Artykuł metodologiczny

Badanie metabolizmu energii mitochondrialnej pojedynczych sferoid mikrotkankowych 3D za pomocą analizy strumienia zewnątrzkomórkowego

DOI:

10.3791/63346

⸱

3 lutego 2022

 ,  ,  ,  , 
1School of Biosciences, University of Birmingham, 2Nanomedicine, Drug Delivery & Nanotoxicology Lab, School of Pharmacy, University of Birmingham, 3Mitochondrial Profiling Centre, University of Birmingham

W tym artykule

Informacja o sprostowaniu

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Te protokoły pomogą użytkownikom badać metabolizm energii mitochondrialnej w sferoidach 3D pochodzących z linii komórek rakowych za pomocą analizy strumienia zewnątrzkomórkowego Seahorse.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Trójwymiarowe (3D) agregaty komórkowe, zwane sferoidami, stały się w ostatnich latach liderem hodowli komórkowych in vitro. W przeciwieństwie do hodowli komórek jako dwuwymiarowych, jednokomórkowych monowarstw (hodowla 2D), hodowla komórek sferoidalnych promuje, reguluje i wspiera fizjologiczną architekturę komórkową i cechy, które istnieją in vivo, w tym ekspresję białek macierzy zewnątrzkomórkowej, sygnalizację komórkową, ekspresję genów, produkcję białek, różnicowanie i proliferację. Znaczenie hodowli 3D zostało dostrzeżone w wielu dziedzinach badawczych, w tym w onkologii, cukrzycy, biologii komórek macierzystych i inżynierii tkankowej. W ciągu ostatniej dekady opracowano ulepszone metody produkcji sferoidów oraz oceny ich funkcji metabolicznych i losu.

Analizatory strumienia zewnątrzkomórkowego (XF) zostały użyte do zbadania funkcji mitochondriów w mikrotkankach 3D, takich jak sferoidy, przy użyciu płytki wychwytującej wysepki XF24 lub mikropłytki sferoidalnej XFe96. Jednak odrębne protokoły i optymalizacja sondowania metabolizmu energii mitochondrialnej w sferoidach przy użyciu technologii XF nie zostały szczegółowo opisane. W artykule przedstawiono szczegółowe protokoły badania metabolizmu energii mitochondrialnej w pojedynczych sferoidach 3D przy użyciu mikropłytek sferoidalnych z analizatorem XFe96 XF. Wykorzystując różne linie komórek rakowych, wykazano, że technologia XF jest w stanie rozróżnić oddychanie komórkowe w sferoidach 3D nie tylko o różnych rozmiarach, ale także o różnych objętościach, liczbie komórek, zawartości i typie DNA.

Optymalne stężenia mitochondrialnych związków efektorowych oligomycyny, BAM15, rotenonu i antymycyny A są używane do badania określonych parametrów metabolizmu energii mitochondrialnej w sferoidach 3D. W artykule omówiono również metody normalizacji danych uzyskanych ze sferoid i poruszono wiele kwestii, które należy wziąć pod uwagę podczas badania metabolizmu sferoidów przy użyciu technologii XF. Protokół ten pomoże w prowadzeniu badań nad zaawansowanymi modelami sferoidalnymi in vitro.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Postęp w modelach in vitro w badaniach biologicznych nastąpił gwałtownie w ciągu ostatnich 20 lat. Takie modele obejmują obecnie metody narządów na chipie, organoidy i sferoidy mikrotkanek 3D, z których wszystkie stały się wspólnym celem poprawy translacji między badaniami in vitro i in vivo. Wykorzystanie zaawansowanych modeli in vitro, w szczególności sferoid, obejmuje kilka dziedzin badawczych, w tym inżynierię tkankową, badania nad komórkami macierzystymi, nowotwory i biologię chorób1,2,3,4,5,6,7 oraz testy bezpieczeństwa, w tym toksykologia genetyczna8,9,10, toksykologia nanomateriałów11,12,13,14, oraz testy bezpieczeństwa i skuteczności leków8,15,16,17,18,19.

Normalna morfologia komórek jest kluczowa dla biologicznego fenotypu i aktywności. Hodowla komórek w sferoidach mikrotkanek 3D pozwala komórkom przyjąć morfologię, funkcję fenotypową i architekturę, bardziej zbliżoną do tej obserwowanej in vivo, ale trudną do uchwycenia za pomocą klasycznych technik hodowli komórek jednowarstwowych. Zarówno in vivo, jak i in vitro, na funkcję komórkową bezpośredni wpływ ma mikrośrodowisko komórkowe, które nie ogranicza się do komunikacji i programowania komórkowego (np. tworzenie połączeń komórka-komórka, możliwości tworzenia nisz komórkowych); narażenie komórek na hormony i czynniki wzrostu w bezpośrednim otoczeniu (np. narażenie na cytokiny komórkowe w ramach odpowiedzi zapalnej); skład matryc fizycznych i chemicznych (np. czy komórki są hodowane w sztywnym plastiku tkankowym, czy w elastycznym środowisku tkankowym); A co najważniejsze, jak na metabolizm komórkowy wpływa odżywianie i dostęp do tlenu, a także przetwarzanie produktów przemiany materii, takich jak kwas mlekowy.

Analiza strumienia metabolicznego to skuteczny sposób na badanie metabolizmu komórkowego w określonych systemach in vitro. W szczególności technologia XF pozwala na analizę zmian w czasie rzeczywistym w bioenergetyce komórkowej nienaruszonych komórek i tkanek. Biorąc pod uwagę, że wiele wewnątrzkomórkowych zdarzeń metabolicznych zachodzi w ciągu kilku sekund do minut, podejścia funkcjonalne w czasie rzeczywistym mają zasadnicze znaczenie dla zrozumienia zmian w czasie rzeczywistym w komórkowym przepływie metabolicznym w nienaruszonych komórkach i tkankach in vitro.

Ten artykuł zawiera protokoły hodowli linii komórkowych pochodzących z raka: A549 (gruczolakorak płuc), HepG2/C3A (rak wątrobowokomórkowy), MCF-7 (gruczolakorak piersi) i SK-OV-3 (gruczolakorak jajnika) jako modele sferoidalne 3D in vitro przy użyciu metod wymuszonej agregacji (Rysunek 1). Również (i) szczegółowo opisuje, jak badać metabolizm energii mitochondrialnej pojedynczych sferoid 3D za pomocą analizatora Agilent XFe96 XF, (ii) podkreśla sposoby optymalizacji testów XF przy użyciu pojedynczych sferoidów 3D oraz (iii) omawia ważne rozważania i ograniczenia sondowania metabolizmu sferoidów 3D przy użyciu tego podejścia. Co najważniejsze, w artykule opisano, w jaki sposób gromadzone są zestawy danych, które umożliwiają obliczenie wskaźnika zużycia tlenu (OCR) w celu określenia fosforylacji oksydacyjnej, a tym samym funkcji mitochondriów w sferoidach komórkowych. Chociaż nie jest to analizowane pod kątem tego protokołu, szybkość zakwaszenia zewnątrzkomórkowego (ECAR) jest kolejnym parametrem, który jest mierzony wraz z danymi OCR w eksperymentach XF. Jednak ECAR jest często słabo lub nieprawidłowo interpretowany na podstawie zestawów danych XF. Przedstawiamy komentarz dotyczący ograniczeń związanych z obliczaniem ECAR zgodnie z podstawowymi podejściami producenta technologii.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-protocol-1
Rysunek 1: Graficzny przepływ pracy do generowania sferoid komórkowych, analizy strumienia zewnątrzkomórkowego i dalszych testów. Cztery linie komórek nowotworowych selektywnie hodowano jako monowarstwy (A), odłączono od kolb do hodowli tkankowych i wysiewano do 96-dołkowych mikropłytek o ultraniskim przyłączeniu w celu utworzenia sferoid (B). Rak płuc A549, rak wątroby HepG2/C3A, gruczolakorak jajnika SK-OV-3 i komórki raka piersi MCF-7 wysiewano w 1 × 103-8 × 103 komórkach / studzienku i hodowano do 7 dni w celu utworzenia pojedynczych sferoid i optymalizacji gęstości siewu sferoidy i czasu uprawy poprzez ciągłą obserwację i pomiary planimetryczne. Po uformowaniu pojedyncze sferoidy przemyto do pożywki XF bez surowicy i ostrożnie wysiano na mikropłytki do testów sferoidalnych, wstępnie pokryte poli-D-lizyną (C). Sferoidy poddano analizie strumienia zewnątrzkomórkowego przy użyciu analizatora XFe96 przy użyciu kilku protokołów w celu uwzględnienia: (1) optymalnego rozmiaru sferoidów dla podstawowej odpowiedzi oddychania mitochondrialnego; (2) zoptymalizowane miareczkowanie mitochondrialnych inhibitorów układu oddechowego; (3) Optymalizacja rozmieszczenia sferoid w studzienkach mikropłytkowych. (D) Analizy po XF, mikroskopia z kontrastem fazowym i kwantyfikacja sferoidalnego DNA zostały wykorzystane do normalizacji danych i innych dalszych testów in vitro. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

1. Hodowla linii komórek rakowych jako sferoidy 3D in vitro

Linia komórkowaopisPożywka hodowlanaźródło
A549Linia komórkowa raka płucSilnik RPMI 1640Europejska Kolekcja Uwierzytelnionych Kultur Komórkowych (ECACC)
Pirogronian sodu (1 mM)
Penicylina- Streptomycyna - (100 U/ml – 100 mg/mL)
10 % (v/v) FBS
HepG2/C3ALinia komórkowa raka wątroby, klonalna pochodna macierzystej linii komórkowej HepG2 DMEM (DMEM)Amerykańska Kolekcja Kultur Tkankowych (ATCC)
Penicylina- Streptomycyna - (100 U/ml – 100 mg/mL)
10 % (v/v) FBS
MCF7Linia komórkowa gruczolakoraka piersiSilnik RPMI 1640Europejska Kolekcja Uwierzytelnionych Kultur Komórkowych (ECACC)
Pirogronian sodu (1 mM)
Penicylina- Streptomycyna - (100 U/ml – 100 mg/mL)
10 % (v/v) FBS
SK-OV-3Linia komórkowa gruczolakoraka jajnikaSilnik RPMI 1640Europejska Kolekcja Uwierzytelnionych Kultur Komórkowych (ECACC)
Pirogronian sodu (1 mM)
Penicylina- Streptomycyna - (100 U/ml – 100 mg/mL)
10 % (v/v) FBS
składnikPożywka do oznaczania RPMI (50 ml objętości końcowej)
Podłoże podstawoweAgilent Seahorse XF RPMI, pH 7,4
Glukoza (1 M jałowy bulion)11 mM (0,55 ml roztworu podstawowego)
L-glutamina (200 mM sterylnego zapasu)2 mM (0,5 ml roztworu podstawowego)
Pirogronian sodu (100 mM sterylnego wywaru)1 mM (0,5 ml roztworu podstawowego)

Tabela 1: Kompozycje pożywek linii komórek nowotworowych i pożywek XF.

  1. Przeprowadzić hodowlę wszystkich linii komórkowych przy użyciu standardowej techniki aseptycznej hodowli tkankowej i potwierdzić, że są one wolne od mykoplazmy, używając odpowiedniego zestawu do oznaczania.
  2. Wyhodować linie komórkowe w kolbach do hodowli tkankowych T75 lub równoważnych, używając zalecanej pożywki (Tabela 1). Hoduj linie komórkowe do zbiegu 65-80% i pasażuj je regularnie, maksymalnie do 25 pasaży.
  3. Przepłukać dwukrotnie kolby do hodowli komórkowych w zmodyfikowanym roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanem (DBPS) firmy Dulbecco.
  4. Oderwać komórki od kolb z 3 ml odczynnika do dysocjacji komórek (patrz tabela materiałów) na 5 minut w temperaturze 37 °C i potwierdzić odłączenie za pomocą mikroskopii.
  5. Delikatnie odessać zawiesinę oderwanych komórek, aby zapewnić zawiesinę jednokomórkową i dezaktywować odczynnik dysocjacji komórek za pomocą 7 ml kompletnej pożywki do hodowli tkankowych.
  6. Zebrać komórki przez odwirowanie w stężeniu 300 × g przez 5 minut, odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w kompletnym podłożu.
  7. Policz komórki za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek i miareczkuj do żądanej gęstości komórek wymaganej do wysiewu.
    UWAGA: Aby wysiać całą 96-dołkową płytkę w 100 μL/basenik w 4 × 103 komórek/dołk, komórki należy miareczkować do 4 × 104 komórek/ml w zalecanej objętości 12 ml.
  8. Zdekantować zawiesinę komórkową do sterylnego zbiornika i dozować 100 μl zawiesiny komórek do każdej studzienki mikropłytki odstraszającej komórki za pomocą pipetora wielokanałowego.
    UWAGA: Tylko 60 wewnętrznych dołków mikropłytki powinno być wysiewane, a pozostałą część wypełniać DPBS. Stworzy to barierę dla parowania, zapewni jednorodność sferoidy na całej płytce i zminimalizuje efekty krawędzi płytki.
  9. Odwirować mikropłytki sferoidalne o masie 300 × g przez 15 minut, aby zmusić komórki do powstania luźnych agregatów.
  10. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez co najmniej 3 dni, aby zapewnić tworzenie sferoidów.
  11. Wykonaj mikroskopię z kontrastem fazowym przy użyciu standardowych praktyk laboratoryjnych w celu monitorowania wzrostu sferoidów. Uzupełniaj pożywkę do hodowli komórkowych co 3 dni lub dwa razy w tygodniu, wykonując wymianę pożywki o połowie objętości.

2. Badanie metabolizmu energii mitochondrialnej pojedynczych sferoidów za pomocą technologii strumienia zewnątrzkomórkowego (XF)

  1. Przygotowanie testu (dzień wcześniej)
    1. Sprawdź żywotność sferoidy za pomocą mikroskopu światła odwróconego z kontrastem fazowym przy 4-krotnym powiększeniu, aby zapewnić nienaruszoną strukturę sferoidalną, morfologię i ogólną jednorodność między próbkami.
    2. Uwodnić wkład czujnika.
      1. Porcja ~20 ml kalibru do stożkowej probówki.
      2. Umieścić stożkową rurkę zawierającą kalibert w inkubatorze o temperaturze 37 °C niezawierającej CO2 °C.
      3. Wyjąć zawartość z zestawu do oznaczania.
      4. Wyjmij wkład czujnika z tabliczki narzędziowej i umieść go do góry nogami na blacie obok tabliczki użytkowej.
      5. Odpipetować 200 μl sterylnego ddH2O do każdego dołka płytki użytkowej wkładu czujnika za pomocą wielokanałowej pipety P300.
      6. Umieść wkład czujnika na górze tabliczki użytkowej.
      7. Sprawdź, czy poziom wody w każdej studzience jest wystarczająco wysoki, aby zanurzyć sondy czujnika.
      8. Przenieś zmontowany wkład czujnika do inkubatora o temperaturze 37 °C bez CO2 i pozostaw na noc.
        UWAGA: Ten krok można wykonać 12-72 godzin przed rozpoczęciem testu.
  2. Mikropłytka do oznaczania sferoidów płaszcza
    1. Stosując techniki aseptyczne, dodać 30 μl/basenik sterylnego roztworu poli-D-lizyny (0,1 mg/ml) do mikropłytki sferoidalnej i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
    2. Odessać roztwór z każdej studzienki mikropłytki sferoidalnej, odwrócić płytkę i mocno uderzyć nią w bibułkę, aby usunąć resztki roztworu.
    3. Umyć płytkę dwukrotnie 200 μl/dołek sterylnego ddH2O.
    4. Po ostatnim umyciu odwróć mikropłytkę i mocno uderz nią w bibułę, aby usunąć resztki wody.
    5. Pozostaw płytkę do wyschnięcia na powietrzu przez 30 minut przed użyciem lub przechowywaniem jej w temperaturze 4 °C do wykorzystania w przyszłości.
      UWAGA: Mikropłytka do testu sferoidalnego powinna być pokryta klejem molekularnym, aby upewnić się, że sferoidy są zamocowane na dnie mikropłytki. Bez kleju molekularnego sferoidy mogą ulec przemieszczeniu i zakłócić wyniki testu. Inne kleje molekularne mogą być również stosowane jako alternatywa dla poli-D-lizyny do wstępnego powlekania płytek. Wstępnie powlekane płytki mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C, ale przed rozpoczęciem badania należy je pozostawić do zrównoważenia do temperatury pokojowej.
  3. Przygotuj pożywkę do oznaczania XF
    1. Przygotować pożywkę XF RPMI, jak opisano w Tabeli 1, i sterylny filtr z filtrem strzykawkowym 0,22 μm
  4. Przygotowanie testu (1 h przed badaniem)
    1. Podgrzej uzupełnioną pożywkę testową XF RPMI do 37 °C.
    2. Wstępnie ogrzej powlekaną mikropłytkę do oznaczania sferoidalnego w inkubatorze lub w suchej kąpieli niezawierającejCO2 37 °C.
    3. Przygotuj wkład czujnika.
      1. Wyjąć stożkową rurkę zawierającą kaliber i wkład czujnika z inkubatora powietrza.
      2. Wyjmij wkład czujnika z tabliczki użytkowej i umieść go do góry nogami na powierzchni roboczej.
      3. Za pomocą pipety wielokanałowej P300 odessać wodę z płytki użytkowej i wylać ją.
      4. Wlać roztwór kalibru do sterylnego zbiornika na odczynnik i dodać 200 μl/studzienkę podgrzanego kalibru do płytki użytkowej za pomocą pipety wielokanałowej P300.
      5. Podnieś wkład czujnika i umieść go z powrotem na płycie użytkowej, upewniając się, że czujniki są dobrze zanurzone w kalibrze.
      6. Przenieś zmontowany wkład czujnika z powrotem do inkubatora o temperaturze 37 °C innej niż CO2 °C, aż będzie gotowy do załadowania roztworów do wstrzykiwań portowych.
  5. Przemyć sferoidy pożywką do oznaczania.
    1. Wyjąć płytkę do hodowli sferoidów z inkubatora o temperaturze 37 °C, 5% CO2 i obserwować sferoidy pod mikroskopem, aby upewnić się, że są integralne przed etapem transferu sferoidów.
    2. Załadować wszystkie studzienki płytki sferoidalnej 180 μl/studzienkę wstępnie podgrzanego podłoża do oznaczania, w tym wszelkich studzienek korekcyjnych tła.
    3. Częściowo napełnić 7-centymetrową szalkę Petriego 3 ml pożywki do oznaczania.
    4. Za pomocą pipety wielokanałowej wyposażonej w końcówki pipet z szeroką kryzą przenieść sferoidy z 96-dołkowej płytki hodowlanej na 7-centymetrowe szalki Petriego, ustawiając pipetor na objętość aspiracji 10-50 μl.
  6. Sferoidy nasienne do wstępnie pokrytej mikropłytki do testu sferoidalnego.
    1. Za pomocą mikroskopu preparacyjnego i aparatu lightbox przenieś sferoidy z płytki Petriego na mikropłytkę do testu sferoidalnego, jak opisano poniżej.
      1. Ustawić objętość pipetora jednokanałowego wyposażonego w końcówkę pipety z szerokim otworem na 20 μl i ostrożnie zassać pojedynczą sferoidę. Umieść końcówkę bezpośrednio w środku każdej studzienki mikropłytki do oznaczania sferoidów i pozwól, aby grawitacja wymyła pojedynczą sferoidę do środka każdej studzienki, tj. nie wyrzucaj żadnego medium z końcówki pipety i pozwól, aby działanie kapilarne wycofało sferoidę z końcówki pipety. Aby potwierdzić elucję, zawartość pipetora można odpipetować z powrotem na 7-centymetrową szalkę Petriego pod mikroskopem.
        UWAGA: Elucja grawitacyjna pojedynczej sferoidy trwa zwykle 15-30 s w zależności od rozmiaru/gęstości sferoidy. W tym czasie pipetora nie należy wyjmować. Wszelkie studzienki korekcyjne tła powinny być wolne od sferoid i zawierać wyłącznie pożywkę do oznaczania. Pod mikroskopem potwierdź położenie każdej sferoidy. Każda sferoida powinna być idealnie umieszczona w środku każdej studzienki.
      2. Po przeniesieniu wszystkich sferoid na mikropłytkę do testu sferoidalnego należy przenieść płytkę do inkubatora niezawierającegoCO2 w temperaturze 37 °C na co najmniej 1 godzinę przed badaniem.

3. Przygotowanie i ładowanie związków do wkładu czujnika do testów XF

szt. szt. szt. szt. szt. szt. szt. szt. szt. szt. szt. szt.
Strategia wtryskuZłożony (port)XFe96 objętość początkowa mikrostudzienki (μL)Pożądane stężenie w studzience końcowejObjętość portu (μL)Końcowa objętość mikrodołka XFe96 po wstrzyknięciu (μL)Koncentracja zapasów roboczych
1Oligomycyna (A)1803 μg/ml2020030 μg/ml
Rotenon (B)2002 μM2022022 μM
Antymycyna A (B)2002 μM2022022 μM
2BAM15 (A)1805 μM2020050 μM
Rotenon (B)2002 μM2022022 μM
Antymycyna A (B)2002 μM2022022 μM

Tabela 2: Stężenia związków mitochondrialnych do badania metabolizmu energii mitochondrialnej pojedynczych sferoidów 3D za pomocą analizatora XFe96.

  1. Przygotować stężenia zapasu roboczego każdego związku, jak podano w tabeli 2, używając w pełni uzupełnionej, wstępnie podgrzanej pożywki do oznaczania XF RPMI.
  2. Ustaw płytkę nabojową (sprzężoną z tabliczką narzędziową) w kierunku kolumny, 1-12 od lewej do prawej.
  3. Jeśli używasz prowadnicy ładowania, umieść ją na płycie naboju zgodnie z procedurą ładowania studni, np. jeśli port A jest ładowany jako pierwszy, upewnij się, że A jest widoczny w lewym górnym rogu prowadnicy.
  4. Przenieś roztwór roboczy każdego związku do odpowiedniego zbiornika i za pomocą skalibrowanej pipety wielokanałowej P100 dozuj 20 μl do wszystkich odpowiednich portów. Powtórz dla każdego związku do pozostałych portów.
    UWAGA: Jeśli jakiekolwiek porty nie są używane na płytce wkładu czujnika, można je pozostawić puste lub napełnić pożywką testową. Jeżeli używany jest tylko wybór określonej litery portu, należy upewnić się, że inne porty odpowiadające tej literze są załadowane pożywką do oznaczania; W przeciwnym razie powietrze zostanie wstrzyknięte do studni, co pogorszy wyniki w tych studniach.
  5. Po załadowaniu portu wyjmij prowadnice ładowania płyt (jeśli są używane) i przygotuj analizator do załadowania wkładu czujnika.
    UWAGA: Jeśli test nie jest uruchamiany natychmiast po załadowaniu portów, umieść pokrywę z powrotem na kasecie czujnika i włóż płytkę z powrotem do inkubatora powietrza o temperaturze 37 °C, aż będzie gotowa do załadowania do urządzenia.

4. Projektowanie testów, strategie iniekcji i akwizycja danych

  1. Uruchamianie testu
    1. Włącz analizator i podłącz do sterownika (komputera).
      UWAGA: Można to sprawdzić na podstawie stanu połączenia instrumentu w panelu widżetów oprogramowania Wave Controller.
    2. Przejdź do strony szablonów w oprogramowaniu WAVE, znajdź plik szablonu testu dla eksperymentu i kliknij dwukrotnie, aby go otworzyć.
      UWAGA: Jeśli szablon testu nie jest wyświetlany w widoku Szablony, zaimportuj plik szablonu do folderu szablonu z udostępnionego dysku sieciowego lub dysku flash USB.
    3. Aby rozpocząć test, kliknij kartę Uruchom test.
      UWAGA: Jeśli definicje grup zostały prawidłowo przypisane na mapie tablicowej, test będzie gotowy do uruchomienia, jak wskazano zielonym znacznikiem po prawej stronie strony. Na tym etapie wszelkie dodatkowe informacje można wprowadzić na stronie podsumowania testu lub na stronie pozostawionej pustą; Przejdź do następnego kroku. Ze względu na opóźnioną penetrację modulatorów mitochondrialnych w sferoidach mikrotkanek 3D (Rysunek 2), należy skorzystać z informacji protokołu pomiarowego opisanych w Tabeli 3.
Okres pomiaruNumer i port wtryskuSzczegóły pomiaruCzas trwania okresu (h:min:s)
wzorcowanieNie dotyczyAnalizatory XF zawsze wykonują tę kalibrację, aby upewnić się, że pomiary są dokładne00:20:00 (jest to średnia i może się różnić w zależności od maszyny)
RównowagaNie dotyczyRównowaga następuje po kalibracji i jest to zalecane.00:10:00
PodstawowyNie dotyczyCykle = 500:30:00
Mix = 3:00
Czekaj = 0:00
Pomiar = 3:00
Oligomycyna / BAM15Wstrzyknięcie 1 (Port A)Cykle = 1001:00:00
Mix = 3:00
Czekaj = 0:00
Pomiar = 3:00
Rotenon + antymycyna AWstrzyknięcie 2 (Port B)Cykle = 1001:00:00
Mix = 3:00
Czekaj = 0:00
Pomiar = 3:00
Całkowity czas:03:00:00

Tabela 3: Konfiguracja protokołu do badania metabolizmu energii mitochondrialnej pojedynczych sferoidów 3D za pomocą analizatora XFe96.

  1. Kliknij przycisk Rozpocznij uruchamianie, aby wyświetlić okno dialogowe lokalizacji zapisywania.
  2. Wprowadź lokalizację zapisu pliku wyników i umieść zmontowany wkład czujnika na tacy termicznej, która pojawia się z drzwiczek z boku analizatora. Poczekaj, aż taca termiczna otworzy się automatycznie, a na ekranie pojawi się komunikat Load Calibrant Utility Plate. Przed wykonaniem instrukcji wyświetlanych na ekranie upewnij się, że i) wkład czujnika jest prawidłowo dopasowany do płytki narzędziowej, ii) pokrywa została zdjęta z wkładu czujnika oraz iii) prawidłowa orientacja wkładu czujnika na tabliczce narzędziowej.
  3. Postępuj zgodnie z poleceniami wyświetlanymi na ekranie, aby rozpocząć kalibrację wkładu czujnika.
    UWAGA: Czas potrzebny do zakończenia kalibracji wynosi około 10-20 minut (w przypadku testów w temperaturze 37 °C).
  4. Po kalibracji wkładu czujnika załaduj mikropłytkę sferoidalną do analizatora, postępując zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na ekranie kontrolera fal, aby zainicjować 12-minutowy krok równoważenia.
    UWAGA: Zielone pola z białymi znacznikami oznaczają "dobrą" kalibrację dla tego dołka. Jeśli którekolwiek ze studzienek nie zapewnią "dobrej" kalibracji, zostaną oznaczone czerwoną ramką i białym krzyżykiem. Takie studzienki powinny być odnotowane i wyłączone z jakiejkolwiek analizy po zakończeniu testu przy użyciu zakładki test modyfikacji.
  5. Poczekaj, aż analizator automatycznie rozpocznie pobieranie pomiarów linii bazowej po tym, jak maszyna zakończy etap równoważenia (zgodnie z opisem w protokole przyrządu).
  6. Aby zakończyć eksperyment, postępuj zgodnie z poleceniami wyświetlanymi na ekranie kontrolera WAVE.
    UWAGA: Po wyjęciu mikropłytki sferoidalnej z analizatora należy wyrzucić wkład czujnika i odłożyć płytkę sferoidalną do dalszej analizy, jeśli to konieczne (np. kwantyfikacja dwuniciowego (ds) DNA). Jeśli mikropłytka nie jest potrzebna do dalszej analizy, można ją wyrzucić wraz z wkładem czujnika.
  7. Poczekaj, aż pojawi się okno dialogowe testu i wyświetl wyniki lub wróć do widoku szablonów.

5. Strategie normalizacji i analizy danych - normalizacja po teście i dalsze testy (opcjonalne kroki)

  1. Normalizacja danych
    1. Aby znormalizować dane sferoidalne, zapoznaj się z serią protokołów związanych ze strategiami normalizacji danych do obliczania wielkości i objętości sferoidów oraz ilościowego określania dsDNA w testach sferoidalnych. Zostały one dołączone jako pliki uzupełniające; patrz Plik uzupełniający 1 i Plik uzupełniający 2.
  2. analiza danych
    1. Aby wyeksportować dane do jednego z automatycznych generatorów analizy, postępuj zgodnie z poleceniami eksportu danych na kontrolerze WAVE i wybierz generator eksportu, który pasuje do typu testu. Możesz też wyeksportować plik danych i przesłać go do pliku Seahorse analytics.
      UWAGA: Wadą generatorów raportów i analityki Seahorse jest to, że analiza danych jest ograniczona do tego, jak zaprojektowano test XF i nie pozwala na uzyskanie średnich z różnych cykli pomiarowych. Ręczny eksport zbiorów danych z oprogramowania urządzenia pozwala na preferencje użytkownika w tym zakresie. Biorąc pod uwagę, że strategia iniekcji do oceny oddychania mitochondrialnego sferoidów 3D prawdopodobnie będzie się różnić od typowego testu "MitoStress", opracowano szereg szablonów arkuszy kalkulacyjnych, aby pomóc w analizie tych zestawów danych, specyficznych dla kultur komórkowych 3D i zostaną dostarczone na żądanie. Te pliki szablonów danych będą zawierać dane na temat kluczowych parametrów mitochondrialnych układu oddechowego, szczegółowo i wyjaśnione w Rysunek 2.
    2. Aby przeanalizować dane, wyeksportuj dane jako raport arkusza kalkulacyjnego z oprogramowania kontrolera WAVE i użyj niezależnego szablonu arkusza kalkulacyjnego do analizy.

figure-protocol-2
Rysunek 2: Schematyczne deskryptory parametrów pochodzących z analiz danych strumienia zewnątrzkomórkowego. Skrót: OCR = wskaźnik zużycia tlenu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby uzyskać dobrze uformowane, zwarte sferoidy, każda linia komórkowa została indywidualnie zoptymalizowana pod kątem gęstości wysiewu i czasu trwania uprawy (Rysunek 3). Linie komórkowe A549, HepG2 / C3A i SK-OV-3 początkowo tworzyły luźne agregaty, które nie rozwijały się w okrągłe sferoidy z wyraźnie określonymi obwodami aż do 7 dni w hodowli. I odwrotnie, komórki MCF-7 mogą tworzyć sferoidy w ciągu 3 dni. Stwierdzono wyraźną korelację między początkową gęstością wysiewu komórek a objętością sferoi...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Główne ustalenia i wyniki
Ten artykuł zawiera szczegółowy protokół badania metabolizmu energii mitochondrialnej pojedynczych sferoid 3D przy użyciu szeregu linii komórkowych pochodzących z raka za pomocą analizatora XFe96 XF. Opracowano i opisano metodę szybkiej hodowli sferoid komórkowych A549, HepG2/C3A, MCF7 i SK-OV-3 przy użyciu technologii odstraszających komórki do wymuszonej agregacji. Protokół ten odnosi się do wielu kwestii związanych z sondowaniem metabolizmu sferoidów za pomocą technologi...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

N.J.C otrzymał nagrodę BBSRC MIBTP CASE Award od Sygnature Discovery Ltd (BB/M01116X/1, 1940003)

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
A549ECACC #86012804Linia komórkowa raka płuc
Agilent Seahorse XF RPMI Medium, pH 7,4Agilent Technologies Inc.103576-100Pożywka testowa XF z 1 mM HEPES, bez czerwieni fenolowej, wodorowęglanu sodu, glukozy, L-glutaminy i pirogronianu sodu
Analizator strumienia zewnątrzkomórkowego Agilent Seahorse XFe96Agilent Technologies Inc.-Przyrząd do pomiaru szybkości sferoidalnego poboru tlenu w pojedynczych sferoidach
Antymycyna AMerck Life ScienceA8674Mitochondrialny kompleks oddechowy III inhibitor
BAM15TOCRIS bio-techne5737Mitochondrialny rozprzęgacz protnoforowy
Mikropłytka czarnościennaGreiner Bio-One655076Do testów
opartych na fluorescencjiPowierzchnia odpychająca komórki CELLSTAR 96 Mikropłytki U UGreiner Bio-One650970Mikropłytki do generowania sferoid
Test żywotności komórek CellTiter-Glo 3DPromegaG9681Test do oznaczania żywotności komórek w sferoidach mikrotkanek 3D
Cultrex Poly-D-LysineR& D Systems marka biotechne3439-100-01Molekularny klej komórkowy do powlekania mikropłytek sferoidalnych XFe96 w celu ułatwienia mocowania sferoidów
D-(+)-GlukozaMerck Life SciencesG8270Suplement do wzrostu kultur komórkowych i pożywki do oznaczania XF
Dulbecco' s Zmodyfikowana pożywka Eagle Medium (DMEM)Gibco11885084Pożywka hodowlana dla sferoid HepG2/C3A
obrazowania rdzenia EVOS XLThermo Fisher ScientificAMEX1000Mikroskop do obrazowania z kontrastem fazowym
Zestaw testowy EZ-PCR MykoplazmaPrzemysł biologiczny20-700-20Badania przesiewowe mykoplazmy w hodowlach komórkowych
FIDŻI to tylko obraz JAnaliza zestawionych obrazów
Surowica bydlęca płoduMerck Life ScienceF7524Suplement do pożywki do hodowli komórkowych
HepG2/C3AATCC #CRL-10741Linia komórkowa raka wątroby, klonalna pochodna macierzystej linii komórkowej HepG2
Mleczan-GloPromegaJ5021Test do pomiaru mleczanu w pożywce do hodowli sferydów
L-glutamina (roztwór 200 mM)Merk Life SciencesG7513Suplement do wzrostu hodowli komórkowych i pożywki testowej XF
Mikroskop stereoskopowy M50Mikrosytemy LeicaLEICAM50Stereoskopowy mikroskop preparacyjny; używany do obsługi sfeorydów
MCF-7ECACC#86012803Linia komórkowa gruczolakoraka piersi
Oligomycyna z Streptomyces diastatochromogenesMerck Life ScienceO4876Inhibitor syntazy ATP
Penicilin-StreptomycynaGibco15140122Antybiotyki dodane do pożywki do hodowli komórkowych
Quant-iT Zestaw do oznaczania dsDNA PicoGreenIazotP7589Analiza dsDNA w spehroidach
RotenonMerck Life ScienceR8875Mitochondrialny kompleks oddechowy I Inhibitor
RPMI 1640Gibco21875091Pożywka hodowlana dla A549, MCF7 i SK-OV-3 sferoidy
Seahorse AnalyticsAgilent Technologies Inc.Kompilacja 421https://seahorseanalytics.agilent.com
Seahorse XFe96 Spheroid FluxPakAgilent Technologies Inc.102905-100Każdy Seahorse XFe96 Spheroid FluxPak zawiera: 6 mikropłytek sferoidalnych Seahorse XFe96 (102978-100), 6 wkładów z czujnikiem XFe96 i 1 butelkę roztworu Seahorse XF Calibrant Solution 500 ml (100840-000)
Pipeta serologiczna: 5, 10 i 25 mlGreiner Bio-One606107; 607107; 760107Materiały eksploatacyjne do hodowli komórkowych
SK-OV-3ECACC #HTB-77Linia
komórkowa gruczolakoraka jajnikaPirogronian sodu (roztwór 100 mM)Merck Life ScienceS8636Suplement do wzrostu kultur komórkowych i pożywki do oznaczania XF
Kolba do hodowli komórkowych T75 cm2Greiner Bio-One658175Kolby poddane hodowli tkankowej do utrzymywania kultur komórkowych
TrypLExpressGibco12604-021Odczynnik do dysocjacji komórek
Oprogramowanie kontrolera falAgilent Technologies Inc.-
Końcówka z szerokim otworemSTARLAB International GmbHE1011-8400Końcówki do pipet z szerokim otworem do obsługi sferoidów
System

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Correa de Sampaio, P., et al. A heterogeneous in vitro three dimensional model of tumour-stroma interactions regulating sprouting angiogenesis. PLoS One. 7 (2), 30753(2012).
  2. Amann, A., et al. Development of an innovative 3D cell culture system to study tumour-stroma interactions in non-small cell lung cancer cells. PLoS One. 9 (3), 92511(2014).
  3. Russell, S., Wojtkowiak, J., Neilson, A., Gillies, R. J. Metabolic profiling of healthy and cancerous tissues in 2D and 3D. Scientific Reports. 7 (1), 15285(2017).
  4. Zanoni, M., et al. 3D tumor spheroid models for in vitro therapeutic screening: a systematic approach to enhance the biological relevance of data obtained. Scientific Reports. 6, 19103(2016).
  5. Song, Y., et al. Patient-derived multicellular tumor spheroids towards optimized treatment for patients with hepatocellular carcinoma. Journal of Experimental and Clinica Cancer Research. 37 (1), 109(2018).
  6. Courau, T., et al. Cocultures of human colorectal tumor spheroids with immune cells reveal the therapeutic potential of MICA/B and NKG2A targeting for cancer treatment. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 7 (1), 74(2019).
  7. Ivanova, E., et al. Use of ex vivo patient-derived tumor organotypic spheroids to identify combination therapies for HER2 mutant non-small cell lung cancer. Clinical Cancer Research. 26 (10), 2393-2403 (2020).
  8. Mandon, M., Huet, S., Dubreil, E., Fessard, V., Le Hegarat, L. Three-dimensional HepaRG spheroids as a liver model to study human genotoxicity in vitro with the single cell gel electrophoresis assay. Scientific Reports. 9 (1), 10548(2019).
  9. Stampar, M., et al. Hepatocellular carcinoma (HepG2/C3A) cell-based 3D model for genotoxicity testing of chemicals. Science of the Total Environment. 755, 143255(2020).
  10. Coltman, N. J., et al. Application of HepG2/C3A liver spheroids as a model system for genotoxicity studies. Toxicology Letters. 345, 34-45 (2021).
  11. Tchoryk, A., et al. Penetration and uptake of nanoparticles in 3D tumor spheroids. Bioconjugate Chemistry. 30 (5), 1371-1384 (2019).
  12. Leite, P. E. C., et al. Suitability of 3D human brain spheroid models to distinguish toxic effects of gold and poly-lactic acid nanoparticles to assess biocompatibility for brain drug delivery. Partical Fibre Toxicology. 16 (1), 22(2019).
  13. Elje, E., et al. Hepato(Geno)toxicity assessment of nanoparticles in a HepG2 liver spheroid model. Nanomaterials. 10 (3), 545(2020).
  14. Conway, G. E., et al. Adaptation of the in vitro micronucleus assay for genotoxicity testing using 3D liver models supporting longer-term exposure durations. Mutagenesis. 35 (4), 319-330 (2020).
  15. Wang, Z., et al. HepaRG culture in tethered spheroids as an in vitro three-dimensional model for drug safety screening. Journal of Applied Toxicology. 35 (8), 909-917 (2015).
  16. Proctor, W. R., et al. Utility of spherical human liver microtissues for prediction of clinical drug-induced liver injury. Archives of Toxicology. 91 (8), 2849-2863 (2017).
  17. Basharat, A., Rollison, H. E., Williams, D. P., Ivanov, D. P. HepG2 (C3A) spheroids show higher sensitivity compared to HepaRG spheroids for drug-induced liver injury (DILI). Toxicology and Applied Pharmacology. 408, 115279(2020).
  18. Benning, L., Peintner, A., Finkenzeller, G., Peintner, L. Automated spheroid generation, drug application and efficacy screening using a deep learning classification: a feasibility study. Scientific Reports. 10 (1), 11071(2020).
  19. Mittler, F., et al. High-content monitoring of drug effects in a 3D spheroid model. Frontiers in Oncology. 7, 293(2017).
  20. Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. The Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).
  21. Benz, R., McLaughlin, S. The molecular mechanism of action of the proton ionophore FCCP (carbonylcyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone). Biophysical Journal. 41 (3), 381-398 (1983).
  22. Kasianowicz, J., Benz, R., McLaughlin, S. The kinetic mechanism by which CCCP (carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone) transports protons across membranes. The Journal of Membrane Biology. 82 (2), 179-190 (1984).
  23. Kenwood, B. M., et al. Identification of a novel mitochondrial uncoupler that does not depolarize the plasma membrane. Molecular Metabolism. 3 (2), 114-123 (2013).
  24. Mitchell, P. Coupling of phosphorylation to electron and hydrogen transfer by a chemi-osmotic type of mechanism. Nature. 191, 144-148 (1961).
  25. Alexopoulos, S. J., et al. Mitochondrial uncoupler BAM15 reverses diet-induced obesity and insulin resistance in mice. Nature Communications. 11 (1), 2397(2020).
  26. Chen, S. -Y., et al. Mitochondrial uncoupler SHC517 reverses obesity in mice without affecting food intake. Metabolism - Clinical and Experimental. 117, 154724(2021).
  27. Goedeke, L., Shulman, G. I. Therapeutic potential of mitochondrial uncouplers for the treatment of metabolic associated fatty liver disease and NASH. Molecular Metabolism. 46, 101178(2021).
  28. Hill, B. G., et al. Integration of cellular bioenergetics with mitochondrial quality control and autophagy. Biological chemistry. 393 (12), 1485-1512 (2012).
  29. Demine, S., Renard, P., Arnould, T. Mitochondrial uncoupling: a key controller of biological processes in physiology and diseases. Cells. 8 (8), 795(2019).
  30. Wang, J., et al. Uncoupling effect of F16 is responsible for its mitochondrial toxicity and anticancer activity. Toxicological Sciences. 161 (2), 431-442 (2018).
  31. Tretter, L., Chinopoulos, C., Adam-Vizi, V. Plasma membrane depolarization and disturbed Na+ homeostasis induced by the protonophore carbonyl cyanide-p-trifluoromethoxyphenyl-hydrazon in isolated nerve terminals. Molecular Pharmacology. 53 (4), 734-741 (1998).
  32. Connop, B. P., Thies, R. L., Beyreuther, K., Ida, N., Reiner, P. B. Novel effects of FCCP [carbonyl cyanide p-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone] on amyloid precursor protein processing. Journal of neurochemistry. 72 (4), 1457-1465 (1999).
  33. Stöckl, P., et al. Partial uncoupling of oxidative phosphorylation induces premature senescence in human fibroblasts and yeast mother cells. Free Radical Biology and Medicine. 43 (6), 947-958 (2007).
  34. Firsov, A. M., et al. Protonophoric action of BAM15 on planar bilayers, liposomes, mitochondria, bacteria and neurons. Bioelectrochemistry. 137, 107673(2021).
  35. Dranka, B. P., Hill, B. G., Darley-Usmar, V. M. Mitochondrial reserve capacity in endothelial cells: The impact of nitric oxide and reactive oxygen species. Free Radical Biology and Medicine. 48 (7), 905-914 (2010).
  36. Eilenberger, C., Rothbauer, M., Ehmoser, E. K., Ertl, P., Kupcu, S. Effect of spheroidal age on sorafenib diffusivity and toxicity in a 3D HepG2 spheroid model. Scientific Reports. 9 (1), 4863(2019).
  37. vanden Brand, D., Veelken, C., Massuger, L., Brock, R. Penetration in 3D tumor spheroids and explants: Adding a further dimension to the structure-activity relationship of cell-penetrating peptides. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1860 (6), 1342-1349 (2018).
  38. Niora, M., et al. Head-to-head comparison of the penetration efficiency of lipid-based nanoparticles into tumor spheroids. ACS Omega. 5 (33), 21162-21171 (2020).
  39. Millard, M., et al. Drug delivery to solid tumors: the predictive value of the multicellular tumor spheroid model for nanomedicine screening. International Journal of Nanomedicine. 12, 7993-8007 (2017).
  40. Ruas, J. S., et al. Underestimation of the maximal capacity of the mitochondrial electron transport system in oligomycin-treated cells. PLoS One. 11 (3), 0150967(2016).
  41. Benton, G., DeGray, G., Kleinman, H. K., George, J., Arnaoutova, I. In vitro microtumors provide a physiologically predictive tool for breast cancer therapeutic screening. PLoS One. 10 (4), 0123312(2015).
  42. Hirpara, J., et al. Metabolic reprogramming of oncogene-addicted cancer cells to OXPHOS as a mechanism of drug resistance. Redox Biology. 25, 101076(2019).
  43. Ware, M. J., et al. Generation of homogenous three-dimensional pancreatic cancer cell spheroids using an improved hanging drop technique. Tissue Engineering. Part C, Methods. 22 (4), 312-321 (2016).
  44. Song, Y., et al. TGF-β-independent CTGF induction regulates cell adhesion mediated drug resistance by increasing collagen I in HCC. Oncotarget. 8 (13), 21650-21662 (2017).
  45. Wrzesinski, K., et al. HepG2/C3A 3D spheroids exhibit stable physiological functionality for at least 24 days after recovering from trypsinisation. Toxicology Research. 2 (3), 163-172 (2013).
  46. Gaskell, H., et al. Characterization of a functional C3A liver spheroid model. Toxicology Research. 5 (4), 1053-1065 (2016).
  47. Takahashi, Y., et al. 3D spheroid cultures improve the metabolic gene expression profiles of HepaRG cells. Bioscience Reports. 35 (3), 00208(2015).
  48. Hendriks, D. F. G., Puigvert, L. F., Messner, S., Mortiz, W., Ingelman-Sundberg, M. Hepatic 3D spheroid models for the detection and study of compounds with cholestatic liability. Scientific Reports. 6, 35434(2016).
  49. Leung, B. M., Lesher-Perez, S. C., Matsuoka, T., Moraes, C., Takayama, S. Media additives to promote spheroid circularity and compactness in hanging drop platform. Biomaterials Science. 3 (2), 336-344 (2015).
  50. Cavo, M., et al. A synergic approach to enhance long-term culture and manipulation of MiaPaCa-2 pancreatic cancer spheroids. Scientific Reports. 10 (1), 10192(2020).
  51. Carlsson, J., Yuhas, J. M. Liquid-overlay culture of cellular spheroids. Recent Results in Cancer Research. 95, 1-23 (1984).
  52. Costa, E. C., Gaspar, V. M., Coutinho, P., Correia, I. J. Optimization of liquid overlay technique to formulate heterogenic 3D co-cultures models. Biotechnology and Bioengineering. 111 (8), 1672-1685 (2014).
  53. Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays. Journal of Biomolecular Screening. 8 (5), 566-570 (2003).
  54. Zhang, X. D., et al. The use of strictly standardized mean difference for hit selection in primary RNA interference high-throughput screening experiments. Journal of Biomolecular Screening. 12 (4), 497-509 (2007).
  55. Yepez, V. A., et al. OCR-Stats: Robust estimation and statistical testing of mitochondrial respiration activities using Seahorse XF Analyzer. PLoS One. 13 (7), 0199938(2018).
  56. Silva, L. P., et al. Measurement of DNA concentration as a normalization strategy for metabolomic data from adherent cell lines. Analytical Chemistry. 85 (20), 9536-9542 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Sprostowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Exploring Mitochondrial Energy Metabolism of Single 3D Microtissue Spheroids using Extracellular Flux Analysis
Posted by JoVE Editors on 3/11/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: Exploring Mitochondrial Energy Metabolism of Single 3D Microtissue Spheroids using Extracellular Flux Analysis. The Representative Results section was updated.

Figure 5 was updated from:

Oxygen consumption rate (OCR) graphs with oligomycin effects on A549, HepG2/C3A, MCF-7, SK-OV-3 cells.
Figure 5: Single or sequential injection of mitochondrial respiratory compounds. Cancer-cell-derived spheroids of MCF-7, HEPG2/C3A, SK-OV-3, and A549 were placed into wells of an XFe96 spheroid microplate in XF RPMI and probed for OCR using the Agilent Seahorse XFe96 analyzer. OCR was measured 5x, after which 2 µg/mL oligomycin (injection Port A: green trace) or 5 µM BAM15 (injection Port A: blue trace or injection port B: green trace) to inhibit the mitochondrial ATP synthase and determine maximal respiratory capacity, respectively. Kinetic OCR data are expressed as % basal (A-D). Maximal respiratory capacity (OCRmax) was calculated as a factor of basal OCR by the equation: OCRmax = OCRBAM15 / OCRbasal. OCRmax was obtained from OCR averages across measurement cycles 8-10 post BAM15 injection with (green bars) and without (blue bars) oligomycin. Data are averages ± SEM from 3-8 individual well replicates across the spheroid assay microplate. Abbreviations: OCR = oxygen consumption rate. Please click here to view a larger version of this figure.

to:

Oligomycin effect on OCR in cancer cell lines; comparison graph; metabolic activity analysis.
Figure 5: Single or sequential injection of mitochondrial respiratory compounds. Cancer-cell-derived spheroids of MCF-7, HEPG2/C3A, SK-OV-3, and A549 were placed into wells of an XFe96 spheroid microplate in XF RPMI and probed for OCR using the Agilent Seahorse XFe96 analyzer. OCR was measured 5x, after which 2 µg/mL oligomycin (injection Port A: green trace) or 5 µM BAM15 (injection Port A: blue trace or injection port B: green trace) to inhibit the mitochondrial ATP synthase and determine maximal respiratory capacity, respectively. Kinetic OCR data are expressed as % basal (A-D). Maximal respiratory capacity (OCRmax) was calculated as a factor of basal OCR by the equation: OCRmax = OCRBAM15 / OCRbasal. OCRmax was obtained from OCR averages across measurement cycles 8-10 post BAM15 injection with (green bars) and without (blue bars) oligomycin. Data are averages ± SEM from 3-8 individual well replicates across the spheroid assay microplate. Abbreviations: OCR = oxygen consumption rate. Please click here to view a larger version of this figure.

Tagi

Tr jwymiarowa hodowla sferoid wmikrop ytki do sferoid wszybko zu ycia tlenusferoidy z kom rek nowotworowychanalizator XFpodstawowy poziom oddychania mitochondrialnegoywotno sferoid wpow oka z poli D lizyny

Powiązane artykuły