanej przy 510 nm po naprzemiennym wzbudzeniu (750 milisekund) przy 340 i 380 nm.
  9. Przetwarzanie uzyskanych wartości za pomocą oprogramowania do analizy fluorescencji.
  10. Wyraź wyniki eksperymentu w tabeli, w której każdy wiersz reprezentuje pojedynczą komórkę, a każdy wiersz punkt czasu.

5. Przetwarzanie danych

  1. Za pomocą arkusza kalkulacyjnego narysuj zmienność wartości współczynnika fluorescencji Fura-2 dla pojedynczych komórek osobno lub wszystkich z nich w tym samym czasie.
  2. Aby określić ilościowo liczbę komórek reaktywnych na określony bodziec, należy ustalić wartość graniczną 30% wzrostu wyjściowego poziomu wapnia

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W niniejszej pracy wykorzystano hodowlę komórek siatkówki z zarodków kurcząt z 8. dnia embrionalnego, aby zbadać sposób przekazywania sygnałów przez neurony i glej w formie zmian poziomu wapnia. Hodowle przygotowano zgodnie z opisem15,19 jako mieszane hodowle neuronów i gleju (przy gęstości ≥ 1 x 106 komórek/szalkę) na etapie 7 dni in vitro (Rycina 1A). Alternatywnie przygotowano wzbogacone hodowle neuronów o niskiej gęsto...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Użyliśmy tkanki siatkówki, aby pokazać, że odpowiedzi wapniowe, w których pośredniczy KCl lub ATP, są wyraźnie podzielone odpowiednio na odpowiedzi neuronalne i glejowe (ryc. 1). Chociaż niektóre dane w literaturze sugerują, że receptory P2X7 ulegają ekspresji w neuronach, które regulują aktywność neuronalną i uwalnianie neuroprzekaźników synaptycznych20, inni autorzy kwestionują istnienie neuronalnych receptorów P2X7. Rzeczywiście, obecne wyniki potwierdzają ideę, że...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Granty, sponsorzy i źródła finansowania: MH jest laureatem stypendium doktoranckiego CNPq. HRF jest stypendystą stażu podoktorskiego wspieranego przez CNPq (grant HRF nr 152071/2020-2). RAMR jest wspierany przez CNPq i FAPERJ (numery grantów E-26/202.668/2018, E-26/010.002215/2019, 426342/2018-6 i 312157/2016-9 oraz INCT-INNT (National Institute for Translational Neuroscience).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Szkiełko nakrywkowe 15 mmPaul Marienfeld GmbH & Co. KG111550Obsługa komórek
Filtr długoprzepustowy 510 nmCarl Zeiss
ATPSigmaA1852
B-27 SuplementGibco17504044Suplement
CaCl2Sigma-AldrichC8106
CoolSNAP cyfrowy kameraRoper Scientific, Trenton, NJ
D-(+)-GlucoseNeon1466
DMEM/ F-12Gibco12400-24Pożywka do hodowli komórkowych
Oprogramowanie ExcelMicrosoft
Płodowa surowica cielęcaSigma-AldrichF9665Suplement
Mikroskop fluorescencyjnyAxiovert 200; Sondy molekularne Carl ZeissB 40-080
Fura-2 AMF1221Ratiometryczny wskaźnik Ca2+
Siarczan gentamycynyCalbiochem1405-41-0antybiotyki
HEPESSigmaH4034
KClSigmaP5405
KH2PO4SigmaP5655
Lambda Aparat DG-4Sutter Instrument, Novato, CADG-4PLUS/OF30
LamininGibco23017-015Pomoc adhezja komórek
Oprogramowanie MetafluorUniversal Imaging Corp. West Chester, PA
MgCl2SigmaM4880
Na2HPO4Vetec129
NaClIsofar310
NaHCO3Vetec306
Platforma PH3Warner Intruments, Hamden, CT64-0286
Pluronic F-127Sondy molekularneP6866niejonowy, powierzchniowo czynny
Poli-L-lizynaSigma-AldrichP8920Wspomaga adhezję komórek
Trypsyna-EDTA 0,25%Gibco25200056enzymu dysocjacji

Bibliografia

  1. Tsien, R. Y., Pozzan, T., Rink, T. J. Calcium homeostasis in intact lymphocytes: cytoplasmic free calcium monitored with a new, intracellularly trapped fluorescent indicator. Journal of Cell Biology. 94 (2), 325-334 (1982).
  2. Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Zheng, W., Lechleiter, J. D. Chemical calcium indicators. Methods. 46 (3), 143-151 (2008).
  3. Islam, M. S. Calcium Signaling: From Basic to Bedside. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1131, 1-6 (2020).
  4. De Melo Reis, R. A., et al. Functional identification of cell phenotypes differentiating from mice retinal neurospheres using single cell calcium imaging. Cellular and Molecular Neurobiology. 31 (6), 835-846 (2011).
  5. Ganguly, K., Schinder, A. F., Wong, S. T., Poo, M. GABA itself promotes the developmental switch of neuronal GABAergic responses from excitation to inhibition. Cell. 105 (4), 521-532 (2001).
  6. Schitine, C., et al. Ampakine CX546 increases proliferation and neuronal differentiation in subventricular zone stem/progenitor cell cultures. European Journal of Neuroscience. 35 (11), 1672-1683 (2012).
  7. Xapelli, S., et al. Modulation of subventricular zone oligodendrogenesis: a role for hemopressin. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 59(2014).
  8. Ribeiro-Resende, V. T., et al. Mice lacking GD3 synthase display morphological abnormalities in the sciatic nerve and neuronal disturbances during peripheral nerve regeneration. PLoS One. 9 (10), 108919(2014).
  9. Xapelli, S., et al. Activation of type 1 cannabinoid receptor (CB1R) promotes neurogenesis in murine subventricular zone cell cultures. PLoS One. 8 (5), 63529(2013).
  10. Kubrusly, R. C. C., et al. Neuro-glial cannabinoid receptors modulate signaling in the embryonic avian retina. Neurochemistry International. 112, 27-37 (2018).
  11. Egan, T. M., Khakh, B. S. Contribution of calcium ions to P2X channel responses. Journal of Neuroscience. 24 (13), 3413-3420 (2004).
  12. Illes, P. P2X7 Receptors Amplify CNS Damage in Neurodegenerative Diseases. International Journal of Molecular Sciences. 21 (17), (2020).
  13. Faroni, A., et al. Purinergic signaling mediated by P2X7 receptors controls myelination in sciatic nerves. Journal of Neuroscience Research. 92 (10), 1259-1269 (2014).
  14. Freitas, H. R., et al. Cannabinoids Induce Cell Death and Promote P2X7 Receptor Signaling in Retinal Glial Progenitors in Culture. Molecular Neurobiology. 56 (9), 6472-6486 (2019).
  15. Freitas, H. R., et al. Glutathione-Induced Calcium Shifts in Chick Retinal Glial Cells. PLoS One. 11 (4), 0153677(2016).
  16. Yang, X. L. Characterization of receptors for glutamate and GABA in retinal neurons. Progress in Neurobiology. 73 (2), 127-150 (2004).
  17. Reis, R. A., Kubrusly, R. C., de Mello, M. C., de Mello, F. G. Transient coupling of NMDA receptor with ip3 production in cultured cells of the avian retina. Neurochemistry International. 26 (4), 375-380 (1995).
  18. López-Colomé, A. M., Ortega, A., Romo-de-Vivar, M. Excitatory amino acid-induced phosphoinositide hydrolysis in Müller glia. Glia. 9 (2), 127-135 (1993).
  19. Ventura, A. L., de Mello, F. G., de Melo Reis, R. A. Methods of dopamine research in retina cells. Methods in Molecular Biology. 964, 25-42 (2013).
  20. Miras-Portugal, M. T., Sebastián-Serrano, Á, de Diego García, L., Díaz-Hernández, M. Neuronal P2X7 Receptor: Involvement in Neuronal Physiology and Pathology. Journal of Neuroscience. 37 (30), 7063-7072 (2017).
  21. Illes, P., Khan, T. M., Rubini, P. Neuronal P2X7 Receptors Revisited: Do They Really Exist. Journal of Neuroscience. 37 (30), 7049-7062 (2017).
  22. Schitine, C. S., et al. Functional plasticity of GAT-3 in avian Müller cells is regulated by neurons via a glutamatergic input. Neurochemistry International. 82, 42-51 (2015).
  23. Ferreira, D. D., Stutz, B., de Mello, F. G., Reis, R. A., Kubrusly, R. C. Caffeine potentiates the release of GABA mediated by NMDA receptor activation: Involvement of A1 adenosine receptors. Neuroscience. 281, 208-215 (2014).
  24. Faria, R. X., Freitas, H. R., Reis, R. A. M. P2X7 receptor large pore signaling in avian Müller glial cells. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 49 (3), 215-229 (2017).
  25. Passos, A., et al. Regulation of the Serotonergic System by Kainate in the Avian Retina. Cellular and Molecular Neurobiology. 39 (7), 1039-1049 (2019).
  26. de Melo Reis, R. A., Ventura, A. L., Schitine, C. S., de Mello, M. C., de Mello, F. G. Müller glia as an active compartment modulating nervous activity in the vertebrate retina: neurotransmitters and trophic factors. Neurochemical Research. 33 (8), 1466-1474 (2008).
  27. Harada, K., Kamiya, T., Tsuboi, T. Gliotransmitter Release from Astrocytes: Functional Developmental, and Pathological Implications in the Brain. Frontiers in Neuroscience. 9, 499. 9, 499(2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Hodowla kom rek siatk wkibarwnik Fura 2stymulacja chlorkiem potasustymulacja ATPnapi ciowo zale ne kana y wapniowereceptor P2X7mieszana hodowla kom rkowamikroskopia fluorescencyjna

Powiązane artykuły