Artykuł metodologiczny

Zasoby bioinformatyczne do badania oddziaływań białek za pośrednictwem glikanów

DOI:

10.3791/63356

⸱

20 stycznia 2022

1Proteome Informatics Group, SIB Swiss Institute of Bioinformatics, 2Computer Science Department, University of Geneva, 3Section of Biology, University of Geneva

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół ilustruje, jak badać, porównywać i interpretować ludzkie glicomes białkowe za pomocą zasobów online.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Inicjatywa Glyco@Expasy została uruchomiona jako zbiór współzależnych baz danych i narzędzi obejmujących kilka aspektów wiedzy z zakresu glikobiologii. W szczególności ma na celu podkreślenie interakcji między glikoproteinami (takimi jak receptory na powierzchni komórki) a białkami wiążącymi węglowodany, w których pośredniczą glikany. W tym miejscu główne zasoby kolekcji są przedstawiane za pomocą dwóch ilustracyjnych przykładów skoncentrowanych na N-gliglucie ludzkiego antygenu swoistego dla prostaty (PSA) i O-glikonie ludzkich białek surowicy. Za pomocą różnych zapytań do bazy danych i za pomocą narzędzi do wizualizacji ten artykuł pokazuje, jak eksplorować i porównywać zawartość w kontinuum w celu zebrania i skorelowania rozproszonych informacji. Zebrane dane mają posłużyć do opracowania bardziej skomplikowanych scenariuszy funkcjonowania glikanów. Przedstawiona tu glikoinformatyka jest zatem proponowana jako środek do wzmocnienia, ukształtowania lub obalenia założeń dotyczących specyficzności białka glicome w danym kontekście.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Glikany, białka, do których są przyłączone (glikoproteiny) i białka, z którymi się wiążą (lektyny lub białka wiążące węglowodany) są głównymi aktorami molekularnymi na powierzchni komórki1. Pomimo tej kluczowej roli w komunikacji komórka-komórka, badania na dużą skalę, w tym glikomika, glikoproteomika lub interaktomika glikanów, są nadal rzadkie w porównaniu z ich odpowiednikami w genomice i proteomice.

Do niedawna nie opracowano metod charakteryzowania rozgałęzionych struktur węglowodanów złożonych, które są nadal sprzężone z białkiem nośnikowym. Biosynteza glikoprotein jest procesem nieopartym na matrycy, w którym donory monosacharydów, akceptujące substraty glikoproteinowe oraz glikozylotransferazy i glikozydazy odgrywają interaktywną rolę. Powstałe glikoproteiny mogą mieć złożone struktury z wieloma punktami rozgałęzienia, gdzie każdy składnik monosacharydowy może być jednym z kilku typów obecnych w nature1. Proces nieoparty na szablonach narzuca analizę biochemiczną jako jedyną opcję generowania danych strukturalnych oligosacharydów. Proces analityczny struktur glikanowych przyłączonych do natywnego białka jest często trudny, ponieważ wymaga czułych, ilościowych i solidnych technologii do określenia składu monosacharydów, wiązań i sekwencji rozgałęzień2.

W tym kontekście, spektrometria mas (MS) jest najczęściej używaną techniką w eksperymentach glikomicznych i glikoproteomicznych. Z biegiem czasu są one wykonywane w ustawieniach o wyższej przepustowości, a dane gromadzą się teraz w bazach danych. Struktury glikanów w różnych formatach3, wypełniaj GlyTouCan4, uniwersalne repozytorium danych glikanów, w którym każda struktura jest powiązana ze stabilnym identyfikatorem, niezależnie od poziomu precyzji, z jaką glikan jest zdefiniowany (np. możliwy brak typu połączenia lub niejednoznaczny skład). Zbierane są bardzo podobne struktury, ale ich drobne różnice są wyraźnie odnotowane. Glikoproteiny są opisane i wyselekcjonowane w GlyConnect5 i GlyGen6, dwóch bazach danych powiązanych ze sobą. Dane MS wspierające dowody strukturalne są coraz częściej przechowywane w GlycoPOST7. Aby uzyskać szerszy zakres zasobów online, rozdział 52 podręcznika referencyjnego, Podstawy glikobiologii, jest poświęcony glikoformatice8. Co ciekawe, w ostatnich latach rozpowszechniło się oprogramowanie do identyfikacji glikopeptydów9,10, choć nie z korzyścią dla odtwarzalności. Ta ostatnia obawa skłoniła liderów HUPO GlycoProteomics Initiative (HGI) do wyznaczenia wyzwania programistycznego w 2019 roku. Dane MS uzyskane z przetwarzania złożonych mieszanin N- i O-glikozylowanych ludzkich białek surowicy w trybach fragmentacji CID, ETD i EThcD zostały udostępnione konkurentom, zarówno użytkownikom oprogramowania, jak i programistom. Pełny raport z wyników tego wyzwania11 jest tylko opisany tutaj. Po pierwsze, zaobserwowano rozsiewanie się identyfikacji. Interpretowano to głównie jako spowodowane różnorodnością metod zaimplementowanych w wyszukiwarkach, ich ustawień oraz sposobu filtrowania danych wyjściowych i "zliczania" peptydów. Projekt eksperymentalny mógł również postawić niektóre programy i podejścia w (nie)korzystnej sytuacji. Co ważne, uczestnicy korzystający z tego samego oprogramowania zgłaszali niespójne wyniki, podkreślając w ten sposób poważne problemy z odtwarzalnością. Porównując różne zgłoszenia, stwierdzono, że niektóre rozwiązania programowe działają lepiej niż inne, a niektóre strategie wyszukiwania dają lepsze wyniki. Informacje zwrotne prawdopodobnie posłużą do ulepszenia metod automatycznej analizy danych glikopeptydowych, co z kolei wpłynie na zawartość bazy danych.

Ekspansja technologii glycoinformatics doprowadziła do stworzenia portali internetowych, które dostarczają informacji i dostępu do wielu podobnych lub uzupełniających się zasobów. Najnowsze i aktualne są opisane w rozdziale serii książek Comprehensive Glycoscience12, a dzięki współpracy oferowane jest rozwiązanie do udostępniania danych i wymiany informacji w trybie otwartego dostępu. Stworzono jeden z takich portali, który pierwotnie nazywał się Glycomics@ExPASy13 i przemianowany na Glyco@Expasy, po gruntownym remoncie platformy Expasy14, która od dziesięcioleci hostuje dużą kolekcję narzędzi i baz danych używanych w kilku -omikach, z których najpopularniejszym jest UniProt15-Uniwersalna Baza Wiedzy o Białkach. Glyco@Expasy oferuje dydaktyczne odkrycie przeznaczenia i zastosowania baz danych i narzędzi, w oparciu o wizualną kategoryzację i pokazanie ich wzajemnych zależności. Poniższy protokół ilustruje procedury badania danych glikomicznych i glikoproteomicznych za pomocą wybranych zasobów z tego portalu, które wyraźnie wskazują na związek między glikoproteomiką a interaktomiką glikanów za pośrednictwem glikomiki. W tej chwili eksperymenty glikomiczne wytwarzają struktury, w których monosacharydy są w pełni zdefiniowane, a wiązania częściowo lub w pełni określone, ale ich przyłączenie do miejsca białkowego jest słabo, jeśli w ogóle, scharakteryzowane. W przeciwieństwie do tego, eksperymenty glikoproteomiczne generują precyzyjne informacje o przyłączaniu się miejsc, ale ze słabą rozdzielczością struktur glikanów, często ograniczoną do kompozycji monosacharydowych. Informacje te są gromadzone w bazie danych GlyConnect. Co więcej, narzędzia wyszukiwania w GlyConnect mogą być używane do wykrywania potencjalnych ligandów glikanów, które są opisane wraz z białkami rozpoznającymi je w UniLectin16, połączonych z GlyConnect za pomocą glikanów. Przedstawiony tutaj protokół jest podzielony na dwie sekcje, aby objąć pytania specyficzne dla glikanów i glikoprotein sprzężonych z N i O.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Wymagane jest urządzenie z dostępem do Internetu (preferowany większy ekran) i aktualną przeglądarką internetową, taką jak Chrome lub Firefox. Korzystanie z Safari lub Edge może nie być tak niezawodne.

1. Od białka N-glycome w GlyConnect do lektyny UniLectin

  1. Dostęp do zasobów z Glyco@Expasy
    UWAGA: Opisana tutaj procedura ma na celu uzyskanie dostępu do GlyConnect, ale może być zastosowana do uzyskania dostępu do dowolnego zasobu zarejestrowanego na platformie.
    1. Przejdź do https://glycoproteome.expasy.org/glycomics-expasy i rozważ wykres bąbelkowy po prawej stronie przedstawiający różne kategorie, takie jak glikokoniugaty lub wiązanie glikanów. W menu po lewej stronie, które odzwierciedla kategorie w bąbelkach, zaznacz pole Glikoproteiny, aby wykres bąbelkowy po prawej stronie natychmiast powiększył bąbelek pasujący do tej kategorii.
      UWAGA: Zielone bąbelki to narzędzia, a żółte bąbelki to bazy danych. Kliknięcie jednego z nich powoduje ponowne powiększenie, aby podać szczegółowe informacje o zasobie. Zanim to zrobisz, użytkownik może chcieć zrozumieć zależności tego zasobu od innych osób.
    2. Aby uzyskać informacje na temat zależności, przejdź z zakładki Klasyfikacja tematyczna zasobów do zakładki Koło zależności zasobów. Umieść kursor myszy na GlyConnect w kole, aby sprawdzić jego poziom integracji z innymi źródłami (Rysunek 1).
    3. Wróć do zakładki Klasyfikacja tematyczna zasobów, aby przejść do bąbelka GlyConnect, jak w kroku 1.1.1 i kliknij na nią (Rysunek uzupełniający 1), aby wyświetlić stronę główną GlyConnect w nowej karcie, która pokazuje statystyki zawartości w najnowszej wersji bazy danych.
      UWAGA: Schemat kolorów wyszczególniony w Tabeli 1 odpowiada różnym typom informacji przechowywanych w bazie danych. Ten kod kolorystyczny jest ważny na wszystkich stronach encji w GlyConnect i jest spójny przez cały czas. Na stronie głównej wyświetlane są również cztery sekcje poświęcone ukierunkowanym zestawom danych, takim jak te opisujące glikozylację białka kolca Sars-Cov-2 (COVID-19) lub szczegółowo opisujące oligosacharydy mleka ludzkiego (HMO). Nie będą one badane w niniejszym protokole.
  2. Badanie informacji kontekstowych białka N-glikom<br /> UWAGA: Wszystkie struktury glikanów w GlyConnect są wyświetlane w trzech alternatywnych i powszechnie używanych formatach: (1) Nomenklatura symboli dla glikanów (SNFG)17 (2) IUPAC condensed18, oraz (3) Oxford19. W przeciwieństwie do tego, nie ma standardowej notacji wyrażającej skład glikanów. W GlyConnect używany jest następujący kod: Hex dla heksozy, HexNAc dla N-acetyloheksozaminy, dHex dla fukozy i NeuAc dla kwasów sjalowych. Dla uproszczenia narzędzia do wizualizacji opierają się na skondensowanej notacji: H dla heksozy, N dla N-acetyloheksozaminy, F dla fukozy i S dla kwasów sjalowych. Dodatkowo małe litery oznaczają modyfikacje, takie jak "a" dla acetylacji, "p" dla fosforylacji i "s" dla siarczanowania, dla najczęstszego z tych tak zwanych podstawników.
    1. Aby wyświetlić i zbadać N-glicome ludzkiego antygenu swoistego dla prostaty (PSA), na stronie głównej GlyConnect, wykonaj następujące czynności.
      UWAGA: Glikozylacja ludzkiego PSA była badana przez lata, zwłaszcza w kontekście raka prostaty. Baza danych GlyConnect przechowuje trzy referencje20,21,22, które łączą dane glikomiczne i glikoproteomiczne. Należy pamiętać, że podane tutaj wyniki zostały uzyskane w wersji GlyConnect z września 2021 r. Późniejsze korzystanie z bazy danych może przynieść nieco inne statystyki ze względu na częste aktualizacje danych.
    2. Wybierz przycisk BIAŁKO, aby otworzyć widok białka bazy danych. Na stronie widoku białka wpisz prostatę w oknie wyszukiwania. Poszukaj dwóch wpisów wymienionych w danych wyjściowych rozróżniających dwie izoformy PSA o różnych wartościach pI. Kliknij na 790 (kolumna Id) odpowiadającą wspólnej izoformie PSA.
      UWAGA: Poszukaj górnego wielokolorowego paska, który pokazuje podsumowanie informacji wyodrębnionych z opublikowanej pracy w schemacie opisanym powyżej. Dostępnych jest kilka opcji nawigacji, jak opisano poniżej.
    3. Na górnym wielokolorowym pasku kliknij przycisk ŹRÓDŁO w kolorze zielonym, aby wyświetlić typy próbek, z których przetworzono opublikowane dane: Mocz i Płyn nasienny. Aby dokładniej przeglądać te informacje, kliknij jeden z tych typów próbek. To samo dotyczy każdego elementu, który pojawia się po kliknięciu kolorowego przycisku.
    4. Aby sprawdzić zawartość bazy danych związaną ze zdrowiem, kliknij przycisk CHOROBA, który zawiera dwie pozycje, z których jedna to Rak prostaty, która łączy się z odpowiednią stroną poświęconą chorobie w GlyConnect. Podsumowanie tej strony pokazuje, że trzy badania na dużą skalę wykazały 319 kompozycji w 1087 miejscach znalezionych w 308 ludzkich białkach.
    5. Kliknij na przycisk STRUKTURA, aby wyświetlić pełną listę 135 struktur powiązanych z PSA na podstawie danych glycomics. Kliknij przycisk KOMPOZYCJA, aby wyświetlić powiązane 78 kompozycji określonych za pomocą eksperymentów glikoproteomicznych. Kliknij dowolną strukturę lub kompozycję, aby uzyskać więcej informacji.
      UWAGA: Można uzyskać szczegółowe informacje, takie jak wykaz alternatywnych białek przenoszących daną strukturę lub wykaz struktur pasujących do składu. Wiadomo, że PSA ma tylko jedno miejsce N-glikozylacji w Asn-69 (tylko jedna pozycja liczona dla brązowego przycisku SITE).
    6. Aby zmniejszyć niejednoznaczność kompozycji, kliknij na SUGEROWANA STRUKTURA poniżej wybranej kompozycji (na przykład Hex:6 HexNAc:3 NeuAc:1). Za każdym razem, gdy liczba monosacharydów pokrywa się z liczbą struktury wymienionej powyżej, pojawia się sugestia (Rysunek 2).
      UWAGA: Kompozycja Hex:6 HexNAc:3 NeuAc:1 wygenerowana w eksperymencie glikoproteomicznym jest dopasowana do czterech struktur o wyższej rozdzielczości na podstawie danych glikomicznych. W przypadku PSA nie ma niejasności miejsca do rozwiązania, ponieważ tylko Asn-69 jest glikozylowany.
    7. Aby w pełni zapoznać się ze stroną poświęconą białkowi, zapoznaj się z dalszymi szczegółami po prawej stronie strony (Rysunek 3).
      1. Zobacz domyślny wpis 3QUM PDB (Protein Data Bank23) dla PSA, który jest pokazany z dwoma złożonymi glikanami przyłączonymi do każdego monomeru (Rysunek 3) lub alternatywny wpis 2ZCK, który jest również dostępny ze względu na dołączony węglowodan. Drugi wpis pokazuje pojedynczy łańcuch.
        UWAGA: Oba wpisy są wizualizowane za pomocą wtyczki 3D LiteMol 24, która wyświetla glikany w notacji SNFG-3D przyjętej w PDB-RCSB.
      2. Kliknij odpowiednie linki do innych odsyłaczy, aby zapoznać się z istotnymi informacjami funkcjonalnymi z głównych baz danych proteomicznych, takich jak UniProt (Rysunek 3).
  3. Wizualizacja i korelacja informacji kontekstowych białka N-glikomu
    UWAGA: Jak widać w poprzedniej sekcji, długie listy struktur lub kompozycji mogą być trudne do zrozumienia jako całość, a GlyConnect opiera się na dwóch różnych narzędziach do wizualizacji kluczowych informacji, a mianowicie GlyConnect Octopus i GlyConnect Compozitor (pierwsze z nich rozszerza informacje podsumowujące zebrane w kolorowych przyciskach, a drugie wydobywa zależności strukturalne pod względem struktury/kompozycji zawartej w innej). Jak pokazano poniżej, GlyConnect Octopus bada powiązania między różnymi jednostkami przechowywanymi w bazie danych poprzez wyróżnianie wielu lub pojedynczych połączeń jako odbicia zawartości bazy danych.
    1. Przeprowadź wyszukiwanie GlyConnect Octopus, aby potwierdzić obecność wspólnych cech strukturalnych, takich jak hybrydowe struktury rdzeniowe i bardzo częste struktury zawierające kwas sjalowy w różnorodności glikanów przyłączonych do PSA, jak opisano poniżej.
    2. Przejdź do strony głównej Octopus https://glyconnect.expasy.org/octopus/. Pozostaw domyślnie wybraną kartę N połączoną. Przejdź do podzakładki Rdzenie i kliknij ikonę Hybryda. Przejdź do podzakładki Właściwości i kliknij ikonę Sialylated. Kliknij zielony przycisk Szukaj poniżej.
      UWAGA: Wyniki wyszukiwania są wyświetlane graficznie jako relacje między trzema kategoriami elementów. Domyślnie środkowa lista jest zgodna z zapytaniem dotyczącym kompozycji, lewa kolekcja obejmuje powiązane białka, a prawa obejmuje powiązane glikany.
    3. Na wyświetlonym wykresie relacji najedź na H6N4F1S1, aby podświetlić powiązania z sześcioma białkami i trzema strukturami. Porównaj to, najeżdżając kursorem na H6N4F2S1, która wyróżnia dwie izoformy PSA (obie określane jako UniProt ID: KLK3_HUMAN) i jedną strukturę (ID: 10996). Najedź kursorem na identyfikator struktury, aby wyświetlić jej reprezentację SNFG i kliknij na nią, aby otworzyć odpowiednią stronę (rysunek uzupełniający 2).
    4. Zmień węzły ośmiornicy na dowolny inny temat opisujący kontekst glikozylacji. Kod kolorystyczny pozostaje taki sam, jak opisany wcześniej (patrz Tabela 1).
      1. Zmień węzły środkowe na Tkanki, aby wyświetlić 15 opcji w środku wykresu, z których wiele to płyny ustrojowe. Poszukaj wszystkich powiązań między białkami i glikanami pasującymi do zapytania w zależności od informacji o tkankach. Umieść kursor na moczu lub płynie nasiennym w środku wykresu, aby wyświetlić różne powiązania ( Rysunek 4A,B).
      2. Zmień węzły środkowe na Choroba, aby wyświetlić 13 opcji, z których jedną jest Rak prostaty. Jedynym związanym z nim białkiem jest PSA (KLK3_HUMAN) (rysunek uzupełniający 3).
        UWAGA: Bliższe przyjrzenie się N-gligonowi PSA pokazanemu na stronie z białkiem zwraca uwagę na bardzo wysoką częstotliwość końcowego NeuAc(a?-?)Gal(b?-?)Podbudowa GlcNAc w wielu przypadkach na konstrukcjach z dwiema lub trzema antenami. Na tej podstawie można wygenerować kolejną ośmiornicę, jak opisano poniżej.
    5. Kliknij przycisk Wyczyść, aby odświeżyć wyszukiwanie. Przejdź do podzakładki Właściwości i kliknij ikonę Bi-antennary. Przejdź do podzakładki Wyznaczniki i kliknij ikonę 3-Sialyl-LN (typ 2). Kliknij zielony przycisk Szukaj poniżej.
    6. Sprawdź powiązania odzyskane przez ośmiornicę z glikanami dwuantenowymi zawierającymi końcowy motyw 3-Sialyl-LN (typ 2), tj. NeuAc(a1-3)Gal(b1-4)GlcNAc. Zmień węzły środkowe na Tkanki, aby ułatwić czytanie i najedź na KLK3_HUMAN, aby bezpośrednio połączyć płyn nasienny z powszechną izoformą PSA i siedmioma strukturami (rysunek uzupełniający 4).
      UWAGA: Drugie narzędzie do wizualizacji, GlyConnect Compozitor, wykonuje skanowanie potencjalnych relacji między każdą kompozycją na jej liście (patrz poniżej). Związek definiuje się jako różniący się tylko jednym monosacharydem między dwoma kompozycjami. Te zidentyfikowane zależności naniesione na wykres ujawniają (nie)ciągłość glikomu.
    7. Użyj GlyConnect Compozitor do wykonania skanowania potencjalnych relacji między każdą kompozycją na jej liście, jak pokazano poniżej w przypadku PSA.
      UWAGA: GlyConnect Compozitor przetwarza kompozycje w powiązaniu z kontekstem. Oferuje odrębne zakładki do wyszukiwania zapytań GlyConnect, np. Białka, Źródła, Linie komórkowe, Choroby, które nie wymagają wyjaśnień, aby zakwalifikować kontekst. Jest to zilustrowane tutaj za pomocą PSA w następujący sposób.
    8. Wróć do strony poświęconej białku PSA: https://glyconnect.expasy.org/browser/proteins/790. Po prawej stronie strony zgłoszeniowej PSA kliknij link Compozitor. Upewnij się, że pola wyszukiwania Compozitor są wstępnie wypełnione szczegółami wpisu Id 790 w zakładce Białko (Białko: antygen specyficzny dla prostaty, gatunek: Homo sapiens i typ glikanu: N-linkowany).
    9. Kliknij przycisk Dodaj do zaznaczenia, aby pobrać dane z bazy danych i wyświetlić wykres połączonych kompozycji. Usuń zaznaczenie opcji Uwzględnij węzły wirtualne. Kliknij przycisk Compute Graph, aby wyświetlić wykres przedstawiający dobrze połączony zestaw 78 kompozycji reprezentujących N-glikom PSA oraz wykres słupkowy pokazujący główne cechy glikanów.
    10. Umieść kursor na fioletowym pasku na wykresie słupkowym, który lokalizuje wszystkie struktury sjalowane na wykresie, aby ujawnić obserwowalne odchylenie w kierunku struktur sjalowanych.
    11. Pozostań w głównej zakładce Białko i wybierz Antygen specyficzny dla prostaty - izoforma wysokiej liczby Pi (psah) w polu Białko (nazwa).
      UWAGA: Pola Typ glikanu i Witryna glikanu są wypełniane automatycznie.
    12. Kliknij przycisk Dodaj do zaznaczenia, aby pobrać dane z bazy danych, które liczą 57 kompozycji. Kliknij przycisk Oblicz wykres, aby wygenerować nałożone na siebie wykresy obu izoform i ocenić różnice w glikach dwóch izoform PSA. Najedź kursorem na etykiety węzłów, aby wyświetlić liczbę struktur odpowiadających kompozycjom/etykietom (Rysunek 5).
  4. Informacje o wiązaniu glikanów w UniLectin
    UWAGA: Przypomnij sobie determinantę testowaną u ośmiornicy, opisaną jako NeuAc(a2-3)Gal(b1-4). Z definicji jest to ustalona część wiążąca struktury glikanu i jako taka może być wyszukiwana w bazie danych UniLectin3D25.
    1. Przejdź do https://www.unilectin.eu/ i kliknij przycisk UniLectin3D. Alternatywnie, przejdź bezpośrednio do strony: https://www.unilectin.eu/unilectin3D/.Click na przycisk Glycan Search, aby otworzyć tę stronę: https://www.unilectin.eu/unilectin3D/glycan_search (Rysunek uzupełniający 6).
    2. Kliknij na fioletowy diament reprezentujący kwas sjalowy, który spowoduje wyświetlenie wszystkich motywów wiążących glikany, zakończonych kwasem sjalowym przechowywanym w bazie danych. Górna część tego zbioru motywów zawiera badany wcześniej motyw NeuAc(a2-3)Gal(b1-4)GlcNAc (rys. uzupełniający 7).
    3. Kliknij na motyw NeuAc(a2-3)Gal(b1-4)GlcNAc, aby wyświetlić wszystkie lektyny, dla których znana jest struktura 3D potwierdzająca oddziaływanie z NeuAc(a2-3)Gal(b1-4)GlcNAc. Wynik domyślnie pokazuje lektyny we wszystkich gatunkach. Użyj opcji Szukaj według pola, aby ograniczyć widok do informacji skoncentrowanych na człowieku.
    4. Kliknij opcję Szukaj według pola. W polu gatunków wpisz Homo sapiens. Kliknij przycisk Eksploruj struktury rentgenowskie, aby odfiltrować oryginalną listę. Pozostał tylko jeden wpis, tj. ludzka galektyna-8. Kliknij przycisk Wyświetl strukturę i informacje 3D w prawym górnym rogu wymienionego elementu, aby wyświetlić szczegółowe informacje o interakcji ludzkiej galektyny-8 z NeuAc(a2-3)Gal(b1-4)GlcNAc.
    5. Uzyskaj dostęp do informacji strukturalnych o ludzkiej galektynie-8 wyświetlanych na stronie za pomocą dwóch różnych przeglądarek.
      1. Przytrzymaj mysz, aby obrócić cząsteczkę i wysunąć ligand na pierwszy plan za pomocą zintegrowanego oprogramowania Litemol 26, aby pokazać strukturę lektyny 3D. Najedź kursorem myszy na jedną z wymienionych interakcji po lewej stronie, aby zaktualizować widok po prawej stronie i zlokalizować, gdzie ta konkretna interakcja działa w strukturze za pomocą oprogramowania PILP 27 zintegrowanego w celu szczegółowego wyszczególnienia oddziaływań atomowych między lektyną a ligandem (Rysunek 6).
    6. Kliknij dowolny zielony przycisk, który prowadzi do odpowiednich wpisów w UniProt, PDB (strony europejskie lub amerykańskie) i GlyConnect, aby zapoznać się z tymi odsyłaczami.

2. Odkrywanie i porównywanie O-glicomes w GlyConnect

  1. Przeglądanie zestawu danych wysokiego poziomu ufności wyzwania HGI
    UWAGA: Zestaw danych HGI wspomniany we wstępie jest przechowywany w bazie danych GlyConnect. Zawiera 163 N- i 23 O-glikopeptydy znajdujące się w 37 glikoproteinach uważanych za listę o wysokim poziomie ufności. GlyConnect Compozitor28 jest kluczem do oceny spójności danych glycome. Co ważne, Compozitor pozwala na węzły wirtualne (pokazane w kolorze szarym), gdy do połączenia izolowanych węzłów potrzebny jest tylko jeden krok pośredni. W ten sposób węzły wirtualne dokręcają wykres i mogą być interpretowane jako struktury potencjalnie pominięte w wynikach eksperymentalnych.
    1. Przeglądaj zestaw danych HGI ze strony głównej GlyConnect, przechodząc bezpośrednio na stronę referencyjną artykułu: https://glyconnect.expasy.org/browser/references/2943.
      UWAGA: Podsumowanie w kolorowych przyciskach częściowo odzwierciedla liczby podane w artykule. Jeśli jednak wymienionych jest tylko 69 unikalnych peptydów, odzwierciedla to wiele powiązań między peptydami a miejscami lub strukturami. W artykule glikopeptyd zdefiniowano jako unikalne połączenie peptydu i kompozycji. W GlyConnect najpierw rozważane są glikozyty, które są opisywane jako połączenie peptydu ze strukturami. To wyjaśnia rozbieżność w liczbach między GlyConnect a powyższym cytatem.
    2. Sprawdź wysoką częstotliwość występowania kompozycji sprzężonych z N, takich jak Hex:5 HexNAc:4 NeuAc:2, zidentyfikowanych w 42 miejscach w 43 peptydach, w przeciwieństwie do częstej unikalności większości kompozycji związanych z O zidentyfikowanych w 1 miejscu w 1 peptydzie.
    3. Kliknij link Compozitor po prawej stronie wprowadzania referencyjnego, aby ocenić spójność zestawu danych. Upewnij się, że narzędzie Compozitor bezpośrednio przetwarza DOI odniesienia i wypełnia pole wyszukiwania reference=10.1101/2021.03.14.435332 w zakładce Zaawansowane narzędzia. Wpisz &glycan_type=O-linked po numerze DOI, aby zawęzić wyszukiwanie do glikanów połączonych z O, tak aby zapytanie otrzymało postać: reference=10.1101/2021.03.14.435332&glycan_
      type=O połączone
    4. Kliknij przycisk Dodaj do zaznaczenia, aby pobrać dane z bazy danych (jest 20 kompozycji połączonych O). Pozostaw zaznaczoną opcję Uwzględnij węzły wirtualne. Kliknij przycisk Compute Graph, aby wyświetlić wykres połączonych kompozycji. Wynik ten uwypukla kilka luk w oczekiwanej ciągłości biosyntezy glikanów z dziewięcioma wirtualnymi węzłami wymaganymi do ukończenia wykresu (Rysunek 7).
  2. Porównanie z O-glycome wybranego białka surowicy w GlyConnect
    UWAGA: Aby ocenić, czy luki mogą zostać wypełnione przez dane przechowywane w GlyConnect, wybrano jedno białko O-glikozylowane spośród 37 wymienionych z odniesieniem. W zbiorze danych podano, że inhibitor łańcucha ciężkiego H4 między alfa-trypsynami (Q14624) jest O-glikozylowany na Thr-725.
    1. Przejdź do zakładki Białko w GlyConnect Compozitor (patrz krok 2.1.3). Z listy Białko wybierz inhibitor łańcucha ciężkiego inter-alfa-trypsyny H4. Upewnij się, że wybór gatunku to domyślnie Homo sapiens. Usuń zaznaczenie opcji N-linked w typie Glycan. Wybierz tylko Thr-725 na liście Witryna, klikając najpierw znak minus po lewej stronie Witryny, aby odznaczyć wszystkie witryny, a następnie wybierając z listy tylko Thr-725.
    2. Kliknij przycisk Dodaj do zaznaczenia (zauważ, że sześć kompozycji jest powiązanych z Thr-725). Kliknij przycisk Compute Graph (Oblicz wykres), aby wyświetlić wykres połączonych kompozycji (Rysunek uzupełniający 8).
    3. Zwróć uwagę na wyświetlany wykres, który na niebiesko pokazuje 17 unikalnych kompozycji z 20 kompozycji powiązanych z O w zbiorze danych artykułu, a na czerwono trzy unikalne z sześciu w bazie danych. Innymi słowy, nakładanie się tych dwóch źródeł jest obecne w trzech kompozycjach, które są reprezentowane w kolorze magenta. Zwróć uwagę, że obrót wykresu o 45° jest generowany automatycznie.
      UWAGA: Liczba węzłów wirtualnych jest zmniejszona o jeden. Jak się okazuje, H2N2S1, którego brakuje w 20 kompozycjach powiązanych z O w zbiorze danych artykułu i jest reprezentowany jako wirtualny węzeł, jest teraz wypełniony dodatkową kompozycją związaną z Thr-725 łańcucha ciężkiego inhibitora inter-alfa-trypsyny H4 w bazie danych. Upraszcza to topologię grafu, ponieważ dwa inne węzły wirtualne są bezużyteczne, ponieważ były alternatywnymi opcjami wypełnienia luki między H1N2S1 i H2N2S2. Jednak druga kompozycja zaimportowana z bazy danych zostałaby odizolowana, gdyby nie utworzenie dwóch nowych alternatywnych węzłów wirtualnych H2N2F1S1 i H1N2F2S1.
    4. Aby zrozumieć węzły wirtualne, sprawdź, czy odpowiednie kompozycje są obecne w GlyConnect. Aby to zrobić, kliknij przycisk Eksportuj pod wykresem. Wybierz opcję Tylko wirtualne, usuwając zaznaczenie wszystkich innych opcji. Kliknij ikonę schowka, aby skopiować wybór 8 kompozycji.
    5. Wklej zaznaczenie w oknie zapytania na karcie Niestandardowe Compozitor. Wybierz opcję O-linked w polu Glycan Type (Typ Glycan). Ustaw Etykietę wyboru w polu Kompozycje na, na przykład, VN, aby nazwać listę 8 kompozycji. Kliknij przycisk Dodaj do zaznaczenia, a następnie przycisk Obliczanie wykresu. Wszystkie węzły wirtualne są teraz wyświetlane jako zielone węzły (Rysunek 8).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pierwsza część protokołu (sekcja 1) pokazała, jak zbadać specyficzność lub powszechność N-glikanów dołączonych do Asn-69 ludzkiego antygenu swoistego dla prostaty (PSA) za pomocą platformy GlyConnect. Zależne od tkanek (mocz i płyn nasienny), a także zależne od izoformy (normalne i wysokie pI) zmiany w ekspresji glikanów, zostały podkreślone za pomocą dwóch narzędzi wizualizacyjnych (Rysunek 4 i Rysunek 5).

Po pierwsze, G...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

GlyConnect Octopus jako narzędzie do ujawniania nieoczekiwanych korelacji
GlyConnect Octopus został pierwotnie zaprojektowany do przeszukiwania bazy danych z luźną definicją glikanów. Rzeczywiście, literatura często podaje główne cechy glikanów w glikozie, takie jak fukozylacja lub sjalilacja, budowa z dwóch lub więcej czułków itp. Co więcej, glikany, zarówno sprzężone z N, jak i O, są klasyfikowane w rdzeniach, jak opisano w podręczniku referencyjnym Essentials of Glycobiology1

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autor serdecznie dziękuje byłym i obecnym członkom Proteome Informatics Group zaangażowanym w rozwój zasobów użytych w tym samouczku, w szczególności Julienowi Mariethozowi i Catherine Hayes za GlyConnect, François Bonnardelowi za UniLectin, Davide Alocci i Fredericowi Nikitinowi za Octopus, oraz Thibault Robin za Compozitor i ostatnie szlifowanie Octopus.

Rozwój projektu glyco@Expasy jest wspierany przez szwajcarski rząd federalny za pośrednictwem Sekretariatu Stanu ds. Edukacji, Badań i Innowacji (SERI) i jest obecnie uzupełniany przez Szwajcarską Narodową Fundację Nauki (SNSF: 31003A_179249). ExPASy jest utrzymywany przez Szwajcarski Instytut Bioinformatyki i hostowany w Centrum Kompetencyjnym Vital-IT. Autor dziękuje również Anne Imberty za znakomitą współpracę nad platformą UniLectin wspieraną wspólnie przez ANR PIA Glyco@Alps (ANR-15-IDEX-02), Alliance Campus Rhodanien Co-funds (http://campusrhodanien.unige-cofunds.ch) Labex Arcane/CBH-EUR-GS (ANR-17-EURE-0003).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Połączenie zInternetem Wybór
Najnowsza wersja przeglądarki internetowejWybór użytkownika
użytkownika

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Spring Harbor Laboratory Press. Essentials of Glycobiology. , Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor (NY). (2015).
  2. Gray, C. J., et al. Advancing solutions to the carbohydrate sequencing challenge. Journal of the American Chemical Society. 141 (37), 14463-14479 (2019).
  3. Tsuchiya, S., Yamada, I., Aoki-Kinoshita, K. F. GlycanFormatConverter: a conversion tool for translating the complexities of glycans. Bioinformatics. 35 (14), 2434-2440 (2018).
  4. Fujita, A., et al. The international glycan repository GlyTouCan version 3.0. Nucleic Acids Research. 49, 1529-1533 (2021).
  5. Alocci, D., et al. GlyConnect: glycoproteomics goes visual, interactive, and analytical. Journal of Proteome Research. 18 (2), 664-677 (2019).
  6. York, W. S., et al. GlyGen: computational and informatics resources for glycoscience. Glycobiology. 30 (2), 72-73 (2020).
  7. Watanabe, Y., Aoki-Kinoshita, K. F., Ishihama, Y., Okuda, S. GlycoPOST realizes FAIR principles for glycomics mass spectrometry data. Nucleic Acids Research. 49, 1523-1528 (2020).
  8. Campbell, M. P., Aoki-Kinoshita, K. F., Lisacek, F., York, W. S., Packer, N. H. Glycoinformatics. Essentials of Glycobiology. , (2015).
  9. Cao, W., et al. Recent advances in software tools for more generic and precise intact glycopeptide analysis. Molecular & Cellular Proteomics. 20, 100060(2021).
  10. Mariethoz, J., Hayes, C., Lisacek, F. Glycan compositions with Compozitor to enhance glycopeptide identification. Proteomics Data Analysis. 2361, 109-127 (2021).
  11. Kawahara, R., et al. Communityevaluation of glycoproteomics informatics solutions reveals high-performance search strategies of serum glycopeptide analysis. Nature Methods. 18, 1304-1316 (2021).
  12. Lisacek, F., Aoki-Kinoshita, K. F., Vora, J. K., Mazumder, R., Tiemeyer, M. Glycoinformatics resources integrated through the GlySpace Alliance. Comprehensive Glycoscience. 1, 507-521 (2021).
  13. Mariethoz, J., et al. Glycomics@ExPASy: bridging the gap. Molecular & Cellular Proteomics. 17 (11), 2164-2176 (2018).
  14. Duvaud, S., et al. Expasy, the swiss bioinformatics resource portal, as designed by its users. Nucleic Acids Research. 49, 216-227 (2021).
  15. The UniProt Consortium et al. UniProt: the universal protein knowledgebase in 2021. Nucleic Acids Research. 49, 480-489 (2021).
  16. Bonnardel, F., Perez, S., Lisacek, F., Imberty, A. Structural database for lectins and the UniLectin web platform. Lectin Purification and Analysis. 2132, 1-14 (2020).
  17. Neelamegham, S., et al. Updates to the symbol nomenclature for glycans guidelines. Glycobiology. 29 (9), 620-624 (2019).
  18. Sharon, N. IUPAC-IUB Joint Commission on Biochemical Nomenclature (JCBN). Nomenclature of glycoproteins, glycopeptides and peptidoglycans: JCBN recommendations 1985. Glycoconjugate Journal. 3 (2), 123-133 (1986).
  19. Harvey, D. J., et al. Proposal for a standard system for drawing structural diagrams of N- and O-linked carbohydrates and related compounds. Proteomics. 9 (15), 3796-3801 (2009).
  20. Song, E., Mayampurath, A., Yu, C. -Y., Tang, H., Mechref, Y. Glycoproteomics: identifying the glycosylation of prostate specific antigen at normal and high isoelectric points by LC-MS/MS. Journal of Proteome Research. 13 (12), 5570-5580 (2014).
  21. Moran, A. B., et al. Profiling the proteoforms of urinary prostate-specific antigen by capillary electrophoresis - mass spectrometry. Journal of Proteomics. 238, 104148(2021).
  22. Wang, W., et al. High-throughput glycopeptide profiling of prostate-specific antigen from seminal plasma by MALDI-MS. Talanta. 222, 121495(2021).
  23. wwPDB consortium metal. Protein Data Bank: the single global archive for 3D macromolecular structure data. Nucleic Acids Research. 47, 520-528 (2019).
  24. Sehnal, D., Grant, O. C. Rapidly display glycan symbols in 3D structures: 3D-SNFG in LiteMol. Journal of Proteome Research. 18 (2), 770-774 (2019).
  25. Bonnardel, F., et al. UniLectin3D, a database of carbohydrate binding proteins with curated information on 3D structures and interacting ligands. Nucleic Acids Research. 47, 1236-1244 (2019).
  26. Sehnal, D., et al. LiteMol suite: interactive web-based visualization of large-scale macromolecular structure data. Nature Methods. 14 (12), 1121-1122 (2017).
  27. Salentin, S., Schreiber, S., Haupt, V. J., Adasme, M. F., Schroeder, M. PLIP: fully automated protein-ligand interaction profiler. Nucleic Acids Research. 43, 443-447 (2015).
  28. Robin, T., Mariethoz, J., Lisacek, F. Examining and fine-tuning the selection of glycan compositions with GlyConnect Compozitor. Molecular & Cellular Proteomics. 19 (10), 1602-1618 (2020).
  29. Compagno, D., et al. Glycans and galectins in prostate cancer biology, angiogenesis and metastasis. Glycobiology. 24 (10), 899-906 (2014).
  30. Gentilini, L. D., et al. Stable and high expression of Galectin-8 tightly controls metastatic progression of prostate cancer. Oncotarget. 8 (27), 44654-44668 (2017).
  31. Schwämmle, V., Verano-Braga, T., Roepstorff, P. Computational and statistical methods for high-throughput analysis of post-translational modifications of proteins. Journal of Proteomics. 129, 3-15 (2015).
  32. Khatri, K., Klein, J. A., Zaia, J. Use of an informed search space maximizes confidence of site-specific assignment of glycoprotein glycosylation. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (2), 607-618 (2017).
  33. Sztain, T., et al. A glycan gate controls opening of the SARS-CoV-2 spike protein. Nature Chemistry. 13, 963-968 (2021).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Interakcje glikan bia konarz dzia glikoinformatycznebazy danych glikoproteinwizualizacja glikan wanaliza N glikomuanaliza O glikomubaza danych GlyConnectUniLectin3Dspecyficzno glikomu bia ekpor wnanie sk adu glikan w

Powiązane artykuły