Artykuł metodologiczny

Zbiorcze badania przesiewowe biblioteki shRNA w celu identyfikacji czynników modulujących fenotyp oporności na leki

2.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63383

⸱

17 czerwca 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Clinical Haematology, Christian Medical College, 2Department of Biotechnology, Thiruvalluvar University, 3Centre for Stem Cell Research, Christian Medical College

W tym artykule

Podsumowanie

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe RNA (RNAi) z wykorzystaniem puli lentiwirusowych shRNA mogą być narzędziem do wykrywania terapeutycznie istotnych syntetycznych celów śmiertelnych w nowotworach złośliwych. Zapewniamy zbiorcze podejście do badań przesiewowych shRNA w celu zbadania efektorów epigenetycznych w ostrej białaczce szpikowej (AML).

Streszczenie

Zrozumienie klinicznie istotnych mechanizmów napędzających nabytą chemooporność jest kluczowe dla wyjaśnienia sposobów obejścia oporu i poprawy przeżywalności u pacjentów z ostrą białaczką szpikową (AML). Niewielka część komórek białaczkowych, które przeżywają chemioterapię, ma stabilny stan epigenetyczny, aby tolerować zniewagi chemioterapeutyczne. Dalsza ekspozycja na chemioterapię pozwala tym komórkom utrwalonym na lek osiągnąć stały stan epigenetyczny, co prowadzi do zmienionej ekspresji genów, co skutkuje proliferacją tych opornych na leki populacji i ostatecznie nawrotem choroby lub opornością na leczenie. Dlatego identyfikacja modulacji epigenetycznych, które wymagają przeżycia lekoopornych komórek białaczkowych, ma kluczowe znaczenie. Szczegółowo opisujemy protokół identyfikacji modulatorów epigenetycznych, które pośredniczą w oporności na analog nukleozydu cytarabiny (AraC) przy użyciu połączonych badań przesiewowych biblioteki shRNA w nabytej linii komórkowej AML opornej na cytarabinę. Biblioteka składa się z 5 485 konstruktów shRNA ukierunkowanych na 407 ludzkich czynników epigenetycznych, co umożliwia wysokoprzepustowe badania przesiewowe czynników epigenetycznych.

Wprowadzenie

Opcje terapeutyczne w ostrej białaczce szpikowej (AML) pozostały niezmienione przez prawie pięć ostatnich dekad, z cytarabiną (AraC) i antracyklinami jako podstawą leczenia choroby. Jednym z wyzwań dla powodzenia terapii AML jest oporność białaczkowych komórek macierzystych na chemioterapię, prowadząca do nawrotu choroby1,2. Regulacja epigenetyczna odgrywa istotną rolę w patogenezie nowotworów i oporności na leki, a kilka czynników epigenetycznych okazało się obiecującymi celami terapeutycznymi3,4,5. Epigenetyczne mechanizmy regulacyjne wpływają na proliferację i przeżycie przy ciągłym narażeniu na leki chemioterapeutyczne. Badania nad nowotworami złośliwymi niehematologicznymi wykazały, że niewielka część komórek, które przezwyciężają działanie leku, przechodzi różne modyfikacje epigenetyczne, co skutkuje przeżyciem tych komórek6,7. Jednak rola czynników epigenetycznych w pośredniczeniu w nabytej oporności na cytarabinę w AML nie została zbadana.

Badania przesiewowe o wysokiej przepustowości to podejście do odkrywania leków, które z czasem zyskało globalne znaczenie i stało się standardową metodą w różnych aspektach do identyfikacji potencjalnych celów w mechanizmach komórkowych, do profilowania szlaków i na poziomie molekularnym8,9. Koncepcja syntetycznej śmiertelności obejmuje interakcję między dwoma genami, w której zaburzenie jednego genu jest żywotne, ale oba geny jednocześnie powodują utratę żywotności10. Wykorzystanie syntetycznej śmiertelności w leczeniu nowotworów może pomóc w identyfikacji i mechanistycznym scharakteryzowaniu silnych syntetycznych letalnych interakcji genetycznych11. Przyjęliśmy kombinatoryczne podejście do wysokoprzepustowych badań przesiewowych shRNA z syntetyczną śmiertelnością w celu zidentyfikowania czynników epigenetycznych odpowiedzialnych za nabytą oporność na cytarabinę w AML.

Ostre białaczki spowodowane translokacją chromosomalną genu białaczki mieszanej (MLL lub KMT2A) są znane z tego, że są związane ze słabym przeżyciem pacjentów. Powstałe chimeryczne produkty rearanżacji genów MLL, tj. białka fuzyjne MLL (MLL-FP), mogą przekształcać hematopoetyczne komórki macierzyste/progenitorowe (HSPC) w blasty białaczkowe przy udziale wielu czynników epigenetycznych. Te regulatory epigenetyczne stanowią skomplikowaną sieć, która dyktuje utrzymanie programu białaczki, a zatem mogą stanowić potencjalne cele terapeutyczne. W tym kontekście wykorzystaliśmy linię komórkową MV4-11 (zawierającą gen fuzji MLL MLL-AF4 z mutacją FLT3-ITD; określaną jako MV4-11 P) do opracowania nabytej linii komórkowej opornej na cytarabinę, określanej jako MV4-11 AraC R. Linia komórkowa była narażona na rosnące dawki cytarabiny z przerywaną rekonwalescencją po leczeniu farmakologicznym, znanym jako wakacje od leków. Połowę maksymalnego stężenia hamującego (IC50) oceniano za pomocą testu cytotoksyczności in vitro.

Użyliśmy zbiorczej epigenetycznej biblioteki shRNA (patrz Tabela materiałów) napędzanej przez promotor hEF1a ze szkieletem lentiwirusowym pZIP. Biblioteka ta zawiera shRNA ukierunkowane na 407 czynników epigenetycznych. Każdy czynnik ma 5-24 shRNA, z łączną liczbą 5 485 shRNA, w tym pięć niedocelowych kontrolnych shRNA. Zmodyfikowane rusztowanie miR-30 "UltrmiR" zostało zoptymalizowane pod kątem wydajnej pierwotnej biogenezy i ekspresji shRNA12,13.

Zarys tego eksperymentu jest zilustrowany w Rysunek 1A. Obecny protokół koncentruje się na badaniach przesiewowych RNAi przy użyciu biblioteki epigenetycznego czynnika shRNA w linii komórkowej MV4-11 AraC R (Figura 1B), zawiesinowej linii komórkowej. Protokół ten może być wykorzystany do badania przesiewowego dowolnej docelowej biblioteki w dowolnej wybranej przez siebie lekoopornej linii komórkowej. Należy zauważyć, że protokół transdukcji będzie inny dla komórek przylegających.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Postępuj zgodnie z wytycznymi Instytucjonalnego Komitetu Bezpieczeństwa Biologicznego (IBSC) i użyj odpowiedniego urządzenia do obsługi lentiwirusa (BSL-2). Personel powinien być odpowiednio przeszkolony w zakresie obchodzenia się z lentiwirusem i jego usuwania. Protokół ten jest zgodny z wytycznymi dotyczącymi bezpieczeństwa biologicznego Christian Medical College w Vellore.

1. Wybór najsilniejszego promotora w celu uzyskania trwałej i przedłużonej ekspresji shRNA

UWAGA: Niezbędne jest przeprowadzenie eksperymentu transdukcji przy użyciu wektorów lentiwirusowych z różnymi promotorami wyrażającymi białka fluorescencyjne, aby zidentyfikować promotor, który zapewnia stabilną i długoterminową ekspresję shRNA w linii komórkowej wybranej do eksperymentu. Najczęściej stosowanymi promotorami w tym celu są hEF1α (ludzki czynnik wydłużenia 1α), hCMV (ludzki wirus cytomegalii) i SSFV (wirus tworzący ognisko śledziony), które wyrażają białko zielonej fluorescencji (GFP) (Figura 2A).

  1. Zliczanie komórek należy przeprowadzić przy użyciu metody wykluczania błękitu trypanowego. Zawieś komórki R AraC MV4-11 w pożywce 10% RPMI (RPMI z 10% FBS uzupełnionym 100 U / ml penicyliny i 100 U / ml streptomycyny) zawierającej 8 μg / ml polibrenu. Wysiew 1 x 106 komórek w 1,5 ml pożywki/dołka sześciodołkowej płytki w trzech powtórzeniach.
  2. Do każdego dołka dodać różne objętości skoncentrowanych lentiwirusów (na przykład 10 μl, 20 μl i 40 μl, w zależności od miana lentiwirusów). Delikatnie zakręć talerzem, aby wymieszać zawartość.
  3. Przeprowadzić dezynfekcję przez odwirowanie w temperaturze 920 x g w temperaturze 37 °C przez 90 min.
  4. Natychmiast inkubować płytki w inkubatorze CO2 (5 % CO2 w temperaturze 37 °C).
  5. Obserwuj ekspresję GFP po 48 godzinach pod mikroskopem fluorescencyjnym, aby zapewnić pomyślną transdukcję.
  6. Określić ilościowo ekspresję GFP za pomocą cytometrii przepływowej po 72 godzinach w celu oceny skuteczności transdukcji.
  7. Hodować komórki przez łącznie 2 tygodnie i okresowo monitorować ekspresję GFP za pomocą cytometrii przepływowej. Zmniejszenie ekspresji GFP mierzone średnią intensywnością fluorescencji i procentem komórek GFP+ wskazuje na wyciszenie promotora.
  8. Sortuj komórki GFP+ 10 dnia i hoduj komórki przez 1 tydzień po sortowaniu. Okresowo sprawdzaj ekspresję GFP podczas hodowli.
  9. Użyj nietransdukowanych komórek, aby ustawić bramę. Populacja znajdująca się poza skalą 1 x 101 w kierunku prawej strony osi x jest uważana za populację dodatnią dla GFP.
  10. Wybierz promotor, który wykazuje trwałą ekspresję GFP w przedłużonej hodowli komórek.

2. Przygotowanie zbiorczej biblioteki shRNA ludzkiego czynnika epigenetycznego lentiwirusowego

  1. Hodowla komórek 293T (przy niskiej liczbie pasażów z dobrym współczynnikiem proliferacji) na trzech 10-centymetrowych szalkach do hodowli komórkowych z 8 ml 10% pożywki DMEM (DMEM z 10% FBS zawierającej 100 U/ml penicyliny i 100 U/ml streptomycyny) na każdej płytce.
  2. Gdy komórki osiągną 60% zbieżności, zastąp pożywkę kompletną pożywką.
  3. Przygotować mieszaninę do transfekcji (jak opisano w Tabeli 1), która zawiera pożywkę bez surowicy, opakowanie lentiwirusowe (psPAX2) i plazmid otoczki (pMD2.G), plazmidy z biblioteki zbiorczej i na koniec odczynnik do transfekcji.
  4. Postukaj w mieszaninę, aby dobrze ją wymieszać i inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
  5. Dodaj mieszaninę transfekcji do komórek 293T i delikatnie wymieszaj, obracając płytki. Inkubować płytki w inkubatorze CO2 (5 % CO2 w temperaturze 37 °C). Wymień podłoże po 24 godzinach.
  6. Po 48 godzinach sprawdź ekspresję GFP pod mikroskopem fluorescencyjnym, aby zapewnić wysoką wydajność transfekcji w komórkach 293T.
  7. Zebrać supernatanty wirusa po 48 godzinach, 60 godzinach i 72 godzinach i przechowywać je w temperaturze 4 °C. Dodać świeżą pożywkę (8 ml) w każdym punkcie czasowym po zebraniu wirusa.
  8. Połączyć supernatanty wirusa. Całkowita objętość połączonych wirusów wyniesie: ~8 ml / płytkę x 3 kolekcje = ~ 24 ml / płytkę; ~24 ml/płytkę x 3 płytki = ~72 ml z 3 płytek.
  9. Przefiltruj zebrane wirusy za pomocą filtra 0,4 μm.
  10. W celu uzyskania wysokiego miana wirusów, należy skoncentrować zebrane wirusy przez ultrawirowanie. Przefiltrowany supernatant wirusa przenieść do dwóch probówek 70 Ti (32 ml / probówkę) i wirować przy 18 000x g przez 2 godziny z powolnym przyspieszaniem i zwalnianiem. Użyć wirnika i wirówki wstępnie schłodzonych do temperatury 4 °C.
  11. Delikatnie wyjmij probówki z wirówki i całkowicie usuń supernatant.
  12. Za pomocą mikropipety delikatnie zawiesić granulkę w 400 μL DMEM (bez FBS i antybiotyków). Inkubować na lodzie przez 1 godzinę i wymieszać granulki z obu probówek.
  13. Podzielić wirusy na porcje i zamrozić w temperaturze -80 °C.
    UWAGA: Probówki i wirusy muszą być trzymane na lodzie podczas kroków 2.10.-2.13. Unikaj pienienia się podczas ponownego zawieszania wirusa za pomocą zwykłego podłoża. Pożywkę należy utrzymywać w temperaturze 4 °C.
  14. Oblicz stężenie (x) wirusa jak poniżej:
    Całkowita objętość przed zatężeniem = 72 ml (72 000 μl)
    Objętość po zagęszczeniu = 400 μL
    Koncentracja = 72 000/400 = 180x

3. Oszacowanie skuteczności transdukcji lentiwirusów

  1. Transdukuj komórki 293T ze skoncentrowanym wirusem w różnych objętościach (2 μL, 4 μL, 8 μL), aby potwierdzić pomyślne przygotowanie lentiwirusów.
    UWAGA: Jeśli skoncentrowane wirusy wykazują wysoką skuteczność transdukcji (>50%) w małych objętościach (1-2 μL), zaleca się rozcieńczenie skoncentrowanego wirusa w pożądanych ilościach (od 100 do 75 razy).
  2. Rozcieńczyć skoncentrowany wirus do 100x za pomocą DMEM (bez FBS i antybiotyków) w celu przeprowadzenia eksperymentów miareczkowania w linii komórkowej MV4-11 AraC R.
  3. Zasiew 1 x 106 komórek (linia komórkowa MV4-11 AraC R w 1,5 ml pożywki 10% RPMI zawierającej 8 μg / ml polibrenu) w jednym dołku sześciodołkowej płytki. Przygotuj cztery studzienki do transdukcji z różnymi objętościami wirusów.
  4. Dodaj cztery różne objętości (na przykład 1 μl, 1,5 μl, 2 μl i 2,5 μl) 100x wirusów.
  5. Przeprowadzić dezynfekcję przez odwirowanie płytki o sile 920 x g przez 90 minut w temperaturze 37 °C.
  6. Po 72 godzinach zmierz procentową zawartość komórek GFP+ za pomocą cytometrii przepływowej.
  7. Określ objętość wirusów, aby uzyskać 30% wydajność transdukcji. Ta niska wydajność transdukcji ma zapewnić pojedynczą integrację shRNA na komórkę.

4. Transdukcja zbiorczej epigenetycznej biblioteki shRNA w lekoopornej linii komórkowej

  1. Utrzymuj docelową linię komórkową MV4-11 AraC R na poziomie 0,5 x 106 komórek/ml. Upewnij się, że komórki znajdują się w fazie wzrostu wykładniczego w hodowli.
  2. Oblicz liczbę komórek, które mają zostać pobrane do eksperymentu, jak poniżej, w oparciu o liczbę integrantów wirusowych.
    Liczba komórek potrzebnych do transdukcji = 5,485 (liczba shRNA) × 500 (reprezentacja składana shRNA) / 0,25 (MOI) = 10,982,000 ~11 x 106 komórek
  3. Ponownie zawieś 1,1 x 107 komórek w 16 ml pożywki 10% RPMI.
  4. Dodaj polybrene (8 μg/ml) i dobrze wymieszaj. Następnie dodaj wymaganą objętość wirusów, aby uzyskać 30% wydajności transdukcji, jak obliczono w poprzedniej sekcji.
  5. Zasiej wszystkie komórki na sześciodołkowej płytce o gęstości 1 x 106 komórek/1,5 ml 10% pożywki RPMI na dołek.
  6. Odwirowywać płytkę przez 90 minut w temperaturze 920 x g w temperaturze 37 °C.
  7. Inkubować płytkę przez noc w inkubatorze CO2 (5 % CO2 w temperaturze 37 °C).
  8. Po 24 godzinach zmienić pożywkę i przenieść transdukowane komórki do kolby T-75.
  9. Po 48 godzinach sprawdź GFP pod mikroskopem fluorescencyjnym, aby upewnić się, że transdukcja przebiega pomyślnie.
  10. Po 72 godzinach określić ilościowo procent komórek GFP+ za pomocą cytometrii przepływowej.

5. Wzbogacenie komórek GFP dodatnich

UWAGA: Rozszerz transdukowane komórki, hodując je w gęstości 0,5 x 106 komórek/ml przez 5-7 dni. Komórki te są mieszaną populacją transdukowanych i nietransdukowanych, wybranych na podstawie GFP przez sortowanie, jak wspomniano w następnym kroku.

  1. Przeprowadzanie sortowania przepływowego komórek transdukcyjnych GFP+ z ustawieniami sortowania przepływowego ustawionymi na wysoką czystość i niską wydajność. Użyj nietransdukowanych komórek, aby ustawić bramę. Populacja znajdująca się poza 1 x 102 w kierunku prawej jest uważana za populację dodatnią.
  2. Zbierz posortowane komórki w 5% RPMI (RPMI z 5% FBS uzupełnione 100 U/ml penicyliny i 100 U/ml streptomycyny).
  3. Hoduj posortowane komórki w pożywce 10% RPMI.
  4. Po 72 godzinach należy przeprowadzić oszacowanie procentowej zawartości komórek GFP+ po sortowaniu, aby zapewnić >95% wydajność sortowania.
    UWAGA: Upewnij się, że po sortowaniu uzyskałeś ~3-5 x 10>6 komórek dodatnich GFP, aby uzyskać 450x do ~500x reprezentację biblioteki shRNA.

6. Badania przesiewowe w celu zidentyfikowania czynników epigenetycznych pośredniczących w oporności na leki

  1. Hodowla komórek transdukowanych w bibliotece shRNA w 10% RPMI przez okres do 5 dni. Kriokonserwować transdukowane komórki do przyszłych eksperymentów, jeśli jest to wymagane, przed leczeniem farmakologicznym.
  2. Odwirować 1 x 107 komórek w dwóch egzemplarzach przy 280 x g przez 5 minut w temperaturze 25 °C. Odrzucić supernatant i przechowywać granulki w temperaturze -80 °C. Próbki te posłużą jako podstawowe odniesienie dla epigenetycznej biblioteki shRNA.
  3. Hoduj pozostałe transdukowane komórki jako duplikaty (R1 i R2), z których każda jest utrzymywana w liczbie komórek, która zapewnia 500-krotną reprezentację biblioteki.
  4. Jeden z duplikatów należy leczyć lekiem (cytarabina 10 μM) (R2), a drugi bez leczenia farmakologicznego (R1).
  5. Zmieniaj podłoże do kolb z lekiem i bez niego co 72 godziny. Powtarzaj zmianę pożywki 3 razy, aby uzyskać łączną ekspozycję na lek wynoszącą 9 dni.
  6. Po 9 dniach leczenia farmakologicznego należy sprawdzić żywotność komórek metodą wykluczania błękitu trypanowego.
  7. Odwirować pozostałe komórki przy 280 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Ponownie zawiesić komórki w sterylnym PBS i umyć komórki. Wirować przy 280 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  8. Odrzucić supernatant i przechowywać granulki w temperaturze -80 °C w celu ekstrakcji DNA.

7. Amplifikacja zintegrowanych shRNA metodą PCR

  1. Wyodrębnić DNA z transdukowanych komórek wyjściowych (T) (krok 6.2.) oraz komórek leczonych lekiem (R2) i nieleczonych lekiem (R1).
  2. Sprawdź stężenie próbki za pomocą fluorometru.
  3. Oblicz ilość DNA wymaganą do PCR, jak poniżej:
    5 485 (liczba shRNA) × 500 (reprezentacja shRNA) × 1 x 6,6−12 (g/diploidalny genom) = 15 μg DNA
  4. Próbki należy poddać pierwszej rundzie PCR.
    UWAGA: Mieszanina reakcyjna PCR jest przedstawiona w tabeli 2 wraz z warunkami termocyklera. Szczegółowe informacje na temat starterów znajdują się w tabeli uzupełniającej 1.
  5. Ustaw wiele reakcji zawierających 850 ng DNA w probówce (w sumie 43 reakcje).
    UWAGA: Pierwsza runda PCR amplifikuje boczne regiony shRNA, co daje amplikon o wielkości 397 pz.
  6. Połącz produkty PCR i oczyść produkty PCR za pomocą 3-4 kolumn standardowego zestawu do oczyszczania żelu/PCR.
    UWAGA: Szczegółowe informacje znajdują się w tabeli 3.
  7. Eluować produkt w 50 μl buforu z każdej kolumny i połączyć eluowane.
  8. Określić ilościowo DNA i przechowywać je w temperaturze -20 °C.
    UWAGA: Odczynniki są zestawione w tabeli 4 z warunkami termocyklera. Druga runda PCR wykorzystuje startery z sekwencją INDEX wymaganą do multipleksowania w NGS w komórce jednoprzepływowej. Dlatego każda próbka powinna być oznaczona innym indeksem. Sekwencje starterów przedstawiono w tabeli uzupełniającej 1.
  9. Ustawić cztery reakcje z 500 ng pierwotnego produktu PCR w całkowitej objętości reakcji 50 μl dla każdej próbki i kontroli ujemnej.
  10. Załaduj cały produkt do elektroforezy za pomocą 2% żelu agarozowego KZM i potwierdź rozmiar pasma za pomocą drabinki molekularnej 1 kb. Wielkość amplikonu wynosi 399 pz.
  11. Wizualizacja produktów PCR w systemie dokumentacji żelu.
  12. Wyciąć określoną opaskę i oczyścić za pomocą zestawu do oczyszczania żelu.
    UWAGA: Obliczenia dotyczące oczyszczania za pomocą zestawu znajdują się w tabeli 3.
  13. Eluować w końcowej objętości 30 μl buforu elucyjnego. Przybliżone stężenie każdego eluentu wyniesie około 80-90 ng/μl przy całkowitej objętości 30 μl.

8. Sekwencjonowanie nowej generacji i analiza danych

  1. Sekwencjonuj produkt oczyszczony żelem z kroku 7.13 na sekwenatorze nowej generacji (np. Illumina), aby uzyskać liczbę odczytów dla zubożonych shRNA.
  2. Przytnij sekwencje adapterów wygenerowanych odczytów FastQ za pomocą zestawu narzędzi Fastx (wersja 0.7).
  3. Dopasuj filtrowane odczyty do sekwencji referencyjnych za pomocą wyrównywacza Bowtie z parametrem zezwalającym na dwie niezgodności. Upewnij się, że długość odczytu po przycięciu adaptera wynosi około 21 pz.
  4. Załaduj pliki za pomocą programu Samtools (wersja 1.9). Użyj opcji Flagstat i oblicz podsumowanie wyrównania.
  5. Załaduj przycięte pliki fastQ do oprogramowania CRISPRCloud2 (CC2) (https://crispr.nrihub.org/) wraz z referencyjnymi sekwencjami shRNA w postaci plików FASTA i wykonaj analizę zgodnie z instrukcjami.
    1. Kliknij łącze Rozpocznij analizę w CC2.
    2. Wybierz typ ekranu jako ekrany przetrwania i rezygnacji. Ustaw liczbę grup i wpisz nazwę każdej grupy.
    3. Prześlij bibliotekę referencyjną w formacie pliku FASTA. Przesłane dane są przetwarzane. Kliknij wyjściowy adres URL, aby uzyskać wyniki.
      UWAGA: To oprogramowanie wykorzystuje model dwumianowy beta ze zmodyfikowanym testem t Studenta do pomiaru różnic w poziomach sgRNA/shRNA, a następnie połączonym testem prawdopodobieństwa Fishera w celu oszacowania znaczenia na poziomie genu. Oblicza szacowane ogólne logarytmiczne2-krotne zmiany (Log2Fc) shRNA dla czynników epigenetycznych między próbkami poddanymi działaniu substancji (wzbogaconymi/zubożonymi) a niepoddanymi działaniu substancji (linia wyjściowa) z "wartościami p" i "wartościami FDR".
  6. Upewnij się, że wartość FDR jest "Ujemna" dla ekranu Dropout i "Positive" dla ekranu Survival.
    UWAGA: CC2 to platforma analityczna do zliczania odczytów i obliczania reprezentacji fałdowania (wzbogacenia lub zubożenia) shRNA między próbkami.
  7. Zidentyfikuj znacznie wzbogacone i zubożone shRNA (FDR <0,05) na podstawie wyników CC2.
    UWAGA: Przeciwko każdemu czynnikowi występuje 5-24 shRNA. Sprawdź wartości FDR dla każdego z shRNA; rozważ FDR, który wynosi <0,01, i weź średnią dla wybranych shRNA. Weźmy pod uwagę 40 najpopularniejszych hitów. Narysuj wykres dla wybranych czynników na podstawie wartości ujemnych Log2Fc lub FDR. Upewnij się, że niedocelowe shRNA mają również znaczące wartości FDR, aby zapewnić autentyczność danych, ponieważ służą one jako kontrolne shRNA.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Ogólny schemat procesu przesiewowego przedstawiono na Rysunku 1A. Badanie cytotoksyczności in vitro komórek MV4-11 AraC R (48 h) wykazało, że wartość IC50 dla cytarabiny w linii MV4-11 AraC R jest wyższa niż w linii MV4-11 P (Rysunek 1B). Linia komórkowa ta została wykorzystana w badaniu jako model do przesiewowego wyznaczania czynników epigenetycznych odpowiedzialnych za oporność na cytarabinę.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Interferencja RNA (RNAi) jest szeroko stosowana w badaniach genomiki funkcjonalnej, które obejmują badania przesiewowe siRNA i shRNA. Zaletą shRNA jest to, że mogą być włączane do wektorów plazmidowych i integrowane z genomowym DNA, co skutkuje stabilną ekspresją, a tym samym dłuższym knockdownem docelowego mRNA. Badanie przesiewowe w zbiorczej bibliotece shRNA jest solidne i opłacalne w porównaniu z konwencjonalnymi ekranami macierzowymi (siRNA). Identyfikacja istotności określonej klasy białek w badaniu przesiewowym ca...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają konfliktu interesów i nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

To badanie jest częściowo finansowane przez grant Departamentu Biotechnologii BT/PR8742/AGR/36/773/2013 dla SRV; oraz Departament Biotechnologii Indie BT/COE/34/SP13432/2015 oraz Departament Nauki i Technologii, Indie: EMR/2017/003880 do P.B. RVS i P.B. są wspierane przez Wellcome DBT India Alliance IA/S/17/1/503118 i IA/S/15/1/501842, odpowiednio. S.D. jest wspierany przez stypendium CSIR-UGC, a S.I. jest wspierany przez stypendium ICMR Senior Research Fellowship. Dziękujemy Abhirupowi Bagchi, Sandyi Rani i personelowi CSCR Flow Cytometry Core Facility za ich pomoc. Dziękujemy również firmie MedGenome Inc. za pomoc w wysokoprzepustowym sekwencjonowaniu i analizie danych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Reodczynniki
100 bp Drabinka Hyper LadderBIOLINEBIO-33025
1kb Drabinka Hyper LadderBIOLINEBIO-33056
AgarozaLonza Seachekm50004
Betaina (5mM)SigmaB03001VL
Kwas BorowyQualigens12005
Tworzywa sztuczne do hodowli komórkowychCorningjako zastosowanie
Chlorowodorek cytozyny i beta;-D-arabinofuranosyduSigmaC1768-500MG
DMEMMP BIO
DMSOWak Chemie GMBHKriosure DMSO 10ml
EDTASigmaE5134
BromeketydynySigmaE1510-10 mL
Płodowa surowica bydlęcaThermo Fisher Scientific16000044
Gel/PCR Zestaw do oczyszczaniaMACHEREY-NAGELREF  740609.50
Gibco- RPMI 1640Thermo Fisher Scientific23400021
Lodowaty kwas octowyThermoQ11007
hCMV GFPTransomicsTransomics Wybór promotora ZESTAW
hEF1a GFPlasmidTransomicsWybór
HEK 293TATCCCRL-11268
Linia komórkowa HL60ATCCCCL-240
KOD Hot Start PolimerazaMerck71086
Molm13 Linia komórkowaEllen Weisberg Lab, Dana Farber Cancer Institute, Boston, MA, USADana Farber Cancer Institute, Boston, MA, USA
Linia komórkowa MV4-11ATCCCRL-9591
Penicylina streptomycynaThermo Fisher Scientific
psPAX2 i pMD2.GPlazmid AddgeneAddgene nr 12260 i Addgene plazmid nr 12259
Zestaw testowy Qubit dsDNA HSInvitrogenREF Q32854
SFFV  GFP PlasmidTransomicsWybór promotora TransOmics KIT
shERWOOD-UltrmiR shRNA Biblioteka od TransomicsTransomics TransomicsNr kat. TLH UD7409; Część nr: A116. V 132.14
Trans-IT-LTI MirusMirusMirus Numer katalogowy: MIR2300
TrisMP Biomedicals0219485591
Probówki Trypan BlueSigma-AldrichT8154-100ML
UltraBeckman Coulter  103319
Equipments
5% CO2 inkubatorThermo Fisher
BD Aria III sorter komórekBecton Dickinson
Beckman Coulter Optima L-100K- UltrawirówkaRedlica
WirówkaThermo Multiguge 3SR+
System obrazowania ChemiDoc ( System Fluro Chem M)Fluro Chem
Leica AF600świetlny Leica
Zeiss Axiovert 40c
NanodropThermo Scientific
Qubit 3.0 FluorometrInvitrogen
Thermal CyclerBioRad
91233354 promotora ZESTAW15140122Beckman Mikroskop

Bibliografia

  1. Döhner, H., Weisdorf, D. J., Bloomfield, C. D. Acute myeloid leukemia. The New England Journal of Medicine. 373 (12), 1136-1152 (2015).
  2. De Kouchkovsky, I., Abdul-Hay, M. Acute myeloid leukemia: A comprehensive review and 2016 update. Blood Cancer Journal. 6 (7), 441(2016).
  3. Zuber, J., et al. RNAi screen identifies Brd4 as a therapeutic target in acute myeloid leukaemia. Nature. 478 (7370), 524-528 (2011).
  4. Shi, J., et al. The Polycomb complex PRC2 supports aberrant self-renewal in a mouse model of MLL-AF9;NrasG12D acute myeloid leukemia. Oncogene. 32 (7), 930-938 (2013).
  5. Chen, C. -W., et al. DOT1L inhibits SIRT1-mediated epigenetic silencing to maintain leukemic gene expression in MLL-rearranged leukemia. Nature Medicine. 21 (4), 335-343 (2015).
  6. Li, F., et al. In vivo epigenetic CRISPR screen identifies Asf1a as an immunotherapeutic target in Kras-mutant lung adenocarcinoma. Cancer Discovery. 10 (2), 270-287 (2020).
  7. Balch, C., Huang, T. H. -M., Brown, R., Nephew, K. P. The epigenetics of ovarian cancer drug resistance and resensitization. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 191 (5), 1552-1572 (2004).
  8. Carnero, A. High throughput screening in drug discovery. Clinical and Translational Oncology. 8 (7), 482-490 (2006).
  9. Lal-Nag, M., et al. A high-throughput screening model of the tumor microenvironment for ovarian cancer cell growth. SLAS Discovery: Advancing Life Sciences R & D. 22 (5), 494-506 (2017).
  10. O'Neil, N. J., Bailey, M. L., Hieter, P. Synthetic lethality and cancer. Nature Reviews Genetics. 18 (10), 613-623 (2017).
  11. Hoffman, G. R., et al. Functional epigenetics approach identifies BRM/SMARCA2 as a critical synthetic lethal target in BRG1-deficient cancers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (8), 3128-3133 (2014).
  12. Fellmann, C., et al. An optimized microRNA backbone for effective single-copy RNAi. Cell Reports. 5 (6), 1704-1713 (2013).
  13. Knott, S. R. V., et al. A computational algorithm to predict shRNA potency. Molecular Cell. 56 (6), 796-807 (2014).
  14. Papaemmanuil, E., et al. Genomic classification and prognosis in acute myeloid leukemia. New England Journal of Medicine. 374 (23), 2209-2221 (2016).
  15. Vidal, S. J., Rodriguez-Bravo, V., Galsky, M., Cordon-Cardo, C., Domingo-Domenech, J. Targeting cancer stem cells to suppress acquired chemotherapy resistance. Oncogene. 33 (36), 4451-4463 (2014).
  16. Evers, B., et al. CRISPR knockout screening outperforms shRNA and CRISPRi in identifying essential genes. Nature Biotechnology. 34 (6), 631-633 (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Modulatory epigenetyczneoporno na cytarabinostra bia aczka szpikowatransdukcja lentiwirusowacytometria przep ywowaprzesiewowa selekcja negatywnasekwencjonowanie nast pnej generacjiwyciszanie gen w

Powiązane artykuły