Artykuł metodologiczny

Dynamiczne monitorowanie serokonwersji za pomocą wieloanalitowego testu immunobeadowego w kierunku Covid-19

DOI:

10.3791/63352

⸱

16 lutego 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Anatomy & Cell Biology, Rush University Medical Center, 2Department of Microbial Pathogens and Immunity, Rush University Medical Center, 3Department of Pathology, Rush University Medical Center

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten artykuł opisuje wygodną metodę monitorowania dynamicznych zmian w mianach przeciwciał dla dwóch izotypów immunoglobulin jednocześnie (IgA, IgM lub IgG) wynikających z odpowiedzi immunologicznej na zakażenie SARS-CoV-2 lub szczepienie. Ten "Multianalitowy panel odpowiedzi immunologicznej Covid-19" wykorzystuje trzy pośrednie testy immunologiczne zbudowane na kodowanych mikrosferach, które są odczytywane za pomocą przepływowego czytnika multipleksowego z funkcją "dwukanałową".

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Technologie multipleksowe do wspólnego badania wielu biomarkerów istnieją od kilkudziesięciu lat; jednak metody oceny wielu epitopów na tym samym analicie pozostają ograniczone. W niniejszym raporcie opisano rozwój i optymalizację multipleksowanego testu immunokulkowego do testów serologicznych powszechnych izotypów immunoglobulin (np. IgA, IgM i IgG) związanych z odpowiedzią immunologiczną na zakażenie SARS-CoV-2 lub szczepienie. Testy przeprowadzono przy użyciu przepływowego, multipleksowego czytnika fluorescencyjnego z możliwością pracy dwukanałowej. Optymalizacje koncentrowały się na czasie wychwytywania analitu, stężeniu przeciwciał wykrywania i czasie inkubacji przeciwciał detekcji. Charakterystykę skuteczności testu analitycznego (np. zakres testu (w tym dolną i górną granicę oznaczalności) oraz precyzję wewnątrz i między testami) ustalono dla kombinacji serotypów IgG/IgM lub IgA/IgM w tandemie przy użyciu trybu "dwukanałowego". Czas wychwytywania analitu wynoszący 30 minut dla IgG, 60 minut dla IgM i 120 minut dla IgA był odpowiedni dla większości zastosowań, zapewniając równowagę między wydajnością testu a przepustowością. Zaobserwowano optymalną inkubację przeciwciał detekcyjnych w stężeniu 4 μg/ml przez 30 minut, które są zalecane do zastosowań ogólnych, biorąc pod uwagę ogólną doskonałą precyzję (procentowy współczynnik wariancji (%CV) ≤ 20%) i obserwowane wartości czułości. Zakres dynamiki izotypu IgG obejmował kilka rzędów wielkości dla każdego testu (Spike S1, nukleokapsyd i glikoproteiny błonowe), co wspiera solidne oceny miana przy współczynniku rozcieńczenia 1:500 do zastosowań klinicznych. Na koniec zoptymalizowany protokół zastosowano do monitorowania serokonwersji Spike S1 u osób (n = 4), które ukończyły schemat szczepienia przeciwko SARS-CoV-2. W tej kohorcie zaobserwowano, że poziomy IgG Spike S1 osiągają maksymalne miana po 14 dniach od podania drugiej dawki, przy znacznie wyższej (~40-krotnej) intensywności sygnału niż izotypy IgM lub IgA. Co ciekawe, zaobserwowaliśmy bardzo zmienne tempo zaniku miana Spike S1 IgG, które było w dużej mierze zależne od pacjenta, co będzie tematem przyszłych badań.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jednoczesny pomiar wielu biomarkerów związanych z chorobą w próbkach biologicznych pozwala na opisowy i predykcyjny wgląd w procesy patologiczne. Podczas gdy konwencjonalne procedury immunologiczne z pojedynczym analitem, takie jak testy immunoenzymatyczne (ELISA), są podstawą analiz ilościowych zarówno w warunkach klinicznych, jak i badawczych, techniki te mogą mieć znaczne ograniczenia dotyczące przepustowości, ilości próbki wymaganej do każdego pomiaru i opłacalności, które znacznie ograniczają badanie wielu elementów biologicznych, które często przeplatają się w przebiegu choroby1. Technologia multipleksowania oparta na mikrosferze stała się niezastąpioną platformą zarówno dla ośrodków diagnostycznych, jak i badawczych ze względu na jej zdolność do łączenia testów w celu zwiększenia przepustowości laboratorium, złagodzenia niedoboru próbek i zmniejszenia liczby powtarzających się testów w celu maksymalizacji oszczędności kosztów1,2,3,4. Ostatnio wprowadzono dalsze rozszerzenie tej mocy multipleksowania za pomocą instrumentów posiadających możliwości podwójnego reportera. Funkcja podwójnego reportera implementuje dwa kanały fluorescencyjne do detekcji, zapewniając kolejny wymiar multipleksowania, umożliwiając wykrywanie wielu epitopów na tym samym analicie.

Koronawirus zespołu ciężkiej ostrej niewydolności oddechowej 2 (SARS-CoV-2) jest patogenem odpowiedzialnym za obecną pandemię choroby koronawirusowej 2019 (COVID-19)5. Podczas gdy testy RT-PCR mają kluczowe znaczenie dla potwierdzenia zakażenia na początku przebiegu choroby, badania serologiczne mian przeciwciał okazały się niezbędne do dokładnej i pełnej krytyki osób pod kątem wcześniejszej ekspozycji lub powrotu do zdrowia; odpowiedź na szczepienia; i/lub ocena skuteczności szczepionki Covid-19 6,7.

Ten raport przedstawia metody pomiaru serokonwersji dla wielu antygenów wirusa SARS-CoV-2, które wykorzystują oparty na przepływie, podwójny system raportowania czytnika multipleksowego. W szczególności opisano jednoczesne wykrywanie dwóch podtypów przeciwciał (skonfigurowanych jako IgG/IgM lub IgA/IgM) dla panelu antygenów SARS-CoV-2 3-plex, który obejmuje testy na glikoproteiny Spike S1, nukleokapsyd i błonę (inaczej Matrix). Podejście to stanowi idealne przedsięwzięcie do uchwycenia podłużnej serokonwersji i stanowi cenne narzędzie w arsenale przeciwko pandemii Covid-19.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszyscy badani zostali zapisani za pisemną świadomą zgodą z pełną aprobatą Institutional Review Board (IRB) Rush University Medical Center zgodnie z protokołem ORA 20101207 przestrzegając wszystkich wytycznych instytucjonalnych dotyczących etycznego prowadzenia badań. Krew pobrano za pomocą konwencjonalnej flebotomii do lawendowych wakutainerów (K2EDTA) i przetworzono zgodnie z zalecanymi protokołami. Uzyskane osocze zostało zarchiwizowane w temperaturze -80 °C do czasu przeprowadzenia oceny.

1. Przygotowanie mikrosfer sprzężonych z antygenem

  1. Wybierz trzy różne fiolki z mikrosferami magnetycznymi z unikalnymi obszarami kulek, zapisując identyfikator kulki i informacje o partii dla każdej użytej fiolki.
    UWAGA: Poniższe kroki zostaną wykonane dla każdego odrębnego regionu mikrosfery. Mikrosfery są wrażliwe na światło i należy je chronić przed długotrwałym działaniem światła. Podczas etapów prania należy uważać, aby nie naruszyć mikrosfer. W przypadku zakłóceń odczekaj drugie 60 sekund separacji.
  2. Wiruj mikrosferę przez 60 s i sonikuj przez 5 minut przed użyciem, aby zdysocjować zagregowane kulki.
  3. Przenieś 1,0 x 106 kulek do 1,5 ml niskobiałkowych probówek wirówkowych.
  4. Włóż rurkę do separatora magnetycznego i pozwól, aby separacja nastąpiła przez 60 sekund. Trzymając rurkę nadal w separatorze magnetycznym, ostrożnie usuń supernatant, nie naruszając osadu kulkowego.
  5. Wyjmij probówkę z separatora magnetycznego, ponownie zawieś kulki za pomocą 100 μl wody klasy HPLC i wiruj przez 30 sekund. Umieść probówkę z powrotem w separatorze magnetycznym na 60 s, a następnie usuń supernatant. Powtórz ten protokół prania dwukrotnie.
  6. Wyjąć probówkę z separatora magnetycznego i ponownie zawiesić umyte mikrosfery w 90 μl 100 mM jednozasadowego fosforanu sodu o pH 6,2 (bufor aktywacyjny) przez wirowanie przez 30 s.
  7. Dodać 10 μl 50 mg/ml Sulfo-NHS (rozcieńczonego buforem aktywacyjnym) do mikrosfer i delikatnie wirować przez 10 s. Dodać 10 μl 50 mg/ml roztworu EDC (rozcieńczonego buforem aktywacyjnym) i delikatnie wirować przez 10 s. Inkubować mikrosfery przez 20 minut w temperaturze pokojowej (RT) z delikatnym wirem co 10 minut.
  8. Powtórz kroki mycia 1,4-1,5 z 50 mM MES, pH 5,0 (bufor sprzęgający) zamiast wody klasy LC/MS, w sumie dwa mycia.
  9. Wyjąć probówkę z separatora magnetycznego i ponownie zawiesić kulki ze 100 μl buforu sprzęgającego za pomocą wiru przez 30 s, a następnie natychmiast dodać żądaną ilość białka.
  10. Doprowadzić całkowitą objętość do 150 μl za pomocą bufora sprzęgającego. Mieszać reakcję sprzęgania wirowego przez 30 s i inkubować przez 2 godziny przez obrót w temperaturze RT.
    UWAGA: Dla testów zdefiniowanych w niniejszym dokumencie koniugacje przeprowadzono z następującymi stężeniami białka: Spike S1: 5 μg; Nukleokapsyd: 5 μg; Membrana: 12,5 μg.
  11. Powtórz etap płukania 1.4 z solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) -1% albuminą surowicy koziej, 0,01% polisorbatem-20 (buforem hartującym) zamiast wody klasy LC/MS, w sumie dwa płukania. Ponownie zawiesić przemyte mikrosfery w 100 μl buforu hartowniczego zawierającego 0,05% azydku sodu wirowo przez 30 s.
    UWAGA: Pozwól koralikom całkowicie ugasnąć przez co najmniej 6 godzin przed przystąpieniem do jakiejkolwiek innej procedury.
  12. Policz liczbę odzyskanych mikrosfer za pomocą automatycznego licznika komórek lub hemocytometru. Zapisz zaobserwowane stężenie kulek.
  13. Sprzężone mikrosfery przechowywać w lodówce w temperaturze 4 °C w ciemności.

2. Procedury

  1. Wydajność testu (protokół podstawowy)
    1. Ponownie zawiesić sprzężone mikrosfery za pomocą wiru na 30 s i sonikować przez ~60-90 s.
    2. Usuń wymaganą ilość koloidu z każdego koloidu kulek z odpowiedniej probówki i połącz koloidy kulek w nowej probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml.
    3. Włóż rurkę do separatora magnetycznego i pozwól, aby separacja nastąpiła przez 60 sekund. Trzymając rurkę nadal w separatorze magnetycznym, ostrożnie usuń supernatant, nie naruszając osadu kulkowego.
    4. Wyjmij kulki z separatora, ponownie zawieś je ze 100 μl PBS-1% albuminy surowicy bydlęcej, 0,01% polisorbatu-20 (bufor testowy) i wiruj przez 30 s. Umieść probówkę w separatorze magnetycznym i pozwól na separację przez 60 s. Powtórz ten protokół prania (tj. kroki 2.1.3-2.1.4) dwukrotnie
    5. Dostosuj stężenie mieszaniny mikrosfer roboczych 3-plex, dodając odpowiednią objętość buforu testowego, aby uzyskać końcowe stężenie 100 mikrosfer na 1 μl dla każdego celu.
    6. Podwielokrotność 12,5 μl mieszaniny mikrosfer przygotowanej w kroku 2.1.5 do każdego dołka płytki 384-dołkowej lub 25 μl do każdej studzienki płytki 96-dołkowej.
    7. Rozcieńczyć próbki osocza/surowicy 500-krotnie w buforze testowym. Przygotować próbki wzorcowe zgodnie z pożądanym miareczkowaniem.
    8. Dodać 12,5 μl buforu do oznaczania jako próbkę ślepą i dodać każdą z rozcieńczonych próbek lub wzorców do każdego wyznaczonego dołka na 384-dołkowej płytce do pobierania próbek lub 25 μl ślepej, rozcieńczonej próbki lub wzorca do każdego dołka na 96-dołkowej płytce do pobierania próbek.
    9. Przykryj płytkę aluminiową uszczelką lub folią i inkubuj przez 1 godzinę w temperaturze suchej na wytrząsarce płytowej ustawionej na 700 obr./min.
      UWAGA: Schemat krzywych rozcieńczania znajduje się w tabeli 1.
    10. Przygotować roztwór przeciwciał wykrywających przeciwciała anty-ludzkie (roztwory przeciwciał drugorzędowych) o stężeniu 4 μg/ml z buforem do oznaczania, jak określono w kroku 2.1.11.
    11. Przygotować przeciwciała przeciwko ludzkim IgM, sprzężone z Super Bright 436 (SB)/Kozioł-anty-ludzka IgA, skoniugowane przeciwciała wykrywające fikoerytrynę (PE) w stężeniu 4 μg/ml; lub przeciwciała przeciwko ludzkim IgM, SB Sprzężone/Koziołko-anty-ludzkiemu IgG, PE Sprzężone przeciwciała wykrywające w 4 μg/ml.
      UWAGA: W przypadku płytki 384-dołkowej wymagane jest 12,5 μl/basenik przygotowanego roztworu przeciwciał drugorzędowych, a w przypadku formatu płytki 96-dołkowej wymagane jest 25 μL/basenik.
    12. Umieść płytkę na separatorze magnetycznym, szybko umyj i mocno odwróć nad pojemnikiem na zagrożenie biologiczne, aby usunąć płyn ze studni. Trzymając talerz nadal odwrócony, mocno uderz nim o gruby zwitek papieru.
    13. Przemyć każdą studzienkę 100 μl buforu do oznaczania i usunąć ciecz przez wymuszoną inwersję nad pojemnikiem stanowiącym zagrożenie biologiczne, jak opisano wcześniej. Powtórz te kroki (2.1.12-2.1.13), co daje w sumie dwa prania. Wyrzuć wszystkie zużyte zwitki papieru do pojemnika na zagrożenie biologiczne.
    14. Dodać 12,5 μl roztworu roboczego przeciwciała wtórnego do każdego dołka płytki 384-dołkowej lub 25 μl do każdego dołka płytki 96-dołkowej. Przykryj płytkę aluminiową uszczelką lub folią i inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej na wytrząsarce płytowej ustawionej na 700 obr./min.
    15. Powtórz kroki prania 2.1.12-2.1.13
    16. Dodać 75 μl buforu testowego do każdego dołka na płytce 384-dołkowej lub 100 μl do każdego dołka płytki 96-dołkowej. Przykryj płytkę aluminiową uszczelką lub folią i inkubuj przez 5 minut w temperaturze suchej na wytrząsarce płytowej ustawionej na 700 obr./min.
    17. Analizuj 60 μl za pomocą analizatora przyrządów zgodnie z instrukcją obsługi systemu.
  2. Optymalizacja czasu inkubacji pobierania próbek
    1. Wykonaj czynności opisane w sekcji 2.1, stosując czas inkubacji wynoszący 30 min, 60 min i 120 min w kroku 2.1.9.
      UWAGA: Inkubacje mogą być przeprowadzane albo z oddzielnymi płytkami, albo przez pauzę na kroku 2.1.6 do czasu przejścia do kroku 2.1.9. aby osiągnąć pożądane czasy inkubacji.
    2. Kontynuuj odczyt płytki na analizatorze, używając 60 μl mieszaniny testowej zgodnie z zaleceniami producenta.
  3. Optymalizacja stężenia przeciwciał drugorzędowych
    1. Wykonać tę procedurę zgodnie z opisem w sekcji 2.1, z wyjątkiem końcowych stężeń odczynników w roztworze roboczym przeciwciał drugorzędowych (przygotowanym w kroku 2.1.10-2.1.11) zmodyfikowanym w następujący sposób:
      Kozie przeciwciała anty-ludzkie (lub królicze) IgM, sprzężone SB wykrywające 8, 4, 2, 1 i 0,5 μg/ml.
      Kozie przeciwciała anty-ludzkie (lub królicze) IgA, PE-sprzężone przeciwciała wykrywające 8, 4, 2, 1 i 0,5 μg/ml.
      Kozio-anty-ludzkie (lub królicze) przeciwciała IgG, PE-sprzężone przeciwciała wykrywające przy 8, 4, 2, 1 i 0,5 μg/ml.
      Kozie przeciwciała anty-ludzkie (lub królicze) IgG, koniugat PE/kozioł anty-ludzki (lub króliczy) IgM, SB-sprzężone przeciwciała wykrywające przy 8, 4, 2, 1 i 0,5 μg/ml.
      Kozie przeciwciała anty-ludzkie (lub królicze) IgA, koniugat PE/kozioł anty-ludzki (lub króliczy) IgM, SB-koniugowane przeciwciała wykrywające przy 8, 4, 2, 1 i 0,5 μg / ml.
    2. Kontynuuj odczyt płytki na analizatorze, używając 60 μl mieszaniny testowej zgodnie z zaleceniami producenta.
  4. Optymalizacja czasu inkubacji przeciwciał wtórnych
    1. Wykonaj tę procedurę zgodnie z opisem w sekcji 2.1 z 15 minutami, 30 minutami, 60 minutami i 120 minutami czasu inkubacji określonymi w kroku 2.1.14.
    2. Kontynuuj odczyt płytki na analizatorze, używając 60 μl mieszaniny testowej zgodnie z zaleceniami producenta.
  5. Ocena badanych próbek za pomocą zoptymalizowanych testów dwukanałowych
    1. Pobrać próbki osocza pacjenta (n = 4) w dniach -21, -11, -1/0, +14, +28, +60, +90 i +120 w stosunku do zakończenia podawania szczepionki Covid-19 (tj. drugiej dawki).
      UWAGA: Dzień 0 reprezentuje punkt czasowy, w którym szczepienie zostało zakończone.
    2. Wszystkie testy należy wykonać przy użyciu protokołu podstawowego (sekcja 2.1.) jako dwukanałowego testu IgG/IgM lub IgA/IgM.
    3. Znormalizuj wyniki do maksymalnej obserwowanej wartości mediany intensywności fluorescencji (MFI) dla każdej specyficznej immunoglobuliny i testu.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Typowe wyniki testów i oceny wydajności
Testy immunobeadowe zwykle zapewniają krzywą sigmoidalną, gdy są oceniane w kilku (logarytmicznych) rzędach wielkości, jak pokazano w każdym z paneli przedstawionych w Rysunek 1. Użytkownik musi eksperymentalnie zdefiniować optymalny zakres stężeń dla każdego analitu w multipleksie, aby określić pełny zakres oznaczalności, upewniając się, że nie pobiera się nadpróbkowania skrajnych (obszary zbliżające się do dolnej granicy oznaczalności [LLOQ] lub górnej granicy oznaczalności [ULOQ]). Rzeczywisty zakres wymagany do przeprowadzenia testu jest jednak podyktowany rozkładem docelowych analitów w matrycy biologicznej (tj. "niewiadomych") przy danym współczynniku rozcieńczenia. Ponadto, chociaż krzywe standardowe są zwykle interpretowane za pomocą regresji liniowej z 4- lub 5-parametrycznym algorytmem dopasowania, liniowa część danej krzywej zazwyczaj zapewnia największą pewność dokładności ilościowej w przypadku liniowego (y = mx + b) modelu kwantyfikacji. Dopasowanie krzywej kalibracyjnej do obserwowanych wartości dla nieznanego przy danym współczynniku rozcieńczenia powinno być celem w opracowywaniu testów ilościowych.

W związku z tym, 7-punktowa krzywa standardowa oparta na serii seryjnych rozcieńczeń 1:5 została oceniona dla każdego z przeciwciał Spike S1, nukleokapsydu i błony, które wahają się od 1 μg/ml do 0,000064 μg/ml dla Spike S1 i nukleokapsydu oraz 5 μg/ml i 0,00032 μg/ml dla membrany, jak pokazano na Rysunek 1. Dolna granica wykrywalności (LLOD) dla każdego testu została zdefiniowana jako najniższe stężenie analitu, które dało sygnał odróżniający się od jego tła. LLOD można zidentyfikować za pomocą równania opisanego wcześniej8,9, LLOD = LoB + 1,645(SDpróbka o niskim stężeniu). LoB jest dolną granicą ślepej próby i jest to "pozorne" stężenie analitu, które jest wytwarzane ze ślepej próby, gdy oczekiwana jest wartość zerowa, i można je ustalić za pomocą tego równania LoB = średniaślepa próba + 1,645 (SD ślepa) 8. W oparciu o tę metodę wartości MFI dla testu Spike S1 wahały się od 134,38 do 20191,2, przy czym 134,38 MFI odpowiada 0,00024 μg/ml i jest zdefiniowane jako LLOD. W przypadku testu membranowego praktyczny zakres MFI wynosił od 52,24 do 4764,9, przy czym 52,24 MFI obliczono na 0,004885 μg/ml i przypisano jako LLOD. Zakres MFI dla testu nukleokapsydu wynosił od 517,9 do 19666,34, przy czym 517,9 określono jako 0,00024 μg/ml, co stanowiło LLOD. Górna granica wykrywalności (ULOD) jest definiowana jako stężenie analitu, po przekroczeniu którego zmiana MFI nie jest już liniowa, a odpowiedź sygnału jest nasycona. Należy zauważyć, że pełny sigmoidalny charakter tych krzywych nie jest obserwowalny dla badanych wzorców, z wyjątkiem krzywej nukleokapsydu. Biorąc jednak pod uwagę, że zaobserwowane wartości MFI dla wszystkich niewiadomych oznaczonych do tej pory (przy rozcieńczeniu 1:500) mieszczą się w przedstawionym zakresie krzywych dla każdego analitu i można je łatwo określić ilościowo przy użyciu dopasowania parametrycznego 4 lub 5 za pomocą regresji liniowej.

Precyzja testu
Precyzja wewnątrz testu: Na tej samej płytce przeprowadzono cztery powtórzenia testów w celu oceny precyzji testu, obliczonej jako %CV lub iloraz odchylenia standardowego i średniej pomnożony przez 100. Do tych tabel wybrano standardowe punkty 2 i 5, z wartościami skatalogowanymi w tabeli 2. Typowy dopuszczalny górny próg graniczny dla wartości %CV wynosi ≤20%, co zaobserwowano dla tych danych, z wyjątkiem normy 2 IgG błonowej, co prawdopodobnie wynika z poziomów tła i można je skorygować poprzez wyeliminowanie wartości skrajnych (dane nie pokazane). Należy zauważyć, że pozorną niestabilność wartości odczytu zaobserwowano w przypadku testów błonowych, w których wartości MFI wynosiły <200, najczęściej w przypadku izotypów IgA i IgM.

Precyzja między testami: Trzy odrębne partie zestawów kulek zostały przygotowane dla każdego testu i przetestowane, zgodnie z definicją dla precyzji wewnątrz testu (powyżej i jak widać w Rysunek 1). Zmienność między testami oceniano, obliczając %CV na podstawie średnich wyników dla każdej z trzech partii, jak pokazano w tabeli 3. Ponownie, górny próg graniczny dla akceptowalnego %CV jest ustalony na ≤20%, który istnieje dla wszystkich badanych warunków (z podobnym efektem w przypadku standardu 2 IgG błonowego, jak pokazano powyżej). Należy zauważyć, że zmienność wartości MFI netto między partiami jest powszechnie obserwowana w wielu seriach tych samych immunoreagentów podczas opracowywania testów niestandardowych. Zastosowanie krzywej kalibracyjnej sporządzonej z komercyjnie uzyskanego przeciwciała anty-docelowego (np. króliczego przeciwciała anty-Spike S1), a następnie przeciwciała wykrywającego przeciwciało antygatunkowe może zapewnić spójność wyników analitycznych i umożliwić porównania między wieloma partiami w różnych okresach czasu.

Precyzja między testami z próbkami ludzkimi: Ocena precyzji między testami została powtórzona z próbkami ludzkiego osocza (n = 5) pobranymi w ciągu miesiąca od pierwszego zgłoszenia objawów infekcji SARS-CoV-2; osiągnięto za pomocą trzech odrębnych partii testów (tj. różnych preparatów zestawów kulek). Wyniki te przedstawiono w tabeli 4 i wykazują precyzję przy wartości %CV przy typowej górnej wartości granicznej wynoszącej ≤20%. Obliczono, że uśrednione wartości %CV dla miana Spike S1, nukleokapsydu i błonowego IgG wynoszą odpowiednio 9,9% (zakres 2,6%-18%), 11,0% (zakres 3,5%-24,4%) i 7,6% (zakres 3,2%-12,9%). Podobne obserwacje przeprowadzono dla mian IgM i IgA tych trzech analitów, z których wszystkie dostarczyły wartości %CV <20%. Jedynym wyjątkiem od tej reguły były miana IgM Testera 5 dla białka błonowego, które zostało następnie wykluczone jako wartość odstająca. Wartości precyzji dla ocen ludzi są zgodne z tymi widzianymi powyżej dla przeciwciał królików, co sugeruje, że testy te można łatwo przekonfigurować w celu oceny miana antygenów u wielu gatunków przy niewielkim wpływie na precyzję testu. Jak wspomniano powyżej, wystąpiła wyraźna niestabilność odczytu wartości obserwowanych dla testów błonowych, w których wartości MFI wynosiły <200, najczęściej w przypadku izotypów IgA i IgM.

Optymalizacja stężenia przeciwciał pierwotnych
"Czas wychwytywania" analitu oceniano za pomocą kulek sprzężonych z antygenem, a przeciwciała w próbkach osocza lub w wzorcach testowano poprzez modyfikację długości pierwotnej inkubacji (30 min, 1 h, 2 h i 4 h). Różnica w średniej MFI jest przedstawiona jako iloraz określonej inkubacji i maksymalnego czasu inkubacji, określanego jako % Max., w Rysunek 2, między 30-minutową inkubacją (minimalny czas trwania) a 4-godzinną inkubacją (maksymalny czas trwania). Wartości po 120 minutach były optymalne dla miana IgG dla przeciwciał Spike S1, błony i nukleokapsydu, co wskazuje na kinetykę szybkiego wiązania przeciwciał pierwotnych, co pozwala na elastyczność w celu zwiększenia przepustowości testu. Jednak wolniejszą kinetykę zaobserwowano dla izotypów IgA i IgM (dane nie pokazane), wykazując szczytowe poziomy wychwytywania w punkcie czasowym 4 godzin, jak pokazano na Rysunek 2. Ogólnie rzecz biorąc, istnieje równowaga między zbliżającym się nasyceniem testu a praktyczną celowością czasową uruchamiania każdego testu w trakcie produkcji (w celu maksymalizacji przepustowości). Dzięki temu w tych wynikach zaobserwowano odpowiednie sygnały do celów ilościowych przy minimalnych czasach inkubacji wynoszących 30 minut dla IgG, 60 minut dla IgM i 120 minut dla IgA.

Optymalizacja stężenia przeciwciał wtórnych
Badano pięć stężeń przeciwciał drugorzędowych (kozie przeciwciała anty-ludzkie IgG, skoniugowane z PE; kozie przeciwciała anty-ludzkie IgA, PE sprzężone; kozie anty-ludzkie IgM, SB-sprzężone) (0,5, 1, 2, 4 i 8 μg/ml). Wszystkie przeciwciała wykazywały szeroki zakres sygnału, bez oczywistego nasycenia sygnału w żadnych warunkach, zapewniając w ten sposób liniowy pomiar dla każdego ze stężeń. Na przykład średni sygnał wygenerowany z testu Spike S1 przy użyciu koziego anty-ludzkiego IgM, sprzężonego z SB przy 0,5 μg/ml, wynosił 13,2% MFI wygenerowanego z maksymalnego sygnału (8 μg/ml), podczas gdy MFI wygenerowanego z 4 μg/ml wynosił 73,3% MFI objawiającego się przy maksymalnym sygnale. Szczegóły dotyczące zakresu sygnałów z innych izotypów przeciwciał Spike S1, przeciwciał błonowych i przeciwciał nukleokapsydu znajdują się w tabeli 5 i Rysunek 3. Z praktycznego punktu widzenia, pierwotny wpływ między optymalnym stężeniem przeciwciał drugorzędowych a wcześniej określonym stężeniem przeciwciał drugorzędowych wynoszącym 4 μg/ml znajduje odzwierciedlenie w czułości testu i koszcie testu. Oznacza to, że stężenie przeciwciał drugorzędowych 8 μg/ml może być pożądane w przypadku stosowania z niskimi mianami przeciwciał lub niewielkimi ilościami cennej próbki, ale koszt związany z tymi testami byłby znacznie wyższy niż zastosowanie wcześniej zdefiniowanego stężenia 4 μg/ml. I odwrotnie, przypadki, w których zaobserwowano wysokie miana przeciwciał (takie jak osoby, które doświadczyły szczepień przeciwko Covid-19 lub z nieograniczonymi ilościami surowic) przyniosłyby koszty i korzyści dzięki zastosowaniu niższych ilości przeciwciał drugorzędowych (np. 1 μg/ml).

Optymalizacja inkubacji przeciwciał wtórnych
Badano również potencjalny wpływ czasu trwania inkubacji przeciwciał drugorzędowych poprzez modyfikację długości inkubacji (15, 30, 60 i 120 min). Ogólnie rzecz biorąc, różnica w średnim MFI przedstawionym jako iloraz określonej inkubacji i maksymalnego czasu inkubacji, określanego jako %Max, między 15-minutową inkubacją (minimalny czas trwania) a 120-minutową inkubacją (maksymalny czas trwania) nie przekraczała 30%, 55% i 50% odpowiednio dla przeciwciał Spike S1, błony i nukleokapsydu, co wskazuje na szybki krok kinetyczny w drugorzędowym wiązaniu przeciwciał i sposób na zwiększenie przepustowości testu. Tabela 6 zawiera szczegółowe informacje na temat zmian sygnału dla wszystkich czasów inkubacji. Ilustracje zaobserwowanych sygnałów z różnych inkubacji tej analizy są pokazane na Rysunek 4.

Dwukanałowa wydajność i specyfika
Dla każdego analitu porównano pojedynczy przebieg w formacie reporterowym (tylko IgG-PE, tylko IgA-PE lub tylko IgM-SB) z sygnałem wygenerowanym dla tego samego analitu, gdy był on uruchamiany w formacie z podwójnym reporterem (np. Spike S1 IgG-PE tylko w porównaniu z Spike S1 IgG-PE w połączeniu z Spike S1 IgM-SB w formacie podwójnego reportera). Precyzja testu (wyrażona jako %CV) dla sygnałów utworzonych w dwóch formatach została wykorzystana do analizy zależności w wynikach tego eksperymentu. Wartości %CV w testach Spike S1 wynosiły odpowiednio 6,19%, 16,4% i 23% dla IgM, IgG i IgA. W przypadku testu membranowego wartości %CV wynosiły odpowiednio 3,3%, 7,9% i 16,4% dla IgM, IgG i IgA. Wreszcie, test nukleokapsydu wykazał wartości %CV na poziomie 8,7%, 10,3% i 24,2% odpowiednio dla IgM, IgG i IgA. Wartości precyzji obserwowane dla izotypów IgM i IgA sugerują, że dłuższy czas inkubacji może zapewnić lepsze wyniki testów ze względu na znane różnice kinetyczne wiązania między tymi klasami immunoglobulin. Rysunek 4 pokazuje zgodność między formatami różnych stężeń przeciwciał drugorzędowych.

Aby potwierdzić specyfikę kanałów reporterskich, jeden kanał reporterowy był testowany w jednym czasie, podczas gdy drugi kanał był przypisany jako pusty, aby zapytać o niespecyficzny sygnał (efekt krwawienia). Wyniki te wskazują, że istnieje znikome zanieczyszczenie sygnałem krzyżowym między dwoma kanałami reporterowymi, biorąc pod uwagę wysoką specyficzność w całym spektrum warunków. Wyniki te są zilustrowane w Rysunek 5. Ogólnie rzecz biorąc, zaobserwowaliśmy 6,45% zakłóceń między kanałem 1 a kanałem 2. Jednakże, gdy uwzględniono wielkość sygnałów, zaobserwowaliśmy następujące potencjalne poziomy zakłóceń w trybie podwójnego reportera: Spike IgG/IgM na poziomie 71,98%, Spike IgA/ IgM na poziomie 28,11%; Membrana IgG/ IgM na poziomie 7,41%, IgA/ IgM błony na poziomie 134,61%; i nukleokapsyd IgG/IgM na poziomie 146,03%, nukleokapsyd IgA/IgM na poziomie 112,13%. W określonej konfiguracji wymagałoby to pomiaru Spike IgM w połączeniu z izotypem IgA, IgM błonowego z izotypem IgM oraz pomiarów nukleokapsydu niewykonywanych w formacie dwukanałowym. Odkrycie to może wymagać zbadania odwrócenia strategii znakowania, w której IgA i IgG są mierzone w kanale 2, a IgM w kanale 1.

Ocena zdarzeń serokonwersji po szczepieniu Covid-19
Serokonwersję monitorowano u czterech osób po ocenie IgA, IgM i IgG za pomocą testu Spike S1 w punktach czasowych od okresu przed szczepieniem do czterech miesięcy po zakończeniu serii szczepień przeciwko Covid-19. Pomiary wykonano w trybie dwukanałowym (IgG/ IgM i IgA/ IgM, przy uśrednionych wartościach IgM). Wszyscy badani otrzymali szczepionkę jako 2-etapową immunizację, zgodnie ze standardową praktyką, z 21-dniowym odstępem między pierwszą a drugą dawką. Wykresy odpowiedzi immunologicznej każdego pacjenta są pokazane w Rysunek 6A-C. Wartości odpowiedzi immunologicznej dla antygenów nukleokapsydu i błony zaobserwowano na poziomach tła dla wszystkich ocenianych immunoglobulin (dane nie pokazane), co było zgodne z tym, że osoby nie miały udokumentowanego wcześniejszego zakażenia SARS-CoV-2 w okresie przed szczepieniem. Ogólnie rzecz biorąc, obserwowane wartości Spike S1, IgA i IgM były około 40-krotnie niższe niż miana izotypów IgG, przy czym miana szczytowe osiągały szczyt już po 14 dniach zarówno dla izotypów IgM, jak i IgG, a izotyp IgA osiągał szczytowe miano między czasem podania drugiej dawki (dzień 0) a 14 dni po drugiej dawce, w zależności od tematu. Warto zauważyć, że miana IgG Spike S1 zaczynają zanikać w ciągu czterech miesięcy po zakończeniu szczepienia w bardzo zmiennym tempie, w sposób zależny od pacjenta.

figure-results-1
Rysunek 1: Reprezentatywne krzywe standardowe 3-plex. Reprezentatywne krzywe wzorcowe dla trzech analitów; przedstawiona jako 7-punktowa krzywa seryjnego rozcieńczania 1:5 zaczynająca się od (A) 1 μg / ml dla Spike S1, (B) 5 μg / ml dla błony i (C) 1 μg / ml dla nukleokapsydu i przeciwciał. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Optymalizacja czasu inkubacji przeciwciała pierwotnego/próbki: Średni sygnał MFI wytwarzany z różnych czasów inkubacji pierwotnego przeciwciała/próbek (wychwytywanie przeciwciał) w zakresie od 30 minut do 4 godzin dla standardów 1-7 (jak wskazano w Tabeli 1). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Optymalizacje stężenia przeciwciał wtórnych i wydajność dwukanałowa. Krzywe ilustrują średni MFI (znormalizowany do najwyższej zarejestrowanej wartości w serii) uzyskany z badanych stężeń przeciwciał drugorzędowych, w zakresie 0,5-8 μg/ml. Każda instancja została przeprowadzona zarówno jako test jedno-, jak i dwukanałowy, aby ocenić różnice w formacie eksperymentalnym. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Optymalizacja czasu inkubacji przeciwciał drugorzędowych, format dwukanałowy. Wykresy reprezentatywne obserwowanych wartości MFI (znormalizowanych do najwyższej zarejestrowanej wartości w szeregu) w odniesieniu do czasu inkubacji z przeciwciałami drugorzędowymi. Eksperymenty przeprowadzono jako testy dwukanałowe jako kombinacje (A-C) IgA/IgM lub (D-F) IgG/IgM. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5: Oceny swoistości dla testów dwukanałowych. Wyniki testu w formacie testu dwukanałowego, przy czym po jednym z każdej kombinacji oznacza się ślepą próbę w celu zilustrowania braku fluorescencji lub interferencji międzykanałowej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-6
Rysunek 6: Ilustracja serokonwersji po szczepieniu przeciwko Covid-19. Wykresy ilustrujące względne miana przeciwciał (A) IgG, (B) IgM i (C) IgA dla antygenu Spike S1 w trakcie szczepienia przeciwko Covid-19 (przed szczepieniem - 4 miesiące po zakończeniu); czas jest podany w dniach w stosunku do zakończenia serii szczepień; Wskazane są ogólne punkty podania szczepionki (czerwone linie). Eksperymenty przeprowadzono w trybie dwukanałowym, zgodnie z opisem w Protokole. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

pkt. pkt.
Numer standardowySeria rozcieńczeńAnty-Spike S1 lub N (μg/ml)Powłoka antymembranowa (μg/ml)
pustypusty--
1Układ łożyska STD7 1:115
cyfra arabskaŁożysko STD6 1:50,21
3Choroba St5 1:250,040,2
4Choroba przenoszona drogą piersiową 4 1:1250,0080,04
5Choroba przenoszona drogą płciową 3 1:6250,00160,008
6Choroba przenoszona drogą płciową 2 1:31250,000320,0016
7Choroba przenoszona drogą płciową 1:156250,0000640,00032

Tabela 1: Seria rozcieńczeń dla krzywych standardowych: Tabela współczynników rozcieńczenia stosowanych dla krzywych wzorcowych dla serotypu IgG; przedstawiona jako 7-punktowa, seryjna krzywa rozcieńczenia 1:5 zaczynająca się od 1 μg/ml dla α-Spike S1 i α-Nucleocapsid oraz 5 μg/ml dla przeciwciał α-Membrane.

pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. POWIEDZIAŁ: zł pkt. pkt. pkt. TGL TGL szt. szt. szt. pkt.
AnalitpróbkaPrzedstawiciel 1Przedstawiciel 2Przedstawiciel 3Przedstawiciel 4AveSd%CV
Kolec S1Choroba przenoszona drogą płciową2369,4356,9295,2271,5323,3 pkt.47,4Rozdział 14,6
Choroba przenoszona drogą płciową 53869.134373970.24240,73879.3Rozdział 3348,6
błonaChoroba przenoszona drogą płciową240,637,749,9Pytanie 27,839 Rozdział 39Rozdział 9.1Rozdział 23,3
Choroba przenoszona drogą płciową 5733,2 pkt.731,3724678,1716,7 pkt.263.6
NukleokapsydChoroba przenoszona drogą płciową2Rok 1746.7Klasa 1790,81577,3 pkt.1664,81694,994,25,6
Choroba przenoszona drogą płciową 515598.1Numer katalogowy 14735.5Numer katalogowy 18369.5Numer katalogowy 17408.5Numer katalogowy 16527.91657,710

Tabela 2: Precyzja wewnątrz testu: Procentowy współczynnik wariancji (%CV) obliczony na podstawie czterech powtórzeń standardowych mieszanin przeciwciał w standardzie 2 (STD2) i standardzie 5 (STD5) z pojedynczą partią testu w tym samym eksperymencie. Wartości podane dla powtórzeń i średnich reprezentują zaobserwowane wartości MIF.

pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. zł pkt. szt. okrążeń szt.
AnalitpróbkaPartia 1Partia 2Partia 3AveSd%CV
Kolec S1Choroba przenoszona drogą płciową2383,2 pkt.424,4 pkt.379,9395,8Pytanie 24,86,3
Choroba przenoszona drogą płciową 55639.76062.56384.36028.8373,4 pkt.6.2
błonaChoroba przenoszona drogą płciową239,158,559,152,2Pytanie 11,421,8
Choroba przenoszona drogą płciową 5732,3 pkt.941,4701.1791,6 pkt.130,7Rozdział 16,5
NukleokapsydChoroba przenoszona drogą płciową21342,616211718,21560,6 pkt.Rozdział 195Rozdział 12,5
Choroba przenoszona drogą płciową 513543.914843.217883.4Numer katalogowy: 15423.52227.214,4

Tabela 3: Precyzja między testami ze standardowymi próbkami: Procentowy współczynnik wariancji (%CV) obliczony na podstawie trzech różnych partii testów, ocenionych na poziomie standardu 2 i standardu 5 w tym samym eksperymencie. Wartości podane dla powtórzeń i średnich reprezentują zaobserwowane wartości MIF.

TGL pkt. szt. pkt. szt. zł pkt. szt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. TGLI pkt. pkt. pkt. pkt.
IgG-PEIgM-SBIgA-PE
Ave. MFI%CVAve. MFI%CVAve. MFI%CV
Kolec S1Temat 18002.3Rozdział 17,7Rok 1949.51.32045,8Rozdział 5.5
Temat 219155.87,3918,64.11684,53,9
Temat 317865.618,0549,43.8Nr 961,3Rozdział 8.1
Temat 411901.12.61603Rozdział 4.88736.4Rozdział 5.5
Temat 5Numer katalogowy 9801.8Wersja 4.01014.1Wersja 3.02747.69,3
NukleokapsydTemat 1Numer katalogowy 15097.8Rozdział 11.31049,7Pytanie 9,95276.53,9
Temat 2Numer katalogowy 15204.3Rozdział 12.1265,95.2Numer katalogowy 6761.3Pytanie 11,9
Temat 318471.7Norma 24,4329,1Rozdział 4.5Numer katalogowy: 143082.9
Temat 4Numer katalogowy 16424.73,52418.10,14234.7Rozdział 4.2
Temat 513344.93.6225,6Wersja 10.0Numer katalogowy: 13436.5Pytanie 9,7
błonaTemat 1514,6 pkt.8,6180,614,0141,2Pytanie 9,8
Temat 2196,85.257Pytanie 20,755,513,0
Temat 3553,7 pkt.Pytanie 12,954,5Rozdział 21,2191,2Rozdział 18,6
Temat 4377,93.268,1Rozdział 22.1622.3
Temat 5325,48,2Pytanie 11,491,674,620,8

Tabela 4: Precyzja między testami z próbkami ludzkimi: Średni procentowy współczynnik wariancji (%CV) obliczony na podstawie trzech serii testów testowanych próbkami osocza (rozcieńczonymi 500-krotnie) od pięciu osób z infekcjami SARS-CoV-2.

pkt. TGL pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. szt. pkt. szt. szt. szt. pkt. szt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. Rozdział pkt. pkt. szt. pkt. szt. szt. pkt. pkt. TGL szt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. zł pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. szt. pkt. szt. szt.
Kolec S1błonaNukleokapsyd
μg/mlAve. MFI% Maks.Ave. MFI% Maks.Ave. MFI% Maks.
Igm0,5Rozdział 186Rozdział 13,2Rozdział 32Dnia 25,2132,7Rozdział 13,6
1304,221,645,836194,4Pytanie 19,9
cyfra arabska664,5 pkt.47,278,861,9458,2 pkt.Rozdział 47
41032.173,3101,379,6707,872,6
81407.1100127,2100975100
IgG (IgG)0,5809.7Pytanie 4.927,5151355,66,3
11696,9Rozdział 10.240,6Rozdział 22,22782.113
cyfra arabska4543.8Norma 27,368,3Nr 37,3Numer katalogowy 6661.2Dnia 31,2
4Numer katalogowy: 10003.560110,760,5Numer katalogowy 12605.659 Rozdział 59
8Numer katalogowy 16662.8100182,910021360.6100
IgA0,5797,4Pytanie 19,3Pytanie 31,147,22056,5Rozdział 16.1
11529,53741,462,8Numer katalogowy: 386930,4
cyfra arabska2261.354,7Kategoria 48,673,36648,952,2
42320.456,248,373,26548.151,4
84132.210065,910012744.8100

Tabela 5: Optymalizacja stężenia przeciwciał wtórnych: Średni sygnał MFI wytwarzany z różnych stężeń przeciwciał drugorzędowych w zakresie od 0,5 μg/ml do 8 μg/ml. Wartość każdego sygnału jest również przedstawiana jako procent sygnału przy 8 μg/ml ("Max.") w celu zademonstrowania względnej wielkości sygnału.

szt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. szt. pkt. pkt. pkt. pkt. Rozdział szt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. szt. szt. szt. pkt. szt. TGL szt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. Rozdział pkt. pkt. pkt. szt. szt. TGL szt. szt. TGL pkt. Rozdział pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. SZT. Rozdział pkt. pkt. szt. szt. pkt. szt. szt.
Kolec S1błonaNukleokapsyd
Czas inkubacji (min.)Ave. MFI% Maks.Ave. MFI% Maks.Ave. MFI% Maks.
Igm15118572,240,448,9609,553,3
Rozdział 301416,686,358,470,7894.278,2
601324,880,773,6Nr 89,1945,682,7
1201641,210082,61001143.2100
IgG (IgG)1512917.680,5244,444,915429.880,8
Rozdział 30Numer katalogowy 14915.492,9434,7 pkt.79,91879798,5
6015340.395,6421,4 pkt.77,518694.497,9
120Numer katalogowy 16050.3100Okręg wyborczy 544100Klasa 19085.8100
IgA153141.978,27566,8Numer katalogowy: 910386,6
Rozdział 303569.188,883,974,89563.891
603539.1Rozdział 88Rozdział 8676,69555.790,9
120Numer katalogowy 4020100112,2100Numer katalogowy 10512.9100

Tabela 6: Optymalizacja czasu inkubacji przeciwciał drugorzędowych: Średni sygnał MFI wytwarzany z różnych czasów inkubacji przeciwciał drugorzędowych w zakresie od 15 min do 120 min. Wartość każdego sygnału jest również reprezentowana jako procent sygnału w 120 minutach ("Max."), aby pokazać względną wielkość sygnału.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ocena odpowiedzi immunologicznej na ekspozycję na SARS-CoV-2, w połączeniu z nadzorem stanu zakażenia opartym na RT-PCR, została dobrze opisana jako recepta na wyjaśnienie przebiegu powrotu do zdrowia po Covid-19, służąca jako środek do identyfikacji osocza ozdrowieńców o potencjalnej wartości terapeutycznej oraz do badania wskaźników infekcji w skali populacji10,11. Różne przykłady zrozumienia serokonwersji u ludzi obejmują macierze białek (antygenów)12, immunobloty13, szybkie konstrukty immunochromatograficzne14 i testy immunoenzymatyczne (ELISA)15,16,17. Każda z wyżej wymienionych technik może oceniać wiele izotypów immunoglobulin indywidualnie z niewielkimi modyfikacjami. Procedury te nie mogą być jednak praktycznie ponownie wykorzystane, aby umożliwić równoległą analizę wielu izotypów, jak przedstawiono w tym manuspekcie, co sprawia, że czynniki związane z kosztem i przepustowością stanowią ograniczenia w ich podawaniu w strategii testowania w skali populacyjnej. Niektóre z tych aplikacji dają również możliwość łączenia poziomów wielu antygenów równolegle, tak jak są prezentowane, lub w zmienionych formatach, takich jak multipleksowy ELISA18,19. Wreszcie, platforma immunobead zapewnia możliwość oceny poziomów wielu antygenów równolegle20,21, ale została ograniczona do jednego epitopu (tj. izotypu immunoglobuliny) na test, chyba że jednak zastosowano najnowszy instrument z możliwościami testowania "dwukanałowego".

W niniejszym raporcie wymieniono protokoły, które zapewniają wiarygodny pomiar wielu epitopów w teście immunokulkowym przy użyciu instrumentu w trybie "dwukanałowym" w studium przypadku serokonwersji osób zaszczepionych Covid-19. Metoda wykazała się doskonałą precyzją (wartości %CV zwykle <20%) przy użyciu ręcznych projektów testów, które można ulepszyć dzięki integracji zautomatyzowanych systemów laboratoryjnych. Czułość testu i zakres dynamiki dla wszystkich wybranych analitów i epitopów były odpowiednie do rutynowych ocen. Chociaż brak dostępnych na rynku immunoodczynników antyantygenowych IgA i IgM ograniczał ilościowe oznaczanie do izotypu IgG, takie ograniczenie nie wyklucza możliwości oferowania ocen półilościowych lub ocen w odniesieniu do określonej próbki w kalibrze22,23.

Zwalidowany test immunobeadowy został przydzielony do zbadania serokonwersji w kohorcie osób zaszczepionych szczepionką Covid-19. W przeciwieństwie do innych podobnych platform, rodzina oprzyrządowania umożliwia poszukiwanie serokonwersji u setek osób dziennie w ręcznym przepływie pracy i tysięcy dziennie w schemacie automatycznym. Ogólnie rzecz biorąc, wyniki te potwierdzają, że podejście "dwukanałowe" ma odpowiednią czułość do opisu wielu epitopów równolegle dla identycznego testu i jest wykonalne w kontekście wieloanalitowym. Różnica w czułości na kanał 1 i kanał 2, jak przeprowadzono odpowiednio w przypadku fikoerytryny i fluoroforów Super Bright 436, może uzasadniać zaprojektowanie konkretnego eksperymentu w celu zapewnienia uzyskania realnych wyników analitycznych dla danego eksperymentu. Oznacza to, że rezerwacja kanału 1 dla epitopów lub analitów o mniejszej częstości występowania może być konieczna do utrzymania zakresu dynamicznego testu, który obejmuje obserwowane wartości niewiadomych. Poza tym projekt testu był oczywisty i powinien być łatwo dostępny dla laboratoriów o ograniczonych możliwościach analitycznych. Z pewnością należy wziąć pod uwagę tę kwestię przy rozważaniu zakłóceń między kanałem 1 a kanałem 2, jak zauważyliśmy na rysunku 5, przy czym zakłócenia z izotypów o wyższej liczebności mogą powodować mylące błędy analityczne dla izotypów o znacznie niższej liczebności, gdy są mierzone w formacie dwukanałowym. Ta potencjalna ingerencja w sytuacje o bardzo różnych stężeniach analitu może stanowić istotne ograniczenie podejścia, jeśli nie zostanie odpowiednio wykorzystana w fazie projektowania testu.

Podsumowując, przedstawiono metodę szybkiego pomiaru miana przeciwciał z głównych izotypów immunoglobulin związanych z odpowiedzią immunologiczną na zakażenie Covid-19 lub szczepienie. Zastosowanie tego podejścia w sposób długofalowy do oceny serokonwersji może dostarczyć informacji, które można lepiej wykorzystać do zarządzania i/lub monitorowania przebiegu choroby lub, alternatywnie, kierowania potencjalnymi programami szczepień przypominających przeciwko Covid-19.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dr Borgia jest wynalazcą testu serologicznego użytego w tym manuskrypcie, który oczekuje na opatentowanie. Artykuł jest przedstawiony w sposób opisowy, bez przedstawionych analiz statystycznych, aby uniknąć potencjalnej stronniczości wynikającej z konfliktu autorów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy pragną podziękować Rush Biomarker Development Core za korzystanie z ich obiektów, Rush Biorepository do rejestracji podmiotów i przetwarzania próbek biologicznych, a także Fundacji Walder's Chicago Coronavirus Assessment Network (Chicago CAN) Initiative granty o numerach SCI16 (J.R.S. i J.A.B.) i 21-00147 (J.R.S. i J.A.B.) oraz nagrodzie od Fundacji Swim Across America (J.A.B.).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
384-dołkowe czarne płytki do mikromiareczkowania polistyrenuThermo Fisher12-565-346
Bufor aktywacyjny (0,1 M NaH2PO4, pH 6,2)Przygotowany w domowym
buforze testowym (PBS, 1% albumina surowicy bydlęcej, 0,01% polisorbat-20)Przygotowany w domu
Albumina surowicy bydlęcej, frakcja szoku cieplnegoMilliporeSigmaA-7888-50G
Bufor sprzęgający (50 mM MES, pH 5,0)Przygotowany we własnym zakresie
COVID 19 M Coronavirus Rekombinowane białko matrycowe (6xJego tag)MyBioSourceMBS8574735
Jednorazowe końcówki
EDC (chlorowodorek 1-etylo-3-[3-dimetyloaminopropylo]karbodimidu)Thermo FisherPIA35391
Albumina kozia, frakcja V w proszkumiliporeSigmaA2514-1G
IgA Koza anty-ludzka, R-PE, poliklonalnaThermo FisherOB205009
IgG Koza anty-ludzka, R-PE, PoliklonalnaThermo FisherOB204009
IgG Koza anty-Królik, R-PE, PoliklonalnaThermo FisherOB403009
IgM Koza anty-ludzka, R-PE, PoliklonalnyThermo Fisher
Mysz IgM anty-ludzka, SB 436, klon SA-DA4Thermo Fisher62999842
Analizator przyrządówLuminex Corp.INTELLIFLEX-RUO
Probówki do mikrowirówek o niskim poziomie wiązania (1,5 ml)Thermo Fisher13-698-794
MagPlex-C Microspheres, Region XXXLuminex Corp.MC10XXX-01
Hydrat MES (hydrat kwasu 2-(N-Morfolino)etanosulfonowego)MilliporeSigmaM2933
Aluminiowa taśma uszczelniająca MicroplateThermo Fisher07-200-683
Polysorbate-20Thermo FisherBP337-500
Quality Biological Inc. PBS, pH 7,2Thermo Fisher50-751-7328
Bufor hartujący (PBS, 1% albumina surowicy koziej, 0,01% polisorbat-20)Przygotowany w domu
SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Białko nukleokapsydu (jego tag)Sino Biologicals40588-V08B
SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Białko kolca (podjednostka S1, jego tag)Sino Biologicals40591-V08H
SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Przeciwciało RBD Pike, pAb królikaSino Biologicals40592-T62
SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Przeciwciało nukleokapsydowe, mAb królikaSino Biologicals40588-R0004
Przeciwciało błonowe (IN) SARS-CoV-2 (COVID-19), pAb królikaProSci10-516
Sulfo-NHS (N-hydroksysulfobursztynimid)Bufor
(PBS, 0,01% polisorbatu-20)Przygotowane we własnym zakresie
Woda klasy LC/MSThermo FisherW-64
do pipetOB202009 do płukania Thermo Fisher PIA39269

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tighe, P. J., Ryder, R. R., Todd, I., Fairclough, L. C. ELISA in the multiplex era: potentials and pitfalls. Proteomics - Clinical Applications. 9, 406-422 (2015).
  2. Baker, H. N., Murphy, R., Lopez, E., Garcia, C. Conversion of a capture ELISA to a Luminex xMAP assay using a multiplex antibody screening method. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), e4084(2012).
  3. Powell, R. L., et al. A multiplex microsphere-based immunoassay increases the sensitivity of siv-specific antibody detection in serum samples and mucosal specimens collected from rhesus macaques infected with SIVmac239. BioResearch Open Access. 2 (3), 171-178 (2013).
  4. Volpetti, F., Garcia-Cordero, J., Maerkl, S. J. A microfluidic platform for high-throughput multiplexed protein quantitation. PLoS One. 10 (2), 0117744(2015).
  5. Rabi, F. A., Al Zoubi, M. S., Kasasbeh, G. A., Salameh, D. M., Al-Nasser, A. D. SARS-CoV-2 and coronavirus disease 2019: What we know so far. Pathogens. 9 (3), 231(2020).
  6. Asif, M., Xu, Y., Xiao, F., Sun, Y. Diagnosis of COVID-19, vitality of emerging technologies and preventive measures. Chemical Engineering Journal. 423, Lausanne, Switzerland. 130189(2021).
  7. La Marca, A., Capuzzo, M., Paglia, T., Roli, L., Trenti, T., Nelson, S. M. Testing for SARS-CoV-2 (COVID-19): a systematic review and clinical guide to molecular and serological in-vitro diagnostic assays. Reproductive Biomedicine Online. 41 (3), 483-499 (2020).
  8. Armbruster, D. A., Pry, T. Limit of blank, limit of detection and limit of quantitation. The Clinical Biochemist. Reviews. 29, Suppl 1 49-52 (2008).
  9. Tarhoni, I., et al. Relationship between circulating tumor-associated autoantibodies and clinical outcomes in advanced-stage NSCLC patients receiving PD-1/-L1 directed immune checkpoint inhibition. Journal of Immunological Methods. 490, 112956(2021).
  10. Deeks, J. J., et al. Antibody tests for identification of current and past infection with SARS-CoV-2. The Cochrane Database of Systematic Reviews. 6, 013652(2020).
  11. Mahalingam, S., et al. Landscape of humoral immune responses against SARS-CoV-2 in patients with COVID-19 disease and the value of antibody testing. Heliyon. 7 (4), 06836(2021).
  12. Ruano-Gallego, D., et al. A multiplex antigen microarray for simultaneous IgG and IgM detection against SARS-CoV-2 reveals higher seroprevalence than reported. Microbial Biotechnology. 14 (3), 1228-1236 (2021).
  13. Shah, J., et al. IgG and IgM antibody formation to spike and nucleocapsid proteins in COVID-19 characterized by multiplex immunoblot assays. BMC Infectious Diseases. 21 (1), 325(2021).
  14. Gambino, C. M., et al. Comparison of a rapid immunochromatographic test with a chemiluminescence immunoassay for detection of anti-SARS-CoV-2 IgM and IgG. Biochemia Medica (Zagreb). 30 (3), 030901(2020).
  15. Algaissi, A., et al. SARS-CoV-2 S1 and N-based serological assays reveal rapid seroconversion and induction of specific antibody response in COVID-19 patients. Scientific Reports. 10, 16561(2020).
  16. Chiereghin, A., et al. Recent advances in the evaluation of serological assays for the diagnosis of SARS-CoV-2 infection and COVID-19. Frontiers in Public Health. 8, 620222(2020).
  17. Nicol, T., et al. Assessment of SARS-CoV-2 serological tests for the diagnosis of COVID-19 through the evaluation of three immunoassays: Two automated immunoassays (Euroimmun and Abbott) and one rapid lateral flow immunoassay (NG Biotech). Journal of Clinical Virology: The Official Publication of the Pan American Society for Clinical Virology. 129, 104511(2020).
  18. Butt, J., et al. From multiplex serology to serolomics-A novel approach to the antibody response against the SARS-CoV-2 proteome. Viruses. 13 (5), 749(2021).
  19. Byrum, J. R., et al. multiSero: open multiplex-ELISA platform for analyzing antibody responses to SARS-CoV-2 infection. medRxiv. , (2021).
  20. Dobano, C., et al. Highly sensitive and specific multiplex antibody assays to quantify immunoglobulins m, a, and g against SARS-CoV-2 antigens. Journal of Clinical Microbiology. 59 (2), 01731(2021).
  21. Schultz, J. S., et al. Development and validation of a multiplex microsphere immunoassay using dried blood spots for SARS-CoV-2 seroprevalence: Application in first responders in first responders in Colorado, USA. Journal of Clinical Microbiology. 59 (6), 00290(2021).
  22. Beavis, K. G., et al. Evaluation of the EUROIMMUN anti-SARS-CoV-2 ELISA assay for detection of IgA and IgG antibodies. Journal of Clinical Virology: The Official Publication of the Pan Americal Society for Clinical Virology. 129, 104468(2020).
  23. Jung, J., et al. Clinical performance of a semi-quantitative assay for SARS-CoV2 IgG and SARS-CoV2 IgM antibodies. Clinica Chimica Acta: International Journal of Clinical Chemistry. 510, 790-795 (2020).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Monitorowanie serokonwersjiwykrywanie przeciwcia przeciwko Covid 19multipleksowe testy serologiczneizotypy immunoglobulincytometria przep ywowaprzeciwcia a przeciwko bia ku S1 kolcadwukana owy testocena miana przeciwciaprzygotowanie mikrosfer magnetycznych

Powiązane artykuły