Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Izolacja stabilnie transfekowanych klonów komórek czerniaka

1.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63371

⸱

4 sierpnia 2022

 ,  , 
1Department of Cell Pathology, Faculty of Biotechnology, University of Wrocław

W tym artykule

Podsumowanie

Opisano protokół do izolowania stabilnie transfekowanych klonów komórek czerniaka za pomocą szklanych cylindrów. Stawiamy na praktyczne porady, które mogą zadecydować o powodzeniu całej procedury.

Streszczenie

Populacje komórek, które mają stabilne zmiany w informacjach genomowych, są powszechnie wykorzystywane przez naukowców jako model badawczy. Nie wymagają one wielokrotnej transfekcji komórek, ponieważ może to prowadzić do niejednorodnej populacji komórek i zmiennej wydajności transfekcji, wpływając na odtwarzalność. Ponadto są one preferowane w przypadku analiz na dużą skalę. Generowanie stabilnych klonów komórkowych jest przydatne w szerokim zakresie zastosowań, takich jak badania nad funkcjami genów i produkcją rekombinowanych białek. Istnieje kilka metod uzyskiwania jednorodnej populacji komórek po początkowej transfekcji przejściowej. Tutaj opisujemy izolację klonów jednokomórkowych za pomocą szklanych cylindrów. Chociaż ta metoda jest znana już od jakiegoś czasu, istnieje kilka kluczowych kroków, a ich zaniedbanie może doprowadzić do niepowodzenia. Z powodzeniem zastosowaliśmy tę metodę do uzyskania klonów ze stabilną nadekspresją białka będącego przedmiotem zainteresowania (POI) lub z nokautem genu będącego przedmiotem zainteresowania (GOI). Opisujemy etapy przygotowania, takie jak optymalizacja doboru stężeń leków, przygotowanie szklanych cylindrów oraz walidacja, czy uzyskane klony mają pożądaną zmianę w ekspresji GOI za pomocą PCR, analizy western blot, barwienia immunologicznego lub sekwencjonowania gDNA (w zależności od rodzaju uzyskanych klonów). Omawiamy również niejednorodność fenotypową dobrze ugruntowanych linii komórkowych, ponieważ może to stanowić problem w uzyskiwaniu stabilnych klonów komórek.

Wprowadzenie

Stabilna transfekcja komórek ssaków jest rutynowo stosowaną metodą w wielu zastosowaniach hodowli komórkowych, w tym w badaniach nad rakiem. Jego przewagą nad transfekcją przejściową jest to, że wprowadzony obcy materiał genetyczny nie może zostać utracony z powodu czynników środowiskowych (np. konfluencji komórek lub etapu replikacji) i podziału komórki, ponieważ jest zintegrowany z genomem hosta1. Rozwój linii komórkowych o stabilnej ekspresji może być pracochłonny i wymagający, ale jeśli wymagana jest trwała ekspresja genów przez dłuższy czas, preferowaną opcją jest wyprowadzenie stabilnych linii komórkowych. Najczęstszym celem transfekcji jest badanie funkcji określonego genu lub produktu genowego poprzez nadprodukcję lub regulację w dół jego ekspresji. Jednak produkcja białek rekombinowanych i terapie genetyczne wymagają również wprowadzenia obcego materiału genetycznego do komórki2.

Klon jest zdefiniowany jako populacja komórek pochodząca z jednej pojedynczej komórki. Izolacja klonów pojedynczych komórek jest kluczowym aspektem biologii komórki podczas badania komórek o zmienności genotypowej i fenotypowej. Do wyprowadzania klonów komórek stosuje się trzy główne techniki: technikę rozcieńczania, technikę klonowania pierścieniowego3 oraz technikę sortowania komórek4. Każdy z nich ma zalety i wady. Przedstawiamy szczegółowy opis metody izolowania klonów komórek czerniaka przy użyciu techniki szklanego cylindra. Zaletą tej metody jest to, że komórki wykazują umiarkowany wzrost klonalny z kultur komórkowych o niskiej gęstości. Co więcej, wybrane komórki wykazały już zdolność do proliferacji, ponieważ już utworzyły kolonie5. Procedura ta polega na wysiewaniu transfekowanych komórek rzadko, ale nie przy ograniczonym rozcieńczeniu, do dużego naczynia i umożliwieniu im ekspansji i tworzenia kolonii przez 2-3 tygodnie w obecności selektywnego antybiotyku. Poszczególne kolonie można następnie wyizolować za pomocą szklanych cylindrów, które umieszcza się nad koloniami i przykleja do naczynia za pomocą smaru silikonowego. Następnie komórki są odłączane za pomocą trypsyny, a następnie przenoszone na płytki wielodołkowe w celu dalszej hodowli w obecności selektywnej pożywki.

Istnieje wiele badań opisujących izolację klonów, ale skupiamy się na pokazaniu szczegółów, takich jak rozmiar, jaki powinny mieć klony po 2 tygodniach selekcji, jak oznaczyć lokalizację klonów podczas ich izolacji i jak wybrać odpowiednie stężenie antybiotyku do selekcji. Stawiamy na praktyczne porady, które mogą zadecydować o powodzeniu całej procedury. Przedstawiony protokół pozwala nam na uzyskanie stabilnych klonów komórkowych w ciągu 2-4 tygodni. Metoda jest łatwa i tania i nie wymaga skomplikowanego sprzętu. Dzielimy się techniką, która pozwoliła nam uzyskać wiele modeli badawczych, w tym klony GSN KO6,7,8.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Subkultura komórkowa i wysiew w celu optymalizacji stężenia leku

  1. Podgrzać pożywkę do hodowli komórkowych (w tym przypadku zmodyfikowaną pożywkę Eagle's firmy Dulbecco o obniżonym stężeniu (1,5 g/l) NaHCO3, 10% (v/v) płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 1% (v/v) L-glutaminy i 1% (v/v) antybiotykowo-przeciwgrzybiczą) i roztwór trypsyny w łaźni wodnej do temperatury 37 °C.
  2. Odessać i odrzucić pożywkę do hodowli komórkowych z komórek A735 rosnących w kolbie do hodowli komórkowych T25. Linia komórkowa pozyskiwana jest ze źródeł komercyjnych.
  3. Wypłukać pozostałą pożywkę do hodowli komórkowych z komórek, przemłukując kolbę 1 ml roztworu trypsyny lub PBS.
  4. Odessać i wyrzucić trypsynę lub roztwór PBS z komórek.
  5. Dodać 1 ml roztworu trypsyny do kolby i inkubować w temperaturze 37 °C. Uważnie obserwować odklejanie się komórek za pomocą odwróconego mikroskopu.
  6. Zatrzymaj aktywność trypsyny, dodając 3 ml świeżej, kompletnej pożywki do hodowli komórkowych i przepłucz nią kolbę do hodowli komórkowych, gdy komórki się odłączą.
  7. Przenieść zawiesinę komórek z kolby do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.
  8. Odwirować komórki przy 800 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej (RT).
  9. Odessać i wyrzucić supernatant.
  10. Zawiesić komórki w 1 ml pożywki do hodowli świeżych komórek.
  11. Aby obliczyć gęstość komórek, policz komórki za pomocą automatycznego licznika komórek lub hemocytometru.
  12. Wysiewać odpowiednią liczbę komórek w naczyniu hodowlanym o odpowiedniej wielkości.
    UWAGA: W tym eksperymencie 450 000 komórek linii komórkowej A375 wysiewano w 2 ml pożywki do hodowli komórkowych w naczyniu hodowlanym o średnicy 35 mm.

2. Optymalizacja stężenia wybranego leku

  1. Znajdź zalecany przez producenta zakres stężeń leku, który ma być stosowany do wyboru stabilnych klonów komórkowych.
    UWAGA: Gen selekcyjny wprowadzony do komórki przez transfekcję z wektorem genetycznym zapewnia komórce oporność na lek selekcyjny. Puromycynę w stężeniu 1 μg/ml zastosowano jako marker selekcyjny w celu uzyskania stabilnej ekspresji wektora genetycznego i eliminacji komórek nietransfekowanych.
  2. Zasiej komórki w dołkach 96-dołkowej płytki, aby następnego dnia osiągnąć 50% konfluencji. Przygotuj trzy studzienki dla każdego stężenia leku i nieleczonej kontroli. Wysiewaj 10 000 komórek na dołek. Liczba komórek zależy od używanej linii komórkowej i musi być określona empirycznie.
  3. Po 24 godzinach należy przygotować 10 rozcieńczeń leku w kompletnym pożywce od najniższego do najwyższego stężenia zalecanego przez producenta i dodać je do komórek.
    UWAGA: W tym przypadku zastosowano puromycynę. Zakres stężeń wynosił 0-10 μg/ml. Co 3 dni lub gdy w pożywce zaobserwuje się wiele martwych komórek, zmień pożywkę na świeżą.
  4. Obserwuj komórki codziennie przez tydzień i rób notatki dotyczące ich zbiegu, proliferacji i śmierci w odniesieniu do płytki kontrolnej.
    UWAGA: Odpowiednie stężenie to takie, przy którym komórki przestają się namnażać i nie powodują natychmiastowej śmierci komórek, ale zabijają wszystkie leczone komórki po 48-120 godzinach. Jednak w przypadku niektórych kombinacji linii komórkowych i leków może nie wystąpić faza, w której komórki przestają się namnażać, ale umierają. W takiej sytuacji najniższe stężenie leku, który zabija wszystkie komórki, byłoby odpowiednie do selekcji.

3. Sadzenie komórek i transfekcja

  1. Wysiewaj komórki w dołku na płytce sześciodołkowej.
    UWAGA: Ostateczna objętość zawiesiny komórkowej w pożywce do hodowli komórkowych powinna wynosić 2,5 ml. W tym eksperymencie wysiano 450 000 komórek na studzienkę. Liczbę komórek należy określić empirycznie, aby ich zbieg nie mógł przekroczyć 90% po 48 godzinach od wysiewu.
  2. Hodować komórki w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze zawierającej 5% CO2 przez 24 godziny
    UWAGA: Komórki hodowano przez 24 godziny przed transfekcją. Jednak po 48 godzinach od wysiewu zaobserwowano, że komórki były transfekowane bardziej efektywnie.
  3. Odessać i wyrzucić pożywkę do hodowli komórkowej powyżej komórek.
  4. Zastąp wyrzuconą pożywkę wstępnie podgrzaną, wolną od antybiotyków pożywką do hodowli komórkowych (10% (v/v) FBS, DMEM uzupełniony glutaminą).
    UWAGA: Potrzeba zmiany pożywki do hodowli komórkowych wynika ze zwiększonej przepuszczalności komórek spowodowanej przez niektóre odczynniki do transfekcji, które mogą powodować zwiększony napływ antybiotyków do komórek, powodując śmierć komórki.
  5. Rozcieńczone odczynniki do transfekcji w DMEM bez antybiotyków i surowicy. Użyj polietylenoiminy (PEI), odczynnika do transfekcji na bazie lipidów lub elektroporacji. Do transfekcji komórek należy użyć roztworu polietylenoiminy o stężeniu wagowym 2 mg/ml w stosunku wagowym 1:2,175 na 4 μg DNA.
    UWAGA: Jako roztwór DNA w systemie CRISPR/Cas9(D10A) zastosowano mieszaninę dwóch plazmidów z następującymi sekwencjami gRNA: 5'ccggggtgcagaccgtg3' i 5'atccagctgcacggtaaaga3'.
  6. Inkubować mieszaninę transfekcji przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
  7. Po inkubacji ostrożnie dodawać mieszaninę transfekcji kroplami do komórek rosnących w dołkach sześciodołkowej płytki.
  8. Hodować komórki w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze zawierającej 5% CO2 przez 2-6 godzin.
  9. Zmień pożywkę na kompletną pożywkę do hodowli komórkowych.
  10. Hodować komórki w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze zawierającej 5% CO2 przez następne 24 godziny.

4. Generacja klonów komórek

  1. Trypsynizować i przenieść transfekowane komórki do naczynia hodowlanego o średnicy 150 mm z formowaną siatką o średnicy 20 mm zgodnie z instrukcjami w sekcji 1 protokołu.
    UWAGA: Ze względu na łączenie się komórek ze sobą w przypadku dużej gęstości, zaleca się równomierne przeniesienie komórek do dwóch szalek do hodowli komórkowych. Siatka na naczyniu hodowlanym pomaga lokalizować klony i śledzić ich migrację. Na wydrukowanym planie naczynia można potem zaznaczyć położenie klonów (Rysunek 1B). Ponadto, w przypadku komórek, które nie tolerują usuwania pożywki i wystawienia na działanie powietrza (co skutkuje śmiercią/nieodwracalnym uszkodzeniem), lepiej byłoby użyć większej liczby szalek o mniejszej powierzchni, aby wyizolować mniej kolonii z jednej płytki. Może to skrócić czas ekspozycji na powietrze podczas izolacji klonów i zmniejszyć prawdopodobieństwo odwodnienia komórek.
  2. Hodować komórki w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze zawierającej 5% CO2 przez 24 godziny.
  3. Zmienić pożywkę do hodowli komórkowych na pożywkę zawierającą selektywny antybiotyk.
    UWAGA: Od tego momentu ważne jest, aby hodować komórki w obecności selektywnego antybiotyku; W przeciwnym razie istnieje szansa na wycięcie zintegrowanego transgenu z genu.
  4. Zmieniaj pożywkę co 3 dni lub gdy w pożywce pływa wiele martwych komórek.
    UWAGA: W tym eksperymencie komórki inkubowano z puromycyną w stężeniu 1 μg/ml. Etap wyboru klonu komórki trwa około 2 tygodni. Powstawanie klonów powinno być monitorowane, obserwując ich wzrost pod odwróconym mikroskopem, ponieważ nie powinny one rosnąć i wchodzić w kontakt z sąsiednimi klonami komórkowymi. Nie można zapobiec migracji i wzrostowi komórek z jednej kolonii wraz z inną kolonią. Dlatego ważne jest, aby obserwować płytkę pod kątem migracji komórek z klonów i zanotować informacje na jej temat na planie potrawy.

5. Wybór klonów do izolacji

  1. Zbadaj naczynie do hodowli komórkowych klonów komórkowych pod mikroskopem odwróconym z obiektywem 10x lub 20x.
    UWAGA: Klony składają się z około 500-30 000 komórek. Zależy to jednak od użytej linii komórkowej. Zadowalająca kolonia powinna być oddzielona od innych kolonii komórkowych i mieć średnią wielkość, ponieważ bardzo duże i wybitne klony mogą powstać z więcej niż jednej komórki (Rysunek 1B).
  2. Znajdź odpowiednią kolonię za pomocą odwróconego mikroskopu, dokładnie badając naczynie i oceniając znalezione klony. Umieść znacznik w miejscu wybranego klonu ze znacznikiem na naczyniu pod spodem. Jednocześnie zaznacz lokalizację kolonii na wydrukowanym planie talerza (Rysunek 1B).
    UWAGA: Z naczynia należy wybrać około 20-30 kolonii. Czasami uzyskuje się mniej klonów komórkowych i w takich przypadkach wszystkie z nich należy wyizolować.

6. Przygotowanie szklanych cylindrów

  1. Przed izolacją klonów umieść szklane cylindry (o średnicy 6,4 mm i wysokości 8 mm) (Rysunek 1C) na pierwszej szklanej szalce Petriego i przeprowadź je w autoklawie.
  2. Autoklaw drugiej szklanej szalki Petriego.
  3. Nałóż cienką warstwę smaru silikonowego na dno drugiej autoklawizowanej szklanej szalki Petriego. Umieść naczynie pod komorą z przepływem laminarnym i zastosuj światło UV przez 30 minut, aby wysterylizować smar silikonowy.
    UWAGA: Opcjonalnie smar silikonowy można sterylizować w autoklawie.
  4. Zanurz autoklawowane cylindry w pokrytej smarem silikonowym szalce Petriego. Teraz są gotowi do odizolowania klonów.
  5. Po wyizolowaniu klonów należy oczyścić cylindry zgodnie z zasadami mającymi zastosowanie do materiału komórkowego, z którym mają do czynienia. W przypadku modyfikacji genetycznej do sterylizacji należy użyć podchlorynu sodu.
  6. Umyj cylindry ksylenem przez noc, aby oczyścić je ze smaru silikonowego.
  7. Umyj butle wodą dejonizowaną pod kapturem chemicznym, aby usunąć roztwór ksylenu.
  8. Połóż cylindry na ręczniku papierowym i pozwól im wyschnąć.
  9. Przechowuj cylindry na szklanej szalce Petriego.
  10. Przygotuj butle przed następnym użyciem, zaczynając od punktu 1 niniejszej instrukcji.

7. Izolacja klonów

  1. Przygotować 24-dołkową płytkę zawierającą 0,5 ml wstępnie podgrzanej pożywki do kompletnych hodowli komórkowych w każdym dołku.
  2. Ostrożnie umyj transfekowane komórki rosnące na szalce o średnicy 150 mm trzykrotnie 15 ml ciepłego, sterylnego PBS. Ostrożnie zassać i wyrzucić PBS.
  3. Użyj sterylnej pęsety do przenoszenia cylindrów, które mają smar po jednej stronie. Naciśnij cylindry na dnie naczynia hodowlanego w miejscach oznaczonych klonów, aby utworzyć izolowane studzienki wokół rosnących kolonii pochodzących z klonów jednokomórkowych.
    UWAGA: Butla powinna dobrze przylegać do dna, aby zapobiec wyciekom płynów.
  4. Dodaj 50 μl roztworu trypsyny do każdego cylindra i inkubuj przez kilka minut. Uważaj, aby nie uszkodzić komórek enzymatycznie. Przetwarzaj kolonie jeden po drugim. Pamiętaj, aby wymienić końcówkę pipety dla każdej butli, aby nie zanieczyścić kolonii innymi.
    UWAGA: Czas inkubacji zależy od używanej linii komórkowej i musi być określony empirycznie. Roztwór trypsyny można pipetować w górę i w dół, aby ułatwić odłączanie komórek. Uważnie monitoruj odklejanie komórek za pomocą odwróconego mikroskopu. Po oderwaniu komórek zatrzymaj aktywność trypsyny, dodając 50 μl pożywki do hodowli komórkowej do każdego cylindra.
  5. Natychmiast przenieść 100 μl zawiesiny komórek do pożywki w jednym dołku płytki 24-dołkowej.
    UWAGA: W tym przypadku wzrost klonów kontynuowano za pomocą selektywnego antybiotyku w stężeniu 0,5 μg/ml.
  6. Monitoruj wzrost klonów komórek w 24-dołkowej płytce, a gdy osiągną 90% konfluencji, przenieś je na płytkę sześciodołkową. Postępuj zgodnie z instrukcjami zawartymi w sekcji 1 protokołu; Zmień tylko objętość trypsyny (0,5 ml) i pożywki zatrzymującej (1,5 ml).
  7. Monitoruj klony komórek rosnące na sześciodołkowej płytce, a gdy osiągną konfluencję, przenieś je do kolby do hodowli komórkowej T12.5.
  8. Obserwuj klony komórek w kolbie do hodowli komórkowych T12.5, a gdy osiągną konfluencję, subkulturuj je i policz za pomocą odpowiedniej metody, takiej jak użycie automatycznego licznika komórek lub hemocytometru. Zamrozić połowę komórek w pożywce zawierającej 70% kompletnej pożywki z selektywnym antybiotykiem, 20% (v/v) FBS i 10% (v/v) DMSO. Resztę komórek należy umieścić na szkiełkach nakrywkowych (12 mm x 12 mm) w celu barwienia immunologicznego i w dwóch dołkach sześciodołkowej płytki w celu izolacji gDNA i przygotowania lizatu.
    UWAGA: W przypadku linii komórkowej A375 należy wysiać 45 000 komórek na szkiełko nakrywkowe i 450 000 komórek na dołek płytki sześciodołkowej.

8. Walidacja wygenerowanych klonów komórek

  1. Barwienie immunologiczne
    UWAGA: Wykonaj barwienie immunologiczne na komórkach, aby określić poziom ekspresji białka będącego przedmiotem zainteresowania (POI). Ważne jest, aby jednocześnie barwić komórki typu dzikiego lub klony kontrolne jako kontrolę, aby móc porównać poziomy ekspresji POI (Rysunek 2A).
    1. Odessać i wyrzucić pożywkę do hodowli komórkowych.
    2. Umyj komórki rosnące na szkiełkach nakrywkowych trzykrotnie PBS.
    3. Utrwal komórki, dodając 0,5 ml 4% roztworu formaldehydu do każdej studzienki i inkubuj je przez 20 minut w temperaturze RT.
      UWAGA: Różne przeciwciała mogą wymagać różnych metod utrwalania.
    4. Umyj komórki dwukrotnie PBS.
    5. Aby przepuszczalność komórek, inkubować szkiełka nakrywkowe w 0,1% Triton X-100 w PBS przez 5 minut w temperaturze RT.
      UWAGA: Różne przeciwciała mogą wymagać różnych metod przepuszczalności.
    6. Umyj szkiełka nakrywkowe dwukrotnie za pomocą PBS.
    7. Umieść szkiełka nakrywkowe w komorze barwienia9.
    8. Szkiełka nakrywkowe należy inkubować w 1% (w/v) BSA w 0,1% (v/v) Triton X-100 w roztworze PBS przez 30 minut w temperaturze pokojowej, aby uniknąć niespecyficznego wiązania przeciwciał.
    9. Usuń roztwór, umieszczając szkiełko nakrywkowe krawędzią na kawałku ligniny za pomocą igły i pęsety.
    10. Przygotować roztwór barwiący złożony z przeciwciał pierwszorzędowych w 1% (w/v) BSA i 0,1% (v/v) Triton X-100 w PBS. Upuść 30 μl roztworu na każde szkiełko nakrywkowe i inkubuj je przez 24 godziny w temperaturze 4 °C w wilgotnej komorze wilgotnościowej.
      UWAGA: W tym eksperymencie użyto mysiego przeciwciała anty-GSN w rozcieńczeniu 1:200.
    11. Usuń roztwór, umieszczając szkiełka nakrywkowe krawędzią na kawałku ligniny za pomocą igły i pęsety. Umieść szkiełka nakrywkowe w płytce 24-dołkowej.
    12. Umyj szkiełka nakrywkowe trzykrotnie za pomocą PBS przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    13. Przygotować przeciwciała drugorzędowe i barwniki w 1% (w/v) BSA i 0,1% (v/v) Triton X-100 w roztworze PBS. Upuść 30 μl roztworu na każde szkiełko nakrywkowe i inkubuj je przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności.
      UWAGA: Użyj przeciwciał drugorzędowych znakowanych anty-mysim fluorescencyjnym 488 w rozcieńczeniu 1:200. Do wykrycia F-aktyny i jąder komórkowych użyliśmy falloidyny-Alexa Fluor 568 w rozcieńczeniu 1:200 i Hoechst 33342 w rozcieńczeniu 1:1000.
    14. Usuń roztwór, umieszczając szkiełka nakrywkowe krawędzią na kawałku ligniny za pomocą igły i pęsety. Umieść szkiełka nakrywkowe w płytce 24-dołkowej.
    15. Umyj szkiełka nakrywkowe trzykrotnie PBS przez 5 minut w temperaturze RT w ciemności.
    16. Umyj szkiełka nakrywkowe raz wodą dejonizowaną.
    17. Zamontuj szkiełka nakrywkowe za pomocą medium montażowego na szkle mikroskopu.
    18. Wizualizuj barwienie komórek za pomocą mikroskopu konfokalnego, aby określić poziom POI wyrażony w pochodnych klonach (Rysunek 2A).
  2. Analiza Western Blot
    UWAGA: Aby potwierdzić brak, podwyższony lub obniżony poziom ekspresji POI w pochodnych klonach, wykonaj analizę western blot w standardowych warunkach10. Analizuj jednocześnie komórki typu dzikiego lub klony kontrolne (Rysunki 2B,C).
    1. Umyj komórki rosnące w studzience sześciodołkowej płytki trzykrotnie PBS.
    2. Zebrać komórki za pomocą skrobaka do wybranego bufora i delikatnie wirować przez 20 s. Wykonać trzy cykle zamrażania (w temperaturze -80 °C) i rozmrażania (w temperaturze 4 °C) próbki.
      UWAGA: Użyć buforu do ekstrakcji białek związanych z cytoszkieletem [10 mM Tris-HCl pH 7,4, 100 mM NaCl, 1 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA), 1 mM glikolu etylenowego-bis(eteru 2-aminoetylowego)-N,N,N',N'-tetraoctowego (EGTA), 1 mM NaF, 20 mM Na4P2O7, 2 mM Na3VO4, 1% (v/v) Triton X-100, 10% (v/v) glicerol, 0,1% (w/v) SDS, 0,5% deoksycholan sodu] lub bufor mocznikowy [50 mM TRIS-HCl pH 7, 5% (w/v) SDS, 8,6% (w/v) sacharoza, 74 mM mocznik, 1 mM DTT], oba z dodatkiem koktajlu inhibitora proteazy 1:100, inhibitora fosfatazy serynowej 1:100 i inhibitora fosfatazy tyrozynowej 1:100.
    3. Odwirować lizaty w temperaturze 12 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
    4. Oznaczyć stężenie białka w próbkach (np. za pomocą testu BCA).
      UWAGA: Test zależy od zgodności ze składem buforu.
    5. Aby przeprowadzić analizę western blot próbek, należy załadować 30 μg białka do każdej studzienki na żelu poliakrylamidowym (7%-15%).
    6. Wykonaj elektroforezę SDS-PAGE i przenieś białka do membrany nitrocelulozowej.
    7. Wizualizacja poziomu ekspresji POI poprzez barwienie błony odpowiednimi przeciwciałami (Rysunki 2B, C).
      UWAGA: Zastosowano mysie przeciwciała anty-GSN w rozcieńczeniu 1:2000 i mysie przeciwciała anty-GAPDH w rozcieńczeniu 1:200. Szczegółowe informacje można znaleźć w naszych dokumentach2,11. Czas ekspozycji powinien być wystarczająco długi, aby słabe sygnały nie zostały przeoczone (Rysunek 2C).
  3. Analiza gDNA
    UWAGA: Po oszacowaniu poziomu ekspresji POI w pochodnych klonach za pomocą technik mikroskopowych i western blot, należy przeanalizować genomowe DNA. Porównanie długości produktu reakcji PCR uzyskanego na matrycy gDNA otrzymanych klonów dostarcza informacji o tym, czy sekwencja GOI była edytowana (Rysunek 2D).
    1. Umyj komórki rosnące w studzience sześciodołkowej płytki trzykrotnie PBS.
    2. Zebrać komórki za pomocą skrobaka w 1 ml PBS.
    3. Odwirować komórki przy 5000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
    4. Odessać i wyrzucić supernatanty.
      UWAGA: Pellet można przechowywać przez kilka miesięcy w temperaturze -80 °C.
    5. Wyizoluj gDNA z osadów uzyskanych klonów za pomocą dostępnego na rynku zestawu do ekstrakcji gDNA.
    6. Zaprojektuj startery PCR, wyżarzając co najmniej 300 pz przed i za celem gRNA w miejscu edycji genów CRISPR/Cas9.
      UWAGA: Użyto następujących starterów: Fwd: 5'gtgcagccaggatgagag3', Rev: 5'ccctgttactggtgcatc3'.
    7. Przeprowadzić reakcje PCR przy użyciu DNA Polymerase Master Mix zgodnie z instrukcjami producenta.
      UWAGA: Skład mieszaniny reakcyjnej PCR przedstawiono w tabeli 1, a ustawienia termocyklera dla reakcji PCR przedstawiono w tabeli 2.
    8. Analizuj produkty PCR w 1% lub 2% (w/v) żelu agarozowym w buforze Tris-acetate-EDTA (40 mM Tris pH 8,0, 20 mM kwas octowy, 1 mM EDTA).
    9. Porównaj długość amplikonu produktu PCR klonów GSN KO z długością produktu PCR klonów CTRL KO (203 pz; Rysunek 2D).
  4. Sekwencjonowanie gDNA
    1. Projektowanie starterów PCR poprzez wyżarzanie do sekwencji przed i za sekwencjami rozpoznawanymi przez gRNA kodowane przez plazmidy CRISPR/Cas9(D10A).
      UWAGA: Zaprojektuj podkłady w następujący sposób: Fwd: 5'gatctcgagctcaagcttcgaattctgaaagtgcagacctttg3', Rev: 5'cgggtacccgactgcagaattcaattcaccagaacaggactaggc3'.
    2. Przeprowadź PCR przy użyciu polimerazy DNA o wysokiej wierności (taka analiza wymaga dużej dokładności podczas amplifikacji DNA) i gDNA jako matrycy.
      UWAGA: Skład mieszaniny reakcyjnej PCR przedstawiono w tabeli 3, a ustawienia termocyklera dla reakcji PCR przedstawiono w tabeli 4.
    3. Linearyzować plazmid enzymem restrykcyjnym w wielu miejscach klonowania, inkubując przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
      UWAGA: Skład mieszaniny do reakcji trawienia restrykcyjnego przedstawiono w tabeli 5. Nie ma znaczenia, jaki plazmid jest używany. pACGFP-C1 zlinearyzowano enzymem EcoRI.
    4. Oszacuj stężenie insertów i wytnij plazmid za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym.
    5. Przygotuj reakcje składania DNA.
      UWAGA: Można zastosować tradycyjną metodę klonowania lub dowolną inną metodę.
    6. Przekształć kompetentne bakterie (np. za pomocą procedury szoku cieplnego)12.
    7. Wyizoluj plazmidy (np. z sześciu kolonii bakterii na konstrukcję zgodnie z instrukcjami producenta lub cytowanym protokołem)13.
    8. Sprawdź, czy wstawka została pomyślnie sklonowana do plazmidu i czy jej długość jest odpowiednia, poprzez trawienie restrykcyjne i elektroforezę DNA.
      UWAGA: Jeżeli wybrane kolonie nie zawierają plazmidu z insertem, plazmidy należy wyizolować z kolejnych kolonii bakteryjnych.
    9. Potwierdź edycję genów za pomocą sekwencjonowania plazmidu (Rysunek 3).
      UWAGA: Należy uzyskać co najmniej dwa różne wyniki sekwencjonowania DNA dla każdego uzyskanego klonu komórki ze względu na istnienie dwóch alleli genów. W przypadku wieloploidalnych linii komórkowych (większych niż 2 n) konieczne jest sekwencjonowanie większej liczby plazmidów, aby uzyskać sekwencję wszystkich uzyskanych kopii genów w komórce. Wyizoluj tyle kolonii, ile to konieczne, aż plazmidy ze sklonowanymi sekwencjami wszystkich kopii genu zostaną wyizolowane. Za pomocą komercyjnie dostępnego zestawu można oszacować liczbę loci badanego genu.
    10. Porównaj sekwencje gDNA uzyskane dla klonów GSN KO i CTRL KO za pomocą programu do wyrównywania wielu sekwencji (Rysunek 3).
Odczynnikigłośność
Główna mieszanka polimerazy DNA7,5 μl
Podkład do przodu (10 μM)1,5 μl
Podkład odwrotny (10 μM)1,5 μl
Sterylna woda3,5 μl
Indeks gDNA1 μl zawierający 10 ng gDNA

Tabela 1. Skład mieszaniny reakcyjnej PCR.

KrokiTemperatura [°C]Czas [minuty: sekundy]
195 Rozdział 95godz. 04:00
cyfra arabska95 Rozdział 95godz. 00:30
357godz. 00:30
472 Rozdział 7200:45
5Przejdź do 2, 35xZ
672 Rozdział 72godz. 10:00
78∞

Tabela 2. Ustawienia termocyklera dla reakcji PCR.

Odczynnikigłośność
5 x bufor polimerazy DNA o wysokiej wierności4 μl
dNTP (10 mM)0,4 μl
Podkład do przodu (10 μM)1 μl
Podkład odwrotny (10 μM)1 μl
Sterylna woda12,4 μl
Indeks gDNA1 μl zawierający 10 ng gDNA
Polimeraza DNA o wysokiej wierności0,2 μl

Tabela 3. Skład mieszaniny reakcyjnej PCR.

szt.
KrokiTemperatura [°C]Czas [minuty: sekundy]
1Rozdział 98godz. 00:30
cyfra arabskaRozdział 98godz. 00:30
361godz. 00:30
472 Rozdział 72godz. 01:00
5Przejdź do kroku 2, 35 razyZ
672 Rozdział 72godz. 10:00
78∞

Tabela 4. Ustawienia termocyklera dla reakcji PCR.

Odczynnikikwota
10 x bufor3 μl
Enzym restrykcyjny1 μl
Sterylna woda20,7 μl
Plazmid5,3 μl zawierające 5 μg DNA

Tabela 5. Skład mieszaniny reakcji trawienia restrykcyjnego.

9. Oceń fenotypową heterogeniczność linii komórkowej

  1. Wykonaj barwienie immunologiczne komórek, aby określić poziom ekspresji POI.
  2. Rób zdjęcia bez powiększenia za pomocą 60-krotnej soczewki olejowej w mikroskopie konfokalnym.
  3. Aby ustalić współczynnik dystrybucji komórek o różnych poziomach, należy użyć narzędzia "prześwietlenie/niedoświetlenie", które jest zwykle dostępne w większości programów do analizy obrazów mikroskopowych. Traktuj komórki, które pokazują niedoświetlone obszary, jako wytwarzające POI na niskim poziomie. Sklasyfikuj prześwietlone komórki jako komórki o wysokim poziomie ekspresji POI, a pozostałe komórki jako wyrażające POI na średnim poziomie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wykorzystując przedstawiony protokół, prezentujemy szczegółową demonstrację izolacji stabilnie transfektowanych klonów komórek czerniaka metodą szklanego cylindra (Rycina 1A). Nasze badania dotyczą biologii komórek czerniaka, a najczęściej stosowanym przez nas modelem badawczym jest adherentna i wysoce inwazyjna linia czerniaka A375. Ponieważ nasze badania wykazały, że komórki czerniaka produkują gelzolinę (GSN) na wysokim poziomie w porównaniu z innymi typami nowotworów14<...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Przedstawiliśmy szczegółowy opis izolacji stabilnie transfekowanych klonów komórek czerniaka za pomocą szklanych cylindrów. Ważne jest, aby uzyskać klony kontrolne przy wyprowadzaniu klonów ze zmienioną ekspresją genów, ponieważ wyniki uzyskane dla klonów z docelową modyfikacją powinny być zawsze porównywane z wynikami uzyskanymi dla kontroli. W ten sposób możemy sprawdzić, czy sama transfekcja lub posiew z selektywnym antybiotykiem nie wpływa na wyniki eksperymentów, a nie na jakieś inne czynniki, takie jak wprowadzona ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Narodowe Centrum Nauki, Polska (projekt #2016/22/E/NZ3/00654, przyznany AJM).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Probówka wirówkowa 15 mlGoogleLab Scientific G66010522
150 mm do hodowli komórkowych z siatką 20 mmFalcon353025
24-dołkowa płytkaVWR International10062-896
35 mmEppendorfEP0030700112
6-dołkowaEppendorfEP0030700113
96-dołkowa tabliczka VWRInternational10062-900 
Kwas octowy, 80% roztwórChempur115687330
AgarozaProna-AboBLE500
Antybiotyk-Antybiotyk PrzeciwgrzybiczyGibco15240062
przeciwciała anty-GAPDHSanta Cruz Biotechnology Inc.,sc-47724
przeciwciała anty-GSN  - klon C20Santa Cruz Biotechnology Inc.,sc-6405
anty-GSN  - klon GS-2C4Sigma-AldrichG44896
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)Sigma-AldrichA3294
Color Taq PCR Master Mix (2x)EurXE2525
Control Podwójny plazmid NickazySanta Cruz Biotechnology Inc.,sc-437281
Szkiełka nakrywkowebionovo16283
Dako Średni montaż ClontechS3023
DMSO -  Aplikacja sulfotlenku dimetyluA3672,0250
Zestaw do oczyszczania DNA EurX3555-02
osioł anty-mysz-Alexa Fluor 488Invitrogen# A-21202
DTT - 1,4-DithiothreitolSigma-Aldrich10197777001
EcoRI Thermo Fisher ScientificFD0274
EDTA- kwas etylenodiaminotetraoctowy Poch (Pol-Aura)593280117
EGTA - glikol etylenowy-bis(eter 2-aminoetylowy)-N,N,N',N'-tetraoctowy Sigma-AldrichE0396
FBS - Surowica bydlęca dla płodu Gibco10270-106
Gelsolin CRISPR PlazmidySanta Cruz Biotechnology Inc.,sc-401005-NIC
FormaldehydSigma-AldrichP6148
GlicerolSigma-AldrichL-4909
wysoki poziom glukozy Dulbecco' s zmodyfikowany Orzeł" s o obniżonym stężeniu (1,5 g/l) NaHCO3 Polska Akademia Nauk,Wrocławfigure-materials-1aw, Polska11-500
Hoechst 33342 Thermo Fisher ScientificH3570
L-GlutaminaGibco25030-024
Lignina BionovoB-0521
Lipofectamine 3000 Odczynnik do transfekcji InvitrogenL3000-008
Na3VO4Sigma-AldrichS6508
Na4P2O7Sigma-AldrichP8010
NaFSigma-Aldrich450022
NEBuilder Assembly Tool http://nebuilder.neb.com/#!/
pACGFP-C1 Clontech
PageRuler Prestained Protein LadderThermo Fisher Scientific 26616
Perfect 100 pz drabinka DNAEurXE3134
falloidyna-Alexa Fluor 568InvitrogenA12380
Koktajl inhibitorów fosfatazy 2Sigma-AldrichP5726
Koktajl inhibitorów fosfatazy 3Sigma-AldrichP0044
Phusion Polimeraza DNA o wysokiej wierności Thermo Fisher ScientificF530S
Pierce Thermo Fisher Naukowy 23225
polietyleniminę (PEI)Sigma-Aldrich408727
koktajl inhibitorów proteazySigma-AldrichP8340
puromycynaInviviGenant-pr
SDS - dodecylosiarczan sodu Silikon Sigma-AldrichL4509
 CX80 Polska
Chlorek sodu - NaClChempur7647-14-5
deoksycholan soduSigma-AldrichD6750259
sacharozaPoch (Pol-Aura)PA-06-772090110
cylindry szklane Sigma-AldrichC3983-50EA
Kolba do hodowli tkankowych 25 mlVWR International10062-868
Kolba do hodowli tkankowych 75 cm2VWR10062-872
Baza TrismaSigma-AldrichT1503
Triton X-100Sigma-AldrichX100
trypsyna Polska Akademia Nauk,Wrocławfigure-materials-2aw, Polska20-500
mocznikSigma-Aldrich8656
roztwór ksylenuChempur115208603
przeciwciała Zestaw do oznaczania białek

Bibliografia

  1. Recillas-Targa, F. Multiple strategies for gene transfer, expression, knockdown, and chromatin influence in mammalian cell lines and transgenic animals. Molecular Biotechnology. 34 (3), 337-354 (2006).
  2. Wurm, F. M. Production of recombinant protein therapeutics in cultivated mammalian cells. Nature Biotechnology. 22 (11), 1393-1398 (2004).
  3. McFarland, D. C. Preparation of pure cell cultures by cloning. Methods in Cell Science. 22 (1), 63-66 (2000).
  4. Mattanovich, D., Borth, N. Applications of cell sorting in biotechnology. Microbial Cell Factories. 5 (1), 1-11 (2006).
  5. Park, H. B., et al. Cell cloning-on-the-spot by using an attachable silicone cylinder. Biochemical and Biophysical Research Communications. 474 (4), 768-772 (2016).
  6. Malek, N., et al. Knockout of ACTB and ACTG1 with CRISPR/Cas9(D10A) technique shows that non-muscle β and γ actin are not equal in relation to human melanoma cells' motility and focal adhesion formation. International Journal of Molecular Sciences. 21 (8), 2746(2020).
  7. Malek, N., et al. The origin of the expressed retrotransposed gene ACTBL2 and its influence on human melanoma cells' motility and focal adhesion formation. Scientific Reports. 11 (1), 3329(2021).
  8. Mazurkiewicz, E., Nowak, D., Mazur, A. J. Gelsolin contributes to the motility of A375 melanoma cells and this activity is mediated by the fibrous extracellular matrix protein profile. Cells. 10 (8), 1848(2021).
  9. Mazurkiewicz, E., Mrówczyńska, E., Simiczyjew, A., Nowak, D., Mazur, A. J. A Fluorescent gelatin degradation assay to study melanoma breakdown of extracellular matrix. Methods in Molecular Biology. , Springer Science+Business Media, LLC, part of Springer Nature. 47-63 (2021).
  10. Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some applications. BioEssays. 76 (9), 4350-4354 (1979).
  11. Makowiecka, A., et al. Changes in biomechanical properties of A375 cells due to the silencing of TMSB4X expression are not directly correlated with alterations in their stemness features. Cells. 10 (4), 769(2021).
  12. Pope, B., Kent, H. M. High efficiency 5 min transformation of Escherichia coli. Nucleic Acids Research. 24 (3), 536-537 (1996).
  13. JoVE Science Education Database. Plasmid Purification: Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. JoVE. , Cambridge, MA. (2022).
  14. Mazur, A. J., et al. Gelsolin interacts with LamR, hnRNP U, nestin, Arp3 and in human melanoma cells as revealed by immunoprecipitation and mass spectrometry. European Journal of Cell Biology. 95 (1), 26-41 (2016).
  15. Litwin, M., et al. Gelsolin affects the migratory ability of human colon adenocarcinoma and melanoma cells. Life Sciences. 90 (21-22), 851-861 (2012).
  16. Feldt, J., et al. Structure, regulation and related diseases of the actin-binding protein gelsolin. Expert Reviews in Molecular Medicine. 20, 1-10 (2019).
  17. Chong, Z. X., Yeap, S. K., Ho, W. Y. Transfection types, methods and strategies: A technical review. PeerJ. 9, 1-37 (2021).
  18. Casden, N., Behar, O. An approach for accelerated isolation of genetically manipulated cell clones with reduced clonal variability. Journal of Cell Science. 132 (6), (2019).
  19. Nicosia, R. F., Villaschi, S., Smith, M. Isolation and characterization of vasoformative endothelial cells from the rat aorta. In Vitro Cellular & Developmental Biology-Animal. 30 (6), 394-399 (1994).
  20. Li, D., et al. Generation of human lens epithelial-like cells from patient-specific induced pluripotent stem cells. Journal of Cellular Physiology. 231 (12), 2555-2562 (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Stabilne klony komórkoweizolacja pojedynczych komórekmetoda cylindra szklanegoknockout genunadekspresja białkaselekcja lekiemWestern blotanaliza PCRimmunostynowanie

Ten artykuł został opublikowany

Film wkrótce dostępny

Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.