Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Generowanie i rozszerzanie pierwotnych, złośliwych linii guza międzybłoniaka opłucnej

1.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63374

⸱

21 kwietnia 2022

 ,  , 
1Department of Translational Molecular Pathology, University of Texas MD Anderson Cancer Center

W tym artykule

Podsumowanie

Celem tego artykułu metodycznego jest zademonstrowanie solidnej i powtarzalnej metodologii wzbogacania, generowania i rozszerzania pierwotnych linii komórek nowotworowych z chirurgicznie wyciętego międzybłoniaka opłucnej.

Streszczenie

Brakuje aktualnych metodologii ekspansji pierwotnych linii komórek nowotworowych z rzadkich typów nowotworów. Protokół ten opisuje metody ekspansji pierwotnych komórek nowotworowych z chirurgicznie wyciętego, złośliwego międzybłoniaka opłucnej (MPM), zapewniając pełny przegląd procesu od trawienia do wzbogacenia, ekspansji, krioprezerwacji i charakterystyki fenotypowej. Ponadto protokół ten wprowadza koncepcje generowania guza, które mogą być przydatne dla wielu typów nowotworów, takich jak trypsyna różnicowa i wpływ metod dysocjacji na wykrywanie markerów powierzchni komórek w celu charakterystyki fenotypowej. Głównym ograniczeniem tego badania jest selekcja komórek nowotworowych, które będą się namnażać w dwuwymiarowym (2D) systemie hodowli. Warianty tego protokołu, w tym trójwymiarowe (3D) systemy hodowli, suplementy pożywki, powlekanie płytki w celu poprawy przyczepności i alternatywne metody dezagregacji, mogą poprawić tę technikę i ogólny wskaźnik sukcesu w ustanowieniu linii nowotworowej. Ogólnie rzecz biorąc, protokół ten zapewnia podstawową metodę ustalania i charakteryzowania komórek nowotworowych z tego rzadkiego nowotworu.

Wprowadzenie

Złośliwy międzybłoniak opłucnej (MPM) jest rzadkim nowotworem silnie związanym z ekspozycją na azbest. Chociaż podejścia oparte na immunoterapii wykazały zachęcające wyniki, istnieje niedostatek opcji leczenia dostępnych dla pacjentów, u których rozwija się ta choroba, a ogólny wskaźnik 5-letniego przeżycia jest niski1,2. W wielu instytucjach prowadzone są działania mające na celu lepsze zrozumienie tej choroby i zidentyfikowanie nowych celów terapeutycznych, które mogą poprawić wyniki leczenia pacjentów. Chociaż istnieje wiele modeli myszy międzybłoniaka, dostęp do pierwotnych komórek nowotworowych międzybłoniaka jest bardziej ograniczony3. Ekspansja in vitro pierwotnych komórek nowotworowych międzybłoniaka dostarczyłaby cennego systemu modelowego, który można wykorzystać do bezpośredniego badania komórek nowotworowych i ich interakcji z autologicznymi komórkami odpornościowymi, takimi jak limfocyty naciekające nowotwór. Chociaż istnieją doniesienia o ekspansji linii komórek nowotworowych pierwotnej międzybłoniaka, jest ich niewiele i nie zapewniają szczegółowej standardowej procedury operacyjnej (SOP). Co więcej, niewiele linii komórkowych jest dostępnych ze źródeł komercyjnych, takich jak American Type Culture Collection (ATCC). Chociaż dostępność pierwotnych linii nowotworowych jest ograniczona, wykazano, że komórki nowotworowe mogą być namnażane z wysięku opłucnowego i bezpośrednio z tkanki nowotworowej4,5. Ponadto wykazano, że rozszerzone linie komórek nowotworowych zachowują profil molekularny oryginalnego guza4,5,6.

Nasze laboratorium bada mikrośrodowisko immunologiczne MPM i opracowało metodę rozszerzania pierwotnych linii komórek nowotworowych MPM z chirurgicznie wyciętych przypadków. Metoda ta jest zaadaptowana z naszego doświadczenia w tworzeniu pierwotnych linii komórkowych przerzutowego guza czerniaka. Celem tej pracy jest zapewnienie szczegółowego, praktycznego podejścia do rozszerzania linii guza pierwotnego międzybłoniaka przy użyciu systemu modeli 2D i późniejszego profilowania fenotypowego. Biorąc pod uwagę niedawny sukces strategii blokowania punktów kontrolnych ukierunkowanych na CTLA4 i PD-1 w ustawieniu pierwszej linii2, zdolność do generowania wielu pierwotnych linii nowotworowych może pogłębić zrozumienie zarówno wewnętrznych mechanizmów oporności nowotworu, jak i zapewnić ważny system modelowy do oceny rozpoznawania limfocytów T, pogłębiając w ten sposób nasze zrozumienie odpowiedzi immunologicznej w MPM.

Głównym ograniczeniem tego protokołu jest to, że każdy guz zawiera inne mikrośrodowisko, a stopień zmienności powodzenia ekspansji jest wysoki. Ponadto metoda ta selekcjonuje komórki nowotworowe, które mogą się rozwijać w systemie hodowli 2D. Inne metody, które obejmują produkcję hodowli sferoidów lub organoidów 3D, mogą stanowić alternatywne podejście, które może pozwolić na wyższy wskaźnik powodzenia ekspansji lub skutkować możliwością uzyskania linii komórkowych, które nie są w stanie się rozrosnąć w tradycyjnym systemie 2D. Wykazano, że takie hodowle 3D są przydatne do generowania typów nowotworów, które są trudne do rozszerzenia, na przykład rak trzustki7.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Institution Review Board (IRB) of the University of Texas MD Anderson Cancer Center. Dotyczy to standardowych metod leczenia, chirurgicznie wyciętych guzów MPM usuwanych za świadomą zgodą.

1. Przygotowanie pożywki do trawienia nowotworów i innych powiązanych pożywek

  1. Aby przygotować pożywkę do trawienia guza, dodaj 5 ml 100% Pen/Strep (penicylina/streptomycyna) do 500 ml sterylnego podłoża Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 w okapie z przepływem laminarnym.
    1. Przenieś pożywkę do sterylnego filtra polieterosulfonowego (PES) o pojemności 500 ml i grubości 0,22 μm w celu filtracji próżniowej.
      UWAGA: Etapy filtracji i aspiracji należy wykonywać przy standardowym podciśnieniu 75-150 torr.
    2. Oznaczyć i opatrzyć datą pożywkę do trawienia guza i przechowywać ją w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Pożywka może być przechowywana przez 1 miesiąc w temperaturze 4 °C.
  2. Aby przygotować enzymatyczny koktajl trawiący nowotwór, dodaj 2,5 ml 3% kolagenazy typu 1, 1 ml 1,5 mg/ml hialuronidazy, 20 μl 250 000 jednostek/ml DNAzy od 1 do 16,5 ml pożywki trawiącej w stożkowej probówce o pojemności 50 ml w okapie z przepływem laminarnym.
    UWAGA: Całkowita objętość koktajlu enzymatycznego trawiącego guz wynosi 20 ml; jednak na próbkę guza potrzeba tylko 10 ml. W związku z tym pozostały koktajl można przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu, gdy będzie potrzebny. Nie zamrażaj ponownie podwielokrotności.
  3. Aby przygotować kompletną pożywkę nowotworową, dodaj 5 ml 100% Pen/Strep i 50 ml płodowej surowicy bydlęcej (FBS) do 500 ml sterylnego RPMI 1640 w kapturze z przepływem laminarnym.
    1. Przenieś pożywkę do sterylnego filtra PES o pojemności 500 ml i 0,22 μm w celu filtracji próżniowej.
    2. Oznaczyć i datować całe podłoże nowotworowe i przechowywać je w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Pożywka może być przechowywana przez 1 miesiąc w temperaturze 4 °C.
  4. Aby przygotować pożywkę o obniżonej surowicy do głodówki, dodaj 5 ml 100% Pen/Strep i 5 ml FBS do 500 ml sterylnego RPMI 1640 w okapie z przepływem laminarnym.
    1. Przenieś pożywkę do sterylnego filtra PES o pojemności 500 ml i 0,22 μm w celu filtracji próżniowej.
    2. Oznaczyć i opatrzyć datownikiem pożywkę o obniżonej surowicy i przechowywać ją w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Pożywka może być przechowywana przez 1 miesiąc w temperaturze 4 °C.
  5. Aby przygotować pożywkę do zamrażania, dodaj 5 ml dimetylosulfotlenku (DMSO) do 45 ml FBS w okapie z przepływem laminarnym.
    1. Przenieś pożywkę do sterylnego filtra PES o pojemności 50 ml i 0,22 μm w celu filtracji próżniowej.
    2. Oznacz i opatrz datą pięć stożkowych probówek o pojemności 15 ml.
    3. Przenieść 10 ml pożywki zamrażającej do każdej probówki i przechowywać probówki w temperaturze -20 °C.
  6. Aby przygotować pożywkę wolną od antybiotyków do badania na obecność mykoplazmy, dodaj 50 ml FBS do 500 ml sterylnego RPMI 1640 w okapie z przepływem laminarnym.
    1. Przenieś pożywkę do sterylnego filtra PES o pojemności 50 ml i 0,22 μm w celu filtracji próżniowej.
    2. Oznaczyć i opatrzyć datą pożywkę wolną od antybiotyków i przechowywać ją w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Pożywka może być przechowywana przez 1 miesiąc w temperaturze 4 °C.
  7. Aby przygotować bufor do sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) do analizy fenotypowej, dodaj 16,6 ml sterylnej albuminy surowicy bydlęcej do 500 ml sterylnego 1x buforowanego fosforanem soli fizjologicznej (PBS) w okapie z przepływem laminarnym.
    1. Oznaczyć i opatrzyć datą bufor FACS i przechowywać go w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Bufor FACS nie wymaga sterylizacji filtra, o ile oba składniki są przechowywane w sterylnym stanie. Bufor FACS może być przechowywany przed otwarciem przez 6 miesięcy w temperaturze 4 °C.

2. Trawienie tkanki nowotworowej

  1. Przenieś 10 ml koktajlu enzymatycznego trawiącego nowotwór z kroku 1.2 do probówki dysocjującej.
  2. Przenieś kawałek tkanki nowotworowej na sterylną pokrywkę 6-dołkowej płytki za pomocą sterylnego skalpela.
    UWAGA: Ilość pożywki, która jest przenoszona wraz z tkanką nowotworową, jest wystarczająca do przetworzenia.
    1. Usuń całą tkankę tłuszczową, tkankę martwiczą i/lub skrzepy krwi za pomocą nowego sterylnego skalpela i kleszczyków.
      UWAGA: Tkanka tłuszczowa ma zwykle żółtawy wygląd i jest półstała. Tkanka martwicza jest ciemniejsza niż otaczająca tkanka i bardzo miękka; Zarówno tkanka tłuszczowa, jak i martwicza łatwo się rozpadają. Krwawa tkanka wydaje się jaskrawoczerwona i może uwalniać krew do podłoża podczas manipulacji. Po usunięciu powstała tkanka nowotworowa powinna zachować kształt i być blada lub różowa, w zależności od rodzaju tkanki.
    2. Pokrój całą tkankę nowotworową na 1 mm3 małe fragmenty. Aby upewnić się, że tkanka nie wyschnie, dodaj 500 μl sterylnego 1x Zbilansowany roztwór soli Hanka (HBSS) do tkanki nowotworowej.
  3. Przenieś fragmenty guza do probówki dysocjacyjnej zawierającej 10 ml enzymatycznego koktajlu trawiącego guz (krok 2.1). Zamknij szczelnie rurkę, połóż ją nakrętką do dołu na dysocjatorze tkanek i dodaj urządzenie grzewcze, nakładając je jak tuleję na rurkę dysocjacyjną i naciskając, aby zatrzasnąć ją na miejscu.
    UWAGA: Maksymalna pojemność każdej probówki to 4 g guza i 10 ml objętości.
  4. Wybierz wstępnie zaprogramowane ustawienie w 37C_h_TDK_1 dysocjatora. Sprawdź stan po 10 minutach, aby upewnić się, że nie ma błędu zatkania, na co wskazuje czerwone światło.
    UWAGA: Ten program przetwarza z prędkością 1 865 obr./min przez 1 godzinę przy włączonej temperaturze 37 °C.
    UWAGA: Jeśli dojdzie do zatkania, wyjmij rurkę dysocjacyjną i ręcznie ją zakręć, aby usunąć tkankę złapaną w pokrywie; Następnie umieść rurkę na dysocjatorze i wznów program.
  5. Po 1-godzinnym mineralizowaniu wyjąć rurkę dysocjacyjną i umieścić ją w okapie z przepływem laminarnym. Przefiltruj strawiony guz, umieszczając sitko o wielkości 70 μm na stożkowej probówce o pojemności 50 ml i pipetując strawiony guz za pomocą pipety 10 ml na filtr. Jeśli filtr się zatka, przełącz się na nowy filtr.
    1. Przepłukać probówkę dysocjacyjną 10 ml świeżej pożywki do trawienia guza i przepuścić płukanie przez filtr.
    2. Wyjmij filtr 70 μm i wyrzuć go.
    3. Doprowadzić całkowitą objętość do 40 ml za pomocą pożywki do trawienia guza.
  6. Wirować przy 500 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  7. Za pomocą pipety aspiracyjnej o pojemności 2 ml podłączonej do źródła podciśnienia, odessać supernatant bez naruszania osadu i ponownie zawiesić komórki za pomocą 10 ml sterylnego kompletnego podłoża nowotworowego.
  8. Powtórz krok 2.6.
  9. Odessać supernatant zgodnie z opisem w kroku 2.7. Ponownie zawiesić komórki w 3 ml sterylnej pożywki kompletnej pożywki nowotworowej i przenieść zawiesinę komórek do jednego dołka sterylnej płytki 6-dołkowej.
  10. Przechowywać płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .
  11. Po 24 godzinach przenieść zużytą pożywkę z strawionego guza w basenie 1 do nowego dołka (dołka 2) na tej samej płytce 6-dołkowej. Dodaj 3 ml sterylnego kompletnego podłoża nowotworowego do studzienki 1.
  12. Przenieść zużyte podłoże z dołków 1 i 2 i połączyć z basenikiem 3 na tej samej płytce 6-dołkowej 24 godziny po kroku 2.11. Dodaj 3 ml sterylnej pożywki z kompletnym guzem do studzienek 1 i 2.
  13. Odessać pożywkę ze wszystkich 3 dołków i odpipetować 3 ml kompletnej pożywki nowotworowej do każdej studzienki 48 godzin po kroku 2.12.

3. Generowanie pierwotnej linii komórkowej nowotworu

  1. Za pomocą mikroskopu z odwróconymi fazami określ procentowy stopień zanieczyszczenia fibroblastami w kulturze wczesnego pasażu.
    UWAGA: Fibroblasty są na ogół długie i nieregularne oraz mają źle zdefiniowaną błonę komórkową. Wydają się cienkie lub płaskie w skali Z.
    1. Jeśli zanieczyszczenie fibroblastami jest większe niż 20% komórek w kulturze wczesnego pasażu, kontynuuj hodowlę po zastąpieniu całej pożywki pożywką o obniżonej surowicy.
    2. Powtarzać wymianę na pożywkę o obniżonej surowicy w kroku 3.1.1 dwa razy w tygodniu przez 3-4 tygodnie.
    3. Gdy kultura osiągnie 80% konfluencji, przechodź komórki, dzieląc 50:50 na 2 nowe dołki 6-dołkowej płytki. Kontynuuj pasażowanie 50:50 w pożywce o zmniejszonej surowicy, gdy komórki osiągną 80% zbieżności.
    4. Powtórz krok 3.1.3 przez okres do 4 tygodni, pasażując w większych kolbach hodowlanych w razie potrzeby, dzieląc 50:50, gdy kultura osiągnie 80% zbieżności. Jeśli populacja fibroblastów nie zostanie zmniejszona do 10% lub mniej, przejdź do kroku 3.2, aby spróbować metody trypsynizacji różnicowej w celu usunięcia zanieczyszczenia fibroblastami. W przeciwnym razie przejdź do kroku 3.3.
  2. Aby wzbogacić komórki nowotworowe, delikatnie spłucz studzienkę 1x PBS, aby usunąć pożywkę zawierającą surowicę.
    1. Dodaj trypsynę w następujący sposób: 1 ml na dołek, jeśli znajduje się w płytce 6-dołkowej, 2 ml na kolbę T25, 3 ml na kolbę T75.
    2. Umieścić 6-dołkową płytkę lub kolbę w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 1 minutę. Wyjąć płytkę lub kolbę z inkubatora i sprawdzić przyleganie komórek za pomocą mikroskopu odwróconego. Jeśli komórki częściowo się unoszą lub unoszą w powietrzu, delikatnie usuń zawieszone komórki i tylko trypsynę. Umieść komórki w stożkowej probówce o pojemności 15 ml zawierającej równą lub większą objętość kompletnego podłoża nowotworowego.
      UWAGA: Ta częściowa kolekcja komórek oparta na właściwościach adhezyjnych jest pierwszą z wielu frakcji.
    3. Powtarzaj kroki 3.2.1 i 3.2.2, aż wszystkie komórki zostaną podniesione lub zostaną usunięte 4 frakcje.
    4. Odwirować wszystkie niezależne frakcje w temperaturze 500 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    5. Odessać supernatant zgodnie z opisem w kroku 2.7 i ponownie zawiesić komórki za pomocą 5 ml sterylnej pożywki o zredukowanej surowicy.
    6. Umieścić komórki w kolbie T25 dla każdej frakcji i umieścić kolby w inkubatorze w temperaturze 37 °C.
    7. Oceń hodowlę po 48 godzinach, aby określić, która frakcja jest wzbogacona o komórki nowotworowe, a która o fibroblasty. Wyrzuć kolby bogate w fibroblasty. Jeśli zanieczyszczenie fibroblastami wynosi <10%, kontynuuj ekspansję w pełnym pożywce nowotworowej i przejdź do kroku 4. Jeśli zanieczyszczenie fibroblastami wynosi 10-30%, powtórz kroki 3.1.2-3.1.4. Jeśli zanieczyszczenie fibroblastami jest większe niż 30%, powtórz kroki 3.2-3.2.7.
  3. Jeśli w kulturze wczesnego pasażu zostanie wykrytych niewiele fibroblastów lub nie wykryje się ich wcale, kontynuuj przechodzenie komórek w kompletnym pożywce nowotworowej, dzieląc 50:50, gdy komórki zlewają się w 80% na 6-dołkową płytkę lub kolbę.

4. Ekspansja linii komórek pierwotnego nowotworu o wczesnym pasażu

  1. Gdy pierwotna hodowla guza zawiera 10% lub mniej zanieczyszczenia fibroblastami, odessać pożywkę i zastąpić ją sterylną pożywką z kompletnym guzem dwa razy w tygodniu.
    UWAGA: Optymalna objętość podłoża dla T25 to 5 ml; T75 wynosi 12 ml; T150 wynosi 25 ml.
    1. W razie potrzeby przełóż kulturę w proporcji 50:50 do większych kolb, gdy osiągnie ona 80% zbiegu w płytce lub kolbie.
      UWAGA: Kultura może wymagać pasażu w wyższym stosunku w zależności od jej wzrostu. Dostosuj tak, aby kultura osiągała 80% konfluencji co 3-5 dni.
  2. Przejazd, aż kultura znajdzie się w pasażu 4 lub wyższym. Gdy kultura jest w 80% zlewająca się w co najmniej dwóch kolbach T75, przejdź do kroku 5.

5. Charakterystyka i bankowanie ustalonej pierwotnej linii komórkowej nowotworu

  1. Kriokonserwować jedną kolbę T75 jako zamrażanie we wczesnym pasażu. W przypadku badania na obecność mykoplazmy w pozostałych kolbach T75 należy przejść do kroku 5.2.
    1. W celu kriokonserwacji komórek wcześnie pasażujących, rozmrozić 1 probówkę podzielonego na porcję pożywki do zamrażania przygotowanej w kroku 1.5.
    2. Zebrać komórki przez trypsynizację, najpierw przemywając płytkę 1x PBS, jak opisano w kroku 3.2 i dodając trypsynę, jak opisano w kroku 3.2.1.
    3. Umieścić kolbę w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 3 minuty. Wyjąć kolbę z inkubatora i sprawdzić przyleganie komórek za pomocą mikroskopu odwróconego. Jeśli komórki unoszą się lub unoszą się, delikatnie usuń zawieszone komórki i trypsynę. Umieść komórki w stożkowej probówce o pojemności 15 ml zawierającej równą lub większą objętość kompletnego podłoża nowotworowego.
      UWAGA: Jeśli komórki pozostaną przylegające po 3 minutach, umieść kolbę z powrotem w inkubatorze na dodatkowe 2 minuty.
    4. Dobrze wymieszać probówkę, delikatnie pipetując, i usunąć 20 μl do przeliczenia.
    5. Odwirować probówkę o masie 500 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    6. Podczas obracania się komórek policz przy użyciu protokołu liczenia specyficznego dla laboratorium, takiego jak błękit trypanowy lub oranżan akrydynowy/jodek propidyny (AO/PI).
    7. Po odwirowaniu zawiesić komórki w pożywce do zamrażania z co najmniej 2 × 10 6 komórek/1 ml pożywki do zamrażania.
    8. Przenieść 1 ml zawiesiny komórek z etapu 5.1.7 do wstępnie oznakowanych kriowialiów o pojemności 1,5 ml.
    9. Umieścić kriowiale w komorze zamrażania o kontrolowanej szybkości i natychmiast przenieść je do temperatury -80 °C.
    10. Przechowuj komórki w temperaturze -80 °C przez okres do 1 tygodnia przed przeniesieniem ich do ciekłego azotu w celu długotrwałego przechowywania.
  2. Podziel kolbę T75 w proporcji 50:50 w celu zbadania mykoplazmy. Zmień pożywkę na pożywkę wolną od antybiotyków przygotowaną w kroku 1.6.
    1. Po 72 godzinach rozmrażaj odczynnik do wykrywania mykoplazmy, substrat i kontrole w temperaturze pokojowej przez 15 minut przed badaniem.
    2. Zebrać 1 ml supernatantu z każdej badanej kultury i umieścić go w stożkowej probówce o pojemności 15 ml.
    3. Zawiesiny komórek należy rozdrobnić przez odwirowanie supernatantu o stężeniu 500 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    4. Załadować 100 μl supernatantów i próbek kontrolnych do białej płytki 96-dołkowej. Dodać 100 μl odczynnika do wykrywania mykoplazmy do każdej próbki i kontroli.
    5. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    6. Umieść płytkę w czytniku płytek i odczytaj luminescencję (odczyt A, tj. pierwszy odczyt).
      UWAGA: Protokół producenta zestawu mycoplasma wskazuje na zachowanie ustawień domyślnych w wielofunkcyjnych czytnikach płytek. Odczyt jest ustawiony w punkcie końcowym luminescencji z czasem integracji 1 s i wzmocnieniem 135. Czytnik płytek wykorzystuje procedurę automatycznego skalowania w celu optymalizacji sygnału wzmocnienia dla każdego eksperymentu. Standardowym czasem integracji jest czas integracji 1 s. Oba ustawienia służą do regulacji intensywności sygnału luminescencyjnego interpretowanego przez czytnik płytek i mogą wymagać regulacji w zależności od indywidualnego czytnika płytek.
    7. Wyjąć płytkę z czytnika płytek i dodać 100 μl substratu do wykrywania mykoplazmy do każdej próbki i kontroli.
    8. Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
    9. Umieść płytkę w czytniku płytek i odczytaj luminescencję (odczyt B, czyli drugi odczyt).
    10. Aby określić dodatni wynik mykoplazmy, określ stosunek odczytu B do odczytu A.
      UWAGA: Współczynniki dodatniości mykoplazmy są opisane w protokole producenta zestawu mykoplazmowego. Odczyty A i B są uzyskiwane przy tych samych ustawieniach i po prostu odzwierciedlają kolejność czytania.
      1. Rozważ, że stosunek < 1 jest mykoplazmoujemny.
      2. Uznaj, że stosunek 1-1,2 jest niejednoznaczny i powtórz krok 5,2.
      3. Rozważ stosunek > 1,2 jako mykoplazmo-dodatni i monitoruj tę hodowlę; w razie potrzeby zakończ hodowlę.
  3. Charakterystyka cytometrii przepływowej komórek nowotworowych mykoplazmoujemnych
    1. Usunąć komórki nowotworowe za pomocą buforu dysocjacji komórek.
    2. Policz komórki i ponownie zawieś komórki w temperaturze 1 × 106/ml w buforze FACS od kroku 1.7.
    3. Usunąć 100 μl zawiesiny komórek do pojedynczych probówek w celu zabarwienia powierzchni.
    4. Wirować przy 500 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    5. Odessać supernatant i zablokować receptory Fc, inkubując komórki w 500 μl 5% surowicy koziej w buforze FACS w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
    6. Dodać 2 ml buforu FACS i odwirować zawiesinę o stężeniu 500 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    7. Odessać supernatant i dodać powierzchniową mieszaninę przeciwciał (Tabela 1) i buforu FACS tak, aby końcowa objętość wynosiła 100 μl. Przykryć próbki i barwić je na lodzie przez 30 minut.
    8. Powtórz krok 5.3.6.
    9. Odessać supernatant i utrwalić komórki poprzez ponowne zawieszenie w 200 μl 1% paraformaldehydu (PFA) plus 0,25% EtOH. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut, z próbkami chronionymi przed światłem.
    10. Powtórz krok 5.3.6. Ponownie zawiesić komórki w 200 μl buforu FACS w celu pobrania za pomocą odpowiedniego cytometru przepływowego.
      UWAGA: Oczekuje się, że komórki nowotworowe międzybłoniaka będą dodatnie dla mezoteliny i N-kadheryny. Niektóre mogą również wyrażać CD90.
  4. Rozwiń się w całym pożywce nowotworowej i banku, jak opisano odpowiednio w krokach 4.1 i 5.1.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Aby określić stopień zanieczyszczenia kultur wczesnych pasażów fibroblastami, komórki ocenia się za pomocą odwróconego mikroskopu fazowego w celu zidentyfikowania częstotliwości występowania fibroblastów w stosunku do pozostałych obecnych komórek adherentnych. Rycina 1 przedstawia przykłady rosnącego zanieczyszczenia fibroblastami na poziomie 80% (Rycina 1A), 50% (Rycina 1B) i 30% (Rycina 1C) w porównan...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Chociaż ten protokół jest prosty, istnieje kilka krytycznych kroków, których należy ściśle przestrzegać. Zamrożenie we wczesnym okresie pasażu jest ważne, aby zachować zdolność do powtórzenia procesu wzbogacania komórek nowotworowych, jeśli początkowo się nie powiedzie. Zdolność do oceny zanieczyszczenia fibroblastów za pomocą oka w celu podjęcia decyzji o prawidłowej technice rozdzielania i głodzenia pożywki ma zasadnicze znaczenie dla zapobiegania nadmiernemu wzrostowi fibroblastów w kulturze. Ponadto metoda trypsyniza...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

CH jest członkiem SAB Briacell Therapeutics oraz Fundacji Badań Stosowanych Międzybłoniaka. Wszyscy pozostali autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować Raquel Laza-Briviesca za jej wkład w rozpoczęcie tego protokołu oraz doktorom Borisowi Sepesi, Rezie Mehranowi i Davidowi Rice'owi za współpracę przy pobieraniu tkanek. Z pracami tymi nie wiąże się żadne dodatkowe finansowanie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Pipety serologiczne 10 mlBD Falcon357551
15 ml probówki stożkoweBD Falcon352097
Pipety aspiracyjne 2 mlBD Falcon357558
Pipety serologiczne 5 mlBD Falcon357543
50 ml probówki stożkoweBD Falcon352098
6-dołkowe mikropłytki, hodowla tkankowa traktowanyCorning3516
AccutaseInnovative Cell TechnologiesAT104Mieszanina proteazy i kolagenazy uważana za bardziej skuteczną w zachowaniu epitopów do cytometrii przepływowej.
anty-CD325 (N-kadheryna) PEInvitrogen12-3259-42
anty-CD90 PE-Cy7BD Biosciences561558
anty-mezothelina APCMiltenyi130-118-096
Albumina surowicy bydlęcej 30%SigmaA8577-1L
Bufor dysocjacji komórek, bez enzymówThermo Fisher Scientific13151014
Cell sitko (70 &mikro; m)Greiner Bio-One542-070
Wirówka z adapterami 15 ml i 50 ml Kolagenaza
typu 1Sigma-AldrichC-0130Rozpuścić 1,5 g kolagenazy typu I w 100 ml sterylnego DMEM i podwielokrotność w objętościach 5 ml. Dobrze oznaczyć i przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza.
Komora zamrażania o kontrolowanej szybkościThermo Fisher Scientific15-350-50
CryovialsThermo Fisher Scientific5000-0020
CulturPlate-96Packard Instrument Company6005680Biała, nieprzezroczysta 96-dołkowa mikropłytka.
DimetylosulfotlenekThermo Fisher ScientificBP231-100
DNAse I (z trzustki bydlęcej)Sigma-AldrichD4527Podwielokrotność przy 50 μ L, dobrze oznaczyć i przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza. Po rozmrożeniu przechowywać w temperaturze 4 & stopni; C przez okres do 1 miesiąca.
Dulbecco's Fosforanowy buforowany roztwór soli 1xCorning21-031-CV
Etanol 200 proofThermo Fisher ScientificA4094
FACS rurki-filtr górnyBD Falcon352235
Płodowa surowica bydlęcaGemini-Bio100-106
GentleMACS C-tubesMiltenyi130-093-237
GentleMACS Octo-dysocjator z aparatem grzewczymMiltenyi130-096-427Zawiera specjalistyczne tuleje aparatów grzewczych służące do podgrzewania rurek C podczas dysoterapii.
Surowica koziaSigma-AldrichG9023Aliquot i przechowywać w temperaturze -20 °C.
Zbilansowany roztwór soli Hanka, 500 mlCorningMT21022CV
HyaluronidaseSigma-AldrichH3506Rozpuść 0,15 g hialuronidazy w 100 ml sterylnego DMEM i rozprowadź w 1,0 ml podwielokrotności. Dobrze oznaczyć i przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza.
odwróconymi fazami
Okap
Żywy/martwy żółty barwnikLife TechnologiesL-34968
Końcówki do mikropipet, 20 i mikro; LART2149P
Mikropipettor, 0,5-20 &mikro; L
Zestaw kontrolny do oznaczania MycoalertLonzaLT07-518Podwielokrotne kontrole dodatnie i przechowywać w temperaturze -20 °C.
Zestaw do wykrywania mykoplazmy Mycoalert PlusLonzaLT07-710Podwielokrotny odczynnik i substrat i przechowywać w temperaturze -20 °C. Zachować pozostały bufor i podwielokrotność do kontroli ujemnej i przechowywać w temperaturze -20& stopni C.
Paraformaldehyd 16%Mikroskopia elektronowa Nauki15710Przygotować bulion, filtrując przez filtr strzykawkowy PVDF (nr kat. Millex. SLVV033RS) i podwielokrotność pod wyciągiem. Przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza.
Penicylina-streptomycyna 10 000 U/mlGibco15140-122
Pipet aid
Czytnik płytek z możliwością luminescencjiBioTek Synergy HTmożna użyć dowolnego czytnika płytek o tych specyfikacjach
Nośnik RPMI 1640Corning10-040-CV
SkalpelAndwin2975#21
Stericup Quick Release-GP sterylny system filtracji próżniowej, 0,22 i mikro; m PES Express PLUS, 500 mlEMD MilliporeS2GPU05RE
filtr Steriflip-GP, 0,22 i mikro; m PES Express PLUS, 50 mlEMD MilliporeSCGP00525
Sterylne kleszczeThermo Fisher Scientific12-000-157
Kolby T25, kolbyCorning430639
Roztwór błękitu trypanowego 0,4%Gibco15250-061
Trypsyna EDTA 0,05% Corning25-052-CI
ViaStain pomarańczowy akrydynowy/jodek propydyny (AO/PI)roztwór NexcelomCS2-0106-5ML
Mikroskop z z przepływem laminarnym T75 poddane obróbce kultur tkankowych Corning 430641U

Bibliografia

  1. Guzman-Casta, J., et al. Prognostic factors for progression-free and overall survival in malignant pleural mesothelioma. Thoracic Cancer. 12 (7), 1014-1022 (2021).
  2. Baas, P., et al. First-line nivolumab plus ipilimumab in unresectable malignant pleural mesothelioma (CheckMate 743): a multicentre, randomised, open-label, phase 3 trial. Lancet. 397 (10272), 375-386 (2021).
  3. Testa, J. R., Berns, A. Preclinical models of malignant mesothelioma. Frontiers in Oncology. 10, 101(2020).
  4. Usami, N., et al. Establishment and characterization of four malignant pleural mesothelioma cell lines from Japanese patients. Cancer Science. 97 (5), 387-394 (2006).
  5. Kobayashi, M., Takeuchi, T., Ohtsuki, Y. Establishment of three novel human malignant pleural mesothelioma cell lines: morphological and cytogenetical studies and EGFR mutation status. Anticancer Research. 28 (1), 197-208 (2008).
  6. Chernova, T., et al. Molecular profiling reveals primary mesothelioma cell lines recapitulate human disease. Cell Death and Differentiation. 23 (7), 1152-1164 (2016).
  7. Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
  8. Han, A. C., et al. Differential expression of N-cadherin in pleural mesotheliomas and E-cadherin in lung adenocarcinomas in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Human Pathology. 28 (6), 641-645 (1997).
  9. Tachibana, K. N-cadherin-mediated aggregate formation; cell detachment by Trypsin-EDTA loses N-cadherin and delays aggregate formation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 516 (2), 414-418 (2019).
  10. Donnenberg, V. S., Corselli, M., Normolle, D. P., Meyer, E. M., Donnenberg, A. D. Flow cytometric detection of most proteins in the cell surface proteome is unaffected by trypsin treatment. Cytometry A. 93 (8), 803-810 (2018).
  11. Pham, K., et al. Isolation of pancreatic cancer cells from a patient-derived xenograft model allows for practical expansion and preserved heterogeneity in culture. American Journal of Pathology. 186 (6), 1537-1546 (2016).
  12. Derycke, L. D., Bracke, M. E. N-cadherin in the spotlight of cell-cell adhesion, differentiation, embryogenesis, invasion and signalling. International Journal of Developmental Biology. 48 (5-6), 463-476 (2004).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Ekspansja komórek nowotworowychpierwotne linie nowotworowedysocjacja guzatrypsynizacja różnicowakontaminacja fibroblastamicharakterystyka fenotypowacytometria przepłyewowakriotransportekspresja markerów powierzchniowych
Generowanie i rozszerzanie pierwotnych, złośliwych linii guza międzybłoniaka opłucnej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.