Grawitacyjna metoda perfuzji przezsercowej do analizy histologicznej ośrodkowego układu nerwowego myszy

Podsumowanie

Prezentowana jest wygodna metoda perfuzji grawitacyjnej do analizy histologicznej ośrodkowego układu nerwowego myszy. Immunofluorescencyjne wykrywanie fosforylowanej α-synukleiny wykazano w mysim modelu choroby Parkinsona. Praca ta kompleksowo opisuje również etapy perfuzji przezsercowej, rozwarstwienia, zamrażania/osadzania tkanek i zamrażania sekcji.

Streszczenie

Analiza histologiczna próbek mózgu i rdzenia kręgowego wyizolowanych od myszy jest powszechną praktyką oceny patologii w tym systemie modelowym. Aby utrzymać morfologię tych delikatnych tkanek, rutynowo podaje się chemiczny utrwalacz, taki jak paraformaldehyd, poprzez kaniulację serca u znieczulonych zwierząt (perfuzja przezsercowa). Perfuzja przezsercowa serca myszy tradycyjnie opierała się na użyciu pomp perystaltycznych lub ciśnienia powietrza w celu dostarczenia zarówno roztworów soli fizjologicznej, jak i utrwalaczy niezbędnych w tym procesie. Jako łatwo dostępną alternatywę dla tych metod, praca ta demonstruje zastosowanie grawitacyjnej metody dostarczania perfuzatu, która wykorzystuje materiały dostępne w większości sklepów ze sprzętem.

Aby potwierdzić tę nową metodę perfuzji, ta praca demonstruje wszystkie kolejne kroki niezbędne do czułego wykrywania fosforylowanej α-synukleiny zarówno w mózgu, jak i rdzeniu kręgowym. Etapy te obejmują preparację nieruchomych tkanek mózgu i rdzenia kręgowego, szybkie zamrażanie/osadzanie i kriosekcję tkanek oraz barwienie immunofluorescencyjne. Ponieważ metoda ta skutkuje dostarczeniem utrwalacza do całego ciała, może być również wykorzystana do przygotowania innych tkanek nieneuronalnych do analizy histologicznej.

Wprowadzenie

Histologiczna charakterystyka patologii w ośrodkowym układzie nerwowym myszy (OUN) jest rutynową techniką stosowaną w badaniach nad neurodegeneracją. Ponieważ tkanki neuronalne szybko ulegają degradacji po śmierci, powszechną praktyką jest dostarczanie chemicznego utrwalacza, takiego jak paraformaldehyd, do tkanek OUN, aby zachować ich morfologię^1,2. Utrwalanie chemiczne można przeprowadzić albo poprzez perfuzję całego ciała roztworem utrwalającym, albo poprzez izolację tkanek i zanurzenie ich w roztworze utrwalającym (tzw. utrwalanie kroplą). Perfuzja jest preferowaną metodą dostarczania utrwalającego, ponieważ utrwalanie kropli może nie pozwolić na szybką penetrację roztworu utrwalającego do głębokich struktur OUN^3,4,5. Ponadto, ponieważ trudno jest usunąć nieutrwalony rdzeń kręgowy z kręgosłupa, podanie roztworu utrwalającego przez perfuzję pozwala na zachowanie in situ mikroskopijnej i ogólnej anatomii rdzenia kręgowego oraz usztywnia tkankę, aby zminimalizować uszkodzenia podczas usuwania.

Dostarczanie roztworów buforowych i utrwalających niezbędnych do utrwalenia jest zwykle wykonywane przy użyciu dostępnych na rynku pomp lub ciśnienia powietrza. Grawitacyjne dostarczanie perfuzatu może służyć jako alternatywa dla dostarczania pompy z następujących powodów: (1) Dostarczanie pompy lub ciśnienia powietrza może w niektórych przypadkach wymagać od użytkownika ręcznego utrzymywania ciśnienia w systemie przez cały czas perfuzji. Grawitacyjne dostarczanie perfuzatu może być utrzymane bez interwencji użytkownika. (2) Aparat do perfuzacji dostarczany grawitacyjnie może być skonstruowany przy niskich kosztach dla użytkownika, uzyskując materiały dostępne od standardowych dostawców naukowych. W tej pracy opisano, jak skonstruować proste urządzenie do perfuzji grawitacyjnej przy użyciu butelek do mycia i rurek winylowych. Wykorzystując mysi model choroby Parkinsona, praca ta demonstruje skuteczność tego systemu w perfuzji tkanek mózgu i rdzenia kręgowego przed ich izolacją w celu zamrożonego cięcia. Praca ta kompleksowo opisuje wszystkie kroki, techniki i materiały potrzebne do wypreparowania utrwalonej tkanki ze zwierzęcia, szybkiego zamrożenia/osadzenia i kriosekcji tkanki oraz wykrycia obecności fosforylowanej α-synukleiny zarówno w mózgu, jak i rdzeniu kręgowym za pomocą pośredniej mikroskopii immunofluorescencyjnej.

Protokół

Dane i kroki eksperymentalne przedstawione w tym protokole zostały wygenerowane przy użyciu myszy C57BL/6J. Wszystkie metody z udziałem zwierząt zostały zatwierdzone przez State University of New York Upstate Medical University Institutional Animal Care and Use Committee.

1. Budowa aparatu perfuzyjnego i platformy preparacyjnej

1. Jak pokazano w Rysunek 1, przytnij wewnętrzne słomki z dwóch butelek do mycia o pojemności 500 ml, przycinając je równo z wewnętrzną stroną zakręcanej nakrętki za pomocą ostrej żyletki. Wytnij kwadratowy otwór o wymiarach 4 cm x 4 cm na dnie każdej butelki buforowej. Wytnij mały otwór w dnie każdej butelki, aby umożliwić przejście wygiętej mikroszpatułki ze stali nierdzewnej.
2. Utwórz zagięcie w kształcie litery "S" w mikroszpatułkach, aby można je było wykorzystać jako haczyki do zawieszenia butelek buforowych. Włóż wygięte mikroszpatułki do odpowiednich otworów w butelkach buforowych.
3. Odetnij dwie rurki o długości 25 cm i szczelnie połącz je z zewnętrznymi wylotami słomki do butelki. Połącz końce tych rurek ze złączem Y. Wytnij 2 m rurki i połącz ją z wolnym końcem złącza Y.
4. Wyjąć tłok ze strzykawki o pojemności 1 ml i odciąć strzykawkę w odległości około 6 cm od końcówki strzykawki. Przeciąć strzykawkę, najpierw nacinając plastik żyletką, a następnie ostro trzaskając plastikową strzykawką.
5. Włożyć odciętą powierzchnię strzykawki do wolnego końca plastikowej rurki. Włożyć na wystarczającą głębokość, aby zapewnić szczelne uszczelnienie.
   UWAGA: Ważne jest, aby wszystkie połączenia w aparacie perfuzyjnym były wystarczająco szczelne, aby uniknąć wycieku. W przypadku luźnych połączeń małe zaciski do węży ze stali nierdzewnej można umieścić i dokręcić na skrzyżowaniach według potrzeb, aby w razie potrzeby zapewnić szczelne uszczelnienie.
6. Oznaczyć jedną butelkę buforową jako PFA, a jedną butelkę jako PBS (bufor). Odmierz około 1/3 długości od otworu butelki i narysuj linię wokół obwodu butelki w tym miejscu, aby oznaczyć odpowiedni poziom napełnienia roztworami perfuzatu.
7. Wyprostuj się, a następnie utwórz pętlę w dużym spinaczu do papieru, która zmieści się na obwodzie rurki. Umieść tę pętlę wokół rurki tuż proksymalnie do strzykawki.
8. Umieść blok styropianowy o odpowiedniej wielkości w szklanej tacy. Umieść końce spinacza w bloku styropianowym, aby przymocować rurkę.
9. Za pomocą ręczników papierowych podnieś przedni koniec szklanej tacy o około 2 cm.
   UWAGA: Spowoduje to ustawienie myszy w pozycji Trendelenburga pod kątem około 20° (pochylenie do tyłu), aby umożliwić łatwiejszą wizualizację przepony podczas sekcji i zachęcić do odpływu płynów podczas perfuzji.

Rysunek 1: Diagram przedstawiający zmontowany aparat perfuzyjny. Skróty: PBS = sól fizjologiczna buforowana fosforanami; PFA = paraformaldehyd. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

2. Przygotowanie roztworu paraformaldehydu (PFA)

UWAGA: Roztwór PFA musi być przygotowany świeży w dniu perfuzji i wyrzucony po zakończeniu perfuzji do wyznaczonego pojemnika na odpady przed usunięciem przez przeszkolony personel. Ten protokół wytwarza 1 l 4% roztworu PFA, co wystarcza do perfuzji około 4 myszy. PFA jest wysoce toksyczny i należy zachować ostrożność, aby uniknąć wdychania lub bezpośredniego kontaktu ze skórą w postaci sproszkowanej lub płynnej. Większość etapów przygotowawczych wykonuje się zatem w rękawicach, okularach ochronnych i fartuchu laboratoryjnym pod wyciągiem.

1. Wypłukać zlewkę o pojemności 1 l wodą destylowaną i napełnić około 800 ml 18 mΩ_H2Oklasy biologii molekularnej.
2. Podgrzewać zlewkę_H2Ow kuchence mikrofalowej przez 3 minuty lub do momentu, gdy temperatura wody osiągnie 65 °C. Umieścić na płycie grzewczej/mieszającej umieszczonej w dygestorium.
3. Opłucz mieszadło wodą destylowaną i umieść je w gorącej wodzie. Uruchom mieszadło i przekręć płytę grzejną na średni ogień. Upewnij się, że temperatura wody nie przekracza 70 °C.
4. Załóż maskę chirurgiczną, rękawice, okulary ochronne i fartuch laboratoryjny i odmierz 40 g proszku PFA. Wsyp ten proszek do podgrzanej wody.
5. Za pomocą pipety transferowej dodać kilka kropli 5 M NaOH do roztworu. Poczekaj, aż proszek PFA całkowicie się rozpuści. Jeśli proszek nie rozpuści się całkowicie po kilku minutach, w razie potrzeby dodaj krople 5 M NaOH.
6. Gdy prawie cały PFA się rozpuści (będzie wydawał się lekko mętny), przerwij mieszanie/podgrzewanie i natychmiast dodaj 100 ml 10x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS). Na koniec uzupełnić wodę do poziomu oznaczonego 1 litrem na zlewce, używając 18 mΩ_H2O, pochodzącego z biologii molekularnej. Przykryj zlewkę folią spożywczą i umieść ją w zamrażarce o temperaturze -20 °C, aż roztwór osiągnie temperaturę pokojową (około 45 min).
7. Skalibruj pH-metr przy użyciu odpowiednich wzorców. Gdy zlewka znajduje się na płytce mieszającej, zmierzyć pH roztworu i dodawać HCl, aż pH osiągnie 7,4. W razie potrzeby dodać 5 M NaOH, aby zwiększyć pH, jeśli jest zbyt niskie.
8. Podłączyć kolbę próżniową do odkurzania i umieścić w kolbie czysty ceramiczny lejek Büchnera z bibułą filtracyjną. Włącz próżnię i zwilż bibułę filtracyjną za pomocą pipety transferowej wypełnionej 4% roztworem PFA.
9. Powoli wylewaj 4% roztwór PFA na bibułę filtracyjną, aż cały roztwór zostanie przefiltrowany.
10. Przefiltrowany roztwór przenieść do czystego, zabezpieczonego przed światłem pojemnika i przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu użycia (przechowywać nie dłużej niż 24 godziny).

3. Perfuzja przezsercowa "bez pompy"

1. W dygestorii umieść styropianowy klocek preparacyjny w szklanej tacy. Upewnij się, że blok preparacyjny ma 5-6 krótkich igieł do przytrzymywania myszy podczas operacji i 2 długie igły do podtrzymywania rurki perfuzyjnej.
2. Przepłukać aparat perfuzyjny wodą destylowaną. Pozwól, aby cała woda spłynęła przed zawieszeniem aparatu perfuzyjnego. Zawieś butelki perfuzyjne 1 m nad zwierzęciem, któremu podano perfuzję (dla myszy o wadze 20-30 g).
3. Przygotować niesterylny roztwór 1x PBS przy użyciu 10x PBS rozcieńczony 18 mΩ_H2Oklasy biologii molekularnej.
4. Jak pokazano na rysunku Rysunek 2, zaciśnij główną linię aparatu perfuzyjnego za pomocą hemostatu. Zacisnąć linię PFA z innym hemostatem.
   UWAGA: Okluzja z wieloma hemostatami może być konieczna na linię, aby całkowicie zapobiec przepływowi.
5. Napełnij pojemnik buforowy 1x PBS w temperaturze pokojowej.
6. Umieść końcówkę strzykawki aparatu perfuzyjnego w zlewce, aby zebrać bufor odpadów i usunąć hemostat zamykający główną linię (Rysunek 2, po lewej).
7. Pozwól PBS przepływać przez linię, jednocześnie usuwając uwięzione powietrze, energicznie stukając w ścianki rury.
8. Gdy całe powietrze zostanie usunięte z bufora i linii głównych, należy zatkać przepływ, umieszczając hemostat na linii głównej.
9. Usuń hemostat z linii PFA i pozwól PBS płynąć w sposób wsteczny do butelki PFA, jednocześnie wystukując wszelkie pęcherzyki w linii PFA (Rysunek 2, środek). Kontynuuj wpuszczanie PBS do linii PFA, aż PBS będzie widoczny tuż nad otworem butelki. Zatkaj linię PFA hemostatem, aby zatrzymać przepływ do butelki PFA.
10. Podłączyć igłę do infuzji motylkowej do strzykawki perfuzyjnej i przepłukać PBS przez linię (otwierając hemostat z głównej linii) w celu usunięcia pęcherzyków ze strzykawki perfuzyjnej. Zamknij hemostat z głównej linii.
11. Upewnij się, że butelka PBS jest teraz wypełniona w około 1/3 PBS. W razie potrzeby przepłucz PBS przez główną linię lub wlej więcej PBS do butelki buforowej do 1/3 pełnej pojemności.
Po usunięciu wszystkich pęcherzyków z PBS, PFA i głównych linii, napełnij butelkę PFA 4% roztworem PFA w temperaturze pokojowej do czarnego znaku na butelce (około 1/3 napełnienia) (Rysunek 2, po prawej).

Rysunek 2: Przygotowanie aparatu perfuzyjnego do operacji perfuzji. Najpierw zamknij hemostat linii PFA i otwórz hemostat na linii PBS i linii głównej. Napełnij PBS i usuń bąbelki z linii PBS i linii głównej. Następnie napełnij linię PFA PBS, otwierając hemostat na linii PFA i zamykając hemostat na linii głównej. Usuń bąbelki w linii PFA. Na koniec zamknij hemostat na linii PFA, gdy PBS dotrze do otworu butelki PFA. Napełnij butelkę PFA w 1/^{3 PFA}. Upewnij się, że poziom PBS w butelce PBS^{jest napełniony} w 1/3 i albo napełnij PBS, albo opróżnij PBS, otwierając hemostat głównej linii, jeśli to konieczne. Skróty: PBS = sól fizjologiczna buforowana fosforanami; PFA = paraformaldehyd. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

13. Przygotuj się do operacji nieprzeżywalnej, czyszcząc następujące narzędzia wodą, a następnie 70% etanolem: duże nożyczki, drobne nożyczki preparacyjne, kleszcze do skóry, cienkie zakrzywione kleszcze z okienkami.
14. Przygotuj znieczulenie, umieszczając chusteczki bezpyłowe w stożkowej probówce o pojemności 50 ml. W dygestorium dokładnie nasącz chusteczki bezpyłowe izofluranem i umieść otwartą probówkę do góry nogami w zlewce o pojemności 500 ml. Upewnij się, że na dnie zlewki nie ma ciekłego izofluranu i wyrzuć płynny izofluran przed umieszczeniem myszy w zlewce.
15. Umieść mysz w zlewce i umieść plastikową folię na otworze, aby rozpocząć znieczulenie.
16. Podawaj znieczulenie, aż mysz przestanie oddychać (około 1 min i 30 s).
17. Po ustaniu oddychania natychmiast wyjmij mysz ze zlewki i załóż nakrętkę na stożkową rurkę o pojemności 50 ml.
18. Sprawdź, czy mysz jest wystarczająco znieczulona, używając odruchu szczypania palców u stóp. Jeśli zwierzę nie jest wystarczająco znieczulone, należy podać więcej izofluranu zgodnie z opisem w kroku 3.15.
19. Pracując szybko, umieść mysz na bloku styropianowym i przypnij łapy na zewnątrz za pomocą czterech krótkich igieł (np. igieł strzykawkowych 22 G).
20. Unosząc skórę brzucha za pomocą kleszczy do skóry, użyj dużych nożyczek, aby przeciąć ścianę brzucha. Upewnij się, że żadne narządy jamy brzusznej nie zostały przecięte!
21. Kontynuuj cięcie brzucha w kierunku wątroby. Odłącz wątrobę od przedniej ściany brzucha i kontynuuj początkowe nacięcie górnie w kierunku przepony. Zatrzymaj to nacięcie około 1 cm poniżej membrany. Uważaj, aby wątroba nie została przecięta!
22. Kontynuuj początkowe nacięcie bocznie w górę w kierunku prawej i lewej strony membrany, aby wykonać nacięcie w kształcie litery "Y" (Rysunek 3A).
23. Gdy nacięcie dotrze do przepony, wykonaj otwór w przeponie za pomocą cienkich nożyczek preparacyjnych i przetnij żebra po prawej stronie zwierzęcia. Przetnij żeberka mniej więcej do połowy prawej pachy.
24. Wykonaj podobne, ale dłuższe nacięcie po lewej stronie przepony prawie aż do lewej pachy.
25. Odbij ścianę klatki piersiowej i przypnij ją do bloku styropianowego.
26. W razie potrzeby wypreparuj tłuszcz z okolic serca, aby odsłonić lewą komorę. Zidentyfikuj lewą komorę na podstawie stosunkowo jaśniejszego koloru w porównaniu z prawą komorą.
27. Po zidentyfikowaniu lewej komory przytrzymaj serce stabilnie, lekko uciskając cienkimi zakrzywionymi kleszczami. Otworzyć hemostat z głównej linii, aby umożliwić PBS przepływ przez igłę. Natychmiast przekłuć lewą komorę i upewnić się, że igła została wprowadzona nie dalej niż 0,5 cm do komory. W razie potrzeby lekko wyjąć igłę.
    UWAGA: Dokładne umieszczenie igły w lewej komorze jest wskazane przez wsteczny przepływ krwi do rurki igły. Ważne jest, aby upewnić się, że igła nie jest zbyt głęboko włożona do komory. Może to spowodować wsteczny przepływ przez żyły płucne lub przebicie przegrody międzykomorowej.
28. Oprzyj rurkę motylkową na osi X wykonanej ze styropianu za pomocą dwóch dużych igieł 18 G.
    UWAGA: Ma to kluczowe znaczenie, ponieważ pozwoli uniknąć ruchu igły motylkowej w sercu podczas perfuzji.
29. Zidentyfikuj żyłę główną dolną wychodzącą z wątroby i przeciąć ją za pomocą cienkich nożyczek preparacyjnych (Ryc. 3B). Alternatywnie otwórz prawe przedsionek nożyczkami.
30. Natychmiast otwórz główną linię, aby umożliwić rozpoczęcie perfuzji PBS ( Rysunek 3C).
31. Upewnij się, że PBS spływa z bloku styropianowego do szklanej tacy poniżej. Jeśli tak się nie stanie, wyreguluj kąt tacki lub bloku styrofoakowego, aby umożliwić spływanie płynów do szklanej tacy.
32. Kontynuuj perfuzję PBS, aż płyn wypływający z żyły głównej dolnej będzie wolny od krwi (około 3 min).
    UWAGA: Właściwe umieszczenie igły w sercu spowoduje wizualne usunięcie krwi z wątroby, która zmieni kolor z czerwonego na słomkowy. Jeśli tak się nie stanie, można temu zaradzić, umieszczając igłę infuzyjną w lewej komorze. Można wykonać małe nacięcie w brzusznej podstawie ogona, aby ocenić jakość perfuzji. Właściwa perfuzja spowoduje wypłynięcie czystego PBS z nacięcia podstawy ogona.
33. Pracując szybko, zamknij linię PBS za pomocą hemostatu i otwórz linię PFA.
34. Pozwól PFA perfować przez kilka minut, aż ogon zacznie się zwijać. Gdy ogon zacznie się zwijać, rozpocznij 50-minutowy timer. Jeśli ogon nie zwija się po 5 minutach perfuzji PFA, rozpocznij 50-minutowy odliczacz perfuzji PFA.
35. Monitoruj poziom PFA w butelce w sposób ciągły przez cały czas perfuzji, aby upewnić się, że poziom nie spadnie zbyt nisko. Napełnij więcej PFA w butelce, jeśli poziom spadnie poniżej 2 cm powyżej pokrywki butelki.

Rysunek 3: Diagram przedstawiający perfuzję przezsercową. (A) Najpierw przecina się ścianę brzucha, a następnie wykonuje się dwa boczne nacięcia skierowane w stronę pachy, tworząc literę "Y". (B) Po wejściu do klatki piersiowej i odsłonięciu serca, igła jest wprowadzana do lewej komory. Następnie przechodzi się przez IVC lub prawe przedsionek, aby umożliwić drenaż perfuzatów po ich krążeniu w ciele. IVC jest cięty wyżej niż membrana. (C) Procedura podawania perfuzatów. Skrót = IVC = żyła główna dolna. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

35. Po upływie 50 minut należy zatkać linię główną hemostatem i wyjąć igłę z lewej komory.
    UWAGA: W tym momencie cała mysz jest sztywna i można ją teraz umieścić w oznaczonym pojemniku z 4% PFA na noc w temperaturze 4 °C. Na tym etapie możliwe jest wypreparowanie tkanek OUN i umieszczenie ich pojedynczo w utrwalaczu na noc. W tej pracy cała mysz jest umieszczana w utrwalaczu, ponieważ skraca to odstęp między utrwaleniem a umieszczeniem w temperaturze 4 °C. Pozwala to również uniknąć wszelkich możliwych mechanicznych zniekształceń tkanki nerwowej, które mogą wystąpić, jeśli zwierzęta zostaną wstępnie wypreparowane przed zakończeniem fiksacji przez noc.

4. Rozwarstwienie OUN

1. Przygotuj następujące narzędzia do sekcji, myjąc je wodą, a następnie 70% etanolem: nożyczki, kleszcze do skóry, zakrzywione kleszcze z okienkami, zakrzywione kleszcze drobnoziarniste, proste cienkie kleszcze, cienkie nożyczki.
2. Oznacz cztery probówki na mysz w następujący sposób i napełnij sterylną 20% sacharozą: ID myszy, Mózg 1, ID myszy, Mózg 2, ID myszy, Odcinek lędźwiowy, ID myszy, Szyjka macicy.
3. Wyjmij mysz z roztworu PFA i osusz ją ręcznikiem papierowym, aby usunąć nadmiar PFA.
4. Za pomocą dużych nożyczek usuń głowę myszy, przecinając szyję.
5. Umieść ciało w roztworze PFA. Zachowaj głowę, aby wypreparować mózg z czaszki.
6. Aby przeprowadzić sekcję mózgu, zacznij od odbicia skóry czaszki do przodu, aby odsłonić całą czaszkę (Ryc. 4A).
7. Wykonaj płytkie nacięcie w przewodzie słuchowym za pomocą cienkich nożyczek preparacyjnych, aby dostać się do czaszki
8. Kontynuuj to cięcie wzdłuż zatoki poprzecznej, aż czaszka zostanie przecięta aż między obydwoma kanałami słuchowymi.
9. Wykonaj cięcie prostopadłe do poprzedniego cięcia wzdłuż podłużnej szczeliny aż do najbardziej rostralnej części czaszki (mniej więcej między oczami).
10. Używając zakrzywionych kleszczy z fenestracją, odbij czaszkę na boki, aby odsłonić przodomózgowie. Kontynuuj usuwanie czaszki, aż całe przodomózgowie, w tym opuszki węchowe, zostaną odsłonięte.
11. Rozpocznij preparację okolicy ogonowej czaszki, wykonując cięcie przez kość potyliczną i powoli kontynuując to cięcie w dół w kierunku otworu wielkiego.
12. Odbij dwie części czaszki z boku, aby odsłonić móżdżek i pień mózgu doogonowo (Rysunek 4B).
13. Użyj ultracienkich zakrzywionych kleszczyków, aby oddzielić opuszki węchowe od przedniej części czaszki i zacznij odrywać mózg od podstawy czaszki, zaczynając od opuszki węchowej.
14. Gdy mózg jest odrywany od podstawy czaszki, użyj ultracienkich kleszczy, aby przeciąć nerwy czaszkowe i umożliwić usunięcie mózgu.
15. Kontynuuj odklejanie mózgu od podstawy czaszki, aż cały nienaruszony mózg zostanie usunięty (Rysunek 4C,D).
16. Przetnij mózg na pół wzdłuż podłużnej szczeliny, aby oddzielić od siebie prawą i lewą półkulę (Rysunek 4E,F).
17. Umieść jedną półkulę w rurki mózgowej 1, a drugą półkulę w rurki mózgowej 2. Rurki należy przechowywać w temperaturze 4 °C, aż półkule mózgowe opadną (mniej więcej na noc).

Rysunek 4: Usunięcie nieruchomego mózgu. (A) Wierzchołek czaszki. (B) Odsłonięty mózg w czaszce. (C) Izolowany mózg (aspekt grzbietowy). (D) Izolowany mózg (aspekt brzuszny). (E) Lewa półkula (aspekt boczny). (F) Lewa półkula (aspekt przyśrodkowy). Podziałka = 1 cm (E i F). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

18. Aby wyciąć rdzeń kręgowy, usuń ciało myszy z PFA i osusz je.
19. Umieść mysz na styropianowym klocku preparacyjnym w pozycji leżącej i przypnij łapy do bloku za pomocą czterech igieł.
20. Rozpocznij sekcję od przecięcia skóry wzdłuż linii środkowej myszy od szyi do ogona, aby odsłonić cały tyłek.
21. Odbij mięsień i powięź na plecach, aby odsłonić tylną część kręgosłupa.
22. Zaczynając od najbardziej czaszkowych kręgów, użyj cienkich nożyczek preparacyjnych, aby przeciąć blaszkę, unikając rdzenia kręgowego (Ryc. 5A).
23. Umieść ultracienkie zakrzywione kleszcze pod blaszką i pociągnij do góry, aby złamać kręgi i odsłonić rdzeń kręgowy (Ryc. 5B).
24. Użyj zakrzywionych kleszczy, aby odbić złamane kręgi i odsłonić najbardziej boczne obszary rdzenia kręgowego.
25. Kontynuuj ten proces dla następnych kręgów, umieszczając ultracienkie zakrzywione kleszcze poniżej blaszki i łamiąc kręgi. Kontynuuj łamanie kręgów, aż cały kręgosłup szyjny i odcinek piersiowy zostaną odsłonięte (Rysunek 5C).
26. Kontynuuj odsłanianie rdzenia kręgowego aż do końca lędźwiowego rdzenia kręgowego (Rysunek 5D).
27. Za pomocą ostrej żyletki przetnij całą długość rdzenia kręgowego w środkowej części klatki piersiowej.
28. Za pomocą ultracienkich zakrzywionych kleszczy przeciąć nerwy rdzeniowe bocznie od kręgosłupa i powięzi przedniej do rdzenia kręgowego, aby powoli oddzielić rdzeń kręgowy szyjny od kręgosłupa.
29. Kontynuuj preparowanie rdzenia kręgowego w odcinku szyjnym, aż zostanie on wolny od kręgów (Rysunek 5E). Umieść rdzeń kręgowy szyjno-piersiowy w rurce oznaczonej jako szyjna. Rurkę należy przechowywać w temperaturze 4 °C, aż rdzeń kręgowy szyjny opadnie (około nocy).
30. Kontynuuj łamanie kręgów piersiowych aż do ogona końskiego, jak opisano w krokach od 4.22 do 4.25. Kiedy ogon koński jest odsłonięty, użyj ostrej żyletki, aby przeciąć rdzeń kręgowy 1 cm poniżej lędźwiowego rdzenia kręgowego (Ryc. 5F).
31. Wypreparuj rdzeń kręgowy lędźwiowy z dala od kręgów, jak opisano w krokach 4.26-4.27. Umieść rdzeń kręgowy ogona ogona końskiego w rurce oznaczonej jako odcinek lędźwiowy. Przechowywać tę rurkę w temperaturze 4 °C, aż lędźwiowy rdzeń kręgowy opadnie (około nocy).
32. Gdy wszystkie tkanki zanurzą się w 20% sacharozy, przenieś je do oznakowanych probówek z 30% sacharozą, aż opadną lub na 3 dni.
    UWAGA: Tkanki rdzenia kręgowego często nie toną przy 30% sacharozy.

Rysunek 5: Usunięcie stałych segmentów rdzenia kręgowego. (A) Wstępne nacięcie w blaszce kręgów szyjnych. (B) Umieszczenie zakrzywionych kleszczy w celu złamania poszczególnych kręgów. (C) Odsłonięty kręgosłup szyjny. (D) Odsłonięty kręgosłup szyjny, piersiowy i lędźwiowy. (E) Usunięcie odcinka szyjnego kręgosłupa po przecięciu nerwów rdzeniowych. (F) Przecięcie kręgosłupa krzyżowego. (G) Izolowany odcinek szyjny kręgosłupa. (H) Izolowany odcinek lędźwiowy kręgosłupa. Podziałka = 1 cm (G i H). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

5. Osadzanie OCT i przechowywanie tkanek

1. Dla każdej myszy oznacz cztery krioformy w kształcie prostokąta: identyfikator myszy, prawa półkula, data osadzenia; Identyfikator myszy, lewa półkula, data osadzenia; Identyfikator myszy, szyjka macicy, data osadzenia; Identyfikator myszy, odcinek lędźwiowy, data osadzenia.
2. Ustaw pojemnik na styropian i zawieś metalowy kubek nad pojemnikiem.
3. Napełnij pojemnik styropianu ciekłym azotem mniej więcej do połowy. Napełnij metalowy kubek świeżym 2-metylobutanem mniej więcej do połowy.
   UWAGA: 2-metylobutan jest toksyczny, wysoce lotny i łatwopalny. Należy zachować ostrożność, aby uniknąć wdychania, wykonując kolejne czynności w dygestoriach i z dala od źródeł spalania.
4. Powoli opuść metalowy kubek do ciekłego azotu i unikaj rozpryskiwania ciekłego azotu do metalowego kubka.
5. Pozwól, aby 2-metylobutan zaczął się zamrażać. Podczas gdy 2-metylobutan zamarza, wyjmij żądaną tkankę z 30% roztworu sacharozy i osusz ją na bezpyłowej chusteczce.
6. Umieść tkankę w kriofordzie z obszarem rostralnym skierowanym w stronę górnej (nieoznakowanej) części formy.
7. Oszczędnie wlewaj pożywkę do osadzania w optymalnej temperaturze cięcia (OCT) na tkankę w krioformie, używając tylko tyle, aby całkowicie pokryć tkankę. Unikaj używania nadmiernej ilości OCT, ponieważ może to spowodować pękanie. Usuń wszelkie bąbelki z OCT.
8. Gdy zamrożony 2-metylobutan całkowicie pokryje wewnętrzną powierzchnię metalowego kubka, całkowicie zanurz kriomat w leżącej nad nim fazie ciekłej 2-metylobutanie na 12 sekund. Po 12 sekundach umieść kriomold do odsączenia w oznaczonym kwadracie z folii aluminiowej i zawiń całą krioformę. Natychmiast umieść owiniętą kriomold na suchym lodzie i unikaj rozmrażania. Upewnij się, że zamrożone OCT/cryomold są zawsze pokryte suchym lodem.
9. Powtórz kroki od 5.6 do 5.8 dla wszystkich tkanek. Umieść chusteczkę dla jednej myszy w szczelnie zamkniętej małej plastikowej torbie, a następnie w kriobezpiecznym, szczelnym pojemniku. Przechowuj ten pojemnik w zamrażarce o temperaturze -80 °C do momentu pocięcia sekcji.

6. Kriosekcja

1. Przed kriosekcją upewnij się, że temperatura komory kriostatu i głowicy próbki są ustawione na odpowiednie ustawienia.
   UWAGA: Do cięcia skrawków mózgu stosuje się temperaturę komory -20 °C, temperaturę głowicy próbki -20 °C i grubość przekroju 30 μm. Do cięcia odcinków rdzenia kręgowego stosuje się temperaturę komory -23 °C, temperaturę głowy próbki -30 °C i grubość przekroju 30 μm. Ważne jest, aby pamiętać, że ustawienia kriostatu (zwłaszcza temperatura główki próbki) będą musiały zostać dostosowane podczas cięcia, aby rozwiązać problemy z jakością tkanek. Ogólnie rzecz biorąc, temperatura główki próbki jest obniżona, aby skorygować rozmazywanie tkanek. I odwrotnie, temperatura główki próbki jest zwiększana, aby skorygować nadmierne zwijanie się tkanek.
2. Wyjmij żądany blok OCT z zamrażarki o temperaturze -80 °C i umieść nieopakowany blok krioformu/OCT w komorze kriostatu.
3. Pozwól blokowi OCT zaaklimatyzować się do temperatury komory przez 30 minut.
4. Wyczyść uchwyt z 70% etanolem i wytrzyj go do sucha chusteczką bezpyłową. Umieść oczyszczony uchwyt w komorze kriostatu i wykonaj na nim okrąg OCT wielkości monety. Pozostaw OCT do zamrożenia (około 1-2 min).
5. Gdy OCT zamarznie, umieść kropkę świeżego OCT wielkości ziarnka grochu na uchwycie i natychmiast umieść blok OCT tkanki na uchwycie. Upewnij się, że tkanka jest idealnie prostopadła do uchwytu, zanim OCT całkowicie zamarznie.
   UWAGA: Ogólnie rzecz biorąc, najbardziej rostralny obszar mózgu jest umieszczony w kierunku uchwytu, tak że cięcie zaczyna się od końca ogonowego. W przypadku rdzenia kręgowego, ogólnie rzecz biorąc, najbardziej ogonowy obszar jest umieszczony na uchwycie, tak że cięcie zaczyna się od końca rostralnego.
6. Gdy OCT stwardnieje, umieść więcej OCT wokół podstawy bloku OCT, aby działało jako podpora konstrukcyjna podczas cięcia. Gdy ta podpora lekko stwardnieje, umieść uchwyt na głowicy próbki i pozwól, aby blok OCT osiągnął temperaturę głowicy próbki przez 30 minut.
7. Umieść ostrze mikrotomu w uchwycie ostrza i wyczyść płytkę zabezpieczającą. Dostosuj odległość płytki przeciw zwijaniu się, aby upewnić się, że tkanka przechodzi tuż pod płytką podczas cięcia. Aby uzyskać więcej informacji na temat prawidłowego umieszczenia płytki przeciwprzechyleniowej, należy zapoznać się z instrukcją kriostatu.
8. Po tym, jak blok OCT zaaklimatyzuje się do temperatury głowy próbki, rozpocznij przycinanie bloku OCT, aż do osiągnięcia tkanki. Gdy tkanka jest widoczna, przejdź z przycinania do cięcia i rozpocznij wycinanie odcinków 30 μm. Odsunąć na bok płytkę stabilizatora i za pomocą szkiełka mikroskopowego podnieść sekcję.
9. Kontynuuj cięcie i zbieranie skrawków, aż będziesz zadowolony z anatomicznego położenia skrawków lub cała tkanka zostanie przecięta. Umieść szkiełka do wyschnięcia w temperaturze pokojowej na 1-3 dni. Po wyschnięciu umieść szkiełka w pudełku na szkiełka i umieść to pudełko w szczelnie zamkniętej plastikowej torbie. Oznacz torbę identyfikatorem myszy i informacjami o tkankach przed umieszczeniem szkiełek w zamrażarce o temperaturze -80 °C.

7. Barwienie immunofluorescencyjne

1. Rozmrażać szkiełka przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
2. Umieść szkiełka w poziomym słoiku na szkiełka i umyj sekcje 3 razy w PBS przez 10 minut każde mycie w temperaturze pokojowej na shakerze.
3. Przygotować bufor blokujący (2% BSA + 0,3% Triton-X-100 w 1x PBS). Użyć około 1 ml na szkiełko.
4. Stwórz nawilżoną komorę, dodając wodę do dna. Połóż szkiełka poziomo do góry i nie pozwól im wyschnąć. Dodać 1 ml buforu blokującego do każdego szkiełka i inkubować przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
5. Przygotować roztwór przeciwciała pierwszorzędowego, rozcieńczając przeciwciało pierwszorzędowe w buforze przeciwciał (0,7% BSA + 0,3% Triton-X-100 w 1x PBS).
   UWAGA: Dla fosforylowanego przeciwciała α-synukleiny zastosowano współczynnik rozcieńczenia 1:500.
6. Dodać 200-300 μl roztworu przeciwciał pierwszorzędowych na szkiełko. Przykryć szkiełkiem nakrywkowym w celu rozproszenia przeciwciała i inkubować w temperaturze 4 °C przez noc.
7. Następnego dnia wyjmij szkiełka z nawilżonej komory i umieść je w pionowym słoiku Coplin wypełnionym 1x PBS, aby szkiełko nakrywkowe mogło spaść. Zrób to indywidualnie dla każdego szkiełka i uważaj, aby nie naruszyć części tkanki podczas zdejmowania szkiełka nakrywkowego.
8. Umieść szkiełka w poziomym słoiku na szkiełka i umyj sekcje 3 razy w PBS przez 10 minut każde mycie w temperaturze pokojowej na shakerze.
   UWAGA: Wszystkie kolejne kroki należy wykonywać przy zgaszonym świetle, aby uniknąć fotowybielania fluoroforu!
9. Przygotować roztwór przeciwciała drugorzędowego, rozcieńczając przeciwciało drugorzędowe w buforze przeciwciał.
   UWAGA: Do wykrywania fosforylowanej α-synukleiny zastosowano wtórny anty-królik sprzężony z Alexa 488 o współczynniku rozcieńczenia 1:500 w buforze przeciwciała (0,7% BSA + 0,3% Triton-X-100 w 1x PBS).
10. Ułóż szkiełka poziomo w wilgotnej komorze i dodaj 200-300 μl wtórnego roztworu przeciwciał na szkiełko. Przykryj szkiełkiem nakrywkowym w celu rozproszenia przeciwciała. Inkubować w temperaturze pokojowej przez co najmniej 2 godziny.
11. Wyjmij szkiełka z nawilżonej komory i umieść je w pionowym słoiku Coplin wypełnionym 1x PBS, aby szkiełko nakrywkowe mogło spaść. Zrób to indywidualnie dla każdego szkiełka i uważaj, aby nie naruszyć części tkanki podczas zdejmowania szkiełka nakrywkowego.
12. Umieść szkiełka w poziomym słoiku na szkiełka i umyj sekcje 3 razy w PBS przez 10 minut każde mycie w temperaturze pokojowej na shakerze.
13. Osusz boki szkiełek na ręczniku i strząśnij nadmiar PBS.
14. Dodaj 3 krople podłoża montażowego do każdego szkiełka. Dodaj szkiełko nakrywkowe i delikatnie wypchnij pęcherzyki za pomocą kleszków, naciskając szkiełko nakrywkowe przed obrazowaniem za pomocą mikroskopii konfokalnej.

Wyniki

Wysokiej jakości perfuzja jest oznaczona brakiem krwi w wątrobie, rdzeniu kręgowym i głębokich strukturach OUN (Rysunek 4C i Rysunek 5G,H). Zatrzymana krew poniżej opony twardej (na przykład w zatokach żylnych) lub między oponą twardą a czaszką nie była problematyczna, ponieważ krew ta nie znajduje się w miąższu mózgu. Krew widoczna w Rycina 4A znajduje się między czaszką a oponą twardą i dlatego nie jest problematyczna ani nie sugeruje złej jakości perfuzji. Świeży mózg i rdzeń kręgowy są dość miękkie i łatwo ulegają uszkodzeniu podczas przenoszenia. Dla porównania, odpowiednio utrwalone tkanki są twarde. Aby ocenić jakość tkanki i zachowanie morfologii tkanek za pomocą tej metody perfuzji, praca ta demonstruje wykrycie fosforylowanej α-synukleiny w śródmózgowiu i lędźwiowym rdzeniu kręgowym 15-miesięcznej myszy i 7-miesięcznej myszy z ekspresją ludzkiej α-synukleiny A53T (Figura 6).

Mutacja A53T jest nadreprezentowana u pacjentów z autosomalną dominującą chorobą Parkinsona (PD). Co więcej, ludzka α-synukleina z mutacją A53T może podsumować wiele cech ludzkiej choroby Parkinsona, gdy ulega ekspresji u myszy^6,7. Wykazano, że fosforylacja α-synukleiny przy resztach seryny 129 indukuje agregację α-synukleiny⁸. Ciała Leweya są klasycznym odkryciem histologicznym obecnym u pacjentów z PD lub otępieniem z ciałami Leweya⁹. Większość α-synukleiny obecnej w ciałach Leweya jest fosforylowana w Serine 129^10,11. W rezultacie akumulacja fosforylowanej α-synukleiny jest wykorzystywana jako marker histologicznego nasilenia patologii PD. Niniejsze badanie wykazało, że fosforylowana α-synukleina gromadzi się na znacznie wyższym poziomie u 15,5-miesięcznych myszy z objawami w porównaniu z 7-miesięcznymi bezobjawowymi myszami wykazującymi ekspresję ludzkiej α-synukleiny A53T. Jest to zgodne z doniesieniami opisującymi wzbogacenie cytopatologii w przednich rogach rdzenia kręgowego i śródmózgowiu tych myszy. ⁶ Z tego wnioskujemy, że opisana tutaj uproszczona metoda perfuzji zapewnia wysokiej jakości utrwalenie tkanek OUN do dalszej charakterystyki histologicznej.

Rysunek 6: Etykieta dla fosforylowanej α-synukleiny w tkankach śródmózgowia i rdzenia kręgowego w odcinku lędźwiowym z mysiego modelu choroby Parkinsona. Starzejącą się (15,5 miesiąca) schyłkową sparaliżowaną mysz porównano z 7-miesięczną zdrową myszą. Obie myszy wykazują ekspresję podatnego na nieprawidłowe fałdowanie zmutowanego wariantu (A53T) ludzkiej α-synukleiny, która indukuje patologię podobną do choroby Parkinsona. Podziałka = 100 μm (panele górne) i 50 μm (panele dolne). Skrót: α syn-A53T = A53T mutant α-synukleiny; DAPI = 4',6-diamidyn-2-fenyloindol; PS129 = fosforylowana seryna 129 α-synukleiny. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

W tej pracy opisano kluczowe etapy wykonywania perfuzji przezsercowej. Podczas konstruowania aparatu perfuzyjnego (sekcja 1 protokołu) ważne jest, aby używać rurek, które są wystarczająco elastyczne, aby można je było całkowicie zasłonić przez hemostat. Niektóre sztywne rurki mogą nie być wystarczająco zasłonięte przez hemostat i mogą nadal pozwalać na wyciek PFA do głównej linii podczas początkowej perfuzji PBS. Podczas przygotowywania 4% roztworu PFA ważne jest, aby upewnić się, że pH jest fizjologiczne (7.4). Ponieważ przygotowanie roztworu PFA wymaga podgrzania go do temperatury 65 °C, roztwór musi zostać schłodzony z powrotem do 25 °C przed pomiarem pH, ponieważ jest to temperatura, w której pH jest kalibrowane na mierniku.

Podczas wykonywania pierwszego nacięcia w jamie brzusznej należy zachować ostrożność, aby uniknąć uszkodzenia narządów jamy brzusznej (punkt 2 protokołu). Podczas preparacji w kierunku przepony ważne jest, aby uniknąć uszkodzenia wątroby, ponieważ często wątroba przylega do przedniej ściany brzucha. Aby temu zaradzić, wątroba jest ostrożnie i tępo wycinana z dala od przedniej ściany przed kontynuowaniem nacięcia w kierunku przepony. Przy wchodzeniu do jamy klatki piersiowej przez przeponę ważne jest, aby uniknąć uszkodzenia serca, dużych naczyń krwionośnych i płuc. Aby tego uniknąć, końcówka nożyczek jest trzymana powierzchownie i pod ostrym kątem z klatką piersiową.

Wstępna sekcja w celu odsłonięcia serca trwa około 2 minut od pierwszego nacięcia. Oczekuje się, że w tym czasie trochę powietrza dostało się do końcówki igły motyla. Wprowadzenie tego powietrza do krążenia myszy spowoduje złą jakość perfuzji. Dlatego bardzo ważne jest, aby główna linia została otwarta, a PBS został przepłukany przez igłę bezpośrednio przed kaniulacją serca w celu usunięcia pęcherzyków powietrza. Idealnie byłoby, gdyby serce było kaniulowane, podczas gdy mała strużka PBS przepływa przez końcówkę igły, aby zapewnić całkowity brak powietrza podczas nakłuwania LV.

Kiedy igła wchodzi do lewej komory, nie może wchodzić tak głęboko, aby wprowadzić końcówkę igły do prawej komory (RV). Umieszczenie igły w RV lub poza zastawką mitralną spowoduje natychmiastowe "napompowanie" płuc po rozpoczęciu perfuzji. Jest to niepożądane i igłę należy lekko wycofać, aby zapewnić umieszczenie lewej dawki prądu. Jeśli igła zostanie prawidłowo umieszczona, płuca pozostaną płaskie przez cały czas trwania perfuzji. Po rozpoczęciu perfuzji czasami obserwuje się, że z otwartego pyska zwierzęcia wyłania się przezroczysty płyn. Jest to zwykle spowodowane zbyt wysokim ciśnieniem perfuzji lub niewłaściwym umieszczeniem igły w sercu. Autorzy spekulują, że podwyższone ciśnienie perfuzji powoduje wynaczynienie perfuzatu z łożyska naczynia włosowatego tętniczki i wsteczny przepływ PBS przez drzewo oskrzelowe do przełyku i jamy ustnej.

Ciśnienie perfuzji musi być obniżone poprzez zmniejszenie poziomu PBS w butelce PBS lub poprzez obniżenie wysokości butelki PBS. Alternatywnie, jeśli igła zostanie umieszczona zbyt głęboko w lewej komorze, może przejść przez zastawkę mitralną i dostarczyć perfuzat do lewego przedsionka. Może to spowodować wsteczny przepływ przez żyły płucne i wynaczynienie perfuzatu do tętniczek, jak opisano powyżej. Dokładne usunięcie krwi z układu krążenia za pomocą PBS jest szczególnie ważne, aby uniknąć indukowanego utrwalaniem elementów krwi, powodującego niedrożność naczyń po późniejszej perfuzji utrwalającej. Klirens jest skutecznie oceniany przez zmianę koloru wątroby i przepływ PBS z nacięcia w brzusznej podstawie ogona. Klirens krwi jest na ogół całkowity po 3 minutach perfuzji z PBS; Jeśli jednak wizualne oznaki oczyszczenia pojawiają się w krótszym czasie, utrwalacz wprowadza się wcześniej niż 3 minuty. Dłuższe czasy klirencji nie są zalecane, ponieważ opóźniona perfuzja utrwalająca prowadzi do artefaktów w drobnej strukturze OUN¹.

Podczas podawania PFA ważne jest, aby monitorować poziom roztworu PFA w butelce PFA. Napełnij butelkę PFA, jeśli poziom PFA spadnie poniżej 4 cm powyżej wylotu butelki PFA. Po zakończeniu perfuzji aparat perfuzyjny należy dokładnie przepłukać wodą destylowaną. Jest to ważne, ponieważ resztki PFA w głównej linii zanieczyszczą początkową perfuzję PBS PFA i spowodują perfuzję niskiej jakości. Wreszcie, igły motylkowe 25 G są ogólnie zalecane dla średniej wielkości dorosłych myszy w zakresie 20-30 g. Jednak większe lub mniejsze myszy mogą wymagać nieco większych lub mniejszych igieł oprócz regulacji butelek utrwalających, aby zapewnić optymalne natężenie przepływu.

W przypadku rozwarstwienia OUN i osadzenia OCT (sekcja 3 protokołu) często zdarza się, że tkanki rdzenia kręgowego nie zapadają się całkowicie w 30% sacharozy. Tkanki te pozostawia się zatem w sacharozie na 2 dni, a następnie zatapia w OCT, niezależnie od tego, czy toną, czy nie. Podczas zamrażania tkanek w OCT możliwe jest, że niektóre tkanki mogą pękać po umieszczeniu w schłodzonym 2-metylobutanie. Jest to bardziej powszechne w przypadku mózgu i zwykle występuje, gdy zbyt dużo OCT zostanie umieszczone na tkance. Aby tego uniknąć, umieść tylko tyle OCT, aby pokryć powierzchnie tkanek przed natychmiastowym zamrożeniem. W niektórych protokołach cracking jest mniej powszechny pomimo całkowitego zanurzenia w OCT. Jest to zwykle spowodowane wolniejszą metodą zamrażania, taką jak stosowanie 2-metylobutanu chłodzonego suchym lodem lub bezpośrednie umieszczanie kriofordu na bloku suchego lodu. W tej pracy preferowany jest 2-metylobutan chłodzony ciekłym azotem, ponieważ szybkość zamrażania jest znacznie szybsza i może lepiej zachować morfologię tkanek niż wolniejsze metody zamrażania.

Podczas kriosekcji tkanki (sekcja 4 protokołu) ważne jest, aby unikać wielokrotnych cykli zamrażania i rozmrażania. Dlatego optymalne jest wycięcie wszystkich sekcji z jednego bloku OCT, aby uzyskać określony obszar mózgu do analizy, zamiast rozmrażania i ponownego zamrażania wybranych obszarów. Jeśli nie jest to możliwe, po uzyskaniu kilku sekcji użytkownicy mogą ponownie zamrozić i przechowywać bloki OCT w zamrażarce o temperaturze -80 °C jeszcze 1-2 razy do wykorzystania w przyszłości.

Główne zalety tej metody w porównaniu z bardziej tradycyjnym pompą lub podawaniem perfuzatu pod ciśnieniem powietrza są następujące: (1) niski koszt i dostępność aparatu do perfuzji. (2) Użytkownicy nie muszą ręcznie utrzymywać ciśnienia w aparacie perfuzyjnym przez cały czas trwania perfuzji. (3) Niższe i bardziej stałe ciśnienie perfuzji niż inne tanie alternatywy dla perfuzji, takie jak dostarczanie strzykawką. Korzystając z równania Bernoulliego, oblicza się, że skonstruowany tutaj aparat perfuzyjny zasilany grawitacyjnie utrzyma ciśnienie perfuzyjne około 73 mm Hg, gdy butelki z perfuzatem zostaną umieszczone na wysokości 1 m w stosunku do igły. Biorąc pod uwagę, że jest to znacznie poniżej skurczowego ciśnienia krwi tych zwierząt, to ciśnienie perfuzyjne jest prawdopodobnie wystarczająco niskie, aby uniknąć pęknięcia naczyń^{krwionośnych 12}.

Autorzy do tej pory z powodzeniem wykorzystali ten system perfuzyjny do wykrycia obecności fosforylowanej α-synukleiny w mysim modelu choroby Parkinsona. W tym czasie nie napotkano znaczących ograniczeń związanych z tą metodą perfuzji, które nie występują w przypadku metody dostarczania perfuzji z pompą. Głównym ograniczeniem tej techniki jest czasochłonny charakter perfuzji w porównaniu z utrwalaniem kropli. Ta technika jest lepsza niż upuszczanie fiksacji, ponieważ perfuzja powoduje głębszą penetrację utrwalacza do struktur OUN. Drugim ograniczeniem tej techniki jest to, że wymaga ona pewnych umiejętności chirurgicznych, ponieważ serce musi zostać kaniulowane szybko po wejściu do jamy klatki piersiowej. Jednak wraz z doświadczeniem przeszkoleni użytkownicy mogą rutynowo kanalizować serce w ciągu 1 minuty od początkowego nacięcia w jamie brzusznej.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
2-metylobutan (certyfikowany ACS), Fisher Chemical	Fisher Scientific	03551-4
Andwin Scientific Tissue-Tek OCT Compound	Fisher Scientific	NC1029572
Artman Instruments 4,5-calowe proste nożyczki sprężynowe Castroveijo	Amazon	B0752XHK2X	"cienkie nożyczki"
BD ogólnego zastosowania i igły podskórne PrecisionGlide, 18 g	Fisher Scientific	14-826-5D
BD Ogólnego zastosowania i igły podskórne PrecisionGlide, 22 g	Fisher Scientific	14-826B
Filtry strzykawkowe Corning PES	Fisher Scientific	09-754-29
Cytiva Hyclone Fosforan buforowany solą fizjologiczną (PBS), 10x	Fisher Scientific	SH30258
Falcon 50 ml stożkowe probówki wirówkowe	Fisher Scientific	14-432-22
Fisher BioReagents Albumina surowicy bydlęcej (BSA) Proszek bez proteaz	Fisher Scientific BP9703100
Fisherbrand Zakrzywione średniopunktowe kleszcze ogólnego przeznaczenia	Fisher Scientific	16-100-110	"zakrzywione kleszcze z okienkiem"
Fisherbrand Zakrzywione bardzo cienkie precyzyjne kleszcze	Fisher Scientific	16-100-123	" zakrzywione drobne kleszcze"
Jednorazowe pipety transferowe z podziałką Fisherbrand	Fisher Scientific	13-711-9AM
Fisherbrand Wysokoprecyzyjna, prosta, stożkowa, ultra cienka pęseta/kleszcze	Fisher Scientific	12-000-122	"proste kleszcze drobnoziarniste"
Mikroszpatułki Fisherbrand z zaokrąglonymi końcami	Fisher Scientific	21-401-5
Lejki porcelanowe Fisherbrand Buchner ze stałymi perforowanymi płytkami	Fisher Scientific	FB966J
Szkło osłonowe Fisherbrand Premium, 24 x 50	Fisher Scientific	12-548-5M
Kleszczyki do tkanek Fisherbrand Premium 1X2 zęby 5 w. Niemiecka stal	Fisher Scientific	13-820-074	"kleszcze do skóry"
Fisherbrand Wielorazowe grubościenne kolby filtracyjne	Fisher Scientific	FB3002000
Fisherbrand Standardowe nożyczki preparacyjne	Fisher Scientific	08-951-20	"nożyczki preparacyjne"
Fisherbrand Sterylne strzykawki do jednorazowego użytku	Fisher Scientific	14-955-464
Hemostatyki z prostym blokowaniem Fisherbrand	Fisher Scientific	16-100-115
Szkiełka mikroskopowe Fisherbrand Superfrost Plus	Fisher Scientific	12-550-15
Zestawy rurek i złączy winylowych Fisherbrand, 1/4 cala.	Fisher Scientific	14-174-1C
Fisherbrand Wzmocnione na mokro jakościowe koła z bibuły filtracyjnej	Fisher Scientific	09-790-12F
Fisherbrand Y Złącze z 1/4 cala. ID - Polipropylen - QC	Fisher Scientific	01-000-686
Garvey Economy Ostrze tnące z pojedynczą krawędzią Amazon		B001GXFAEQ
Koza anty-królicza IgG (H + L) Wtórne przeciwciało, DyLight 488	ThermoFisher Scientific	35552
Idealny zacisk Stant Zaciski wysokociśnieniowe	Fisher Scientific	14-198-5A	"opaski zaciskowe"
IMEB, Inc Sakura Accu-Edge Niskoprofilowe ostrza mikrotomowe, jednorazowe	Fisher Scientific	NC9822467
Kawasumi 25 Gauge Standardowy skrzydlaty zestaw do pobierania krwi	Fisher Scientific	22-010-137	"igła motylkowa"
Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delikatne wycieraczki do zadań, 1-warstwowe	Fisher Scientific	06-666
Sondy molekularne ProLong Diamond Anti Blaknięcie z DAPI	Fisher Scientific	P36962
Butelki do mycia LDPE z wąskimi ustami ThermoFisher	Scientific	2425-0506	"butelki buforowe"
Długopis PAP	abcam	ab2601
Paraformaldehyd Granulowane	systemy mikroskopii elektronowej	19210
Suszenie szkła Pyrex Naczynia, 34,9 x 24,9 x 6 cm	Rekombinowane	15-242D
[EP1536Y]	abcam	ab51253
Wodorotlenek sodu	Sigma-Aldrich	221465-2,5 kg
Kubek do picia ze stali nierdzewnej 18 uncji	amazon	B0039PPO9U
sacharozy do biologii molekularnej CAS: 57-50-1	Biologiczny	USAS8010
Triton X-100	Us Biologiczny	T8655
Vetone Fluriso Isoflurane USP	MWI Zdrowie zwierząt	502017