Opisano protokół do izolowania stabilnie transfekowanych klonów komórek czerniaka za pomocą szklanych cylindrów. Stawiamy na praktyczne porady, które mogą zadecydować o powodzeniu całej procedury.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Izolacja stabilnie transfekowanych klonów komórek czerniaka
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Populacje komórek, które mają stabilne zmiany w informacjach genomowych, są powszechnie wykorzystywane przez naukowców jako model badawczy. Nie wymagają one wielokrotnej transfekcji komórek, ponieważ może to prowadzić do niejednorodnej populacji komórek i zmiennej wydajności transfekcji, wpływając na odtwarzalność. Ponadto są one preferowane w przypadku analiz na dużą skalę. Generowanie stabilnych klonów komórkowych jest przydatne w szerokim zakresie zastosowań, takich jak badania nad funkcjami genów i produkcją rekombinowanych białek. Istnieje kilka metod uzyskiwania jednorodnej populacji komórek po początkowej transfekcji przejściowej. Tutaj opisujemy izolację klonów jednokomórkowych za pomocą szklanych cylindrów. Chociaż ta metoda jest znana już od jakiegoś czasu, istnieje kilka kluczowych kroków, a ich zaniedbanie może doprowadzić do niepowodzenia. Z powodzeniem zastosowaliśmy tę metodę do uzyskania klonów ze stabilną nadekspresją białka będącego przedmiotem zainteresowania (POI) lub z nokautem genu będącego przedmiotem zainteresowania (GOI). Opisujemy etapy przygotowania, takie jak optymalizacja doboru stężeń leków, przygotowanie szklanych cylindrów oraz walidacja, czy uzyskane klony mają pożądaną zmianę w ekspresji GOI za pomocą PCR, analizy western blot, barwienia immunologicznego lub sekwencjonowania gDNA (w zależności od rodzaju uzyskanych klonów). Omawiamy również niejednorodność fenotypową dobrze ugruntowanych linii komórkowych, ponieważ może to stanowić problem w uzyskiwaniu stabilnych klonów komórek.
Wprowadzenie
Stabilna transfekcja komórek ssaków jest rutynowo stosowaną metodą w wielu zastosowaniach hodowli komórkowych, w tym w badaniach nad rakiem. Jego przewagą nad transfekcją przejściową jest to, że wprowadzony obcy materiał genetyczny nie może zostać utracony z powodu czynników środowiskowych (np. konfluencji komórek lub etapu replikacji) i podziału komórki, ponieważ jest zintegrowany z genomem hosta1. Rozwój linii komórkowych o stabilnej ekspresji może być pracochłonny i wymagający, ale jeśli wymagana jest trwała ekspresja genów przez dłuższy czas, preferowaną opcją jest wyprowadzenie stabilnych linii komórkowych. Najczęstsz....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Subkultura komórkowa i wysiew w celu optymalizacji stężenia leku
- Podgrzać pożywkę do hodowli komórkowych (w tym przypadku zmodyfikowaną pożywkę Eagle's firmy Dulbecco o obniżonym stężeniu (1,5 g/l) NaHCO3, 10% (v/v) płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 1% (v/v) L-glutaminy i 1% (v/v) antybiotykowo-przeciwgrzybiczą) i roztwór trypsyny w łaźni wodnej do temperatury 37 °C.
- Odessać i odrzucić pożywkę do hodowli komórkowych z komórek A735 rosnących w kolbie do hodowli komórkowych T25. Linia komórkowa pozyskiwana jest ze źródeł komercyjnych.
- Wypłukać pozostałą pożywkę do hodowli komórkowych z komórek, przemłukując ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Wykorzystując przedstawiony protokół, prezentujemy szczegółową demonstrację izolacji stabilnie transfektowanych klonów komórek czerniaka metodą szklanego cylindra (Rycina 1A). Nasze badania dotyczą biologii komórek czerniaka, a najczęściej stosowanym przez nas modelem badawczym jest adherentna i wysoce inwazyjna linia czerniaka A375. Ponieważ nasze badania wykazały, że komórki czerniaka produkują gelzolinę (GSN) na wysokim poziomie w porównaniu z innymi typami nowotworów14<.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Przedstawiliśmy szczegółowy opis izolacji stabilnie transfekowanych klonów komórek czerniaka za pomocą szklanych cylindrów. Ważne jest, aby uzyskać klony kontrolne przy wyprowadzaniu klonów ze zmienioną ekspresją genów, ponieważ wyniki uzyskane dla klonów z docelową modyfikacją powinny być zawsze porównywane z wynikami uzyskanymi dla kontroli. W ten sposób możemy sprawdzić, czy sama transfekcja lub posiew z selektywnym antybiotykiem nie wpływa na wyniki eksperymentów, a nie na jakieś inne czynniki, takie jak wprowadzona .......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez Narodowe Centrum Nauki, Polska (projekt #2016/22/E/NZ3/00654, przyznany AJM).
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Probówka wirówkowa 15 ml | GoogleLab Scientific G66010522 | ||
| 150 mm do hodowli komórkowych z siatką 20 mm | Falcon | 353025 | |
| 24-dołkowa płytka | VWR International | 10062-896 | |
| 35 mm | Eppendorf | EP0030700112 | |
| 6-dołkowa | Eppendorf | EP0030700113 | |
| 96-dołkowa tabliczka VWR | International | 10062-900 | |
| Kwas octowy, 80% roztwór | Chempur | 115687330 | |
| Agaroza | Prona-Abo | BLE500 | |
| Antybiotyk-Antybiotyk Przeciwgrzybiczy | Gibco | 15240062 | |
| przeciwciała anty-GAPDH | Santa Cruz Biotechnology Inc., | sc-47724 | |
| przeciwciała anty-GSN - klon C20 | Santa Cruz Biotechnology Inc., | sc-6405 | |
| anty-GSN - klon GS-2C4 | Sigma-Aldrich | G44896 | |
| Albumina surowicy bydlęcej (BSA) | Sigma-Aldrich | A3294 | |
| Color Taq PCR Master Mix (2x) | EurX | E2525 | |
| Control Podwójny plazmid Nickazy | Santa Cruz Biotechnology Inc., | sc-437281 | |
| Szkiełka nakrywkowe | bionovo | 16283 | |
| Dako Średni montaż | Clontech | S3023 | |
| DMSO - Aplikacja sulfotlenku dimetylu | A3672,0250 | ||
| Zestaw do oczyszczania DNA | EurX | 3555-02 | |
| osioł anty-mysz-Alexa Fluor 488 | Invitrogen | # A-21202 | |
| DTT - 1,4-Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 10197777001 | |
| EcoRI | Thermo Fisher Scientific | FD0274 | |
| EDTA- kwas etylenodiaminotetraoctowy | Poch (Pol-Aura) | 593280117 | |
| EGTA - glikol etylenowy-bis(eter 2-aminoetylowy)-N,N,N',N'-tetraoctowy | Sigma-Aldrich | E0396 | |
| FBS - Surowica bydlęca dla płodu | Gibco | 10270-106 | |
| Gelsolin CRISPR Plazmidy | Santa Cruz Biotechnology Inc., | sc-401005-NIC | |
| Formaldehyd | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Glicerol | Sigma-Aldrich | L-4909 | |
| wysoki poziom glukozy Dulbecco' s zmodyfikowany Orzeł" s o obniżonym stężeniu (1,5 g/l) NaHCO3 | Polska Akademia Nauk,Wrocław aw, Polska | 11-500 | |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| L-Glutamina | Gibco | 25030-024 | |
| Lignina | Bionovo | B-0521 | |
| Lipofectamine 3000 Odczynnik do transfekcji | Invitrogen | L3000-008 | |
| Na3VO4 | Sigma-Aldrich | S6508 | |
| Na4P2O7 | Sigma-Aldrich | P8010 | |
| NaF | Sigma-Aldrich | 450022 | |
| NEBuilder Assembly Tool | http://nebuilder.neb.com/#!/ | ||
| pACGFP-C1 | Clontech | ||
| PageRuler Prestained Protein Ladder | Thermo Fisher Scientific | 26616 | |
| Perfect 100 pz drabinka DNA | EurX | E3134 | |
| falloidyna-Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A12380 | |
| Koktajl inhibitorów fosfatazy 2 | Sigma-Aldrich | P5726 | |
| Koktajl inhibitorów fosfatazy 3 | Sigma-Aldrich | P0044 | |
| Phusion Polimeraza DNA o wysokiej wierności | Thermo Fisher Scientific | F530S | |
| Pierce | Thermo Fisher Naukowy | 23225 | |
| polietyleniminę (PEI) | Sigma-Aldrich | 408727 | |
| koktajl inhibitorów proteazy | Sigma-Aldrich | P8340 | |
| puromycyna | InviviGen | ant-pr | |
| SDS - dodecylosiarczan sodu | Silikon Sigma-Aldrich | L4509 | |
| CX80 Polska | |||
| Chlorek sodu - NaCl | Chempur | 7647-14-5 | |
| deoksycholan sodu | Sigma-Aldrich | D6750259 | |
| sacharoza | Poch (Pol-Aura) | PA-06-772090110 | |
| cylindry szklane | Sigma-Aldrich | C3983-50EA | |
| Kolba do hodowli tkankowych 25 ml | VWR International | 10062-868 | |
| Kolba do hodowli tkankowych 75 cm2 | VWR | 10062-872 | |
| Baza Trisma | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| trypsyna | Polska Akademia Nauk,Wrocławaw, Polska | 20-500 | |
| mocznik | Sigma-Aldrich | 8656 | |
| roztwór ksylenu | Chempur | 115208603 |
Bibliografia
- Recillas-Targa, F. Multiple strategies for gene transfer, expression, knockdown, and chromatin influence in mammalian cell lines and transgenic animals. Molecular Biotechnology. 34 (3), 337-354 (2006).
- Wurm, F. M.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
Ten artykuł został opublikowany
Film wkrótce dostępny