Kwantyfikacja ruchliwości roju powierzchni bakterii na płytkach gradientu induktora

Summary

Tutaj opisujemy użycie płytek gradientu induktora do oceny ruchliwości roju bakterii, jednocześnie uzyskując wiele odpowiedzi stężenia.

Abstract

Ruchliwość roju bakterii jest powszechnym fenotypem mikrobiologicznym, który społeczności bakteryjne wykorzystują do migracji po powierzchniach półstałych. W badaniach indukowanej ruchliwości roju, określone stężenie induktora może nie być w stanie zgłosić zdarzeń zachodzących w optymalnym zakresie stężeń, aby wywołać pożądane reakcje u gatunku. Płytki półstałe zawierające wiele stężeń są powszechnie stosowane do badania odpowiedzi w zakresie stężeń induktora. Jednak oddzielne płytki półstałe zwiększają wahania średniej lepkości i zawartości wilgoci w każdej płytce ze względu na niejednorodny czas krzepnięcia.

Ten artykuł opisuje jednoetapową metodę jednoczesnego testowania ruchliwości roju powierzchni na pojedynczej płycie gradientowej, gdzie izometrycznie ułożone studnie testowe pozwalają na jednoczesne uzyskanie odpowiedzi wielostężeniowych. W niniejszej pracy oceniano powierzchniowe rój Escherichia coli K12 i Pseudomonas aeruginosa PAO1 w odpowiedzi na gradient stężeń induktorów, takich jak resweratrol i arabinoza. Okresowo morfologie roju były obrazowane za pomocą systemu obrazowania, aby uchwycić cały proces roju na powierzchni.

Ilościowy pomiar morfologii roju został uzyskany za pomocą oprogramowania ImageJ, dostarczając możliwych do analizy informacji o obszarze roju. W artykule przedstawiono prostą metodę płytek gradientowych, która dostarcza jakościowych i ilościowych informacji na temat wpływu induktorów na rój powierzchniowy, które można rozszerzyć w celu zbadania wpływu innych induktorów na szerszy zakres ruchliwych gatunków bakterii.

Introduction

Ruchliwość roju bakterii odnosi się do zbiorowej migracji komórek bakteryjnych po powierzchni substancji. Oprócz półstałych płytek agarowych specjalnie przygotowanych w laboratorium¹, fenotyp ten obserwuje się również na niektórych miękkich podłożach, takich jak tkanki zwierzęce², powierzchnie uwodnione³ i korzenie roślin⁴. Podczas gdy półstała powierzchnia jest uważana za jeden z podstawowych warunków roju bakterii, niektóre gatunki wymagają również bogatego w energię podłoża, aby wspierać swoją ruchliwość roju⁵. Rotacja wici napędza zarówno pływanie, jak i ruchliwość roju - pływanie opisuje jednokomórkową ruchliwość w płynnym środowisku, podczas gdy rój to synchroniczny ruch populacji drobnoustrojów po półstałych powierzchniach.

Lepkość podłoża wpływa na ruchliwość bakterii; badania drobnoustrojów chorobotwórczych, takich jak Helicobacter pylori, wykazały, że ruchliwość patogenu zmienia się w zależności od lepkości warstwy mucyny, na którą wpływ ma zakwaszenie środowiska u ludzkiego gospodarza⁶. Aby odtworzyć te środowiska, wcześniejsze badania z użyciem stężenia agaru powyżej 0,3% (w/v) ograniczają ruchliwość pływania bakterii, aby spowodować stopniowe przejście do roju powierzchniowego. Stosowanie stężenia agaru powyżej 1% (w/v) zapobiega ruchliwości roju wielu gatunków⁷. Wzory kolonii powstające na powierzchni są różnorodne, w tym mat⁸, bull's eye⁹, dendryty¹⁰ i vortex¹¹.

Chociaż znaczenie takich wzorców pozostaje niejasne, wydaje się, że są one zależne od sygnałów środowiskowych i chemicznych¹². Sygnały środowiskowe obejmują różne aspekty, w tym temperaturę, zasolenie, światło i pH, podczas gdy wskazówki chemiczne obejmują obecność mikrobiologicznych cząsteczek wyczuwających kworum, biochemiczne produkty uboczne i składniki odżywcze. Cząsteczki sygnalizacyjne autoinduktora wykrywające kworum, takie jak AHL (lakton homoserynowy N-heksanoyl-L), mogą wpływać na roj powierzchniowy poprzez regulację produkcji środka powierzchniowo czynnego^13,14. Resweratrol, związek fitoaleksyny, może ograniczać ruchliwość roju bakterii¹⁵.

W niniejszej pracy badamy wpływ gradientowych stężeń resweratrolu na dziki szczep Escherichia coli K12 i badamy indukowaną arabinozą ruchliwość roju zmodyfikowanych gatunków E. coli K12-YdeH i Pseudomonas aeruginosa PAO1-YdeH. Produkcja enzymu YdeH jest indukowana przez arabinozę za pośrednictwem promotora araBAD, co powoduje zaburzenia komórkowe c-di-GMP i wpływa na ruchliwość roju bakterii^16,17. To indukowalne zachowanie roju jest badane za pomocą płytek roju gradientu arabinozy ze szczepami E. coli K12-YdeH i P. aeruginosa PAO1-YdeH.

Gradientowe płyty roju są przygotowywane przez sukcesywne krzepnięcie dwuwarstwowego podłoża (Rysunek 1B). Dolna warstwa składa się z pożywki dodanej wraz z induktorem, wylanej na jedną stronę podpartej szalki Petriego. Po zestaleniu się dolnej warstwy, szalka Petriego jest ponownie umieszczana na płaskiej powierzchni, gdzie górna warstwa zawierająca pożywkę bez induktora jest dodawana z drugiej strony płytki. Po całkowitym zestaleniu się płyt roju, izometrycznie ułożone studnie podtrzymujące są wytwarzane przez wiercenie otworów w płytach roju zgodnie z ustalonym układem (Rysunek 1C) lub przez odciskanie studzienek za pomocą wydrukowanego w 3D modelu pokrywy płyty zawierającej kołki podczas procesu utwardzania medium (Rysunek uzupełniający S1). System obrazowania żelowego służy do uchwycenia morfologii roju w różnych punktach czasowych (Rysunek 2). Analiza roju powierzchniowego za pomocą oprogramowania ImageJ (rysunek uzupełniający S2) dostarcza ilościowych wyników procesu roju powierzchniowego (Rysunek 3).

Dlatego proponujemy prostą metodę badania ruchliwości roju powierzchniowego w zakresie stężeń induktorów. Metoda ta może być stosowana do badania wielu odpowiedzi stężeniowych innych induktorów poprzez zmieszanie induktora z podłożem dolnej warstwy i może być stosowana do innych gatunków ruchliwych (np. Bacillus subtilis, Salmonella enterica, Proteus mirabilis, Yersinia enterocolitica). Takie podejście może dostarczyć wiarygodnych wyników jakościowych i ilościowych do badań przesiewowych pojedynczego induktora chemicznego, a do oceny większej liczby induktorów chemicznych można zastosować oddzielne płytki.

Protocol

1. Przygotowanie płyt roju gradientowego

1. Przygotowanie podłoża roju
   UWAGA: Zobacz sekcję dyskusji, aby zapoznać się z krótkim porównaniem różnych lepkości średnich; W tym protokole zastosowano stężenie agaru na poziomie 0,7% (w/v) w pożywce roju.
   1. Przygotować bulion lizogeniczny (LB) w proszku z agarem w dwóch stożkowych kolbach; każda kolba zawiera 2 g tryptonu, 2 g chlorku sodu, 1 g ekstraktu drożdżowego i 1,4 g agaru. Dodać podwójnie destylowaną wodę (ddH₂O) i wymieszać zawiesinę za pomocą mieszadła magnetycznego. Dostosować końcową objętość do 200 ml, dodając dodatkowo ddH₂O.
   2. Roztwór należy sterylizować w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 20 minut. Użyć przepuszczającej powietrze nakrętki lub folii uszczelniającej butelkę z odpowietrznikiem.
      UWAGA: Agar rozpuści się po podgrzaniu w autoklawie.
   3. Gdy temperatura spadnie do 65 °C, wymieszaj roztwór, aby zapewnić jednorodność, a następnie przenieś pożywkę do inkubatora o temperaturze 65 °C lub łaźni wodnej w celu krótkotrwałego użycia.
2. Przygotowanie warstwy dolnej warstwy roju pożywki
   UWAGA: Pożywka w dolnej warstwie jest mieszaniną pożywki rojowej i roztworów podstawowych induktora. Formułę płytek roju gradientu induktora przedstawiono w tabeli 1.
   1. Przygotować 100 mM roztwór podstawowy resweratrolu, rozpuszczając 114,12 mg liofilizowanego proszku resweratrolu w 5 ml dimetylosulfotlenku (DMSO) i przechowywać roztwór w temperaturze -20 °C.
   2. Przygotować 20% (w/v) roztwór podstawowy arabinozy, rozpuszczając 6 g proszku arabinozy w 30 ml ddH₂O; odczekać 10-15 minut, aby arabinoza mogła się rozpuścić; i przechowywać roztwór w temperaturze pokojowej.
   3. Wyjąć pożywkę z inkubatora o temperaturze 65 °C i umieścić ją w temperaturze pokojowej; pozostawić pożywkę do ostygnięcia, aż kolba Erlenmeyera ostygnie na tyle, aby utrzymać temperaturę (~50 °C). Nie umieszczaj pożywki roju w temperaturze pokojowej przez dłuższy czas, ponieważ spowoduje to zestalenie się agaru.
   4. Dodać wymaganą objętość roztworu podstawowego induktora do pożywki roju w temperaturze 50 °C (tabela 1). Użyj pipety, aby dozować roztwór induktora zamiast go nalewać. Delikatnie zamieszaj, aby wymieszać induktor z podłożem roju.
      UWAGA: Ten krok dotyczy induktorów, których nie można sterylizować w autoklawie. Uważaj, aby nie wprowadzić bąbelków do podłoża.
3. Przygotowanie dwuwarstwowych płyt roju gradientowego
   UWAGA: Pożywka wierzchniej warstwy to pożywka LB zawierająca 0,7% (w/v) agaru.
   1. Oznacz kwadratowe szalki Petriego o wymiarach 13 x 13 cm nazwą induktora i szczepami, a następnie oprzyj szalki nad krawędzią pokrywek (Rysunek 1B).
   2. Dodać 40 ml ciepłej pożywki dolnej warstwy (50 °C) za pomocą pipety 50 ml lub probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.
      UWAGA: Alternatywnie, w przypadku kwadratowych szalek Petriego o wymiarach 13 x 13 cm, odpowiednie jest 40 ml podłoża z dolnej i górnej warstwy; W przypadku kwadratowych szalek Petriego o wymiarach 10 x 10 cm odpowiednia jest pożywka dolna i górna warstwa o pojemności 25 ml.
   3. Pozostawić podłoże dolnej warstwy do utwardzenia bez przykrycia przez 1 godzinę w okapie z przepływem laminarnym. Nie przeszkadzać kwadratowym szalkom Petriego, gdy podłoże krzepnie.
      UWAGA: Podczas utwardzania dolnej warstwy, podłoże roju niezawierające induktorów powinno być utrzymywane w inkubatorze lub łaźni wodnej o temperaturze 65 °C.
   4. Gdy dolna warstwa całkowicie zestali się, zdejmij pokrywki i połóż kwadratowe szalki Petriego w okapie z przepływem laminarnym.
   5. Dodać 40 ml ciepłej pożywki wierzchniej warstwy (50 °C) za pomocą pipety 50 ml lub probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.
      UWAGA: Podłoże z górnej warstwy nie zawiera induktorów.
   6. Dwuwarstwowe płytki utwardzać na blacie pod przykryciem i w nienaruszonym stanie przez 1 godzinę. Przygotowane płytki przechowywać w temperaturze 4 °C do 24 h.
      UWAGA: Dłuższy czas utwardzania zmniejszyłby zawartość wilgoci i ograniczyłby ruchliwość roju.

2. Wzrost E. coli K12 i P. aeruginosa PAO1

1. Przygotować 500 ml pożywki LB, dodając 5 g tryptonu, 5 g NaCl i 2,5 g ekstraktu drożdżowego do ddH₂O i uzupełnić roztwór do 500 ml. Roztwór należy sterylizować w autoklawie w cyklu cieczy przez 20 minut w temperaturze 121 °C i przechowywać w temperaturze 4 °C.
2. Przygotować 100 ml 1,5% (w/v) pożywki LB-agar, dodając 1 g tryptonu, 1 g NaCl, 0,5 g ekstraktu drożdżowego i 1,5 g agaru do ddH₂O i uzupełnić roztwór do 100 ml. Roztwór należy sterylizować w autoklawie w cyklu cieczy przez 20 minut w temperaturze 121 °C. Przenieść podłoże do łaźni wodnej o temperaturze 50 °C, aby zapobiec zestaleniu się agaru.
3. Gdy kolba z pożywką LB-agar jest wygodna do trzymania, dodać 20 ml pożywki LB-agar do szalki Petriego (o średnicy 10 cm) za pomocą pipety o pojemności 25 ml. Pozostawić płytkę w temperaturze pokojowej na noc i przechowywać płytkę LB-agar w temperaturze 4 °C.
4. Pobrać kultury zapasowe przechowywane w temperaturze -80 °C, szczepy E. coli K12, E. coli K12-YdeH, P. aeruginosa PAO1 i P. aeruginosa PAO1-YdeH na szalkach Petriego LB-agar za pomocą jednorazowych pętli inokulacyjnych. Inkubować odwrócone szalki Petriego przez noc w temperaturze 37 °C.
5. Z szalek Petriego należy wybrać pojedyncze kolonie dla różnych szczepów, zaszczepić każdą kolonię w 5 ml pożywki LB i inkubować kulturę w temperaturze 37 °C w laboratoryjnej wytrząsarce orbitalnej ustawionej na 220 obr./min.
6. Gdy gęstość kultury osiągnie OD_600nm ~ 1,0, wyjmij kulturę z wytrząsarki i umieść ją w temperaturze pokojowej. Dostosuj gęstość hodowli do OD_600nm = 1,0, jak opisano w kroku 3.2.1.

3. Inokulacja i inkubacja płytek roju gradientowego

1. Przygotowanie studzienek inokulacyjnych
   UWAGA: Zamiast metody opisanej poniżej można zastosować modele okładek do drukowania 3D, które są w stanie generować studzienki oddalone od siebie standardową odległością (rysunek uzupełniający S1).
   1. Zaznacz pozycje studzienek na papierze A4 pokazane w Rysunek 1C. Ustawić trzy badane stężenia na jednej kwadratowej szalce Petriego z dwoma lub trzema powtórzeniami.
   2. Umieść oznaczony papier A4 pod zastygłą płytą gradientową. Wsunąć szerszą stronę końcówki pipety o pojemności 100 μl w półstałą powierzchnię podłoża w zaznaczonym miejscu. Dociśnij końcówkę pipety, aż dotrze do dolnej części wierzchniej warstwy podłoża.
   3. Gdy końcówka dotknie dna, nie przykładaj do niej siły pionowej; delikatnie obróć końcówkę, aby odizolować zawartość cylindrycznej studzienki.
   4. Przesuwaj końcówki pipet w poziomie na bardzo małą odległość, aby umożliwić przepływ powietrza do wąskiego miejsca odłożonego na bok. Naciśnij końcówkę palcem wskazującym, aby zablokować przepływ gazu wewnątrz końcówki, jednocześnie trzymając pipetę kciukiem i palcem środkowym.
   5. Wyciągnij końcówkę pionowo, trzymając zawartość studzienki w końcówce podczas wyciągania jej.
      UWAGA: Jeśli zawartość studzienki ześlizgnie się, lekko mocniej dociśnij palcem wskazującym, aby całkowicie uszczelnić końcówkę.
   6. Powtórz kroki od 3.1.2 do 3.1.5 w każdej zaznaczonej pozycji. Przykryj płytkę roju przed inokulacją.
2. Inokulacja i inkubacja na płytkach gradientowych
   1. Dostosuj gęstość kultur wzrostu przez noc do OD_600nm = 1,0.
   2. Odpipetować 80 μl nocnej kultury wzrostu do każdej studzienki. Nie wylewaj kultury bakteryjnej na zewnątrz studzienek.
   3. Owiń płytki folią uszczelniającą. W przypadku długotrwałej obserwacji (3-5 dni) owiń płytki sterylną taśmą laboratoryjną.
      UWAGA: Taśma gumowa jest mniej podatna na pęknięcie.
   4. Umieścić zlewkę wypełnioną ddH₂O w inkubatorze, aby utrzymać wilgotność wewnątrz inkubatora. Inkubować płytki roju gradientowego w temperaturze 37 °C.
      UWAGA: Nie inkubuj płytek roju do góry nogami; Spowoduje to wyciek kultury bakteryjnej ze studzienek.
   5. Wyobraź sobie płytkę roju natychmiast po zaszczepieniu, rejestrując to jako punkt czasowy 0 godzin.

4. Obrazowanie roju bakterii na powierzchni

1. Wyjmować płytki roju, pojedynczo, z inkubatora co 12 godzin, trzymając płytkę poziomo, i umieszczać je w systemie obrazowania żelu (patrz Tabela Materiałów).
   UWAGA: Nie pozostawiaj odcisków palców na powierzchni płyt; Trzymaj bok płyty roju czystymi rękawicami.
2. Wybierz tryb obrazowania żelowego; wystaw płytkę roju na działanie białego światła i dostosuj ogniskową, aby uzyskać jak najwyraźniejszy widok rojów.
   UWAGA: Używaj tej samej ogniskowej dla wszystkich płyt w danej partii.
3. Zwiększ jasność rojów, aby uzyskać wyraźną obserwację, dostosowując czas ekspozycji do 300 ms. Dostosuj próg, aby zminimalizować zakłócenia powodowane przez światło tła.
   UWAGA: Próg jest regulowany w interfejsie operacyjnym systemu obrazowania żelu. Zwiększ wartości po lewej stronie, aby zminimalizować zakłócenia powodowane przez światło tła; Zmniejsz wartości po prawej stronie, aby zwiększyć jasność rojów. W tym protokole region wynosi zwykle od 6 000 do 50 000.
4. Zapisz plik obrazu do dalszej analizy. Zapisz czas obrazowania, typ induktora, orientację gradientu i odkształcenia w pliku .txt.

5. Określ ilościowo obszar roju za pomocą oprogramowania ImageJ

1. Zaimportuj plik obrazu uzyskany za pomocą systemu obrazowania żelu.
2. Ustaw pasek skali za pomocą oprogramowania ImageJ i zastosuj go do wszystkich obrazów.
   1. Utwórz odcinek linii wyznaczający długość planszy, klikając narzędzie linii.
   2. Kliknij pozycję Analizuj | Ustaw skalę, aby otworzyć okno Ustaw skalę.
   3. Wpisz rzeczywistą długość w polach Znana odległość i Jednostka długości.
      UWAGA: Ponieważ w tej pracy użyto kwadratowych szalek Petriego o wymiarach 13 x 13 cm, rzeczywista długość to "130", a jednostką długości jest "mm".
   4. Zaznacz pole Globalne.
   5. Wstawianie podziałki liniowej kliknij przycisk Analizuj | Narzędzia | Pasek skali, wpisz Szerokość w mm, Wysokość w pikselach, Rozmiar czcionki i wybierz Kolor, Tło i Lokalizacja z menu rozwijanego. Możesz też wybrać opcję Pogrubiony tekst, Ukryj tekst, Czcionka szeryfowa i Nakładka, zaznaczając pola wyboru.
      UWAGA: Wybór tych parametrów zależy od użytkowników i właściwości obrazów. W tym protokole szerokość w mm została ustawiona na 25, wysokość w pikselach na 20, rozmiar czcionki na 80, a pasek skali został umieszczony w prawym dolnym rogu, wybierając Lokalizacja | Prawy dolny róg. Inne parametry mogą być wybierane przez użytkownika.
3. Kliknij opcję Process (Proces) | Cienie w celu zwiększenia ostrości obrazu, zwłaszcza granic (rysunek uzupełniający S2A). Kliknij opcję Process (Proces) | Przetwarzanie wsadowe obrazów.
   UWAGA: Celem tego kroku jest zapewnienie bardziej precyzyjnego wyznaczenia granic.
   1. Przetwarzaj obraz jako odniesienie, klikając przycisk Proces | Cienie | Południe.
   2. Kliknij opcję Process (Proces) | Partia | Makro, aby otworzyć okno Proces wsadowy. Poszukaj następujących poleceń wyświetlanych w oknie:
      run("południe");
      run("Zapisz");
      close();
   3. Wpisz adres folderu oryginalnych obrazów i adres pliku wyjściowego, klikając przycisk Process (Przetwarzaj) w oknie Batch Process (Proces wsadowy).
      UWAGA: Zaleca się eksportowanie obrazów z cieniami do innego folderu i zachowanie kopii oryginalnych obrazów.
4. Użyj narzędzia Różdżka (śledzenie), aby wybrać roje pojedynczo i dostosować tolerancję (kliknij dwukrotnie narzędzie Różdżka (śledzenie)), aż wygenerowana linia będzie prawidłowo pasować do granicy roju (Rysunek uzupełniający S2B).
   UWAGA: Najpierw kliknij narzędzie Różdżka (śledzenie) i wybierz rój na jednym obrazie. Jeśli obwiednie nie zostały przedstawione poprawnie, kliknij dwukrotnie narzędzie Różdżka (obrysowywanie), aby otworzyć okna narzędzia Różdżka, w których można dostosować Tolerancję.
5. Kliknij Analizuj | Zmierz, aby wyeksportować wartość obszaru.
6. Powtarzaj kroki 5.1.1-5.1.5, aż wszystkie roje zostaną zmierzone, zapisz wyniki w pliku .csv do dalszej analizy.

Results

Przebieg pracy składający się z przygotowania płytek roju gradientowego, inokulacji i inkubacji jest pokazany w Rysunek 1B. Aby wytworzyć gradientowe płyty pływane, podłoże z dolnej warstwy wlewa się do podpartych naczyń pod kątem ~4,3° od płaszczyzny poziomej (rysunek uzupełniający S3), a następnie wlewa się pożywkę z górnej warstwy po całkowitym zestaleniu dolnej warstwy. Skład pożywki dwuwarstwowej przedstawiono w tabeli 1. Następnie kulturę bakteryjną ho...

Discussion

Badanie ruchliwości roju bakterii na półstałych płytkach gradientowych może być trudnym zadaniem 18,19,20, ponieważ obejmuje wiele czynników, takich jak lepkość podłoża, wilgotność i składniki podłoża. Wśród tych czynników stężenie agaru odgrywa decydującą rolę w określaniu powrotu drobnoustrojów do pływania lub ruchliwości roju. Wraz ze wzrostem stężenia agaru z 0,3% (w/v) do 1% (w/v), ruchliwość bakteryjna podczas pływania zos...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar	Sigma-Aldrich	V900500	500 g
Ampicillin	Solarbio	A8180	25 g, ≥ 85% (GC)
Probówka wirówkowa	Corning	430790	15 mL
Fiolka kriogeniczna	Corning	430488	2 ml
Dimetylosulfotlenek (DMSO)	Aladyn	D103272	AR, > 99% (GC)
L(+)-Arabinoza	Aladyn	A106195	98% (GC), 500 g
Szalki Petriego	Bkman	B-SLPYM90-15	Plastikowe szalki Petriego, okrągłe, 90 mm x 15 mm
Resweratrol	Aladyn	R107315	99% (GC), 25 g
Chlorek sodu	Macklin	S805275	AR, 99,5% (GC), 500 g
Kwadratowe szalki Petriego	Bkman	B-SLPYM130F	Plastikowe szalki Petriego, kwadratowe, 13 mm x 13 mm
Tryptone	Thermo Scientific Oxoid	LP0042	500 g
Ekstrakt drożdżowy	Thermo Scientific Oxoid	LP0021	500 g
Equipments
Inkubator biochemiczny	Blue pard	LRH-70
Tanon 5200multi system obrazowania	Tanon	5200CE
Woda termostatyczna wanna	Jinghong	DK-S28