Artykuł metodologiczny

Grawitacyjna metoda perfuzji przezsercowej do analizy histologicznej ośrodkowego układu nerwowego myszy

12.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63386

⸱

21 stycznia 2022

 ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, State University of New York Upstate Medical University, 2Department of Neurology, State University of New York Upstate Medical University, 3Department of Neuroscience and Physiology, State University of New York Upstate Medical University

W tym artykule

Podsumowanie

Prezentowana jest wygodna metoda perfuzji grawitacyjnej do analizy histologicznej ośrodkowego układu nerwowego myszy. Immunofluorescencyjne wykrywanie fosforylowanej α-synukleiny wykazano w mysim modelu choroby Parkinsona. Praca ta kompleksowo opisuje również etapy perfuzji przezsercowej, rozwarstwienia, zamrażania/osadzania tkanek i zamrażania sekcji.

Streszczenie

Analiza histologiczna próbek mózgu i rdzenia kręgowego wyizolowanych od myszy jest powszechną praktyką oceny patologii w tym systemie modelowym. Aby utrzymać morfologię tych delikatnych tkanek, rutynowo podaje się chemiczny utrwalacz, taki jak paraformaldehyd, poprzez kaniulację serca u znieczulonych zwierząt (perfuzja przezsercowa). Perfuzja przezsercowa serca myszy tradycyjnie opierała się na użyciu pomp perystaltycznych lub ciśnienia powietrza w celu dostarczenia zarówno roztworów soli fizjologicznej, jak i utrwalaczy niezbędnych w tym procesie. Jako łatwo dostępną alternatywę dla tych metod, praca ta demonstruje zastosowanie grawitacyjnej metody dostarczania perfuzatu, która wykorzystuje materiały dostępne w większości sklepów ze sprzętem.

Aby potwierdzić tę nową metodę perfuzji, ta praca demonstruje wszystkie kolejne kroki niezbędne do czułego wykrywania fosforylowanej α-synukleiny zarówno w mózgu, jak i rdzeniu kręgowym. Etapy te obejmują preparację nieruchomych tkanek mózgu i rdzenia kręgowego, szybkie zamrażanie/osadzanie i kriosekcję tkanek oraz barwienie immunofluorescencyjne. Ponieważ metoda ta skutkuje dostarczeniem utrwalacza do całego ciała, może być również wykorzystana do przygotowania innych tkanek nieneuronalnych do analizy histologicznej.

Wprowadzenie

Histologiczna charakterystyka patologii w ośrodkowym układzie nerwowym myszy (OUN) jest rutynową techniką stosowaną w badaniach nad neurodegeneracją. Ponieważ tkanki neuronalne szybko ulegają degradacji po śmierci, powszechną praktyką jest dostarczanie chemicznego utrwalacza, takiego jak paraformaldehyd, do tkanek OUN, aby zachować ich morfologię1,2. Utrwalanie chemiczne można przeprowadzić albo poprzez perfuzję całego ciała roztworem utrwalającym, albo poprzez izolację tkanek i zanurzenie ich w roztworze utrwalającym (tzw. utrwalanie kroplą). Perfuzja jest preferowaną metodą dostarczania utrwalającego, ponieważ utrwalanie kropli może nie pozwolić na szybką penetrację roztworu utrwalającego do głębokich struktur OUN3,4,5. Ponadto, ponieważ trudno jest usunąć nieutrwalony rdzeń kręgowy z kręgosłupa, podanie roztworu utrwalającego przez perfuzję pozwala na zachowanie in situ mikroskopijnej i ogólnej anatomii rdzenia kręgowego oraz usztywnia tkankę, aby zminimalizować uszkodzenia podczas usuwania.

Dostarczanie roztworów buforowych i utrwalających niezbędnych do utrwalenia jest zwykle wykonywane przy użyciu dostępnych na rynku pomp lub ciśnienia powietrza. Grawitacyjne dostarczanie perfuzatu może służyć jako alternatywa dla dostarczania pompy z następujących powodów: (1) Dostarczanie pompy lub ciśnienia powietrza może w niektórych przypadkach wymagać od użytkownika ręcznego utrzymywania ciśnienia w systemie przez cały czas perfuzji. Grawitacyjne dostarczanie perfuzatu może być utrzymane bez interwencji użytkownika. (2) Aparat do perfuzacji dostarczany grawitacyjnie może być skonstruowany przy niskich kosztach dla użytkownika, uzyskując materiały dostępne od standardowych dostawców naukowych. W tej pracy opisano, jak skonstruować proste urządzenie do perfuzji grawitacyjnej przy użyciu butelek do mycia i rurek winylowych. Wykorzystując mysi model choroby Parkinsona, praca ta demonstruje skuteczność tego systemu w perfuzji tkanek mózgu i rdzenia kręgowego przed ich izolacją w celu zamrożonego cięcia. Praca ta kompleksowo opisuje wszystkie kroki, techniki i materiały potrzebne do wypreparowania utrwalonej tkanki ze zwierzęcia, szybkiego zamrożenia/osadzenia i kriosekcji tkanki oraz wykrycia obecności fosforylowanej α-synukleiny zarówno w mózgu, jak i rdzeniu kręgowym za pomocą pośredniej mikroskopii immunofluorescencyjnej.

Protokół

Dane i kroki eksperymentalne przedstawione w niniejszym protokole zostały opracowane z wykorzystaniem myszy C57BL/6J. Wszystkie metody obejmujące zwierzęta zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (Institutional Animal Care and Use Committee) State University of New York Upstate Medical University.

1. Budowa aparatu do perfuzji i platformy do sekcji

  1. Jak pokazano w Rycina 1przytnąć wewnętrzne rurki w dwóch butelkach do płukania o pojemności 500 mL, odcinając je ostrym ostrzem żyletki równo z wewnętrzną stroną nakrętki wkręcanej. W dnie każdej butelki z buforem wyciąć kwadratowy otwór o wymiarach 4 cm x 4 cm. W dnie każdej butelki wyciąć mały otwór, aby umożliwić wprowadzenie zgiętej mikroszpatułki ze stali nierdzewnej.
  2. Wygiąć mikroszpatułki w kształt litery „S”, aby można było ich użyć jako haczyków do zawieszenia butelek z buforem. Wsunąć wygięte mikroszpatułki do odpowiednich otworów w butelkach z buforem.
  3. Odetnij dwa odcinki drenu o długości 25 cm i szczelnie połącz je z zewnętrznymi wylotami słomek butelek. Połącz końce tych drenów za pomocą konektora w kształcie litery Y. Odetnij 2 m drenu i połącz go z wolnym końcem konektora Y.
  4. Wyjmij tłok z strzykawki 1 ml i odetnij korpus strzykawki w odległości około 6 cm od jej końcówki. Przetnij strzykawkę, najpierw nacinając plastik żyletką, a następnie gwałtownie go przełamując.
  5. Wprowadź odcięty koniec strzykawki do wolnego końca plastikowej rurki. Wsuń go na wystarczającą głębokość, aby zapewnić szczelne połączenie.
    UWAGA: Należy upewnić się, że wszystkie połączenia w aparacie perfuzyjnym są wystarczająco szczelne, aby uniknąć wycieków. W przypadku luźnych połączeń można w razie potrzeby zastosować i zacisnąć małe zaciski do węży ze stali nierdzewnej w wybranych miejscach łączeń, aby zapewnić szczelność.
  6. Oznakuj jedną butelkę z buforem jako PFA or jedna butelka jako PBS (bufor). Odmierzyć około 1/3rd odległości od otworu butelki i narysować linię wokół obwodu butelki w tym punkcie, aby zaznaczyć odpowiedni poziom napełnienia roztworami perfuzatu.
  7. Wyprostuj duży spinacz biurowy, a następnie uformuj z niego pętlę, która będzie pasować do obwodu rurki. Umieść pętlę wokół rurki, tuż przed strzykawką (proksymalnie względem strzykawki).
  8. Umieść blok styropianowy o odpowiednim rozmiarze w szklanej kuwecie. Wbij końce spinacza do papieru w blok styropianowy, aby przymocować rurkę.
  9. Używając ręczników papierowych, unieś przednią krawędź szklanej tacki o około 2 cm.
    UWAGA: Pozwoli to na umieszczenie myszy w przybliżeniu 20° pozycji Trendelenburga (odchylenie do tyłu), aby ułatwić wizualizację przepony podczas sekcji oraz wspomóc odpływ płynów podczas perfuzji.

Schemat układu podawania płynów; linie PBS i PFA do badania perfuzji tkanek.
Rycina 1: Schemat przedstawiający zmontowany aparat do perfuzji. Skróty: PBS = fosforan buforowany solny; PFA = paraformaldehyd. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

2. Przygotowanie roztworu paraformaldehydu (PFA)

UWAGA: Roztwór PFA musi zostać przygotowany na świeżo w dniu perfuzji i zutylizowany po zakończeniu zabiegu w wyznaczonym pojemniku na odpady przed usunięciem przez przeszkolony personel. Niniejszy protokół opisuje przygotowanie 1 L 4% roztworu PFA, co jest wystarczającą ilością do perfuzji około 4 myszy. PFA jest substancją silnie toksyczną, dlatego należy zachować szczególną ostrożność, aby uniknąć wdychania lub bezpośredniego kontaktu ze skórą, zarówno w formie proszku, jak i roztworu. Większość etapów przygotowania należy zatem przeprowadzać w dygestorium, nosząc rękawice, okulary ochronne i fartuch laboratoryjny.

  1. Wypłucz zlewkę o pojemności 1 L wodą destylowaną i napełnij ją około 800 mL H2O klasy biologii molekularnej o oporności 18 mΩ.
  2. Podgrzewaj zlewkę z H2O w mikrofalówce przez 3 min lub do momentu, aż woda osiągnie temperaturę 65 °C. Umieść ją na płycie grzejno-mieszającej w dygestorium.
  3. Wypłucz pręt szklany do mieszania wodą destylowaną i umieść go w gorącej wodzie. Uruchom mieszadło i ustaw płytę grzejną na średnią moc. Dopilnuj, aby temperatura wody nie przekroczyła 70 °C.
  4. Załóż maseczkę chirurgiczną, rękawiczki, okulary ochronne oraz fartuch laboratoryjny i odważ 40 g proszku PFA. Wsyp proszek do podgrzanej wody.
  5. Za pomocą pipety transferowej dodaj do roztworu kilka kropli 5 M NaOH. Odczekaj do całkowitego rozpuszczenia proszku PFA. Jeśli proszek nie rozpuści się całkowicie po kilku minutach, dodawaj krople 5 M NaOH w razie potrzeby.
  6. Gdy prawie cały PFA się rozpuści (roztwór będzie lekko mętny), zatrzymaj mieszanie i grzanie, a następnie natychmiast dodaj 100 mL 10x soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS). Na koniec dopełnij wodę do poziomu 1 L w zlewce, używając H2O klasy biologii molekularnej o oporności 18 mΩ. Przykryj zlewkę folią spożywczą i umieść ją w zamrażarce o temperaturze -20 °C, aż roztwór osiągnie temperaturę pokojową (około 45 min).
  7. Zkalibruj pH-metr za pomocą odpowiednich wzorców. Trzymając zlewkę na płycie mieszającej, zmierz pH roztworu i dodawaj HCl, aż pH osiągnie wartość 7.4. W razie potrzeby dodaj 5 M NaOH, aby zwiększyć pH, jeśli jest zbyt niskie.
  8. Podłącz kolbę próżniową do pompy próżniowej i umieść w niej czysty ceramiczny lejek Büchnera z papierem filtrującym. Włącz próżnię i zwilż papier filtrujący za pomocą pipety transferowej wypełnionej 4% roztworem PFA.
  9. Powoli wlewaj 4% roztwór PFA na papier filtrujący, aż cały roztwór zostanie przefiltrowany.
  10. Przenieś przefiltrowany roztwór do czystego, chronionego przed światłem pojemnika i przechowuj w temperaturze 4 °C do momentu użycia (przechowywać nie dłużej niż 24 h).

3. Transkardialna perfuzja „bezpompowa”

  1. W dygestorium umieść styropianowy blok sekcyjny w szklanej tacy. Upewnij się, że blok sekcyjny posiada 5-6 krótkich igieł do unieruchomienia myszy podczas zabiegu oraz 2 długie igły do podtrzymywania drenów perfuzyjnych.
  2. Przepłucz aparat perfuzyjny wodą destylowaną. Przed zawieszeniem aparatu perfuzyjnego odczekaj, aż cała woda spłynie. Zawieś butelki perfuzyjne 1 m nad perfundowanym zwierzęciem (w przypadku myszy o masie 20–30 g).
  3. Przygotować niesterylny roztwór 1x PBS, rozcieńczając 10x PBS wodą klasy biologii molekularnej o oporności 18 mΩ2O.
  4. Jak pokazano w Rysunek 2następnie za pomocą kleszczyków hemostatycznych zaklemować główną linię aparatury perfuzyjnej. Linię z PFA zaklemować drugimi kleszczykami hemostatycznymi.
    UWAGA: W celu całkowitego zablokowania przepływu w danej linii może być konieczne zastosowanie kilku kleszczyków hemostatycznych.
  5. Wypełnij bufor pojemnik z 1x PBS w temperaturze pokojowej.
  6. Umieść końcówkę strzykawkową aparatury perfuzyjnej w zlewce w celu zbierania zużytego buforu, a następnie zdejmij zacisk hemostatyczny blokujący linię główną (Rysunek 2, lewa strona).
  7. Pozwolić na przepływ PBS przez linię, jednocześnie usuwając uwięzione pęcherzyki powietrza poprzez energiczne opukiwanie ścianek probówki.
  8. Po usunięciu całego powietrza z linii buforowej i głównej, należy zablokować przepływ, zakładając kleszczyki hemostatyczne na linii głównej.
  9. Usuń zacisk hemostatyczny z linii PFA i pozwól, aby PBS przepływał w kierunku wstecznym aż do butelki z PFA, jednocześnie usuwając pęcherzyki powietrza z linii PFA poprzez opukiwanie (Rysunek 2, środek). Kontynuuj wprowadzanie PBS do linii z PFA, aż PBS pojawi się tuż nad otworem butelki. Zamknij linię z PFA za pomocą kleszczyków hemostatycznych, aby zatrzymać przepływ do butelki z PFA.
  10. Podłączyć igłę motylkową do strzykawki perfuzyjnej i przepłukać linię roztworem PBS (otwierając hemostat linii głównej), aby usunąć pęcherzyki powietrza ze strzykawki perfuzyjnej. Zamknąć hemostat linii głównej.
  11. Upewnij się, że butelka z PBS jest teraz wypełniona w około 1/3.rd pełne PBS. W razie potrzeby przepłukać główną linię PBS lub dolać PBS do butelki z buforem, aż zostanie wypełniona w 1/3rd swojej pełnej pojemności.
  12. Po usunięciu wszystkich pęcherzyków powietrza z linii PBS, PFA oraz linii głównych, należy napełnić butelkę PFA 4% roztworem PFA w temperaturze pokojowej do czarnej kreski na butelce (około 1/3B&R pełny) (Rycina 2, prawy).

Schemat ekstrakcji ciecz-ciecz, system chromatograficzny, wizualizacja metody rozdzielania.
Rycina 2: Przygotowanie aparatu perfuzyjnego do zabiegu perfuzji. Najpierw należy zamknąć zacisk na linii z PFA i otworzyć zaciski na linii z PBS oraz na linii głównej. Napełnić układ PBS i usunąć pęcherzyki powietrza z linii z PBS oraz linii głównej. Następnie napełnić linię z PFA roztworem PBS, otwierając zacisk na linii z PFA i zamykając zacisk na linii głównej. Usunąć pęcherzyki powietrza z linii z PFA. Na koniec zamknąć zacisk na linii z PFA, gdy PBS dotrze do wlotu butelki z PFA. Napełnić butelkę z PFA w 1/3rd roztworem PFA. Upewnić się, że poziom PBS w butelce z PBS wynosi 1/3rd objętości; w razie potrzeby dopełnić PBS lub odlać nadmiar, otwierając zacisk linii głównej. Skróty: PBS = fosforanowy bufor solny; PFA = paraformaldehyd. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

  1. Przygotuj zestaw do operacji nieprzeżyciowej, czyszcząc następujące instrumenty wodą, a następnie 70% etanolem: duże nożyczki, precyzyjne nożyczki preparacyjne, pęsetę do skóry, precyzyjną pęsetę zakrzywioną z otworem.
  2. Przygotuj znieczulenie, umieszczając chusteczki bezpyłowe w probówce stożkowej o pojemności 50 mL. W dygestorium dokładnie nasącz chusteczki bezpyłowe izofluranem i umieść otwartą probówkę dnem do góry w zlewce o pojemności 500 mL. Upewnij się, że na dnie zlewki nie ma płynnego izofluranu i usuń go przed umieszczeniem myszy w zlewce.
  3. Umieść mysz w zlewce i przykryj otwór folią spożywczą, aby rozpocząć znieczulenie.
  4. Podawaj znieczulenie, aż mysz przestanie oddychać (około 1 min i 30 s).
  5. Gdy oddech ustanie, natychmiast wyjmij mysz ze zlewki i zakręć probówkę stożkową 50 mL.
  6. Sprawdź, czy mysz jest dostatecznie znieczulona, wykorzystując odruch uciśnięcia palca u nogi. Jeśli zwierzę nie jest dostatecznie znieczulone, podaj więcej izofluranu zgodnie z opisem w kroku 3.15.
  7. Działając szybko, umieść mysz na bloku styropianowym i przypnij łapy na zewnątrz za pomocą czterech krótkich igieł (np. igieł strzykawkowych 22 G).
  8. Unosząc skórę brzucha pęsetą do skóry, użyj dużych nożyczek, aby przeciąć ścianę brzucha. Upewnij się, że żadne organy jamy brzusznej nie zostały przecięte!
  9. Kontynuuj cięcie brzucha w kierunku górnym, w stronę wątroby. Oddziel wątrobę od przedniej ściany brzucha i kontynuuj początkowe nacięcie w górę, w kierunku przepony. Zakończ to nacięcie około 1 cm poniżej przepony. Zachowaj ostrożność, aby nie przeciąć wątroby!
  10. Kontynuuj początkowe nacięcie bocznie w górę w stronę prawej i lewej strony przepony, aby wykonać nacięcie w kształcie litery „Y” (Rycina 3A).
  11. Gdy nacięcie dotrze do przepony, wykonaj w niej otwór za pomocą precyzyjnych nożyczek preparacyjnych i przetnij żebra po prawej stronie zwierzęcia. Przetnij żebra mniej więcej do połowy w kierunku prawej pachy.
  12. Wykonaj podobne, ale dłuższe nacięcie przez lewą stronę przepony, niemal do lewej pachy.
  13. Odchyl ścianę klatki piersiowej i przypnij ją do bloku styropianowego.
  14. Jeśli jest to konieczne, odetnij tkankę tłuszczową z okolic serca, aby odsłonić lewą komorę. Zidentyfikuj lewą komorę na podstawie względnie jaśniejszego koloru w porównaniu z prawą komorą.
  15. Po zidentyfikowaniu lewej komory unieruchom serce, stosując lekki nacisk precyzyjną pęsetą zakrzywioną. Otwórz zacisk głównej linii, aby umożliwić przepływ PBS przez igłę. Natychmiast przebij lewą komorę i upewnij się, że igła została wprowadzona nie głębiej niż na 0,5 cm do komory. Jeśli to konieczne, lekko wycofaj igłę.
    UWAGA: Prawidłowe umieszczenie igły w lewej komorze objawia się wstecznym przepływem krwi do drenu igły. Ważne jest, aby igła nie była wprowadzona zbyt głęboko do komory. Może to spowodować wsteczny przepływ przez żyły płucne lub przebicie przegrody międzykomorowej.
  16. Oprzyj dren motylkowy o kształt X wykonany w styropianie za pomocą dwóch dużych igieł 18 G.
    UWAGA: Jest to krytyczne, ponieważ zapobiegnie przesunięciu się igły motylkowej w sercu podczas perfuzji.
  17. Zidentyfikuj żyłę główną dolną w miejscu jej wyjścia z wątroby i przetnij ją za pomocą precyzyjnych nożyczek preparacyjnych (Rycina 3B). Alternatywnie można otworzyć prawy przedsionek nożyczkami.
  18. Natychmiast otwórz główną linię, aby rozpocząć perfuzję PBS (Rycina 3C).
  19. Upewnij się, że PBS spływa z bloku styropianowego do szklanej tacy poniżej. Jeśli tak się nie dzieje, skoryguj kąt nachylenia tacy lub bloku styropianowego, aby umożliwić odpływ płynów do szklanej tacy.
  20. Kontynuuj perfuzję PBS, aż płyn wypływający z żyły głównej dolnej będzie pozbawiony krwi (około 3 min).
    UWAGA: Prawidłowe umieszczenie igły w sercu spowoduje wizualne oczyszczenie wątroby z krwi, która zmieni kolor z czerwonego na słomkowy. Jeśli tak się nie stanie, można to naprawić poprzez ponowne ustawienie igły infuzyjnej w lewej komorze. W celu oceny jakości perfuzji można wykonać małe nacięcie u podstawy brzusznej ogona. Prawidłowa perfuzja objawia się wypływem czystego PBS z nacięcia u podstawy ogona.
  21. Działając szybko, zamknij linię PBS za pomocą zacisku i otwórz linię PFA.
  22. Pozostaw PFA do perfuzji przez kilka minut, aż ogon zacznie się zwijać. Gdy ogon zacznie się zwijać, uruchom timer na 50 min. Jeśli ogon nie zwija się po 5 min perfuzji PFA, uruchom timer na 50 min perfuzji PFA.
  23. stale monitoruj poziom PFA w butelce podczas całej perfuzji, aby upewnić się, że poziom nie spadnie zbyt nisko. Dolej PFA do butelki, jeśli poziom spadnie poniżej 2 cm nad zakrętką butelki.

Proces perfuzji myszy; kaniulacja serca, przecięcie IVC; schemat metody; kroki eksperymentu.
Rysunek 3: Schemat przedstawiający perfuzję transkardialną. (A) Najpierw nacinana jest ściana brzuszna, a następnie wykonuje się dwa nacięcia skierowane bocznie w stronę pachwin, tworząc kształt litery „Y”. (B) Po wejściu do jamy klatki piersiowej i odsłonięciu serca, igłę wprowadza się do lewej komory. Następnie przecina się IVC lub prawy przedsionek, aby umożliwić odpływ perfuzatów po ich krążeniu w organizmie. IVC jest przecinane powyżej przepony. (C) Procedura podawania perfuzatów. Skrót: IVC = żyła główna dolna. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

  1. Po upływie 50 min zaklej linię główną za pomocą kleszczyków hemostatycznych i wyjmij igłę z lewej komory.
    UWAGA: Na tym etapie cała mysz jest sztywna i można ją umieścić w opisanym pojemniku z 4% PFA na noc w temperaturze 4 °C. Na tym etapie możliwe jest wypreparowanie tkanek OUN i umieszczenie ich oddzielnie w utrwalaczu na noc. W niniejszej pracy cała mysz jest umieszczana w utrwalaczu, ponieważ skraca to odstęp czasu między utrwalaniem a umieszczeniem w temperaturze 4 °C. Pozwala to również uniknąć ewentualnych mechanicznych zniekształceń tkanki nerwowej, które mogą wystąpić, jeśli zwierzęta zostaną wypreparowane przed zakończeniem nocnego utrwalania.

4. Disekcja OUN

  1. Przygotować następujące narzędzia do sekcji, myjąc je wodą, a następnie 70% etanolem: nożyczki, pęsetę do skóry, zakrzywioną pęsetę okienkową, zakrzywioną pęsetę precyzyjną, prostą pęsetę precyzyjną oraz nożyczki precyzyjne.
  2. Oznaczyć cztery probówki na jedną mysz w następujący sposób i napełnić je sterylnym 20% sacharozą: ID myszy, Mózg 1, ID myszy, Mózg 2, ID myszy, Lędźwiowy, ID myszy, Szyjny.
  3. Wyjąć mysz z roztworu PFA i osuszyć ją ręcznikiem papierowym, aby usunąć nadmiar PFA.
  4. Za pomocą dużych nożyczek odciąć głowę myszy, wykonując cięcie w okolicy szyi.
  5. Umieścić ciało w roztworze PFA. Zachować głowę w celu wypreparowania mózgu z czaszki.
  6. Aby wypreparować mózg, należy rozpocząć od odsunięcia skóry czaszkowej do przodu, aby odsłonić całą czaszkę (Rycina 4A).
  7. Za pomocą precyzyjnych nożyczek do sekcji wykonać płytkie cięcie w obrębie kanału słuchowego, aby dostać się do wnętrza czaszki.
  8. Kontynuować cięcie wzdłuż zatoki poprzecznej, aż czaszka zostanie przecięta całkowicie pomiędzy obydwoma kanałami słuchowymi.
  9. Wykonać cięcie prostopadłe do poprzedniego, wzdłuż szczeliny podłużnej, aż do najbardziej rostralnej części czaszki (mniej więcej pomiędzy oczami).
  10. Używając zakrzywionej pęsety okienkowej, odsunąć czaszkę bocznie, aby odsłonić przedmózgowie. Kontynuować usuwanie czaszki, aż cały przedmózg, w tym opary węchowe, zostanie odsłonięty.
  11. Rozpocząć sekcję tylnego regionu czaszki, wykonując cięcie przez kość potyliczną i powoli kontynuując je w dół w kierunku otworu wielkiego.
  12. Odsunąć dwa fragmenty czaszki bocznie, aby odsłonić móżdżek i pień mózgu od strony tylnej (Rycina 4B).
  13. Użyć ultraprecyzyjnej pęsety zakrzywionej, aby oddzielić opary węchowe od przedniej części czaszki, a następnie rozpocząć oddzielanie mózgu od podstawy czaszki, zaczynając od oparów węchowych.
  14. W miarę oddzielania mózgu od podstawy czaszki, użyć ultraprecyzyjnej pęsety, aby przeciąć nerwy czaszkowe i umożliwić usunięcie mózgu.
  15. Kontynuować oddzielanie mózgu od podstawy czaszki, aż cały nienaruszony mózg zostanie usunięty (Rycina 4C,D).
  16. Przeciąć mózg na pół wzdłuż szczeliny podłużnej, aby oddzielić od siebie prawą i lewą półkulę (Rycina 4E,F).
  17. Umieścić jedną półkulę w probówce mózg 1, a drugą półkulę w probówce mózg 2. Przechowywać probówki w temperaturze 4 °C do momentu zatonięcia półkul mózgu (około jednej nocy).

Proces sekcji, badanie anatomiczne, preparat mózgu, referencja skali, schemat edukacyjny.
Rycina 4: Usunięcie utrwalonego mózgu. (A) Górna część czaszki. (B) Odsłonięty mózg wewnątrz czaszki. (C) Izolowany mózg (widok grzbietowy). (D) Izolowany mózg (widok brzuszny). (E) Lewa półkula (widok boczny). (F) Lewa półkula (widok przyśrodkowy). Paski skali = 1 cm (E i F). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

  1. Aby przeprowadzić sekcję rdzenia kręgowego, wyjmij ciało myszy z PFA i osusz je za pomocą ręcznika papierowego.
  2. Umieść mysz w pozycji brzusznej na styropianowym bloku sekcyjnym i przymocuj łapy do bloku za pomocą czterech igieł.
  3. Rozpocznij sekcję, przecinając skórę wzdłuż linii środkowej myszy od szyi do ogona, aby odsłonić całą tylną część ciała.
  4. Odchyl mięśnie i powięź na plecach, aby odsłonić tylną część kręgosłupa.
  5. Zaczynając od najbardziej kranialnych kręgów, użyj precyzyjnych nożyczek sekcyjnych, aby przeciąć łuki kręgowe, unikając uszkodzenia rdzenia kręgowego (Rycina 5A).
  6. Wsuń ultraprecyzyjną zakrzywioną pęsetę pod łuk kręgowy i pociągnij do góry, aby złamać kręg i odsłonić rdzeń kręgowy (Rycina 5B).
  7. Użyj zakrzywionej pęsety, aby odsunąć złamane kręgi i odsłonić najbardziej lateralne obszary rdzenia kręgowego.
  8. Kontynuuj ten proces dla kolejnych kręgów, wsuwając ultraprecyzyjną zakrzywioną pęsetę pod łuk kręgowy i łamiąc kręg. Kontynuuj łamanie kręgów, aż zostaną odsłonięte cały odcinek szyjny i piersiowy kręgosłupa (Rycina 5C).
  9. Kontynuuj odsłanianie rdzenia kręgowego aż do końca odcinka lędźwiowego (Rycina 5D).
  10. Za pomocą ostrego ostrza do golenia przetnij rdzeń kręgowy w połowie odcinka piersiowego.
  11. Używając ultraprecyzyjnej zakrzywionej pęsety, przetnij bocznie nerwy rdzeniowe oraz powięź przednią przed rdzeniem kręgowym, aby powoli oddzielić szyjny odcinek rdzenia od kręgosłupa.
  12. Kontynuuj wypreparowywanie szyjnego odcinka rdzenia kręgowego, aż zostanie on całkowicie uwolniony z kręgów (Rycina 5E). Umieść szyjno-środkowopiersiowy odcinek rdzenia w probówce oznaczonej jako cervical. Przechowuj probówkę w temperaturze 4 °C, aż odcinek szyjny rdzenia opadnie na dno (około jednej nocy).
  13. Kontynuuj łamanie kręgów piersiowych aż do ogona końskiego, zgodnie z opisem w krokach od 4.22 do 4.25. Po odsłonięciu ogona końskiego, użyj ostrego ostrza do golenia, aby przeciąć rdzeń kręgowy 1 cm poniżej odcinka lędźwiowego (Rycina 5F).
  14. Wypreparuj lędźwiowy odcinek rdzenia kręgowego z kręgów, zgodnie z opisem w krokach 4.26-4.27. Umieść lędźwiowo-środkowy odcinek ogona końskiego w probówce oznaczonej jako lumbar. Przechowuj probówkę w temperaturze 4 °C, aż odcinek lędźwiowy rdzenia opadnie na dno (około jednej nocy).
  15. Gdy wszystkie tkanki opadną w 20% sacharozie, przenieś je do oznaczonych probówek z 30% sacharozą, aż opadną na dno lub przez 3 dni.
    UWAGA: Tkanki rdzenia często nie opadają w 30% sacharozie.

Proces sekcji pokazujący ścięgna, oznaczone A-H, zbliżenia mikroskopowe do badań anatomicznych.
Rycina 5: Usunięcie utrwalonych segmentów rdzenia kręgowego. (A) Pierwsze nacięcie łuków kręgów szyjnych. (B) Umieszczenie zakrzywionej pęsety w celu złamania poszczególnych kręgów. (C) Odsłonięty odcinek szyjny kręgosłupa. (D) Odsłonięte odcinki szyjny, piersiowy i lędźwiowy kręgosłupa. (E) Usunięcie odcinka szyjnego kręgosłupa po przecięciu nerwów rdzeniowych. (F) Przecinanie odcinka krzyżowego kręgosłupa. (G) Wyizolowany odcinek szyjny kręgosłupa. (H) Wyizolowany odcinek lędźwiowy kręgosłupa. Paski skali = 1 cm (G i H). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

5. Osadzanie w OCT i przechowywanie tkanek

  1. Dla każdej myszy oznakuj cztery prostokątne formy do mrożenia (krymody): ID myszy, Prawa półkula, data zatapiania; ID myszy, Lewa półkula, data zatapiania; ID myszy, Odcinek szyjny, data zatapiania; ID myszy, Odcinek lędźwiowy, data zatapiania.
  2. Przygotuj pojemnik styropianowy i zawieś nad nim metalowy kubek.
  3. Wypełnij pojemnik styropianowy ciekłym azotem do około połowy. Napełnij metalowy kubek świeżym 2-metylobutanem do około połowy.
    UWAGA: 2-Metylobutan jest toksyczny, bardzo lotny i łatwopalny. Należy zachować ostrożność, aby uniknąć jego wdychania, wykonując kolejne kroki w dygestorium i z dala od źródeł zapłonu.
  4. Powoli opuść metalowy kubek do ciekłego azotu, unikając rozpryskiwania ciekłego azotu do wnętrza kubka.
  5. Pozostaw 2-metylobutan do rozpoczęcia zamarzania. Podczas zamarzania 2-metylobutanu wyjmij odpowiednią tkankę z 30% roztworu sacharozy i osusz ją na bezpyłowej chusteczce.
  6. Umieść tkankę w formie do mrożenia tak, aby region rostralny był skierowany w stronę górnej (nieoznakowanej) części formy.
  7. Ostrożnie wlej medium do zatapiania OCT (optimal cutting temperature) nad tkanką w formie, używając tylko takiej ilości, która całkowicie ją przykryje. Unikaj nadmiaru OCT, ponieważ może to spowodować pękanie. Usuń pęcherzyki powietrza z OCT.
  8. Gdy zamrożony 2-metylobutan całkowicie pokryje wewnętrzną powierzchnię metalowego kubka, zanurz formę do mrożenia w znajdującej się powyżej ciekłej fazie 2-metylobutanu na 12 s. Po 12 s umieść formę do odcieknięcia na oznakowanym kwadracie z folii aluminiowej i owiń całą formę. Natychmiast umieść owiniętą formę na suchym lodzie, unikając rozmrożenia. Upewnij się, że zamrożony OCT/forma do mrożenia są zawsze przykryte suchym lodem.
  9. Powtórz kroki od 5.6 do 5.8 dla wszystkich tkanek. Umieść tkankę od jednej myszy w szczelnej małej plastikowej torebce, a następnie w szczelnym pojemniku przeznaczonym do krio-przechowywania. Przechowuj ten pojemnik w zamrażarce głębokiej w temperaturze -80 °C do czasu wykonania cięć.

6. Kriotomia

  1. Przed przystąpieniem do kriosekcjonowania należy upewnić się, że temperatura komory kriosztatu oraz głowicy do próbek są ustawione na odpowiednie wartości.
    UWAGA: Do wycinania przekrojów mózgu stosuje się temperaturę komory -20 °C, temperaturę głowicy -20 °C oraz grubość przekroju 30 µm. W przypadku przekrojów rdzenia kręgowego stosuje się temperaturę komory -23 °C, temperaturę głowicy -30 °C oraz grubość przekroju 30 µm. Należy pamiętać, że ustawienia kriosztatu (zwłaszcza temperaturę głowicy) konieczne będzie dostosować w trakcie sekcjonowania, aby rozwiązać problemy z jakością tkanki. Zazwyczaj temperaturę głowicy obniża się, aby skorygować efekt rozmazywania tkanki. I odwrotnie, temperaturę głowicy podnosi się, aby skorygować nadmierne zwijanie się tkanki.
  2. Wyjmij odpowiedni blok OCT z zamrażarki -80 °C i umieść rozpakowaną formę/blok OCT w komorze kriosztatu.
  3. Pozostaw blok OCT do aklimatyzacji do temperatury komory na 30 min.
  4. Oczyść uchwyt (chuck) 70% etanolem i wytrzyj do sucha ściereczką bezpyłową. Umieść oczyszczony uchwyt w komorze kriosztatu i nanieś na niego kroplę OCT o wielkości monety. Pozostaw OCT do zamrożenia (około 1-2 min).
  5. Po zamrożeniu OCT nanieś na uchwyt małą kroplę świeżego OCT i niezwłocznie umieść na nim blok tkankowy w OCT. Przed całkowitym zamarznięciem OCT upewnij się, że tkanka jest ustawiona idealnie prostopadle do uchwytu.
    UWAGA: Zazwyczaj najbardziej rostralny region mózgu umieszcza się w stronę uchwytu, tak aby sekcjonowanie rozpoczynało się od końca kaudalnego. W przypadku rdzenia kręgowego zazwyczaj najbardziej kaudalny region umieszcza się na uchwycie, aby sekcjonowanie zaczynało się od końca rostralnego.
  6. Gdy OCT stwardnieje, nałóż więcej OCT wokół podstawy bloku OCT, aby stanowiło ono wsparcie strukturalne podczas sekcjonowania. Po lekkim stwardnieniu tego wsparcia umieść uchwyt na głowicy do próbek i pozostaw blok OCT na 30 min, aż osiągnie on temperaturę głowicy.
  7. Włóż ostrze mikrotomu do uchwytu na ostrza i oczyść płytkę antyrolującą. Dostosuj odległość płytki antyrolującej tak, aby podczas sekcjonowania tkanka przechodziła tuż pod płytką. Więcej informacji na temat prawidłowego ustawienia płytki antyrolującej znajduje się w instrukcji obsługi kriosztatu.
  8. Po aklimatyzacji bloku OCT do temperatury głowicy rozpocznie przycinanie bloku OCT, aż do momentu odsłonięcia tkanki. Gdy tkanka stanie się widoczna, przejdź z trybu przycinania do trybu sekcjonowania i zacznij wycinać przekroje o grubości 30 μm. Odsuń płytkę antyrolującą i za pomocą szkiełka przedmiotowego pobierz przekrój.
  9. Kontynuuj wycinanie i zbieranie przekrojów, aż do uzyskania pożądanej lokalizacji anatomicznej lub wycięcia całej tkanki. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia w temperaturze pokojowej na 1-3 dni. Po wyschnięciu umieść szkiełka w kasetce i włóż ją do szczelnej plastikowej torby. Oznacz torbę identyfikatorem myszy oraz informacjami o tkance przed umieszczeniem szkiełek w zamrażarce głębokiej -80 °C.

7. Barwienie immunofluorescencyjne

  1. Rozmrażać preparaty na szkiełkach przez 1 h w temperaturze pokojowej.
  2. Umieścić szkiełka w poziomym pojemniku na szkiełka i przemyć sekcje 3 razy w PBS przez 10 min każdego płukania w temperaturze pokojowej na wytrząsarce.
  3. Przygotować bufor blokujący (2% BSA + 0,3% Triton-X-100 w 1x PBS). Zużyć około 1 mL na szkiełko.
  4. Stworzyć komorę wilgotną, wlewając wodę na dno. Położyć szkiełka poziomo stroną preparatu do góry i nie dopuścić do ich wyschnięcia. Dodać 1 mL buforu blokującego na każde szkiełko i inkubować przez co najmniej 1 h w temperaturze pokojowej.
  5. Przygotować roztwór przeciwciała pierwszorzędowego poprzez rozcieńczenie przeciwciała pierwszorzędowego w buforze do przeciwciał (0,7% BSA + 0,3% Triton-X-100 w 1x PBS).
    UWAGA: Dla przeciwciała przeciwko fosforylowanej α-synuclein zastosowano rozcieńczenie 1:500.
  6. Dodać 200-300 µL roztworu przeciwciała pierwszorzędowego na szkiełko. Przykryć szkiełkiem podstawowym w celu rozprowadzenia przeciwciała i inkubować w 4 °C przez noc.
  7. Następnego dnia wyjąć szkiełka z komory wilgotnej i umieścić je w pionowym słoiku Coplina wypełnionym 1x PBS, aby szkiełko podstawowe mogło odpaść. Wykonać tę czynność dla każdego szkiełka z osobna, uważając, aby nie naruszyć sekcji tkanki podczas usuwania szkiełka podstawowego.
  8. Umieścić szkiełka w poziomym pojemniku na szkiełka i przemyć sekcje 3 razy w PBS przez 10 min każdego płukania w temperaturze pokojowej na wytrząsarce.
    UWAGA: Wszystkie kolejne kroki muszą być wykonywane przy zgaszonym świetle, aby uniknąć fotowyblaknięcia fluoroforu!
  9. Przygotować roztwór przeciwciała drugorzędowego poprzez rozcieńczenie przeciwciała drugorzędowego w buforze do przeciwciał.
    UWAGA: Do detekcji fosforylowanej α-synuclein zastosowano przeciwciało drugorzędowe anty-królicze sprzężone z Alexa 488 w rozcieńczeniu 1:500 w buforze do przeciwciał (0,7% BSA + 0,3% Triton-X-100 w 1x PBS).
  10. Położyć szkiełka poziomo w komorze wilgotnej i dodać 200-300 µL roztworu przeciwciała drugorzędowego na szkiełko. Przykryć szkiełkiem podstawowym w celu rozprowadzenia przeciwciała. Inkubować w temperaturze pokojowej przez co najmniej 2 h.
  11. Wyjąć szkiełka z komory wilgotnej i umieścić je w pionowym słoiku Coplina wypełnionym 1x PBS, aby szkiełko podstawowe mogło odpaść. Wykonać tę czynność dla każdego szkiełka z osobna, uważając, aby nie naruszyć sekcji tkanki podczas usuwania szkiełka podstawowego.
  12. Umieścić szkiełka w poziomnym pojemniku na szkiełka i przemyć sekcje 3 razy w PBS przez 10 min każdego płukania w temperaturze pokojowej na wytrząsarce.
  13. Osuszyć krawędzie szkiełek ręcznikiem i strząsnąć nadmiar PBS.
  14. Dodać 3 krople medium montującego na każde szkiełko. Nałożyć szkiełko podstawowe i delikatnie wypchnąć pęcherzyki powietrza pęsetą, dociskając szkiełko podstawowe przed obrazowaniem za pomocą mikroskopii konfokalnej.

Wyniki

Wskaźnikiem wysokiej jakości perfuzji jest brak krwi w wątrobie, rdzeniu kręgowym i głębokich strukturach OUN (Rysunek 4C oraz Rysunek 5G,H). Pozostałości krwi pod oponą twardą (na przykład w zatokach żylnych) lub między oponą twardą a czaszką nie stanowią problemu, ponieważ krew ta nie znajduje się w miąższu mózgu. Krew widoczna na Rysunku 4A znajduje się między czaszką a oponą twardą, w związku z czym nie jest problematyczna ani nie sugeruje niskiej jakości perfuzji. Świeży mózg i rdzeń kręgowy są dość miękkie i łatwo ulegają uszkodzeniu podczas manipulacji. W porównaniu z nimi tkanki odpowiednio utrwalone są twarde. Aby ocenić jakość tkanki i zachowanie morfologii tkanek przy zastosowaniu tej metody perfuzji, w niniejszej pracy zaprezentowano detekcję fosforylowanej α-synukleiny w śródmózgowiu i lędźwiowym odcinku rdzenia kręgowego 15-miesięcznej myszy oraz 7-miesięcznej myszy wykazującej ekspresję ludzkiej α-synukleiny A53T (Rysunek 6).

Mutacja A53T występuje z nadreprezentacją u pacjentów z autosomalną dominującą postacią choroby Parkinsona (PD). Ponadto ludzka α-synukleina z mutacją A53T, po ekspresji u myszy, może odtwarzać wiele cech ludzkiej PD6,7. Wykazano in vivo oraz in vitro, że fosforylacja α-synukleiny w pozostałości seryny 129 indukuje agregację α-synukleiny8. Ciałka Lewy’ego są klasycznym znaleziskiem histologicznym występującym u pacjentów z PD lub otępieniem z ciałkami Lewy’ego9. Większość α-synukleiny obecnej w ciałkach Lewy’ego jest fosforylowana w serynie 12910,11. W związku z tym akumulacja fosforylowanej α-synukleiny jest wykorzystywana jako marker histologicznego stopnia nasilenia patologii PD. Niniejsze badanie wykazuje, że fosforylowana α-synukleina akumuluje się na znacznie wyższym poziomie u 15,5-miesięcznych myszy objawowych w porównaniu do 7-miesięcznych myszy bezobjawowych wykazujących ekspresję ludzkiej A53T α-synukleiny. Jest to zgodne z doniesieniami opisującymi nasilenie cytopatologii w rogach przednich rdzenia kręgowego oraz w śródmózgowiu tych myszy.6 Na tej podstawie wyciągnięto wniosek, że opisana tutaj uproszczona metoda perfuzji zapewnia wysokiej jakości utrwalenie tkanek OUN do dalszej charakterystyki histologicznej.

Mikroskopia fluorescencyjna śródmózgowia i odcinka lędźwiowego kręgosłupa dla α syn-A53T; marker PS129, schemat porównania wieku.
Rycina 6: Wyznakowanie fosforylowanej α-synukleiny w tkankach śródmózgowia i rdzenia kręgowego w odcinku lędźwiowym u mysiego modelu choroby Parkinsona. Mysz w zaawansowanym stadium choroby z paraliżem (w wieku 15,5 miesiąca) została porównana z zdrową myszą w wieku 7 miesięcy. Obie myszy wykazują ekspresję podatnego na błędne fałdowanie wariantu mutantowego (A53T) ludzkiej α-synukleiny, który indukuje patologię przypominającą chorobę Parkinsona. Paski skali = 100 µm (panele górne) i 50 µm (panele dolne). Skróty: α syn-A53T = mutant A53T α-synukleiny; DAPI = 4',6-diamidyno-2-fenyloindol; PS129 = fosforylowana seryna 129 α-synukleiny. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

W tej pracy opisano kluczowe etapy wykonywania perfuzji przezsercowej. Podczas konstruowania aparatu perfuzyjnego (sekcja 1 protokołu) ważne jest, aby używać rurek, które są wystarczająco elastyczne, aby można je było całkowicie zasłonić przez hemostat. Niektóre sztywne rurki mogą nie być wystarczająco zasłonięte przez hemostat i mogą nadal pozwalać na wyciek PFA do głównej linii podczas początkowej perfuzji PBS. Podczas przygotowywania 4% roztworu PFA ważne jest, aby upewnić się, że pH jest fizjologiczne (7.4). Ponieważ przygotowanie roztworu PFA wymaga podgrzania go do temperatury 65 °C, roztwór musi zostać schłodzony z powrotem do 25 °C przed pomiarem pH, ponieważ jest to temperatura, w której pH jest kalibrowane na mierniku.

Podczas wykonywania pierwszego nacięcia w jamie brzusznej należy zachować ostrożność, aby uniknąć uszkodzenia narządów jamy brzusznej (punkt 2 protokołu). Podczas preparacji w kierunku przepony ważne jest, aby uniknąć uszkodzenia wątroby, ponieważ często wątroba przylega do przedniej ściany brzucha. Aby temu zaradzić, wątroba jest ostrożnie i tępo wycinana z dala od przedniej ściany przed kontynuowaniem nacięcia w kierunku przepony. Przy wchodzeniu do jamy klatki piersiowej przez przeponę ważne jest, aby uniknąć uszkodzenia serca, dużych naczyń krwionośnych i płuc. Aby tego uniknąć, końcówka nożyczek jest trzymana powierzchownie i pod ostrym kątem z klatką piersiową.

Wstępna sekcja w celu odsłonięcia serca trwa około 2 minut od pierwszego nacięcia. Oczekuje się, że w tym czasie trochę powietrza dostało się do końcówki igły motyla. Wprowadzenie tego powietrza do krążenia myszy spowoduje złą jakość perfuzji. Dlatego bardzo ważne jest, aby główna linia została otwarta, a PBS został przepłukany przez igłę bezpośrednio przed kaniulacją serca w celu usunięcia pęcherzyków powietrza. Idealnie byłoby, gdyby serce było kaniulowane, podczas gdy mała strużka PBS przepływa przez końcówkę igły, aby zapewnić całkowity brak powietrza podczas nakłuwania LV.

Kiedy igła wchodzi do lewej komory, nie może wchodzić tak głęboko, aby wprowadzić końcówkę igły do prawej komory (RV). Umieszczenie igły w RV lub poza zastawką mitralną spowoduje natychmiastowe "napompowanie" płuc po rozpoczęciu perfuzji. Jest to niepożądane i igłę należy lekko wycofać, aby zapewnić umieszczenie lewej dawki prądu. Jeśli igła zostanie prawidłowo umieszczona, płuca pozostaną płaskie przez cały czas trwania perfuzji. Po rozpoczęciu perfuzji czasami obserwuje się, że z otwartego pyska zwierzęcia wyłania się przezroczysty płyn. Jest to zwykle spowodowane zbyt wysokim ciśnieniem perfuzji lub niewłaściwym umieszczeniem igły w sercu. Autorzy spekulują, że podwyższone ciśnienie perfuzji powoduje wynaczynienie perfuzatu z łożyska naczynia włosowatego tętniczki i wsteczny przepływ PBS przez drzewo oskrzelowe do przełyku i jamy ustnej.

Ciśnienie perfuzji musi być obniżone poprzez zmniejszenie poziomu PBS w butelce PBS lub poprzez obniżenie wysokości butelki PBS. Alternatywnie, jeśli igła zostanie umieszczona zbyt głęboko w lewej komorze, może przejść przez zastawkę mitralną i dostarczyć perfuzat do lewego przedsionka. Może to spowodować wsteczny przepływ przez żyły płucne i wynaczynienie perfuzatu do tętniczek, jak opisano powyżej. Dokładne usunięcie krwi z układu krążenia za pomocą PBS jest szczególnie ważne, aby uniknąć indukowanego utrwalaniem elementów krwi, powodującego niedrożność naczyń po późniejszej perfuzji utrwalającej. Klirens jest skutecznie oceniany przez zmianę koloru wątroby i przepływ PBS z nacięcia w brzusznej podstawie ogona. Klirens krwi jest na ogół całkowity po 3 minutach perfuzji z PBS; Jeśli jednak wizualne oznaki oczyszczenia pojawiają się w krótszym czasie, utrwalacz wprowadza się wcześniej niż 3 minuty. Dłuższe czasy klirencji nie są zalecane, ponieważ opóźniona perfuzja utrwalająca prowadzi do artefaktów w drobnej strukturze OUN1.

Podczas podawania PFA ważne jest, aby monitorować poziom roztworu PFA w butelce PFA. Napełnij butelkę PFA, jeśli poziom PFA spadnie poniżej 4 cm powyżej wylotu butelki PFA. Po zakończeniu perfuzji aparat perfuzyjny należy dokładnie przepłukać wodą destylowaną. Jest to ważne, ponieważ resztki PFA w głównej linii zanieczyszczą początkową perfuzję PBS PFA i spowodują perfuzję niskiej jakości. Wreszcie, igły motylkowe 25 G są ogólnie zalecane dla średniej wielkości dorosłych myszy w zakresie 20-30 g. Jednak większe lub mniejsze myszy mogą wymagać nieco większych lub mniejszych igieł oprócz regulacji butelek utrwalających, aby zapewnić optymalne natężenie przepływu.

W przypadku rozwarstwienia OUN i osadzenia OCT (sekcja 3 protokołu) często zdarza się, że tkanki rdzenia kręgowego nie zapadają się całkowicie w 30% sacharozy. Tkanki te pozostawia się zatem w sacharozie na 2 dni, a następnie zatapia w OCT, niezależnie od tego, czy toną, czy nie. Podczas zamrażania tkanek w OCT możliwe jest, że niektóre tkanki mogą pękać po umieszczeniu w schłodzonym 2-metylobutanie. Jest to bardziej powszechne w przypadku mózgu i zwykle występuje, gdy zbyt dużo OCT zostanie umieszczone na tkance. Aby tego uniknąć, umieść tylko tyle OCT, aby pokryć powierzchnie tkanek przed natychmiastowym zamrożeniem. W niektórych protokołach cracking jest mniej powszechny pomimo całkowitego zanurzenia w OCT. Jest to zwykle spowodowane wolniejszą metodą zamrażania, taką jak stosowanie 2-metylobutanu chłodzonego suchym lodem lub bezpośrednie umieszczanie kriofordu na bloku suchego lodu. W tej pracy preferowany jest 2-metylobutan chłodzony ciekłym azotem, ponieważ szybkość zamrażania jest znacznie szybsza i może lepiej zachować morfologię tkanek niż wolniejsze metody zamrażania.

Podczas kriosekcji tkanki (sekcja 4 protokołu) ważne jest, aby unikać wielokrotnych cykli zamrażania i rozmrażania. Dlatego optymalne jest wycięcie wszystkich sekcji z jednego bloku OCT, aby uzyskać określony obszar mózgu do analizy, zamiast rozmrażania i ponownego zamrażania wybranych obszarów. Jeśli nie jest to możliwe, po uzyskaniu kilku sekcji użytkownicy mogą ponownie zamrozić i przechowywać bloki OCT w zamrażarce o temperaturze -80 °C jeszcze 1-2 razy do wykorzystania w przyszłości.

Główne zalety tej metody w porównaniu z bardziej tradycyjnym pompą lub podawaniem perfuzatu pod ciśnieniem powietrza są następujące: (1) niski koszt i dostępność aparatu do perfuzji. (2) Użytkownicy nie muszą ręcznie utrzymywać ciśnienia w aparacie perfuzyjnym przez cały czas trwania perfuzji. (3) Niższe i bardziej stałe ciśnienie perfuzji niż inne tanie alternatywy dla perfuzji, takie jak dostarczanie strzykawką. Korzystając z równania Bernoulliego, oblicza się, że skonstruowany tutaj aparat perfuzyjny zasilany grawitacyjnie utrzyma ciśnienie perfuzyjne około 73 mm Hg, gdy butelki z perfuzatem zostaną umieszczone na wysokości 1 m w stosunku do igły. Biorąc pod uwagę, że jest to znacznie poniżej skurczowego ciśnienia krwi tych zwierząt, to ciśnienie perfuzyjne jest prawdopodobnie wystarczająco niskie, aby uniknąć pęknięcia naczyńkrwionośnych 12.

Autorzy do tej pory z powodzeniem wykorzystali ten system perfuzyjny do wykrycia obecności fosforylowanej α-synukleiny w mysim modelu choroby Parkinsona. W tym czasie nie napotkano znaczących ograniczeń związanych z tą metodą perfuzji, które nie występują w przypadku metody dostarczania perfuzji z pompą. Głównym ograniczeniem tej techniki jest czasochłonny charakter perfuzji w porównaniu z utrwalaniem kropli. Ta technika jest lepsza niż upuszczanie fiksacji, ponieważ perfuzja powoduje głębszą penetrację utrwalacza do struktur OUN. Drugim ograniczeniem tej techniki jest to, że wymaga ona pewnych umiejętności chirurgicznych, ponieważ serce musi zostać kaniulowane szybko po wejściu do jamy klatki piersiowej. Jednak wraz z doświadczeniem przeszkoleni użytkownicy mogą rutynowo kanalizować serce w ciągu 1 minuty od początkowego nacięcia w jamie brzusznej.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Podziękowania

Autorzy dziękują Xiaowen Wang, Liamowi Coyne'owi i Jasonowi Grullonowi za pomoc w rozwijaniu tego protokołu. Prace te były wspierane przez granty NIH AG061204 i AG063499.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
2-metylobutan (certyfikowany ACS), Fisher ChemicalFisher Scientific03551-4
Andwin Scientific Tissue-Tek OCT CompoundFisher ScientificNC1029572
Artman Instruments 4,5-calowe proste nożyczki sprężynowe CastroveijoAmazonB0752XHK2X"cienkie nożyczki"
BD ogólnego zastosowania i igły podskórne PrecisionGlide, 18 gFisher Scientific14-826-5D
BD Ogólnego zastosowania i igły podskórne PrecisionGlide, 22 gFisher Scientific14-826B
Filtry strzykawkowe Corning PESFisher Scientific09-754-29
Cytiva Hyclone Fosforan buforowany solą fizjologiczną (PBS), 10xFisher ScientificSH30258
Falcon 50 ml stożkowe probówki wirówkoweFisher Scientific14-432-22
Fisher BioReagents Albumina surowicy bydlęcej (BSA) Proszek bez proteazFisher Scientific BP9703100
Fisherbrand Zakrzywione średniopunktowe kleszcze ogólnego przeznaczeniaFisher Scientific16-100-110"zakrzywione kleszcze z okienkiem"
Fisherbrand Zakrzywione bardzo cienkie precyzyjne kleszczeFisher Scientific16-100-123" zakrzywione drobne kleszcze"
Jednorazowe pipety transferowe z podziałką FisherbrandFisher Scientific13-711-9AM
Fisherbrand Wysokoprecyzyjna, prosta, stożkowa, ultra cienka pęseta/kleszczeFisher Scientific12-000-122"proste kleszcze drobnoziarniste"
Mikroszpatułki Fisherbrand z zaokrąglonymi końcamiFisher Scientific21-401-5
Lejki porcelanowe Fisherbrand Buchner ze stałymi perforowanymi płytkamiFisher ScientificFB966J
Szkło osłonowe Fisherbrand Premium, 24 x 50Fisher Scientific12-548-5M
Kleszczyki do tkanek Fisherbrand Premium 1X2 zęby 5 w. Niemiecka stalFisher Scientific13-820-074"kleszcze do skóry"
Fisherbrand Wielorazowe grubościenne kolby filtracyjneFisher ScientificFB3002000
Fisherbrand Standardowe nożyczki preparacyjneFisher Scientific08-951-20"nożyczki preparacyjne"
Fisherbrand Sterylne strzykawki do jednorazowego użytkuFisher Scientific14-955-464
Hemostatyki z prostym blokowaniem FisherbrandFisher Scientific16-100-115
Szkiełka mikroskopowe Fisherbrand Superfrost PlusFisher Scientific12-550-15
Zestawy rurek i złączy winylowych Fisherbrand, 1/4 cala.Fisher Scientific14-174-1C
Fisherbrand Wzmocnione na mokro jakościowe koła z bibuły filtracyjnejFisher Scientific09-790-12F
Fisherbrand Y Złącze z 1/4 cala. ID - Polipropylen - QCFisher Scientific01-000-686
Garvey Economy Ostrze tnące z pojedynczą krawędzią AmazonB001GXFAEQ
Koza anty-królicza IgG (H + L) Wtórne przeciwciało, DyLight 488ThermoFisher Scientific35552
Idealny zacisk Stant Zaciski wysokociśnienioweFisher Scientific14-198-5A"opaski zaciskowe"
IMEB, Inc Sakura Accu-Edge Niskoprofilowe ostrza mikrotomowe, jednorazoweFisher ScientificNC9822467
Kawasumi 25 Gauge Standardowy skrzydlaty zestaw do pobierania krwiFisher Scientific22-010-137"igła motylkowa"
Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delikatne wycieraczki do zadań, 1-warstwoweFisher Scientific06-666
Sondy molekularne ProLong Diamond Anti Blaknięcie z DAPIFisher ScientificP36962
Butelki do mycia LDPE z wąskimi ustami ThermoFisherScientific2425-0506"butelki buforowe"
Długopis PAPabcamab2601
Paraformaldehyd Granulowanesystemy mikroskopii elektronowej19210
Suszenie szkła Pyrex Naczynia, 34,9 x 24,9 x 6 cmRekombinowane15-242D
[EP1536Y]abcamab51253
Wodorotlenek soduSigma-Aldrich221465-2,5 kg
Kubek do picia ze stali nierdzewnej 18 uncjiamazonB0039PPO9U
sacharozy do biologii molekularnej CAS: 57-50-1BiologicznyUSAS8010
Triton X-100Us BiologicznyT8655
Vetone Fluriso Isoflurane USPMWI Zdrowie zwierząt502017
przeciwciało anty-alfa-synukleinowe (fosfo S129) Fisher Scientific

Bibliografia

  1. Tao-Cheng, J. H., Gallant, P. E., Brightman, M. W., Dosemeci, A., Reese, T. S. Structural changes at synapses after delayed perfusion fixation in different regions of the mouse brain. Journal of Comparative Neurology. 501 (5), 731-740 (2007).
  2. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), e3564(2012).
  3. McFadden, W. C., et al. Perfusion fixation in brain banking: a systematic review. Acta Neuropathologica Communications. 7 (1), 146(2019).
  4. Lamberts, R., Goldsmith, P. C. Fixation, fine structure, and immunostaining for neuropeptides: perfusion versus immersion of the neuroendocrine hypothalamus. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 34 (3), 389-398 (1986).
  5. Adickes, E. D., Folkerth, R. D., Sims, K. L. Use of perfusion fixation for improved neuropathologic examination. Archives of Pathology and Laboratory Medicine. 121 (11), 1199-1206 (1997).
  6. Giasson, B. I., et al. Neuronal alpha-synucleinopathy with severe movement disorder in mice expressing A53T human alpha-synuclein. Neuron. 34 (4), 521-533 (2002).
  7. Martin, L. J., et al. Parkinson's disease alpha-synuclein transgenic mice develop neuronal mitochondrial degeneration and cell death. Journal of Neuroscience. 26 (1), 41-50 (2006).
  8. Fujiwara, H., et al. alpha-Synuclein is phosphorylated in synucleinopathy lesions. Nature Cell Biology. 4 (2), 160-164 (2002).
  9. Kalia, L. V., Lang, A. E. Parkinson's disease. Lancet. 386 (9996), 896-912 (2015).
  10. Anderson, J. P., et al. Phosphorylation of Ser-129 is the dominant pathological modification of alpha-synuclein in familial and sporadic Lewy body disease. Journal of Biological Chemistry. 281 (40), 29739-29752 (2006).
  11. Kahle, P. J., et al. Hyperphosphorylation and insolubility of alpha-synuclein in transgenic mouse oligodendrocytes. EMBO Reports. 3 (6), 583-588 (2002).
  12. Mattson, D. L. Comparison of arterial blood pressure in different strains of mice. American Journal of Hypertension. 14, 405-408 (2001).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Perfuzja grawitacyjnautrwalanie paraformaldehydemsekcja m zgusekcja rdzenia kr gowegobarwienie immunofluorescencyjnekriosekcjonowaniedetekcja alfa synukleiny
Grawitacyjna metoda perfuzji przezsercowej do analizy histologicznej ośrodkowego układu nerwowego myszy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.