Wysokoprzepustowe badania przesiewowe RNA (RNAi) z wykorzystaniem puli lentiwirusowych shRNA mogą być narzędziem do wykrywania terapeutycznie istotnych syntetycznych celów śmiertelnych w nowotworach złośliwych. Zapewniamy zbiorcze podejście do badań przesiewowych shRNA w celu zbadania efektorów epigenetycznych w ostrej białaczce szpikowej (AML).
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Zbiorcze badania przesiewowe biblioteki shRNA w celu identyfikacji czynników modulujących fenotyp oporności na leki
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Zrozumienie klinicznie istotnych mechanizmów napędzających nabytą chemooporność jest kluczowe dla wyjaśnienia sposobów obejścia oporu i poprawy przeżywalności u pacjentów z ostrą białaczką szpikową (AML). Niewielka część komórek białaczkowych, które przeżywają chemioterapię, ma stabilny stan epigenetyczny, aby tolerować zniewagi chemioterapeutyczne. Dalsza ekspozycja na chemioterapię pozwala tym komórkom utrwalonym na lek osiągnąć stały stan epigenetyczny, co prowadzi do zmienionej ekspresji genów, co skutkuje proliferacją tych opornych na leki populacji i ostatecznie nawrotem choroby lub opornością na leczenie. Dlatego identyfikacja modulacji epigenetycznych, które wymagają przeżycia lekoopornych komórek białaczkowych, ma kluczowe znaczenie. Szczegółowo opisujemy protokół identyfikacji modulatorów epigenetycznych, które pośredniczą w oporności na analog nukleozydu cytarabiny (AraC) przy użyciu połączonych badań przesiewowych biblioteki shRNA w nabytej linii komórkowej AML opornej na cytarabinę. Biblioteka składa się z 5 485 konstruktów shRNA ukierunkowanych na 407 ludzkich czynników epigenetycznych, co umożliwia wysokoprzepustowe badania przesiewowe czynników epigenetycznych.
Wprowadzenie
Opcje terapeutyczne w ostrej białaczce szpikowej (AML) pozostały niezmienione przez prawie pięć ostatnich dekad, z cytarabiną (AraC) i antracyklinami jako podstawą leczenia choroby. Jednym z wyzwań dla powodzenia terapii AML jest oporność białaczkowych komórek macierzystych na chemioterapię, prowadząca do nawrotu choroby1,2. Regulacja epigenetyczna odgrywa istotną rolę w patogenezie nowotworów i oporności na leki, a kilka czynników epigenetycznych okazało się obiecującymi celami terapeutycznymi3,4,5. Epigenetyczne mec....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Postępuj zgodnie z wytycznymi Instytucjonalnego Komitetu Bezpieczeństwa Biologicznego (IBSC) i użyj odpowiedniego urządzenia do obsługi lentiwirusa (BSL-2). Personel powinien być odpowiednio przeszkolony w zakresie obchodzenia się z lentiwirusem i jego usuwania. Protokół ten jest zgodny z wytycznymi dotyczącymi bezpieczeństwa biologicznego Christian Medical College w Vellore.
1. Wybór najsilniejszego promotora w celu uzyskania trwałej i przedłużonej ekspresji shRNA
UWAGA: Niezbędne jest przeprowadzenie eksperymentu transdukcji przy użyciu wektorów lentiwirusowych z różnymi promotorami wyrażającymi ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Ogólny schemat procesu przesiewowego przedstawiono na Rycina 1A. In vitro cytotoksyczność MV4-11 AraC R (48 h) wykazała, że IC50 dla cytarabiny w komórkach MV4-11 AraC R jest wyższa niż w MV4-11 P (Rysunek 1B). Linię komórkową tę wykorzystano w badaniu jako model do przesiewowego wyznaczania czynników epigenetycznych odpowiedzialnych za oporność na cytarabinę.
Rysunek 2A przedsta.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Interferencja RNA (RNAi) jest szeroko stosowana w badaniach genomiki funkcjonalnej, które obejmują badania przesiewowe siRNA i shRNA. Zaletą shRNA jest to, że mogą być włączane do wektorów plazmidowych i integrowane z genomowym DNA, co skutkuje stabilną ekspresją, a tym samym dłuższym knockdownem docelowego mRNA. Badanie przesiewowe w zbiorczej bibliotece shRNA jest solidne i opłacalne w porównaniu z konwencjonalnymi ekranami macierzowymi (siRNA). Identyfikacja istotności określonej klasy białek w badaniu przesiewowym ca.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają konfliktu interesów i nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
To badanie jest częściowo finansowane przez grant Departamentu Biotechnologii BT/PR8742/AGR/36/773/2013 dla SRV; oraz Departament Biotechnologii Indie BT/COE/34/SP13432/2015 oraz Departament Nauki i Technologii, Indie: EMR/2017/003880 do P.B. RVS i P.B. są wspierane przez Wellcome DBT India Alliance IA/S/17/1/503118 i IA/S/15/1/501842, odpowiednio. S.D. jest wspierany przez stypendium CSIR-UGC, a S.I. jest wspierany przez stypendium ICMR Senior Research Fellowship. Dziękujemy Abhirupowi Bagchi, Sandyi Rani i personelowi CSCR Flow Cytometry Core Facility za ich pomoc. Dziękujemy również firmie MedGenome Inc. za pomoc w wysokoprzepustowym sekwencjonowaniu i analizie da....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Reodczynniki | |||
| 100 bp Drabinka Hyper Ladder | BIOLINE | BIO-33025 | |
| 1kb Drabinka Hyper Ladder | BIOLINE | BIO-33056 | |
| Agaroza | Lonza Seachekm | 50004 | |
| Betaina (5mM) | Sigma | B03001VL | |
| Kwas Borowy | Qualigens | 12005 | |
| Tworzywa sztuczne do hodowli komórkowych | Corning | jako zastosowanie | |
| Chlorowodorek cytozyny i beta;-D-arabinofuranosydu | Sigma | C1768-500MG | |
| DMEM | MP BIO | ||
| DMSO | Wak Chemie GMBH | Kriosure DMSO 10ml | |
| EDTA | Sigma | E5134 | |
| Bromek | etydynySigma | E1510-10 mL | |
| Płodowa surowica bydlęca | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | |
| Gel/PCR Zestaw do oczyszczania | MACHEREY-NAGEL | REF 740609.50 | |
| Gibco- RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 23400021 | |
| Lodowaty kwas octowy | Thermo | Q11007 | |
| hCMV GFP | Transomics | Transomics Wybór promotora ZESTAW | |
| hEF1a GFPlasmid | Transomics | Wybór | |
| HEK 293T | ATCC | CRL-11268 | |
| Linia komórkowa HL60 | ATCC | CCL-240 | |
| KOD Hot Start Polimeraza | Merck | 71086 | |
| Molm13 Linia komórkowa | Ellen Weisberg Lab, Dana Farber Cancer Institute, Boston, MA, USA | Dana Farber Cancer Institute, Boston, MA, USA | |
| Linia komórkowa MV4-11 | ATCC | CRL-9591 | |
| Penicylina streptomycyna | Thermo Fisher Scientific | ||
| psPAX2 i pMD2.G | Plazmid Addgene | Addgene nr 12260 i Addgene plazmid nr 12259 | |
| Zestaw testowy Qubit dsDNA HS | Invitrogen | REF Q32854 | |
| SFFV GFP Plasmid | Transomics | Wybór promotora TransOmics KIT | |
| shERWOOD-UltrmiR shRNA Biblioteka od Transomics | Transomics Transomics | Nr kat. TLH UD7409; Część nr: A116. V 132.14 | |
| Trans-IT-LTI Mirus | Mirus | Mirus Numer katalogowy: MIR2300 | |
| Tris | MP Biomedicals | 0219485591 | |
| Probówki Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154-100ML | |
| Ultra | Beckman Coulter | 103319 | |
| Equipments | |||
| 5% CO2 inkubator | Thermo Fisher | ||
| BD Aria III sorter komórek | Becton Dickinson | ||
| Beckman Coulter Optima L-100K- Ultrawirówka | Redlica | ||
| Wirówka | Thermo Multiguge 3SR+ | ||
| System obrazowania ChemiDoc ( System Fluro Chem M) | Fluro Chem | ||
| Leica AF600 | świetlny Leica | ||
| Zeiss Axiovert 40c | |||
| Nanodrop | Thermo Scientific | ||
| Qubit 3.0 Fluorometr | Invitrogen | ||
| Thermal Cycler | BioRad |
Bibliografia
- Döhner, H., Weisdorf, D. J., Bloomfield, C. D. Acute myeloid leukemia. The New England Journal of Medicine. 373 (12), 1136-1152 (2015).
- De Kouchkovsky, I., Abdul-Hay, M. Acute myeloid leukemia: A comprehensive review and 2016 update. Blood Cancer Journal. 6 (7), 441(201....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
