Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Badanie metabolizmu energii mitochondrialnej pojedynczych sferoid mikrotkankowych 3D za pomocą analizy strumienia zewnątrzkomórkowego

3.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63346

⸱

3 lutego 2022

 ,  ,  ,  , 
1School of Biosciences, University of Birmingham, 2Nanomedicine, Drug Delivery & Nanotoxicology Lab, School of Pharmacy, University of Birmingham, 3Mitochondrial Profiling Centre, University of Birmingham

W tym artykule

Informacja o sprostowaniu

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Podsumowanie

Te protokoły pomogą użytkownikom badać metabolizm energii mitochondrialnej w sferoidach 3D pochodzących z linii komórek rakowych za pomocą analizy strumienia zewnątrzkomórkowego Seahorse.

Streszczenie

Trójwymiarowe (3D) agregaty komórkowe, zwane sferoidami, stały się w ostatnich latach liderem hodowli komórkowych in vitro. W przeciwieństwie do hodowli komórek jako dwuwymiarowych, jednokomórkowych monowarstw (hodowla 2D), hodowla komórek sferoidalnych promuje, reguluje i wspiera fizjologiczną architekturę komórkową i cechy, które istnieją in vivo, w tym ekspresję białek macierzy zewnątrzkomórkowej, sygnalizację komórkową, ekspresję genów, produkcję białek, różnicowanie i proliferację. Znaczenie hodowli 3D zostało dostrzeżone w wielu dziedzinach badawczych, w tym w onkologii, cukrzycy, biologii komórek macierzystych i inżynierii tkankowej. W ciągu ostatniej dekady opracowano ulepszone metody produkcji sferoidów oraz oceny ich funkcji metabolicznych i losu.

Analizatory strumienia zewnątrzkomórkowego (XF) zostały użyte do zbadania funkcji mitochondriów w mikrotkankach 3D, takich jak sferoidy, przy użyciu płytki wychwytującej wysepki XF24 lub mikropłytki sferoidalnej XFe96. Jednak odrębne protokoły i optymalizacja sondowania metabolizmu energii mitochondrialnej w sferoidach przy użyciu technologii XF nie zostały szczegółowo opisane. W artykule przedstawiono szczegółowe protokoły badania metabolizmu energii mitochondrialnej w pojedynczych sferoidach 3D przy użyciu mikropłytek sferoidalnych z analizatorem XFe96 XF. Wykorzystując różne linie komórek rakowych, wykazano, że technologia XF jest w stanie rozróżnić oddychanie komórkowe w sferoidach 3D nie tylko o różnych rozmiarach, ale także o różnych objętościach, liczbie komórek, zawartości i typie DNA.

Optymalne stężenia mitochondrialnych związków efektorowych oligomycyny, BAM15, rotenonu i antymycyny A są używane do badania określonych parametrów metabolizmu energii mitochondrialnej w sferoidach 3D. W artykule omówiono również metody normalizacji danych uzyskanych ze sferoid i poruszono wiele kwestii, które należy wziąć pod uwagę podczas badania metabolizmu sferoidów przy użyciu technologii XF. Protokół ten pomoże w prowadzeniu badań nad zaawansowanymi modelami sferoidalnymi in vitro.

Wprowadzenie

Postęp w modelach in vitro w badaniach biologicznych nastąpił gwałtownie w ciągu ostatnich 20 lat. Takie modele obejmują obecnie metody narządów na chipie, organoidy i sferoidy mikrotkanek 3D, z których wszystkie stały się wspólnym celem poprawy translacji między badaniami in vitro i in vivo. Wykorzystanie zaawansowanych modeli in vitro, w szczególności sferoid, obejmuje kilka dziedzin badawczych, w tym inżynierię tkankową, badania nad komórkami macierzystymi, nowotwory i biologię chorób1,2,3,4,5,6,7 oraz testy bezpieczeństwa, w tym toksykologia genetyczna8,9,10, toksykologia nanomateriałów11,12,13,14, oraz testy bezpieczeństwa i skuteczności leków8,15,16,17,18,19.

Normalna morfologia komórek jest kluczowa dla biologicznego fenotypu i aktywności. Hodowla komórek w sferoidach mikrotkanek 3D pozwala komórkom przyjąć morfologię, funkcję fenotypową i architekturę, bardziej zbliżoną do tej obserwowanej in vivo, ale trudną do uchwycenia za pomocą klasycznych technik hodowli komórek jednowarstwowych. Zarówno in vivo, jak i in vitro, na funkcję komórkową bezpośredni wpływ ma mikrośrodowisko komórkowe, które nie ogranicza się do komunikacji i programowania komórkowego (np. tworzenie połączeń komórka-komórka, możliwości tworzenia nisz komórkowych); narażenie komórek na hormony i czynniki wzrostu w bezpośrednim otoczeniu (np. narażenie na cytokiny komórkowe w ramach odpowiedzi zapalnej); skład matryc fizycznych i chemicznych (np. czy komórki są hodowane w sztywnym plastiku tkankowym, czy w elastycznym środowisku tkankowym); A co najważniejsze, jak na metabolizm komórkowy wpływa odżywianie i dostęp do tlenu, a także przetwarzanie produktów przemiany materii, takich jak kwas mlekowy.

Analiza strumienia metabolicznego to skuteczny sposób na badanie metabolizmu komórkowego w określonych systemach in vitro. W szczególności technologia XF pozwala na analizę zmian w czasie rzeczywistym w bioenergetyce komórkowej nienaruszonych komórek i tkanek. Biorąc pod uwagę, że wiele wewnątrzkomórkowych zdarzeń metabolicznych zachodzi w ciągu kilku sekund do minut, podejścia funkcjonalne w czasie rzeczywistym mają zasadnicze znaczenie dla zrozumienia zmian w czasie rzeczywistym w komórkowym przepływie metabolicznym w nienaruszonych komórkach i tkankach in vitro.

Ten artykuł zawiera protokoły hodowli linii komórkowych pochodzących z raka: A549 (gruczolakorak płuc), HepG2/C3A (rak wątrobowokomórkowy), MCF-7 (gruczolakorak piersi) i SK-OV-3 (gruczolakorak jajnika) jako modele sferoidalne 3D in vitro przy użyciu metod wymuszonej agregacji (Rysunek 1). Również (i) szczegółowo opisuje, jak badać metabolizm energii mitochondrialnej pojedynczych sferoid 3D za pomocą analizatora Agilent XFe96 XF, (ii) podkreśla sposoby optymalizacji testów XF przy użyciu pojedynczych sferoidów 3D oraz (iii) omawia ważne rozważania i ograniczenia sondowania metabolizmu sferoidów 3D przy użyciu tego podejścia. Co najważniejsze, w artykule opisano, w jaki sposób gromadzone są zestawy danych, które umożliwiają obliczenie wskaźnika zużycia tlenu (OCR) w celu określenia fosforylacji oksydacyjnej, a tym samym funkcji mitochondriów w sferoidach komórkowych. Chociaż nie jest to analizowane pod kątem tego protokołu, szybkość zakwaszenia zewnątrzkomórkowego (ECAR) jest kolejnym parametrem, który jest mierzony wraz z danymi OCR w eksperymentach XF. Jednak ECAR jest często słabo lub nieprawidłowo interpretowany na podstawie zestawów danych XF. Przedstawiamy komentarz dotyczący ograniczeń związanych z obliczaniem ECAR zgodnie z podstawowymi podejściami producenta technologii.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Schemat hodowli od monowarstwy do sferoidów; analiza strumienia zewnątrzkomórkowego, proces normalizacji danych.
Rycina 1: Graficzny schemat generowania sferoidów komórkowych, analizy strumienia zewnątrzkomórkowego oraz dalszych badań. Cztery linie komórek nowotworowych były selektywnie hodowane jako monowarstwy (A), odrywane z kolb hodowlanych i wysiewane do mikropłytek 96-dołkowych o ultraniskim przywieraniu w celu utworzenia sferoidów (B). Komórki raka płuca A549, raka wątroby HepG2/C3A, gruczolakoraka jajnika SK-OV-3 oraz raka piersi MCF-7 wysiewano w zagęszczeniu 1 × 103-8 × 103 komórek/dołek i hodowano do 7 dni, aby utworzyć pojedyncze sferoidy oraz zoptymalizować gęstość wysiewu i czas hodowli sferoidów poprzez ciągłą obserwację i pomiary planimetryczne. Po uformowaniu, pojedyncze sferoidy przemywano bezsurowiczym medium XF i ostrożnie wysiewano do mikropłytek do testów sferoidowych, uprzednio pokrytych poli-D-lizyną (C). Sferoidy poddano analizie strumienia zewnątrzkomórkowego przy użyciu analizatora XFe96, stosując kilka protokołów w celu ustalenia: (1) optymalnej wielkości sferoidu dla podstawowej odpowiedzi oddechowej mitochondriów; (2) zoptymalizowanego miareczkowania inhibitorów oddychania mitochondrialnego; (3) optymalizacji rozmieszczenia sferoidów w dołkach mikropłytki. (D) Po analizach XF zastosowano mikroskopię w kontraście fazowym oraz kwantyfikację DNA sferoidów do normalizacji danych i innych dalszych badań in vitro. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

1. Hodowla linii komórek nowotworowych w formie trójwymiarowych sferoidów in vitro

Linia komórkowaOpisPożywka hodowlanaŹródło
A549Linia komórkowa raka płucaRPMI 1640European Collection of Authenticated Cell Cultures (ECACC)
Pirowinian sodu (1 mM)
Penicylina-streptomycyna (100 U/mL – 100 mg/mL)
10% (v/v) FBS
HepG2/C3ALinia komórkowa raka wątroby, klonalna pochodna macierzystej linii komórkowej HepG2 DMEMAmerican Tissue Culture Collection (ATCC)
penicylina-streptomycyna (100 j./ml – 100 mg/ml)
10% (v/v) FBS
MCF7Linia komórkowa gruczolaka przewodowego piersiRPMI 1640European Collection of Authenticated Cell Cultures (ECACC)
Pirowinian sodu (1 mM)
Penicylina-streptomycyna (100 J/ml – 100 mg/ml)
10% (v/v) FBS
SK-OV-3Linia komórkowa gruczolaka jajnikaRPMI 1640European Collection of Authenticated Cell Cultures (ECACC)
Pirowinian sodu (1 mM)
penicylina-streptomycyna (100 U/ml – 100 mg/ml)
10% (v/v) FBS
Komponentpożywka do testu RPMI (objętość końcowa 50 ml)
Pożywka podstawowaAgilent Seahorse XF RPMI, pH 7,4
Glukoza (sterylny roztwór zapasowy 1 M)11 mM (0,55 ml roztworu zapasowego)
L-glutamina (sterylny roztwór zapasowy 200 mM)2 mM (0,5 ml roztworu stokowego)
Pirowinian sodu (sterylny roztwór stokowy 100 mM)1 mM (0,5 ml roztworu zapasowego)

Tabela 1: Składy pożywek dla linii komórkowych raka oraz pożywek XF.

  1. Wszystkie linie komórkowe należy hodować zgodnie ze standardową aseptyczną techniką hodowli tkanek i potwierdzić brak mycoplasma za pomocą odpowiedniego zestawu testowego.
  2. Linie komórkowe należy hodować w kolbach do hodowli tkanek T75 lub równoważnych, używając zalecanego medium (Tabela 1). Linie komórkowe należy hodować do uzyskania 65-80% konfluencji i regularnie pasażować do maksymalnie 25 pasażu.
  3. Kolby z hodowlą komórkową należy przemyć dwukrotnie zmodyfikowanym roztworem soli fosforanowej Dulbecco (DBPS).
  4. Komórki należy odciąć od ścianek kolb za pomocą 3 mL odczynnika do dysocjacji komórek (patrz Tabela Materiałów), inkubując przez 5 min w 37 °C i potwierdzając odczepienie komórek za pomocą mikroskopu.
  5. Odczepioną zawiesinę komórkową należy delikatnie odessać, aby zapewnić powstanie zawiesiny pojedynczych komórek, a następnie dezaktywować odczynnik do dysocjacji komórek za pomocą 7 mL kompletnego medium do hodowli tkanek.
  6. Komórki należy zebrać poprzez wirowanie przy 300 × g przez 5 min, odrzucić supernatant i resuspenderć komórki w kompletnym medium.
  7. Komórki należy policzyć za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek i miareczkować do pożądanej gęstości komórkowej wymaganej do wysiania.
    UWAGA: Aby wysiać całą płytkę 96-dołkową w ilości 100 µL/dołek przy gęstości 4 × 103 komórek/dołek, komórki powinny zostać zmiareczkowane do 4 × 104 komórek/mL w zalecanej objętości 12 mL.
  8. Zawiesinę komórkową należy przelać do sterylnego zbiorniczka i nalać 100 µL zawiesiny do każdego dołka mikroplate o niskim przywieraniu komórek za pomocą pipety wielokanałowej.
    UWAGA: Wysiewać należy tylko do 60 wewnętrznych dołków mikroplate, a pozostałe wypełnić DPBS. Stworzy to barierę zapobiegającą parowaniu, zapewni jednorodność sferoidów na całej płytce i zminimalizuje efekty brzegowe płytki.
  9. Mikroplate ze sferoidami należy wirować przy 300 × g przez 15 min, aby wymusić agregację komórek w luźne skupiska.
  10. Płytki należy inkubować w 37 °C, 5% CO2 przez minimum 3 dni, aby zapewnić formowanie się sferoidów.
  11. Należy przeprowadzić mikroskopię w kontraście fazowym zgodnie ze standardowymi praktykami laboratoryjnymi w celu monitorowania wzrostu sferoidów. Medium do hodowli komórkowej należy uzupełniać co 3 dni lub dwa razy w tygodniu, wykonując wymianę połowy objętości medium.

2. Badanie metabolizmu energetycznego mitochondriów w pojedynczych sferoidach z wykorzystaniem technologii Extracellular Flux (XF)

  1. Przygotowanie testu (jeden dzień wcześniej)
    1. Sprawdzić żywotność sferoidów za pomocą odwróconego mikroskopu świetlnego z kontrastem fazowym przy powiększeniu 4x, aby upewnić się, że struktura sferoidów, ich morfologia oraz ogólna jednolitość między próbkami są zachowane.
    2. Nawodnić kartridż z czujnikami.
      1. Odmiarkować ~20 mL kalibratora do probówki stożkowej.
      2. Umieścić probówkę stożkową z kalibratorem w inkubatorze bez CO2 w temperaturze 37 °C na noc.
      3. Wyjąć zawartość z zestawu testowego.
      4. Zdjąć kartridż z czujnikami z płyty pomocniczej (utility plate) i położyć go do góry dnem na blacie roboczym obok płyty pomocniczej.
      5. Napipetować 200 µL sterylnej ddH2O do każdego dołka płyty pomocniczej kartridża z czujnikami, używając wielokanałowej pipety P300.
      6. Umieścić kartridż z czujnikami na płycie pomocniczej.
      7. Sprawdzić, czy poziom wody w każdym dołku jest wystarczająco wysoki, aby zanurzyć sondy czujników.
      8. Przenieść zmontowany kartridż z czujnikami do inkubatora bez CO2 w temperaturze 37 °C i pozostawić go na noc.
        UWAGA: Ten krok można wykonać od 12 do 72 h przed rozpoczęciem testu.
  2. Powlekanie mikropłytki do testu sferoidów
    1. Stosując techniki aseptyczne, dodać 30 µL/dołek sterylnego roztworu poli-D-lizyny (0.1 mg/mL) do mikropłytki do sferoidów i inkubować przez 30 min w temperaturze pokojowej.
    2. Odssać roztwór z każdego dołka mikropłytki do sferoidów, odwrócić płytkę i mocno uderzyć nią o papier chłonny, aby usunąć pozostałości roztworu.
    3. Przemyć płytkę dwukrotnie, używając 200 µL/dołek sterylnej ddH2O.
    4. Po ostatnim przemyciu odwrócić mikropłytkę i mocno uderzyć nią o papier chłonny, aby usunąć pozostałą wodę.
    5. Pozostawić płytkę do wyschnięcia na powietrzu przez 30 min przed użyciem lub przechowywać w temperaturze 4 °C do późniejszego wykorzystania.
      UWAGA: Mikropłytkę do testu sferoidów należy powlec klejem molekularnym, aby zapewnić unieruchomienie sferoidów na dnie mikropłytki. Bez kleju molekularnego sferoidy mogą się odrywać, co może zakłócić wyniki testu. Jako alternatywę dla poli-D-lizyny do wstępnego powlekania płytek można zastosować inne kleje molekularne. Płytki wstępnie powleczone można przechowywać w temperaturze 4 °C, jednak przed rozpoczęciem testu należy pozostawić je do wyrównania temperatury do temperatury pokojowej.
  3. Przygotowanie pożywki do testu XF
    1. Przygotować pożywkę XF RPMI zgodnie ze szczegółami w Tabeli 1 i przefiltrować sterylnie za pomocą filtra strzykawkowego 0.22 μm
  4. Przygotowanie testu (1 h przed badaniem)
    1. Podgrzać uzupełnioną pożywkę do testu XF RPMI do 37 °C.
    2. Podgrzać powleczoną mikropłytkę do testu sferoidów w inkubatorze bez CO2 w temperaturze 37 °C lub w łaźni suchej.
    3. Przygotować kartridż z czujnikami.
      1. Wyjąć z inkubatora powietrznego probówkę stożkową z kalibratorem oraz kartridż z czujnikami.
      2. Zdjąć kartridż z czujnikami z płyty pomocniczej i położyć go do góry dnem na powierzchni roboczej.
      3. Używając wielokanałowej pipety P300, odessać wodę z płyty pomocniczej i ją usunąć.
      4. Nalać roztwór kalibratora do sterylnego zbiornika na odczynniki i dodać 200 µL/dołek podgrzanego kalibratora do płyty pomocniczej za pomocą wielokanałowej pipety P300.
      5. Podnieść kartridż z czujnikami i umieścić go z powrotem na płycie pomocniczej, upewniając się, że czujniki są dobrze zanurzone w kalibratorze.
      6. Przenieść zmontowany kartridż z czujnikami z powrotem do inkubatora bez CO2 w temperaturze 37 °C do czasu załadowania roztworów wstrzykiwanych do portów.
  5. Przemycie sferoidów pożywką testową.
    1. Wyjąć płytkę z kulturą sferoidów z inkubatora (37 °C, 5% CO2) i obejrzeć sferoidy pod mikroskopem, aby upewnić się co do ich integralności przed etapami transferu sferoidów.
    2. Napełnić wszystkie dołki płytki ze sferoidami ilością 180 µL/dołek podgrzanej pożywki testowej, w tym dołki do korekcji tła.
    3. Wypełnić częściowo szalkę Petriego o średnicy 7 cm ilością 3 mL pożywki testowej.
    4. Używając pipety wielokanałowej z końcówkami o szerokim otworze, przenieść sferoidy z 96-dołkowej płytki hodowlanej do szalek Petriego 7 cm, ustawiając objętość aspiracji pipety na 10-50 µL.
  6. Wysianie sferoidów na wstępnie powleczoną mikropłytkę do testu sferoidów.
    1. Używając mikroskopu sekcyjnego i urządzenia z lightboxem, przenieść sferoidy z szalki Petriego na mikropłytkę do testu sferoidów zgodnie z poniższym opisem.
      1. Ustawić objętość jednokanałowej pipety z końcówką o szerokim otworze na 20 µL i ostrożnie odessać pojedynczy sferoid. Umieścić końcówkę bezpośrednio w centrum każdego dołka mikropłytki do testu sferoidów i pozwolić grawitacji wypłukać pojedynczy sferoid do centrum każdego dołka; tzn. nie wydmuchiwać żadnej pożywki z końcówki pipety, lecz pozwolić działaniu kapilarnemu wyciągnąć sferoid z końcówki. Aby potwierdzić wypłukanie, zawartość pipety można napipetować z powrotem do szalki Petriego 7 cm pod mikroskopem.
        UWAGA: Wypłukiwanie pojedynczego sferoidu grawitacyjnie trwa zazwyczaj 15-30 s, w zależności od wielkości i gęstości sferoidu. W tym czasie nie należy usuwać pipety. Dołki do korekcji tła powinny być wolne od sferoidów i zawierać wyłącznie pożywkę testową. Pod mikroskopem należy potwierdzić pozycję każdego sferoidu. Każdy sferoid powinien być idealnie umieszczony w centrum każdego dołka.
      2. Po przeniesieniu wszystkich sferoidów na mikropłytkę do testu sferoidów, przenieść płytkę do inkubatora bez CO2 w temperaturze 37 °C na minimum 1 h przed rozpoczęciem testu.

3. Przygotowanie i wprowadzanie związków do kasety czujnika w analizach XF

Strategia iniekcjiZwiązek (port)objętość początkowa w mikropłytce XFe96 (µL)Pożądane końcowe stężenie w dołkuObjętość portu (µL)Końcowa objętość mikrosodków XFe96 po wstrzyknięciu (µL)Stężenie roztworu roboczego
1Oligomycyna (A)1803 $\mu$g/mL2020030 µg/mL
Rotenon (B)2002 µM2022022 µM
Antymycyna A (B)2002 µM2022022 µM
2BAM15 (A)1805 µM2020050 µM
Rotenon (B)2002 µM2022022 µM
Antymycyna A (B)2002 µM2022022 µM

Tabela 2: Stężenia związków mitochondrialnych służących do badania metabolizmu energetycznego mitochondriów w pojedynczych sferoidach 3D przy użyciu analizatora XFe96.

  1. Przygotować roztwory robocze każdego związku o stężeniach podanych w Tabeli 2, wykorzystując w pełni uzupełnione, uprzednio ogrzane podłoże assay XF RPMI.
  2. Zorientować płytkę kartridżową (połączoną z płytką pomocniczą) kolumnowo, od 1 do 12 od lewej do prawej strony.
  3. W przypadku korzystania z prowadnika ładowania, umieścić go na płycie kartridżowej zgodnie z procedurą ładowania studzienek; na przykład, jeśli w pierwszej kolejności ładowany jest port A, należy upewnić się, że A jest widoczny w lewym górnym rogu prowadnika.
  4. Przenieść roztwór roboczy każdego związku do odpowiedniego zbiornika i za pomocą skalibrowanej wielokanałowej pipety P100 nanieść 20 µL do wszystkich odpowiadających im portów. Powtórzyć czynność dla każdego związku w pozostałych portach.
    UWAGA: Jeśli niektóre porty na płycie kartridżowej z sensorem nie są wykorzystywane, można je pozostawić puste lub wypełnić podłożem assay. Jeśli używana jest tylko wybrana grupa portów z daną literą, należy upewnić się, że pozostałe porty odpowiadające tej literze są wypełnione podłożem assay; w przeciwnym razie do studzienki zostanie wstrzyknięte powietrze, co zafałszuje wyniki w tych studzienkach.
  5. Po załadowaniu portów usunąć prowadniki ładowania płyt (jeśli były używane) i przygotować analizator do załadowania kartridża z sensorem.
    UWAGA: Jeśli analiza nie jest przeprowadzana natychmiast po załadowaniu portów, należy ponownie nałożyć pokrywkę na kartridż z sensorem i umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze powietrznym w temperaturze 37 °C do momentu załadowania do urządzenia.

4. Projektowanie testu, strategie wstrzykiwania i akwizycja danych

  1. Przeprowadzenie analizy
    1. Włącz analizator i podłącz go do kontrolera (komputera).
      UWAGA: Można to zweryfikować, sprawdzając status połączenia z instrumentem w panelu widżetów oprogramowania Wave Controller.
    2. Przejdź do strony templates (szablony) w oprogramowaniu WAVE, znajdź plik szablonu analizy dla danego eksperymentu i dwukrotnie kliknij, aby go otworzyć.
      UWAGA: Jeśli szablon analizy nie pojawia się w widoku Templates, zaimportuj plik szablonu do folderu z szablonami z sieciowego dysku udostępnionego lub z pamięci USB.
    3. Aby rozpocząć analizę, kliknij kartę Run Assay (Uruchom analizę).
      UWAGA: Jeśli definicje grup zostały poprawnie przypisane w mapie płytki, analiza będzie gotowa do uruchomienia, co zostanie wskazane przez zielony znacznik wyboru po prawej stronie strony. Na tym etapie można wprowadzić dodatkowe informacje na stronie podsumowania analizy lub pozostawić ją pustą; przejdź do następnego kroku. Ze względu na opóźnioną penetrację modulatorów mitochondrialnych w sferoidach mikro-tkankowych 3D (Rysunek 2), należy zastosować informacje dotyczące protokołu pomiarowego opisane w Tabeli 3.
Okres pomiarowyNumer i port wtryskuSzczegóły pomiaruCzas trwania okresu (h:min:s)
KalibracjaNie dotyczyAnalizatory XF zawsze przeprowadzają tę kalibrację, aby zapewnić dokładność pomiarów.00:20:00 (jest to wartość średnia i może się ona różnić w zależności od urządzenia)
RównoważenieNie dotyczyRównoważenie następuje po kalibracji i jest zalecane.00:10:00
BazalnyNie dotyczyLiczba cykli = 500:30:00
Mieszanie = 3:00
Oczekiwanie = 0:00
Pomiar = 3:00
Oligomycyna / BAM15Iniekcja 1 (Port A)Liczba cykli = 1001:00:00
Mieszanie = 3:00
Oczekiwanie = 0:00
Pomiar = 3:00
Rotenon + antymycyna AWtrysk 2 (Port B)Liczba cykli = 1001:00:00
Mieszanie = 3:00
Oczekiwanie = 0:00
Pomiar = 3:00
Czas całkowity:03:00:00

Tabela 3: Konfiguracja protokołu do badania metabolizmu energetycznego mitochondriów w pojedynczych sferoidach 3D z użyciem analizatora XFe96.

  1. Kliknij start run, aby wyświetlić okno dialogowe save location.
  2. Wprowadź save location dla pliku z wynikami i umieść zmontowany wkład czujnika na tacy termicznej, która wysunie się z drzwiczek po boku analizatora. Poczekaj, aż taca termiczna otworzy się automatycznie, a na ekranie pojawi się komunikat Load Calibrant Utility Plate. Przed wykonaniem poleceń wyświetlanych na ekranie upewnij się, że: i) wkład czujnika jest prawidłowo dopasowany do płyty narzędziowej (Utility plate), ii) pokrywka została zdjęta z wkładu czujnika oraz iii) wkład czujnika jest prawidłowo zorientowany na płycie narzędziowej.
  3. Postępuj zgodnie z poleceniami na ekranie, aby rozpocząć kalibrację wkładu czujnika.
    UWAGA: Czas potrzebny na przeprowadzenie kalibracji wynosi około 10-20 min (dla analiz w 37 °C).
  4. Po kalibracji wkładu czujnika załaduj mikropłytkę ze sferoidami do analizatora, postępując zgodnie z instrukcjami na ekranie kontrolera Wave, aby rozpocząć 12 min etap wyrównywania.
    UWAGA: Zielone pola z białymi haczykami oznaczają „dobrą” kalibrację dla danej studzienki. Jeśli w którejkolwiek studzience kalibracja nie przebiegnie pomyślnie, zostanie ona oznaczona czerwonym polem z białym krzyżykiem. Takie studzienki należy odnotować i wykluczyć z jakiejkolwiek analizy po zakończeniu testu, korzystając z karty modification assay.
  5. Odczekaj, aż analizator automatycznie rozpocznie pomiary linii bazowej po zakończeniu etapu wyrównywania przez urządzenie (zgodnie z protokołem instrumentu).
  6. Aby zakończyć eksperyment, postępuj zgodnie z poleceniami na ekranie kontrolera WAVE.
    UWAGA: Po wyjęciu mikropłytki ze sferoidami z analizatora należy wyrzucić wkład czujnika i odłożyć płytkę ze sferoidami do dalszych analiz, jeśli jest to konieczne (np. do ilościowego oznaczenia dwuniciowego (ds) DNA). Jeśli mikropłytka nie jest wymagana do dalszych analiz, można ją wyrzucić wraz z wkładem czujnika.
  7. Poczekaj na pojawienie się okna dialogowego analizy, aby przejrzeć wyniki lub powrócić do widoku templates.

5. Strategie normalizacji i analizy danych – normalizacja po analizie i analizy pochodne (etapy opcjonalne)

  1. Normalizacja danych
    1. W celu normalizacji danych ze sferoidów należy zapoznać się z serią protokołów dotyczącymi strategii normalizacji danych służących do obliczania rozmiaru i objętości sferoidów oraz ilościowego oznaczania dsDNA w testach sferoidów. Zostały one dołączone jako pliki uzupełniające; patrz Supplemental file 1 oraz Supplemental file 2.
  2. Analiza danych
    1. Aby wyeksportować dane do jednego z automatycznych generatorów analizy, należy postępować zgodnie z poleceniami eksportu danych w kontrolerze WAVE i wybrać generator eksportu odpowiadający typowi testu. Alternatywnie można wyeksportować plik danych i przesłać go do systemu Seahorse analytics.
      UWAGA: Wadą generatorów raportów i systemu Seahorse analytics jest to, że analiza danych jest ograniczona do sposobu zaprojektowania testu XF i nie pozwala na wyciąganie średnich z cykli pomiarowych. Ręczny eksport zbiorów danych z oprogramowania instrumentu pozwala użytkownikowi na dowolność w tym zakresie. Biorąc pod uwagę, że strategia wstrzykiwania do oceny respiracji mitochondrialnej sferoidów 3D prawdopodobnie będzie różnić się od strategii typowego testu „MitoStress”, opracowano serię szablonów arkuszy kalkulacyjnych ułatwiających analizę tych zbiorów danych, specyficznych dla hodowli komórkowych 3D, które zostaną udostępnione na żądanie. Te pliki szablonów dostarczą danych na temat kluczowych parametrów respiracji mitochondrialnej, które szczegółowo opisano i wyjaśniono na Rysunku 2.
    2. Aby przeanalizować dane, należy wyeksportować je jako raport w formie arkusza kalkulacyjnego z oprogramowania kontrolera WAVE i użyć niezależnego szablonu arkusza kalkulacyjnego do analizy.

Analiza oddychania mitochondrialnego; wykres OCR z inhibitorami; fosforylacja ADP; zdolność oksydacyjna.
Rysunek 2: Schematyczne opisy parametrów pochodnych z analiz danych przepływu zewnątrzkomórkowego. Skrót: OCR = szybkość zużycia tlenu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Aby uzyskać dobrze uformowane, zwarte sferoidy, każda linia komórkowa była optymalizowana indywidualnie pod kątem gęstości siewu oraz czasu hodowli (Rycina 3). Linie komórkowe A549, HepG2/C3A i SK-OV-3 początkowo tworzyły luźne agregaty, które nie przekształciły się w okrągłe sferoidy z wyraźnie zdefiniowanymi obrysami aż do 7. dnia hodowli. Z kolei komórki MCF-7 były zdolne do tworzenia sferoidów w ciągu 3 dni. W przypadku wszystkich modeli sferoidów zaobserwowano wyraźną korelację między p...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Główne ustalenia i wyniki
Ten artykuł zawiera szczegółowy protokół badania metabolizmu energii mitochondrialnej pojedynczych sferoid 3D przy użyciu szeregu linii komórkowych pochodzących z raka za pomocą analizatora XFe96 XF. Opracowano i opisano metodę szybkiej hodowli sferoid komórkowych A549, HepG2/C3A, MCF7 i SK-OV-3 przy użyciu technologii odstraszających komórki do wymuszonej agregacji. Protokół ten odnosi się do wielu kwestii związanych z sondowaniem metabolizmu sferoidów za pomocą technologi...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Podziękowania

N.J.C otrzymał nagrodę BBSRC MIBTP CASE Award od Sygnature Discovery Ltd (BB/M01116X/1, 1940003)

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
A549ECACC #86012804Linia komórkowa raka płuc
Agilent Seahorse XF RPMI Medium, pH 7,4Agilent Technologies Inc.103576-100Pożywka testowa XF z 1 mM HEPES, bez czerwieni fenolowej, wodorowęglanu sodu, glukozy, L-glutaminy i pirogronianu sodu
Analizator strumienia zewnątrzkomórkowego Agilent Seahorse XFe96Agilent Technologies Inc.-Przyrząd do pomiaru szybkości sferoidalnego poboru tlenu w pojedynczych sferoidach
Antymycyna AMerck Life ScienceA8674Mitochondrialny kompleks oddechowy III inhibitor
BAM15TOCRIS bio-techne5737Mitochondrialny rozprzęgacz protnoforowy
Mikropłytka czarnościennaGreiner Bio-One655076Do testów
opartych na fluorescencjiPowierzchnia odpychająca komórki CELLSTAR 96 Mikropłytki U UGreiner Bio-One650970Mikropłytki do generowania sferoid
Test żywotności komórek CellTiter-Glo 3DPromegaG9681Test do oznaczania żywotności komórek w sferoidach mikrotkanek 3D
Cultrex Poly-D-LysineR& D Systems marka biotechne3439-100-01Molekularny klej komórkowy do powlekania mikropłytek sferoidalnych XFe96 w celu ułatwienia mocowania sferoidów
D-(+)-GlukozaMerck Life SciencesG8270Suplement do wzrostu kultur komórkowych i pożywki do oznaczania XF
Dulbecco' s Zmodyfikowana pożywka Eagle Medium (DMEM)Gibco11885084Pożywka hodowlana dla sferoid HepG2/C3A
obrazowania rdzenia EVOS XLThermo Fisher ScientificAMEX1000Mikroskop do obrazowania z kontrastem fazowym
Zestaw testowy EZ-PCR MykoplazmaPrzemysł biologiczny20-700-20Badania przesiewowe mykoplazmy w hodowlach komórkowych
FIDŻI to tylko obraz JAnaliza zestawionych obrazów
Surowica bydlęca płoduMerck Life ScienceF7524Suplement do pożywki do hodowli komórkowych
HepG2/C3AATCC #CRL-10741Linia komórkowa raka wątroby, klonalna pochodna macierzystej linii komórkowej HepG2
Mleczan-GloPromegaJ5021Test do pomiaru mleczanu w pożywce do hodowli sferydów
L-glutamina (roztwór 200 mM)Merk Life SciencesG7513Suplement do wzrostu hodowli komórkowych i pożywki testowej XF
Mikroskop stereoskopowy M50Mikrosytemy LeicaLEICAM50Stereoskopowy mikroskop preparacyjny; używany do obsługi sfeorydów
MCF-7ECACC#86012803Linia komórkowa gruczolakoraka piersi
Oligomycyna z Streptomyces diastatochromogenesMerck Life ScienceO4876Inhibitor syntazy ATP
Penicilin-StreptomycynaGibco15140122Antybiotyki dodane do pożywki do hodowli komórkowych
Quant-iT Zestaw do oznaczania dsDNA PicoGreenIazotP7589Analiza dsDNA w spehroidach
RotenonMerck Life ScienceR8875Mitochondrialny kompleks oddechowy I Inhibitor
RPMI 1640Gibco21875091Pożywka hodowlana dla A549, MCF7 i SK-OV-3 sferoidy
Seahorse AnalyticsAgilent Technologies Inc.Kompilacja 421https://seahorseanalytics.agilent.com
Seahorse XFe96 Spheroid FluxPakAgilent Technologies Inc.102905-100Każdy Seahorse XFe96 Spheroid FluxPak zawiera: 6 mikropłytek sferoidalnych Seahorse XFe96 (102978-100), 6 wkładów z czujnikiem XFe96 i 1 butelkę roztworu Seahorse XF Calibrant Solution 500 ml (100840-000)
Pipeta serologiczna: 5, 10 i 25 mlGreiner Bio-One606107; 607107; 760107Materiały eksploatacyjne do hodowli komórkowych
SK-OV-3ECACC #HTB-77Linia
komórkowa gruczolakoraka jajnikaPirogronian sodu (roztwór 100 mM)Merck Life ScienceS8636Suplement do wzrostu kultur komórkowych i pożywki do oznaczania XF
Kolba do hodowli komórkowych T75 cm2Greiner Bio-One658175Kolby poddane hodowli tkankowej do utrzymywania kultur komórkowych
TrypLExpressGibco12604-021Odczynnik do dysocjacji komórek
Oprogramowanie kontrolera falAgilent Technologies Inc.-
Końcówka z szerokim otworemSTARLAB International GmbHE1011-8400Końcówki do pipet z szerokim otworem do obsługi sferoidów
System

Bibliografia

  1. Correa de Sampaio, P., et al. A heterogeneous in vitro three dimensional model of tumour-stroma interactions regulating sprouting angiogenesis. PLoS One. 7 (2), 30753(2012).
  2. Amann, A., et al. Development of an innovative 3D cell culture system to study tumour-stroma interactions in non-small cell lung cancer cells. PLoS One. 9 (3), 92511(2014).
  3. Russell, S., Wojtkowiak, J., Neilson, A., Gillies, R. J. Metabolic profiling of healthy and cancerous tissues in 2D and 3D. Scientific Reports. 7 (1), 15285(2017).
  4. Zanoni, M., et al. 3D tumor spheroid models for in vitro therapeutic screening: a systematic approach to enhance the biological relevance of data obtained. Scientific Reports. 6, 19103(2016).
  5. Song, Y., et al. Patient-derived multicellular tumor spheroids towards optimized treatment for patients with hepatocellular carcinoma. Journal of Experimental and Clinica Cancer Research. 37 (1), 109(2018).
  6. Courau, T., et al. Cocultures of human colorectal tumor spheroids with immune cells reveal the therapeutic potential of MICA/B and NKG2A targeting for cancer treatment. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 7 (1), 74(2019).
  7. Ivanova, E., et al. Use of ex vivo patient-derived tumor organotypic spheroids to identify combination therapies for HER2 mutant non-small cell lung cancer. Clinical Cancer Research. 26 (10), 2393-2403 (2020).
  8. Mandon, M., Huet, S., Dubreil, E., Fessard, V., Le Hegarat, L. Three-dimensional HepaRG spheroids as a liver model to study human genotoxicity in vitro with the single cell gel electrophoresis assay. Scientific Reports. 9 (1), 10548(2019).
  9. Stampar, M., et al. Hepatocellular carcinoma (HepG2/C3A) cell-based 3D model for genotoxicity testing of chemicals. Science of the Total Environment. 755, 143255(2020).
  10. Coltman, N. J., et al. Application of HepG2/C3A liver spheroids as a model system for genotoxicity studies. Toxicology Letters. 345, 34-45 (2021).
  11. Tchoryk, A., et al. Penetration and uptake of nanoparticles in 3D tumor spheroids. Bioconjugate Chemistry. 30 (5), 1371-1384 (2019).
  12. Leite, P. E. C., et al. Suitability of 3D human brain spheroid models to distinguish toxic effects of gold and poly-lactic acid nanoparticles to assess biocompatibility for brain drug delivery. Partical Fibre Toxicology. 16 (1), 22(2019).
  13. Elje, E., et al. Hepato(Geno)toxicity assessment of nanoparticles in a HepG2 liver spheroid model. Nanomaterials. 10 (3), 545(2020).
  14. Conway, G. E., et al. Adaptation of the in vitro micronucleus assay for genotoxicity testing using 3D liver models supporting longer-term exposure durations. Mutagenesis. 35 (4), 319-330 (2020).
  15. Wang, Z., et al. HepaRG culture in tethered spheroids as an in vitro three-dimensional model for drug safety screening. Journal of Applied Toxicology. 35 (8), 909-917 (2015).
  16. Proctor, W. R., et al. Utility of spherical human liver microtissues for prediction of clinical drug-induced liver injury. Archives of Toxicology. 91 (8), 2849-2863 (2017).
  17. Basharat, A., Rollison, H. E., Williams, D. P., Ivanov, D. P. HepG2 (C3A) spheroids show higher sensitivity compared to HepaRG spheroids for drug-induced liver injury (DILI). Toxicology and Applied Pharmacology. 408, 115279(2020).
  18. Benning, L., Peintner, A., Finkenzeller, G., Peintner, L. Automated spheroid generation, drug application and efficacy screening using a deep learning classification: a feasibility study. Scientific Reports. 10 (1), 11071(2020).
  19. Mittler, F., et al. High-content monitoring of drug effects in a 3D spheroid model. Frontiers in Oncology. 7, 293(2017).
  20. Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. The Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).
  21. Benz, R., McLaughlin, S. The molecular mechanism of action of the proton ionophore FCCP (carbonylcyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone). Biophysical Journal. 41 (3), 381-398 (1983).
  22. Kasianowicz, J., Benz, R., McLaughlin, S. The kinetic mechanism by which CCCP (carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone) transports protons across membranes. The Journal of Membrane Biology. 82 (2), 179-190 (1984).
  23. Kenwood, B. M., et al. Identification of a novel mitochondrial uncoupler that does not depolarize the plasma membrane. Molecular Metabolism. 3 (2), 114-123 (2013).
  24. Mitchell, P. Coupling of phosphorylation to electron and hydrogen transfer by a chemi-osmotic type of mechanism. Nature. 191, 144-148 (1961).
  25. Alexopoulos, S. J., et al. Mitochondrial uncoupler BAM15 reverses diet-induced obesity and insulin resistance in mice. Nature Communications. 11 (1), 2397(2020).
  26. Chen, S. -Y., et al. Mitochondrial uncoupler SHC517 reverses obesity in mice without affecting food intake. Metabolism - Clinical and Experimental. 117, 154724(2021).
  27. Goedeke, L., Shulman, G. I. Therapeutic potential of mitochondrial uncouplers for the treatment of metabolic associated fatty liver disease and NASH. Molecular Metabolism. 46, 101178(2021).
  28. Hill, B. G., et al. Integration of cellular bioenergetics with mitochondrial quality control and autophagy. Biological chemistry. 393 (12), 1485-1512 (2012).
  29. Demine, S., Renard, P., Arnould, T. Mitochondrial uncoupling: a key controller of biological processes in physiology and diseases. Cells. 8 (8), 795(2019).
  30. Wang, J., et al. Uncoupling effect of F16 is responsible for its mitochondrial toxicity and anticancer activity. Toxicological Sciences. 161 (2), 431-442 (2018).
  31. Tretter, L., Chinopoulos, C., Adam-Vizi, V. Plasma membrane depolarization and disturbed Na+ homeostasis induced by the protonophore carbonyl cyanide-p-trifluoromethoxyphenyl-hydrazon in isolated nerve terminals. Molecular Pharmacology. 53 (4), 734-741 (1998).
  32. Connop, B. P., Thies, R. L., Beyreuther, K., Ida, N., Reiner, P. B. Novel effects of FCCP [carbonyl cyanide p-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone] on amyloid precursor protein processing. Journal of neurochemistry. 72 (4), 1457-1465 (1999).
  33. Stöckl, P., et al. Partial uncoupling of oxidative phosphorylation induces premature senescence in human fibroblasts and yeast mother cells. Free Radical Biology and Medicine. 43 (6), 947-958 (2007).
  34. Firsov, A. M., et al. Protonophoric action of BAM15 on planar bilayers, liposomes, mitochondria, bacteria and neurons. Bioelectrochemistry. 137, 107673(2021).
  35. Dranka, B. P., Hill, B. G., Darley-Usmar, V. M. Mitochondrial reserve capacity in endothelial cells: The impact of nitric oxide and reactive oxygen species. Free Radical Biology and Medicine. 48 (7), 905-914 (2010).
  36. Eilenberger, C., Rothbauer, M., Ehmoser, E. K., Ertl, P., Kupcu, S. Effect of spheroidal age on sorafenib diffusivity and toxicity in a 3D HepG2 spheroid model. Scientific Reports. 9 (1), 4863(2019).
  37. vanden Brand, D., Veelken, C., Massuger, L., Brock, R. Penetration in 3D tumor spheroids and explants: Adding a further dimension to the structure-activity relationship of cell-penetrating peptides. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1860 (6), 1342-1349 (2018).
  38. Niora, M., et al. Head-to-head comparison of the penetration efficiency of lipid-based nanoparticles into tumor spheroids. ACS Omega. 5 (33), 21162-21171 (2020).
  39. Millard, M., et al. Drug delivery to solid tumors: the predictive value of the multicellular tumor spheroid model for nanomedicine screening. International Journal of Nanomedicine. 12, 7993-8007 (2017).
  40. Ruas, J. S., et al. Underestimation of the maximal capacity of the mitochondrial electron transport system in oligomycin-treated cells. PLoS One. 11 (3), 0150967(2016).
  41. Benton, G., DeGray, G., Kleinman, H. K., George, J., Arnaoutova, I. In vitro microtumors provide a physiologically predictive tool for breast cancer therapeutic screening. PLoS One. 10 (4), 0123312(2015).
  42. Hirpara, J., et al. Metabolic reprogramming of oncogene-addicted cancer cells to OXPHOS as a mechanism of drug resistance. Redox Biology. 25, 101076(2019).
  43. Ware, M. J., et al. Generation of homogenous three-dimensional pancreatic cancer cell spheroids using an improved hanging drop technique. Tissue Engineering. Part C, Methods. 22 (4), 312-321 (2016).
  44. Song, Y., et al. TGF-β-independent CTGF induction regulates cell adhesion mediated drug resistance by increasing collagen I in HCC. Oncotarget. 8 (13), 21650-21662 (2017).
  45. Wrzesinski, K., et al. HepG2/C3A 3D spheroids exhibit stable physiological functionality for at least 24 days after recovering from trypsinisation. Toxicology Research. 2 (3), 163-172 (2013).
  46. Gaskell, H., et al. Characterization of a functional C3A liver spheroid model. Toxicology Research. 5 (4), 1053-1065 (2016).
  47. Takahashi, Y., et al. 3D spheroid cultures improve the metabolic gene expression profiles of HepaRG cells. Bioscience Reports. 35 (3), 00208(2015).
  48. Hendriks, D. F. G., Puigvert, L. F., Messner, S., Mortiz, W., Ingelman-Sundberg, M. Hepatic 3D spheroid models for the detection and study of compounds with cholestatic liability. Scientific Reports. 6, 35434(2016).
  49. Leung, B. M., Lesher-Perez, S. C., Matsuoka, T., Moraes, C., Takayama, S. Media additives to promote spheroid circularity and compactness in hanging drop platform. Biomaterials Science. 3 (2), 336-344 (2015).
  50. Cavo, M., et al. A synergic approach to enhance long-term culture and manipulation of MiaPaCa-2 pancreatic cancer spheroids. Scientific Reports. 10 (1), 10192(2020).
  51. Carlsson, J., Yuhas, J. M. Liquid-overlay culture of cellular spheroids. Recent Results in Cancer Research. 95, 1-23 (1984).
  52. Costa, E. C., Gaspar, V. M., Coutinho, P., Correia, I. J. Optimization of liquid overlay technique to formulate heterogenic 3D co-cultures models. Biotechnology and Bioengineering. 111 (8), 1672-1685 (2014).
  53. Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays. Journal of Biomolecular Screening. 8 (5), 566-570 (2003).
  54. Zhang, X. D., et al. The use of strictly standardized mean difference for hit selection in primary RNA interference high-throughput screening experiments. Journal of Biomolecular Screening. 12 (4), 497-509 (2007).
  55. Yepez, V. A., et al. OCR-Stats: Robust estimation and statistical testing of mitochondrial respiration activities using Seahorse XF Analyzer. PLoS One. 13 (7), 0199938(2018).
  56. Silva, L. P., et al. Measurement of DNA concentration as a normalization strategy for metabolomic data from adherent cell lines. Analytical Chemistry. 85 (20), 9536-9542 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Sprostowanie


Formal Correction: Erratum: Exploring Mitochondrial Energy Metabolism of Single 3D Microtissue Spheroids using Extracellular Flux Analysis
Posted by JoVE Editors on 3/11/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: Exploring Mitochondrial Energy Metabolism of Single 3D Microtissue Spheroids using Extracellular Flux Analysis. The Representative Results section was updated.

Figure 5 was updated from:

Oxygen consumption rate (OCR) graphs with oligomycin effects on A549, HepG2/C3A, MCF-7, SK-OV-3 cells.
Figure 5: Single or sequential injection of mitochondrial respiratory compounds. Cancer-cell-derived spheroids of MCF-7, HEPG2/C3A, SK-OV-3, and A549 were placed into wells of an XFe96 spheroid microplate in XF RPMI and probed for OCR using the Agilent Seahorse XFe96 analyzer. OCR was measured 5x, after which 2 µg/mL oligomycin (injection Port A: green trace) or 5 µM BAM15 (injection Port A: blue trace or injection port B: green trace) to inhibit the mitochondrial ATP synthase and determine maximal respiratory capacity, respectively. Kinetic OCR data are expressed as % basal (A-D). Maximal respiratory capacity (OCRmax) was calculated as a factor of basal OCR by the equation: OCRmax = OCRBAM15 / OCRbasal. OCRmax was obtained from OCR averages across measurement cycles 8-10 post BAM15 injection with (green bars) and without (blue bars) oligomycin. Data are averages ± SEM from 3-8 individual well replicates across the spheroid assay microplate. Abbreviations: OCR = oxygen consumption rate. Please click here to view a larger version of this figure.

to:

Oligomycin effect on OCR in cancer cell lines; comparison graph; metabolic activity analysis.
Figure 5: Single or sequential injection of mitochondrial respiratory compounds. Cancer-cell-derived spheroids of MCF-7, HEPG2/C3A, SK-OV-3, and A549 were placed into wells of an XFe96 spheroid microplate in XF RPMI and probed for OCR using the Agilent Seahorse XFe96 analyzer. OCR was measured 5x, after which 2 µg/mL oligomycin (injection Port A: green trace) or 5 µM BAM15 (injection Port A: blue trace or injection port B: green trace) to inhibit the mitochondrial ATP synthase and determine maximal respiratory capacity, respectively. Kinetic OCR data are expressed as % basal (A-D). Maximal respiratory capacity (OCRmax) was calculated as a factor of basal OCR by the equation: OCRmax = OCRBAM15 / OCRbasal. OCRmax was obtained from OCR averages across measurement cycles 8-10 post BAM15 injection with (green bars) and without (blue bars) oligomycin. Data are averages ± SEM from 3-8 individual well replicates across the spheroid assay microplate. Abbreviations: OCR = oxygen consumption rate. Please click here to view a larger version of this figure.

Tagi

Tr jwymiarowa hodowla sferoid wmikrop ytki do sferoid wszybko zu ycia tlenusferoidy z kom rek nowotworowychanalizator XFpodstawowy poziom oddychania mitochondrialnegoywotno sferoid wpow oka z poli D lizyny
Badanie metabolizmu energii mitochondrialnej pojedynczych sferoid mikrotkankowych 3D za pomocą analizy strumienia zewnątrzkomórkowego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.