Artykuł metodologiczny

Mikrofizjologiczny układ wątroby człowieka do oceny toksyczności wątroby indukowanej lekami in vitro

7.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63389

⸱

31 stycznia 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1CN Bio Innovations Ltd

W tym artykule

Podsumowanie

Indukowane lekami uszkodzenie wątroby (DILI) jest główną przyczyną niepowodzenia leku. Opracowano protokół umożliwiający dokładne przewidywanie odpowiedzialności związku za DILI za pomocą systemu mikrofizjologicznego wątroby (MPS). Model wątroby wykorzystuje kokulturę pierwotnych komórek wątroby i punktów końcowych istotnych translacyjnie do oceny odpowiedzi komórkowych na leczenie.

Streszczenie

DILI jest główną przyczyną wyczerpania w rozwoju leków, z ponad 1000 zatwierdzonych przez FDA leków, o których wiadomo, że potencjalnie powodują DILI u ludzi. Niestety, DILI często nie jest wykrywany, dopóki leki nie osiągną stadium klinicznego, co zagraża bezpieczeństwu pacjentów i prowadzi do znacznych strat dla przemysłu farmaceutycznego. Biorąc pod uwagę, że standardowe modele 2D mają ograniczenia w wykrywaniu DILI, konieczne jest opracowanie modeli in vitro, które są bardziej predykcyjne, aby poprawić translatywalność danych. Aby szczegółowo zrozumieć przyczynowość i mechanistyczne aspekty DILI, opracowano MPS ludzkiej wątroby składający się z ludzkich pierwotnych komórek miąższowych i niemiąższowych wątroby (NPC) i hodowanych w mikrotkankach 3D na zmodyfikowanym rusztowaniu pod perfuzją. Kriokonserwowane pierwotne ludzkie hepatocyty (PHH) i komórki Kupffera (HKC) hodowano wspólnie jako mikrotkanki na platformie MPS przez okres do dwóch tygodni, a każdy związek będący przedmiotem zainteresowania był wielokrotnie dawkowany na mikrotkanki wątroby w siedmiu stężeniach testowych przez okres do czterech dni. Przeanalizowano funkcjonalne punkty końcowe specyficzne dla wątroby (w tym biomarkery kliniczne, takie jak aminotransferaza alaninowa, AlAT) w celu oceny czynności wątroby. Ostre i przewlekłe narażenie na związki o różnym nasileniu DILI można ocenić, porównując odpowiedzi na mikrotkanki podawane w pojedynczej i wielokrotnej dawce. Metodologia ta została zwalidowana z szerokim zestawem ciężkich i łagodnie hepatotoksycznych związków. Poniżej przedstawiamy dane dotyczące pioglitazonu i troglitazonu, dobrze znanych związków hepatotoksycznych wycofywanych z rynku w celu powodowania niewydolności wątroby. Ogólnie rzecz biorąc, wykazano, że model MPS wątroby może być użytecznym narzędziem do oceny DILI i jego związku ze zmianami czynności wątroby. Model może być dodatkowo wykorzystany do oceny, jak nowe związki zachowują się w różnych podgrupach pacjentów oraz jak na profile toksyczności mogą wpływać stany chorobowe wątroby (np. wirusowe zapalenie wątroby, stłuszczenie wątroby).

Wprowadzenie

DILI pozostaje najczęstszą przyczyną ostrej niewydolności wątroby w USA i Europie i jest główną przyczyną zaniku związków w procesie opracowywania leków1. Prawie wszystkie klasy leków mogą powodować hepatotoksyczność, przy czym leki na ośrodkowy układ nerwowy i antybiotyki są zdecydowanie najczęstszymi metodami leczenia, które powodują DILI u pacjentów2. Hepatotoksyczność wywołana lekiem jest spowodowana złożoną interakcją czynników genetycznych, niegenetycznych i środowiskowych, prowadzącą do śmierci hepatocytów i innych typów komórek wątroby, w tym cholangiocytów i komórek śródbłonka1,3.

Czynniki wywołujące DILI można sklasyfikować na dwa sposoby: te, które powodują przewidywalne, zależne od dawki uszkodzenie wątroby lub te, które powodują idiosynkratyczne DILI, które jest rzadkie i rozwija się niezależnie od dawki leku, drogi lub czasu podania, ale jest odpowiedzialne za do jednej szóstej wszystkich ostrych niewydolności wątroby tylko w USA4. Niestety, DILI często nie jest wykrywany, dopóki leki nie osiągną klinicznych etapów procesu opracowywania leku. Ranga leczenia lekami w przypadku uszkodzenia wątroby (lub DILIrank) składa się z ponad tysiąca leków zatwierdzonych przez FDA, które są podzielone na cztery klasy w zależności od ich potencjału do wywoływania DILI, a ich stosowanie u pacjentów musi być ściśle monitorowane5.

Badanie mechanizmów hepatotoksyczności leków pozostaje bardzo trudne, dlatego też opracowano wiele modeli przedklinicznych w celu zbadania mechanizmów DILI. Obecne modele in vitro i in vivo wykorzystywane do przewidywania DILI w badaniach przedklinicznych mają kilka ograniczeń w dostarczaniu wglądu w złożone, wieloaspektowe interakcje w żywym ciele ludzkim. Nowotworowe linie komórek wątroby (tj. HepG2, HepaRG) hodowane w 2D są nadal używane we wczesnych stadiach rozwoju leku do oceny toksyczności związków kandydujących6. Mimo to te linie komórkowe pochodzą od pojedynczych dawców i wykazują nieprawidłowy poziom czynności wątroby i nie zawsze wykazują wysoką czułość w wykrywaniu DILI7,8. Jako alternatywa dla nowotworowych linii komórkowych wątroby, PHH lepiej reprezentują fizjologię ludzkiej wątroby, jeśli są odpowiednio hodowane in vitro, chociaż istnieje kilka ograniczeń związanych z ich hodowlą, takich jak krótki czas inkubacji z lekami, stosunkowo krótka długość życia, utrata ekspresji genów wątrobowych i zmiany funkcji metabolicznych leków9,10,11. PHH mogą być hodowane na białkach macierzy zewnątrzkomórkowej na standardowych płytkach do hodowli komórkowych 2D, ale wadą jest szybki spadek ich funkcji, co oznacza, że mają niską czułość (<50%) na przewidywanie DILI12.

Z drugiej strony, testowanie na modelach zwierzęcych jest powolne, kosztowne i wymaga translacji międzygatunkowej, aby ekstrapolować przewidywania na ludzi. Większość nowo opracowanych leków nie uzyskuje aprobaty, co czyni ten proces kosztownym i ryzykownym5. Ponadto, do testowania nowych modalności specyficznych dla człowieka, modele zwierzęce są mniej odpowiednie ze względu na różnice w sekwencji genów lub odpowiedzi immunologicznej w porównaniu z ludźmi13.

W związku z tym, zainteresowanie bardziej zaawansowanymi trójwymiarowymi (3D) modelami wątroby in vitro gwałtownie wzrosło. Hodowla PHH jako sferoidalnych struktur generowanych przez agregację grawitacyjną w wiszących kroplach lub na bardzo niskich powierzchniach mocowania stanowi wysokoprzepustową metodę oceny zobowiązań złożonych14. Sferoidy PHH zostały użyte do oceny DILI w tle chorobowym (np. stłuszczenie i cholestaza)15. Opracowano szeroką gamę modeli, aby uwzględnić platerowane mikrowzorzyste kokultury hepatocytów z fibroblastami zrębu 16, 3D bio-printed liver tissues17, 3D sferoidalne kultury z komórkami niemiąższowymi wątroby lub bez nich15. Jednak wszystkie te metody nadal mają wady, a hodowla PHH w bardziej fizjologicznie istotnym mikrośrodowisku może zapewnić im wyższy poziom funkcjonalności przez dłuższy czas, aby umożliwić badanie długotrwałego narażenia na potencjalne hepatotoksyczne. Dodatkowo, aby poprawić znaczenie translacyjne każdej zaawansowanej hodowli PHH in vitro, należy wykorzystać klinicznie istotne funkcjonalne punkty końcowe lub biomarkery wyjściowe toksyczności, aby umożliwić porównanie danych in vivo lub scenariuszach klinicznych18.

W tym badaniu oceniliśmy, czy model wątroby in vitro MPS, znany również jako Organ-on-a-Chip (OOC), może być użyty do zrozumienia szczegółowych mechanistycznych aspektów toksyczności wątroby. Wcześniej wykazano, że MPS utrzymuje wysoce funkcjonalne mikrotkanki wątroby 3D, pod przepływem, przez okres do 4 tygodni19. System został niedawno przetestowany przez FDA i wykazano, że ma wysoką odtwarzalność podczas wykonywania testów toksyczności leków, metabolizmu i akumulacji wewnątrzkomórkowej20. Co więcej, w porównaniu ze sferoidami i kulturami kanapkowymi, system miał bardziej stabilną funkcję i wyższą czułość w wykrywaniu toksyczności kilku leków20. Do tej pory MPS był używany w szerokim zakresie zastosowań, które obejmują ADME21, modelowanie chorób (HBV22, NAFLD23,24,25) oraz interakcje lek-lek26, co potencjalnie czyni go wysoce odpowiednim do oceny ostrego i przewlekłego DILI. Przedstawiona tu technologia stanowi alternatywę pozwalającą wypełnić lukę między bardziej tradycyjnymi hodowlami komórkowymi i modelami zwierzęcymi a badaniami klinicznymi na ludziach, posuwając się w kierunku symulacji warunków biologicznych człowieka w celu wsparcia oceny toksyczności substancji kandydujących dla wątroby na przedklinicznych etapach procesu opracowywania leku.

Protokół

Wszystkie prace zostały przeprowadzone w laboratorium zgodnie z rygorystycznymi procedurami BHP oraz zgodnie z wewnętrznymi ocenami ryzyka i standardowymi procedurami operacyjnymi (SOP). Wszystkie użyte urządzenia są serwisowane zgodnie z wytycznymi producenta. Mikrobiologiczne szafy bezpieczeństwa (MBSC) są serwisowane corocznie, a Ki-Discus (jodek potasu) testowany zgodnie z brytyjskimi normami. Protokół jest zgodny z Kodeksem Praktyk i dyrektywami brytyjskiego Human Tissue Authority (HTA) oraz wykorzystuje pierwotne ludzkie komórki pozyskane etycznie od dostawców, którzy w pełni przestrzegają ogólnych wymogów dotyczących świadomej zgody (45 CFR §46.116 i §46.117), Dobrej Praktyki Klinicznej (GLP), (ICH E6) oraz wymogów organów regulacyjnych i komisji etycznych.

1. Przygotowanie pożywek do hodowli komórkowych

UWAGA: Przygotować pożywkę Advanced DMEM do wysiewu w Dniu -1 i przechowywać w temperaturze 4 °C. Przygotować pożywkę Advanced DMEM do utrzymania w Dniu 1 i przechowywać w temperaturze 4 °C do 1 tygodnia.

  1. Przygotowanie pożywki Advanced DMEM do wysiewu kokultury PHH i HKC: Do jednej butelki 500 mL pożywki Advanced DMEM (Tabela materiałów) dodać 18 mL Koktajlu A (stężenie końcowe 3,6%) oraz 25 mL FBS (stężenie końcowe 5%).
  2. Przygotowanie pożywki Advanced DMEM do utrzymania kokultury PHH i HKC: Do jednej butelki 500 mL pożywki Advanced DMEM (Tabela materiałów) dodać 20 mL Koktajlu B (stężenie końcowe 4%) oraz 500 nM hydrokortyzonu.
    UWAGA: Hydrokortyzon należy przygotować na świeżo w dniu użycia; kroki dotyczące przygotowania roztworu stokowego oraz wymaganych rozcieńczeń opisano poniżej.
  3. Przygotowanie 500 nM hydrokortyzonu w pożywce Maintenance Advanced DMEM
    1. Przygotowanie roztworu stokowego wyjściowego (20 mM): Odważyć 7,24 mg hydrokortyzonu (Tabela materiałów) do szklanej fiolki o pojemności 1 mL. Zapisać dokładną masę odważonego hydrokortyzonu i wyznaczyć objętość dimetylosulfotlenku (DMSO) korzystając z następującego obliczenia:
      Wzór obliczania objętości DMSO dla hydrokortyzonu w warunkach laboratoryjnych; obejmuje masę i czynnik rozcieńczenia.
    2. Przygotowanie roboczego roztworu stokowego hydrokortyzonu 100 μM: Dodać 5 µL wyjściowego roztworu stokowego 20 mM do 995 μL Advanced DMEM.
      UWAGA: Rozcieńczenie 25 µL roztworu DMSO z kroku 1 w wodzie lub pożywce skutkuje stężeniem DMSO na poziomie 0,5%. W roztworze końcowym stężenie DMSO wyniesie 0,0025%. W tym przypadku dodatkowa objętość 5 µL powoduje nieistotną zmianę objętości całkowitej.
    3. Przygotowanie roboczego roztworu hydrokortyzonu 500 nM w Advanced DMEM: Aby przygotować 1 mL roztworu hydrokortyzonu 500 nM w Advanced DMEM, dodać 5 μL roztworu stokowego hydrokortyzonu 100 μM do 995 μL pożywki Maintenance Advanced DMEM.

2. Konfiguracja i przygotowanie systemu MPS (Dzień -1)

  1. Podłącz kontroler do stacji dokującej umieszczonej w inkubatorze do hodowli komórkowych i upewnij się, że do słoika z osuszaczem znajdującego się z tyłu kontrolera dodano świeży osuszacz (Tabela materiałów).
    UWAGA: Jednostka kontrolera z czasem pochłania wilgoć z inkubatora i jest utrzymywana w suchości za pomocą świeżego osuszacza.
  2. Włącz kontroler (ON), naciskając przełącznik kołyskowy znajdujący się z tyłu, i odczekaj 5 min, aż system się ustabilizuje i osiągnie odpowiednie ciśnienie. Następnie sprawdź na ekranie raport pneumatyczny, aby upewnić się, że: (i) wyjście zbiornika ciśnienia (Pressure Reservoir Output) osiągnęło ~2000 mBar oraz (ii) wyjście zbiornika próżni (Vacuum Reservoir Output) osiągnęło ~850 mBar.
  3. Wyjmij każdą płytkę z opakowania i dokonaj oględzin każdego dołka w celu sprawdzenia ewentualnych wad (brak rusztowań, pęknięcia itp.).
  4. Wsuń uchwyt (z założoną płytką) do stacji dokującej, aby sprawdzić, czy uchwyt został rozpoznany przez stację dokującą i kontroler. Sprawdź, czy wyjście zbiornika ciśnienia spadło o mniej niż 100 mBar, a wyjście zbiornika próżni wzrosło o mniej niż 500 mBar.
  5. Przygotuj każdy dołek, dodając 500 µL pożywki Seeding Advanced DMEM (podgrzanej wcześniej do 37 °C) do strony zbiornika.
  6. Wybierz program Prime na ekranie kontrolera (przepływ w górę przez 3 min z prędkością 2,5 µL/s), aż płyn przejdzie przez wsporniki filtra. UWAGA: „Up flow” to ustawienie w kontrolerze, które umożliwia przepływ pożywki ze zbiornika w górę przez rusztowania w płytce LC12.
  7. Wypełnij wszystkie dołki dodatkowymi 1,1 mL pożywki Seeding Advanced DMEM, aby zakryć kanał powierzchniowy. Wszystkie dołki będą miały wówczas pełną objętość roboczą 1,6 mL.
  8. Umieść uchwyty z płytkami w inkubatorze w temperaturze 37 °C i przy 5% CO2, podłącz do stacji dokującej i uruchom program Incubate.
    UWAGA: Wszystkie programy używane w eksperymencie (Prime, Incubate, Seed, Media Change) są wstępnie ustawione w systemie MPS. Przygotuj płytki w inkubatorze do momentu rozpoczęcia wysiewu.

3. Wysiewanie komórek wątroby do MPS (Dzień 0)

  1. Przeprowadź wstępną walidację wszystkich PHHs i HKCs. Wszystkie partie PHHs i HKCs są walidowane wewnętrznie przed wykonaniem eksperymentu z kulturą komórkową (patrz: Supplementary Material).
  2. Rozmroź fiolki z komórkami PHHs i HKCs (Table of Materials), trzymając je stabilnie w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C, aż pozostanie tylko niewielki odłam lodu.
  3. Przenieś PHHs pipetą bezpośrednio do probówki z uprzednio ogrzanym (37 °C) podłożem do regeneracji kriokonserwowanych hepatocytów CHRM (maksymalnie dwie fiolki na probówkę).
  4. Pipetuj komórki delikatnie, a następnie użyj 1 mL CHRM, aby wypłukać pozostałe komórki z krioprobówki. Podczas rozmrażania i przenoszenia do probówki stożkowej obchodź się z komórkami bardzo delikatnie.
    OSTRZEŻENIE Nie wstrząsaj fiolkami podczas rozmrażania i nie pipetuj ich zawartości w górę i w dół.
  5. Delikatnie przenieś komórki HKCs pipetą z krioprobówki do 10 mL lodowatego podłoża Seeding Advanced DMEM w probówce wirówkowej 15 mL.
    UWAGA: Można połączyć do 2 fiolek HKCs.
  6. Wiruj oba typy komórek w temperaturze pokojowej (RT) przy 100 x g przez 10 min. Usuń nadsącz.
  7. Resuspenduj PHHs w ciepłym podłożu Seeding Advanced DMEM, a HKCs w lodowatym podłożu Seeding Advanced DMEM (aby pomóc zmniejszyć agregację komórek), używając 1 mL na każdą fiolkę komórek dodaną do probówki, a następnie umieść komórki na lodzie. Do resuspensji komórek używaj delikatnego ruchu kołyszącego.
    OSTRZEŻENIE: Nie resuspenduj PHHs poprzez pipetowanie, ponieważ może to prowadzić do śmierci komórek.
  8. Połącz zawiesiny komórkowe z wielu probówek (jeśli dotyczy – tzn. jeśli wszystkie PHHs pochodzą od tego samego dawcy), ale nie mieszaj różnych typów komórek.
  9. Policz komórki. Zapisz żywotność (musi być powyżej 85% dla obu typów komórek, PHHs i HKCs) oraz całkowitą liczbę komórek. Jeśli żywotność komórek spadnie poniżej 85%, rozmroź nową fiolkę komórek i ponownie oceń ich żywotność.
  10. Oblicz żywotność komórek za pomocą następującego wzoru:
    Wzór na obliczenie żywotności komórek: komórki żywe/wszystkie komórki × 100=% komórek żywych. Przedstawienie równania.
  11. Oblicz pożądaną objętość zawiesiny komórkowej do wysiania do każdego dołka oraz dodatkową objętość podłoża Seeding Advanced DMEM potrzebną do osiągnięcia całkowitej objętości wysiewu 400 µL. Liczba komórek na dołek: 0.4 x 106 PHHs i 0.04 x 106 HKCs na dołek, przy gęstości komórkowej odpowiednio 0.25 x 106 PHHs/mL oraz 0.025 x 106 HKCs/mL.
  12. Odłącz driver ze stacji dokującej i umieść go w MBSC.
  13. Odsącz medium znad rusztowania do punktu zatrzymania (schodząc w dół głębokiego wcięcia na pierścieniu mocującym), z kanału i zbiornika. Pozostaw „objętość martwą” 0.2 mL w dołku hodowlanym, sięgającą tuż powyżej rusztowania. Należy uważać, aby nie usunąć całego medium znad rusztowania, aby uniknąć powstawania pęcherzyków powietrza.
  14. Dodaj 400 µL podłoża Seeding Advanced DMEM do komory dołka, umieść driver ponownie na stacji dokującej w inkubatorze i uruchom program Media Change na 3 min. Program zostanie automatycznie wstrzymany po 3 min.
  15. Po zakończeniu odłącz driver ze stacji dokującej i umieść go z powrotem w MBSC.
  16. Odsącz medium znad rusztowania w dół do punktu zatrzymania oraz przy końcówce zbiornika każdego dołka.
  17. Ostrożnie resuspenduj PHHs, delikatnie kołysząc probówką, a następnie dodaj wymaganą objętość zawiesiny komórkowej do każdego dołka hodowlanego. Ostrożnie pipetuj zawiesinę komórkową, upewniając się, że komórki rozkładają się równomiernie na rusztowaniu płytki.
    UWAGA: Aby zapewnić dobre pokrycie całego rusztowania, pipetuj komórki na rusztowanie, wykonując powolny ruch wirowy.
  18. Podobnie ostrożnie resuspenduj HKCs i dodaj zawiesiny komórkowe do każdego dołka hodowlanego.
    UWAGA: Podczas wysiewu HKCs stosuj powolny ruch wirowy, aby zapewnić dobre pokrycie całego rusztowania. Te dwa podetapy wysiewu można rozdzielić lub można wstępnie zmieszać oba typy komórek w odpowiedniej gęstości i wysiać je jednocześnie.
  19. Gdy wszystkie dołki będą zawierały oba typy komórek, umieść driver MPS na stacji dokującej w inkubatorze bez fizycznego łączenia go i pozostaw na 1 h.
  20. Po 1 h dopełnij każdy dołek wymaganą objętością dodatkowego podłoża Seeding Advanced DMEM, aby osiągnąć 400 μL, i uruchom program Seed.
  21. Po 2 min program zostanie automatycznie wstrzymany; wyjmij driver z inkubatora i powoli dodaj 1000 µL podłoża Seeding Advanced DMEM do kanału (bliżej końcówki zbiornika niż komory dołka), aby uzyskać całkowitą objętość 1.4 mL (z dodatkową objętością martwą 200 µL w kanałach).
  22. Przenieś płytki do inkubatora i uruchom resztę programu Seed na 8 h.
    UWAGA: Przepływ automatycznie przełączy się na program Incubate po 8 h.

4. Wymiana pożywki (Dzień 1)

  1. Odłącz sterownik od stacji dokującej i umieść go w MBSC.
  2. Wykonaj Wymianę Pożywki, usuwając pożywkę Seeding Advanced DMEM z komory dołka aż do punktu zatrzymania.
  3. Dodaj 400 µL pożywki Maintenance Advanced DMEM do komory dołka, umieść sterownik z powrotem na stacji dokującej w inkubatorze i uruchom program Wymiany Pożywki na 3 min. Program zatrzyma się automatycznie po 3 min.
  4. Odłącz sterownik od stacji dokującej i w MBSC odessij pożywkę z komory zbiornika, kanału oraz punktu zatrzymania nad rusztowaniem. W tym momencie dołek hodowlany zostanie przywrócony do objętości martwej.
  5. Uzupełnij komorę zbiornika 1,4 mL świeżej, uprzednio ogrzanej (37 °C) pożywki Maintenance Advanced DMEM.
  6. Umieść sterownik z powrotem na stacji dokującej w inkubatorze i uruchom program Inkubacji.

5. Kontrola jakości (QC) mikro tkanek wątroby, pobieranie pożywki, wymiana pożywki i dawkowanie leków (dzień 4)

  1. W dniu 4. przeprowadź Wymianę Medium, używając medium Maintenance Advanced DMEM, oraz wykonaj kontrole QC, aby upewnić się, że wysiew przebiegł pomyślnie.
    UWAGA: QC to proces służący do sprawdzania kondycji utworzonych mikrotkanek poprzez pomiar dehydrogenazy mleczanowej (LDH) i mocznika.
  2. Przed przeprowadzeniem QC przygotuj świeże roztwory zapasowe dla każdego testowanego związku (w medium Maintenance Advanced DMEM lub w medium Maintenance Advanced DMEM zawierającym 0,1% DMSO, w zależności od rozpuszczalności każdego związku). Przygotuj odpowiednie rozcieńczenia, aby uzyskać stężenia testowe dla każdego związku.
  3. Odłącz driver i płytkę ze stacji dokującej i przenieś je do MBSC.
  4. Za pomocą pipety przenieś 50 µL medium z każdej studzienki do płytki 96-dołkowej w celu wykonania testu LDH (Tabela Materiałów) przed pobraniem próbek oraz 25 µL do testu na mocznik (Tabela Materiałów).
    UWAGA: Testy LDH i mocznika zostaną przeprowadzone zgodnie z instrukcjami producenta.
  5. Kontynuuj eksperyment po QC, jeśli odczyty LDH są niższe niż 2 AU/106 cells, a poziom mocznika wynosi powyżej 40 µg/day/106 cells.
    UWAGA: Albuminy nie używa się do QC, ponieważ jest to czasochłonna analiza do przeprowadzenia w tym dniu; zostanie ona wykonana później, po zakończeniu eksperymentu, z próbek pobranych w dniu 4.
  6. Jeśli którakolwiek ze studni nie przejdzie kontroli QC, usuń ją z planu eksperymentalnego.
  7. Po potwierdzeniu układu eksperymentalnego pobierz pozostałe medium z każdej studzienki, uważając, aby nie zakłócić hodowli komórkowej poprzez dotknięcie rusztowania. Przechowuj zebrane medium (oznaczone jako próbki przeddawkowe) w temperaturze -80 °C do późniejszych analiz.
  8. Wykonaj Wymianę Medium w MBSC zgodnie z krokami 4.3-4.5. Wymień medium w studzienkach na Maintenance Advanced DMEM z odpowiednim stężeniem leku zgodnie z planem eksperymentalnym.
  9. Po zakończeniu umieść driver z powrotem w stacji dokującej w inkubatorze i uruchom program Incubate.

6. Zbieranie pożywki, wymiana pożywki i podawanie leku (dzień 6)

  1. Przygotować świeże roztwory stokowe dla każdego związku do przetestowania (w podłożu Maintenance Advanced DMEM lub w podłożu Maintenance Advanced DMEM zawierającym 0,1% DMSO, w zależności od rozpuszczalności każdego związku). Przygotować odpowiednie rozcieńczenia, aby uzyskać stężenia testowe dla każdego związku zgodnie z planem płytki.
  2. Odłączyć driver oraz płytkę ze stacji dokującej i przenieść je do MBSC.
  3. Pobrać ręcznie pipetą pożywkę z każdego dołka (~1 mL), dbając o to, aby nie zakłócić hodowli komórkowej poprzez dotknięcie rusztowania; oznaczyć poziom LDH oraz mocznika. Pozostałą część pobranej pożywki przechowywać w temperaturze -80 °C do późniejszych analiz, oznaczając próbki jako pobrane 48 h po podaniu dawki.
  4. Ponownie podać do każdego dołka lek w takim samym stężeniu jak w dniu 4 i zgodnie z planem płytki, wykonując Wymianę pożywki zgodnie z krokami 4.3-4.5.
  5. Po zakończeniu umieścić driver z powrotem w stacji dokującej w inkubatorze i uruchomić program Inkubacja.

7. Zakończenie eksperymentu (Dzień 8)

  1. Odłącz sterownik i płytkę od stacji dokującej i przenieś je do MBSC.
  2. Pobierz próbki medium z każdej studni ręcznie za pomocą pipety, dbając o to, aby nie zakłócić hodowli komórkowej poprzez dotykanie rusztowania.
  3. Przeanalizuj pobrane medium pod kątem zawartości LDH i mocznika, a resztę zebranego medium przechowuj w temperaturze -80 °C do późniejszych analiz.
  4. Przeprowadzenie testu CYP3A4-glo.
    1. Za pomocą tego testu zmierz wpływ badanych leków na aktywność cytochromu P450 CYP3A4 w PHHs na koniec eksperymentu.
    2. Zrekonstytuuj odczynnik detekcyjny (dla testu CYP3A4 patrz Tabela materiałów) zgodnie z instrukcjami producenta. Jeśli odczynnik detekcyjny został wcześniej zrekonstytuowany i zamrożony, wyjmij go z zamrażarki -20 °C i pozwól mu odtajać w RT.
    3. Przygotuj roztwór stokowy standardu D-lucyferyny 20 mM zgodnie z instrukcjami producenta.
    4. Przygotuj robocze medium z substratem luminogenicznym, stosując rozcieńczenie 1:1000 lucyferyny IPA w medium Maintenance Advanced DMEM (2 mL medium z substratem luminogenicznym na studnię).
    5. Przeprowadź Wymianę medium, jak opisano w krokach 4.3-4.5, używając medium z substratem luminogenicznym. Zachowaj 500 µL medium z substratem luminogenicznym w szklanej fiolce 1,5 mL (Tabela materiałów) jako materiał wejściowy.
    6. Umieść sterownik z powrotem w stacji dokującej w inkubatorze i uruchom program Inkubacja na 1,5 h.
    7. Przygotuj krzywą standardową D-lucyferyny w medium hodowlanym w probówkach 1,5 mL zgodnie z instrukcjami producenta, a następnie nanieś pipetą 50 µL każdego standardu w duplikacie na białą nieprzezroczystą płytkę 96-dołkową (patrz Tabela materiałów), używając medium hodowlanego jako próbki ślepej lub 0 µM.
    8. Po upływie czasu wyjmij sterownik ze stacji dokującej i pobierz próbki medium do testu CYP3A4 zgodnie z krokami 7.4.9-7.4.13.
    9. Po inkubacji przenieś 50 µL medium z każdej studni oraz materiału wejściowego na nieprzezroczystą białą płytkę luminometryczną 96-dołkową zawierającą standardy. Należy zadbać o pozostawienie co najmniej dwóch pustych rzędów na płytce nieprzezroczystej pomiędzy standardami a próbkami, aby uniknąć przenoszenia światła między odczytami najwyższych standardów a próbkami.
    10. Dodaj 50 µL odczynnika detekcyjnego lucyferyny do każdej studni, aby zainicjować reakcję luminescencyjną.
    11. Inkubuj płytkę w RT na wytrząsarce do płytek przez 20 min w ciemności, aby ustabilizować sygnał luminescencyjny.
    12. Zarejestruj luminescencję za pomocą luminometru lub kamery CCD.
    13. Wykreśl krzywą standardową, obliczając średnią dla każdego punktu, a następnie odejmując średnią z prób ślepych. Użyj równania linii do obliczenia szybkości metabolicznej (pmol/min/106 komórek) w pozostałych próbkach, pamiętając o uwzględnieniu wszelkich wykonanych rozcieńczeń.
  5. Usuń rusztowania z płytek za pomocą pęsety i umieść je w płytce 24-dołkowej zawierającej 500 µL D-PBS (bez Ca++ i Mg++) w każdej studni, dbając o to, aby nie zakłócić mikrotkanki.
  6. Wykonaj zdjęcia każdego rusztowania za pomocą odwróconego mikroskopu świetlnego przy powiększeniu 10x.
  7. Przeprowadzenie testu ATP (patrz Tabela materiałów) zgodnie z instrukcjami producenta:
    1. Odmroź odczynnik w RT.
    2. Przemyj rusztowania dwukrotnie 500 µL D-PBS (bez Ca++ i Mg++) w każdym kroku płukania.
    3. Dodaj 120 μL odczynnika i 120 μL PBS do każdego rusztowania oraz takie same objętości do pustej studni (będzie ona służyć jako próba ślepa). Umieść płytkę przykrytą folią aluminiową na wytrząsarce i wytrząsaj intensywnie (500 rpm) przez 5 min, a następnie inkubuj przez 30 min, aby ustabilizować sygnał luminescencyjny.
    4. Przenieś 100 μL zlizowanych próbek w duplikacie na przezroczystą płytkę testową 96-dołkową z płaskim dnem w celu pomiaru. Upewnij się, że studnie ślepe nie znajdują się obok pozostałych studni pomiarowych o wysokiej luminescencji.
    5. Zarejestruj luminescencję za pomocą czytnika mikro płytek.
    6. Porównaj luminescencję próbek z luminescencją standardów, aby określić ilość ATP wykrytą przez odczynnik w próbkach.

Wyniki

Niniejszy artykuł opisuje model MPS wątroby wykorzystywany do oceny DILI. System MPS umożliwia generowanie trójwymiarowych mikrotkanek wątroby, które zachowują wysoką funkcjonalność w warunkach przepływu przez okres do 4 tygodni. Komórki PHHs/HKCs są wysiewane na rusztowania pokryte kolagenem w celu utworzenia mikrotkanek wątroby, które są perfundowane pożywką wzrostową, a po przejściu kontroli jakości (QC) poddawane działaniu badanych związków. W pracy przedstawiono dane dla troglitazonu i pioglitazonu — dwóch strukturalnie podobnych związków, które wykazują różny stopień nasilenia DILI.

W 4. dniu, przed podaniem leku, przeprowadza się kontrolę jakości (QC) uformowanych mikrotekanek wątrobowych, która polega na ocenie uwalniania LDH oraz syntezy mocznika (Rysunek 1A). Kontrola QC ma na celu potwierdzenie, że system MPS wątroby wytwarza wysoce spójne i funkcjonujące mikrotkanki wątrobowe. Przedstawione tutaj dane zostały wygenerowane z trzech eksperymentów i wykazują dobry poziom powtarzalności przy niskiej zmienności wewnątrz- i międzybadaniowej. Po 8-dniowej hodowli oceniano wiele wskaźników zdrowotnych i wątrobowych (albuminy, mocznika, CYP3A4, ATP), a mikrotkanki kontrolne wykazały wysoki poziom funkcjonalności wątrobowej i powtarzalności (Rysunek 1B,C). Mikroskopia fazowo-kontrastowa i barwienie IF mikrotekanek wątrobowych (patrz Materiały uzupełniające) wykazują wysoką spójność wysiewu w mikrokanałach rusztowania oraz ujawniają rozkład HKC w mikrotkankach PHH (Rysunek 1D)

Analiza hodowli komórkowej; wykresy i mikrografie aktywności enzymatycznej, białek i metabolizmu leków.
Rysunek 1: Wątróbny system mikrofizjologiczny (MPS) generuje wysoce powtarzalne dane i spójne mikrotkanki. (A) Wskaźniki kontroli jakości (QC) 3D mikrotkanki wątroby w dniu 4 oraz ocena funkcjonalności na koniec badania w dniu 8 -(B) albuminy i mocznika, (C) CYP3A4 i ATP). Dane zostały zebrane z 3 eksperymentów; w każdym eksperymencie zastosowano 3 powtórzenia kontroli nośnikiem. Przedstawione dane to średnia ± SD, N = 9. (D) Mikroskopia w kontraście fazowym (10x i 20x) oraz immunofluorescencja (IF) 3D mikrotkanek wątroby wytworzonych poprzez kokulturę PHH i HKC na platformie wątrobnego MPS w celu oceny DILI. Aby zwizualizować HKC, przed wysianiem komórki HKC zostały przetransdukowane wektorem adenowirusowym ekspresującym eGFP (patrz Materiały uzupełniające). Przedstawiono reprezentatywne mikrofotografie. Transdukcja i obrazowanie zostały przeprowadzone jako oddzielny eksperyment w celu zademonstrowania lokalizacji komórek i nie były częścią opisanego protokołu DILI. Komórki HKC są wstępnie walidowane wewnętrznie przed użyciem w eksperymentalnej hodowli komórkowej i muszą wykazywać niski poziom aktywacji po rozmrożeniu; ocenia się to poprzez pomiar biomarkerów IL-6 i TNF-alpha. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

wiadomo, że troglitazon wywołuje ciężkie DILI; po dopuszczeniu go do obrotu w leczeniu cukrzycy typu 2, został on wycofany przez FDA po 3 latach obecności na rynku ze względu na częstotliwość występowania uszkodzeń wątroby związanych z jego stosowaniem. Do tej pory opublikowane badania na zwierzętach nie pozwoliły przewidzieć potencjału troglitazonu do wywoływania ciężkiego uszkodzenia wątroby. Toksyczność tego związku nie została również wykryta w standardowych testach wątrobowych 2D in vitro14.

Mikrotkanki wątroby w systemie MPS poddano działaniu troglitazonu przez 96 h, co wywołało ostrą odpowiedź toksyczną zależną od Cmax, którą wykryto poprzez uwalnianie ALT i LDH oraz gwałtowny spadek produkcji albumin i mocznika przy stężeniu około 15 x Cmax po ostrej ekspozycji na troglitazon (Rysunek 2A). Punkt końcowy na poziomie komórkowym (zawartość ATP) oraz aktywność CYP3A4 (do oceny biotransformacji metabolicznej), zmierzone po 96 h ekspozycji, dodatkowo potwierdziły toksyczność wywołaną przez troglitazon, a wartości EC:50 były wysoce porównywalne z innymi punktami końcowymi (Rysunek 2B). Obrazy z mikroskopii w świetle przechodzącym wykonane po 8-dniowej hodowli w systemie MPS ukazują zdrową mikrotkankę wątroby, równomiernie zasiedloną w całym rusztowaniu (kontrola nośnika), w przeciwieństwie do uogólnionej śmierci/degeneracji tkanki widocznej w powtórzeniach traktowanych kontrolą pozytywną oraz troglitazonem w dwóch najwyższych stężeniach testowych (Rysunek 2C).

Analiza żywotności komórek; wykresy LDH, ALT, mocznika, albuminy; obrazy mikroskopowe efektów troglitazonu.
Rycina 2: Określanie ryzyka DILI troglitazonu przy użyciu wielu punktów końcowych hepatotoksyczności. Mikrotkanki wątroby poddano działaniu siedmiu stężeń testowych troglitazonu przez 96 h i porównano pod kątem (A) uwalniania LDH, uwalniania ALT, produkcji albuminy, syntezy mocznika, aktywności CYP3A4 oraz zawartości ATP. Linie niebieskie – ekspozycja przez 48 h (tylko punkty końcowe w medium), linie czerwone – ekspozycja przez 96 h. Kontrolą pozytywną była chlorpromazyna 100 μM. Wszystkie punkty końcowe zmierzono w tych samych kulturach MPS wątroby. Przedstawione dane to średnia ± SD, N = 3. (B) Podsumowanie wartości E:50 wygenerowanych z danych. N.D. = dane niemożliwe do naniesienia na wykres. Linia = brak analizy. (C) Reprezentatywny obraz mikroskopii w świetle przechodzącym mikrotkanek wątroby po 8-dniowej hodowli (powiększenie 10x). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Zbadano również toksyczność dla wątroby po ekspozycji na pioglitazon. Pioglitazon jest związkiem znanym z niskiego ryzyka wywołania DILI4 i nie wykazywał hepatotoksyczności w klasycznych 2D kulturach pierwotnych hepatocytów, a nawet w niektórych bardziej zaawansowanych modelach 3D10, 11. Łagodne efekty hepatotoksyczne zaobserwowano w obu badanych punktach czasowych (Rycina 3). Nie wykryto uwalniania LDH ani ALT; jednak po 48 h zaobserwowano łagodny spadek produkcji albuminy i mocznika przy stężeniu ok. 25x Cmax (Rycina 3A). Przy wysokich stężeniach pioglitazonu odnotowano również niewielki spadek zawartości ATP, lecz nie był on istotny. Wartości EC:50 wyznaczone z krzywych zależnych od dawki przedstawiono na Rycynie 3B). Badanie mikroskopowe wykazało niewielkie zmiany w mikrotkance po 96-godzinnej ekspozycji na pioglitazon w dwóch najwyższych badanych stężeniach (Rycina 3C). Wyniki te demonstrują zdolność systemu MPS wątroby do wykrywania toksyczności związków o łagodnym ryzyku DILI.

Wyniki testu hepatotoksyczności: wykresy LDH i ALT (A); tabela wyników (B); obrazy kropli (C); pioglitazon.
Rycina 3: Określanie ryzyka DILI dla pioglitazonu z wykorzystaniem wielu parametrów hepatotoksyczności. Mikrotkanki wątroby eksponowano na siedem stężeń testowych pioglitazonu przez 96 h i porównywano pod kątem (A) uwalniania LDH, uwalniania ALT, produkcji albuminy, syntezy mocznika, aktywności CYP3A4 oraz zawartości ATP. Linie niebieskie – ekspozycja przez 48 h (tylko parametry medium), linie czerwone – ekspozycja przez 96 h. Kontrolą dodatnią była chlorpromazyna 100 μM. Wszystkie parametry zmierzono w tych samych kulturach MPS wątroby. Przedstawione dane to średnia ± SD, N = 3. (B) Podsumowanie wartości EC:50 wyznaczonych na podstawie danych. N.D. = dane niemożliwe do przedstawienia na wykresie. Linia = brak analizy. (C) Reprezentatywne zdjęcia mikroskopii w polu jasnym mikrotkanek wątroby po 8-dniowej hodowli (powiększenie 10x). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Poprzez ocenę wszystkich funkcjonalnych punktów końcowych oraz biomarkerów toksyczności, które mogą reprezentować scenariusze in vivo lub kliniczne (uwalnianie LDH, synteza mocznika, produkcja albumin, aktywność CYP3A4, zawartość ATP, uwalnianie ALT) oraz potwierdzenie danych uzyskanych dla obu badanych związków podanych w siedmiostopniowym zakresie dawek przez 48 h i 96 h, wygenerowano mapę ciepła w celu uzyskania „sygnatury hepatotoksyczności”, co pomaga zidentyfikować związki o różnym stopniu ryzyka wystąpienia DILI (Rycina 4).

Mapa ciepła markerów biochemicznych; poziomy enzymów LDH i ALT; analiza wpływu stężenia leku.
Rysunek 4: Określanie „sygnatury toksyczności” za pomocą MPS wątroby. Mapa ciepła przedstawiająca wpływ troglitazonu i pioglitazonu na sześć funkcjonalnych punktów końcowych specyficznych dla wątroby (uwalnianie LDH, synteza mocznika, produkcja albumin, uwalnianie ALT, aktywność CYP3A4 i zawartość ATP) po 48 h i 96 h ekspozycji na siedmiopunktowy zakres dawek. Każda wartość została wyznaczona jako średnia dla N = 3 i znormalizowana względem próbek kontrolnych. Wartości na paskach kolorów reprezentują krotność wzrostu w stosunku do kontroli bazowych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Materiały uzupełniające: Obrazowanie mikrotkanek za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego i ocena wstępnej kwalifikacji komórek. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Systemy mikrofizjologiczne (MPS) zostały zaprojektowane w celu odtworzenia funkcjonalnych jednostek ludzkich organów in vitro i opracowano je, aby wyeliminować ograniczenia konwencjonalnych modeli 3D hodowli komórkowych27. Wątroba jest jednym z organów najczęściej modelowanych przy użyciu MPS i opracowano dla niej szeroką gamę systemów. Ludzka wątroba odpowiada za metabolizm leków oraz generowanie toksycznych metabolitów leków, a jej funkcja jest kluczowym elementem modelowania w procesie rozwoju leków, w tym w ocenie ryzyka wystąpienia DILI dla badanych związków28. W niniejszej pracy przedstawiliśmy nową metodę oceny DILI z wykorzystaniem MPS wątroby; protokół ten stanowi wysoce czuły i stabilny test, który umożliwia poszukiwanie wglądu w mechanizmy działania każdego badanego związku w celu ustalenia, w jaki sposób może on wywoływać DILI. Mikrotkanki wątroby są tworzone na płytkach MPS jako kokultura PHH i HKCs; charakteryzują się one wysoką funkcjonalnością, przejawiającą się wysokim poziomem produkcji albumin i mocznika, a także wysoką aktywnością CYP3A4 w porównaniu do standardowych modeli wątroby in vitro20.

Choć opisany tutaj model DILI może służyć jako użyteczne narzędzie w późniejszych etapach testów przedklinicznych w procesie opracowywania leków, posiada on również kilka ograniczeń. Podobnie jak większość systemów MPS obecnie dostępnych na rynku, jest to platforma o niskiej przepustowości, a zatem trudniejsza do zastosowania w wielkoskalowych badaniach przesiewowych leków. Składając się z mikrotkanek utworzonych poprzez kokulturę PHH i HKC, model DILI nie jest również w stanie w pełni oddać złożoności ludzkiej wątroby; dalsza optymalizacja poprzez włączenie różnych typów komórek (np. komórek odpornościowych) byłaby korzystna dla zwiększenia wartości istniejącego modelu. Ten jednorządowy MPS mógłby zostać połączony z platformami innych organów, które mogą dzielić wspólne medium i umożliwiać interakcje międzyorganowe na poziomie komórkowym lub endokrynnym, co pomogłoby w lepszym zrozumieniu mechanizmów toksyczności nieograniczonych tylko do samej wątroby. Ponadto, jak każda stosunkowo nowa technologia, może być ona uznana za kosztowną, a tym samym o ograniczonej dostępności.

MPS to platforma wykorzystywana do opracowywania organotypowych modeli pojedynczych lub wielu ludzkich tkanek. System składa się z kontrolera, kabla pępowinowego oraz sterownika MPS, do którego wkłada się płytkę (Rysunek 5A). Każda płytka MPS dla wątroby posiada 12 niezależnych otwartych dołków do hodowli pierwotnych komórek wątroby w 3D na zaprojektowanych rusztowaniach. Podsumowując, system przechodzi kontrolę jakości, a płytki są przygotowywane w dniu -1; w dniu zero PHH i HKC są wysiewane na płytki (Rysunek 5B, patrz 1). Wbudowane mikropompy umożliwiają cyrkulację pożywki hodowlanej przez rusztowania, co ułatwia formowanie się trójwymiarowych mikrotkanek (Rysunek 5B, patrz 2). Uformowane mikrotkanki są poddawane kontroli jakości w dniu 4, poddawane działaniu różnych stężeń każdego związku co 48 h przez 4 dni, a w dniu 8 analizowane są pod kątem biomarkerów końcowych (Rysunek 5C). Harmonogram eksperymentalny testu DILI na płytce MPS przedstawiono na Rysunku 5D.

Schemat układu mikroprzepływowego do stabilizacji hodowli komórkowych; konfiguracja do analizy stanu zdrowia i funkcji komórek.
Rysunek 5: Układ mikrofizjologiczny oraz harmonogram eksperymentalny standardowego testu DILI. (A) Układ mikrofizjologiczny wraz z jego komponentami: sterownik (1), kabel pępowinowy (2), stacja dokująca (3), sterownik MPS (4) i płytka LC12 (5). (B) Wysiew PHH i HKC na płytkę LC12 w dniu 1 (1); wbudowane mikropompy umożliwiają cyrkulację pożywek hodowlanych z regulowanymi prędkościami przepływu przez 3D mikro-tkanki wysiane na rusztowaniach (2). (C) Wyjmowanie rusztowań po zakończeniu badania. (D) Harmonogram eksperymentalny. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Podczas wykonywania protokołu ważne jest przeprowadzenie rzetelnej kontroli jakości (QC) systemu przed rozpoczęciem pracy, aby sprawdzić, czy system funkcjonuje prawidłowo pod względem pneumatycznym, oraz wizualna inspekcja i wydajne przygotowanie płytek z materiałami eksploatacyjnymi, co zapewni równomierną funkcjonalność we wszystkich dołkach. Posiadanie wysokiej jakości pierwotnych ludzkich komórek jest niezbędne do realizacji tego protokołu, przy czym hepatocyty są znane z tego, że przylegają konsekwentnie w eksperymentach z kulturami komórkowymi i tworzą interakcje 3D. Rozmrażanie tych komórek jest również krytycznym etapem, ponieważ pierwotnych hepatocytów nie należy resuspenderować poprzez pipetowanie, gdyż może to szybko doprowadzić do śmierci komórek. Żywotność komórek powyżej 85% jest kluczowa dla udanego wysiewu, ponieważ duże ilości debris komórkowego będą zakłócać tworzenie się 3D mikrotkanek. Kontrola jakości uformowanych mikrotkanek wątroby w dniu 4. jest również istotna; użytkownik musi upewnić się, że zmierzone poziomy LDH i mocznika są akceptowalne, ponieważ parametry poza zakresem mogą wskazywać na tworzenie tkanek słabej jakości i umożliwiają bezpośrednie rozwiązywanie problemów. Na koniec, hydrokortyzon stosowany w pożywce do hodowli komórkowej musi zostać przygotowany na świeżo w dniu użycia, aby zapobiec niepożądanym procesom degradacji, które mogłyby wpłynąć na funkcjonalność hodowli komórkowej, ponieważ jest on niezbędny do utrzymania funkcjonalności metabolicznej hepatocytów.

Mimo znacznej złożoności, system MPS wątroby nie zawiera wszystkich typów komórek występujących w ludzkiej wątrobie. W celu zwiększenia istotności fizjologicznej możliwe jest dodanie do modelu dalszych typów komórek24,29, jednak powinno się to robić wyłącznie przy wyraźnym uzasadnieniu w kontekście zastosowania. W badaniach nad DILI kluczowym typem komórek są PHH, a włączenie HKC do tego modelu pozwala na określenie niektórych odpowiedzi immunologicznych. Należy również zauważyć, że PHH izolowane z ludzkich wątrób oraz dostępne komercyjnie krio konserwowane PHH wykazują tendencję do pewnych różnic między partiami. Wykazaliśmy tutaj, że niniejszy protokół daje powtarzalne wyniki przy zastosowaniu wysokiej jakości preparatów komórek. Można jednak spodziewać się pewnej zmienności między partiami, co można by zniwelować poprzez stosowanie partii pochodzących z puli wielu dawców. Ograniczenia te można pokonać, wykorzystując komórki hepatocytopodobne zróżnicowane z iPSC, które odtwarzają wiele właściwości funkcjonalnych PHH i były stosowane w procesie opracowywania leków30. Komórki HKC również wykazują zmienność między partiami oraz wysoki poziom aktywacji po rozmrożeniu; dlatego dawcy HKC są wstępnie walidowani wewnętrznie przed użyciem w eksperymentalnych hodowlach komórkowych (kokultura z walidowanymi PHH) i muszą wykazywać niski poziom aktywacji po rozmrożeniu; jest to oceniane poprzez pomiar biomarkerów IL-6 oraz TNF-alpha (patrz Supplementary Material).

Przedstawione tutaj dane potwierdzają, że test ten może dokładnie wykrywać DILI, pomagając w identyfikacji hepatotoksyn, które mogłyby nie zostać wykryte przez modele 2D10,11 a nawet niektóre modele 3D. Dane generowane z MPS nie są jeszcze stosowane jako standard w przemyśle farmaceutycznym do zgłoszeń regulacyjnych lub w celach przesiewania leków ze względu na brak standaryzacji i harmonizacji procesów, w tym powtarzalności między ośrodkami20. Przedstawione tutaj dane i podejścia eksperymentalne odpowiadają na ten problem, wykazując, że model wątroby może być rutynowo i niezawodnie stosowany w testach DILI w celu dokładnego przewidywania potencjalnej toksyczności nowych związków.

Poprzez pomiar szeregu punktów końcowych w celu uzyskania „sygnatury hepatotoksyczności”, metoda ta pomaga zidentyfikować związki o różnym stopniu ryzyka wystąpienia DILI (w tym związki niewykrywalne za pomocą innych metod in vitro) oraz ujawnić ich mechanizmy toksyczności. Technologia ta może wypełnić lukę między tradycyjnymi kulturami komórkowymi i modelami zwierzęcymi z jednej strony a badaniami klinicznymi z udziałem ludzi z drugiej, zmierzając w stronę symulacji ludzkich warunków biologicznych w celu przedklinicznej oceny toksyczności wątroby w ramach procesu opracowywania leków.

Oświadczenia

Wszyscy autorzy są pracownikami CN Bio Innovations Limited.

Podziękowania

CN Bio Innovations Ltd. sfinansowało to badanie.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
24-dołkowe płytki klastrowe do hodowli komórkowych z płaskim dnemCorning3524
96-dołkowe przezroczyste płytki testowe, płaskie dno przezroczyste tworzywo sztuczneGreiner655101
96-dołkowe czarne płaskie dnoCorning3915
96 Well Biała/przezroczysta płyta dolna, powierzchnia TCThermoScientific165306
Advanced DMEM (1x)Gibco12491015Pożywki do hodowli komórkowych.
AssayMax Albumina Zestaw ELISAAssayProEA3201-1Rozcieńczenie 1:250. Punkt czasowy Dzień 4, 6 i 8.
Koktajl utrzymania komórek B, (Pierwotne suplementy podtrzymujące hepatocyty)GibcoCM4000
CellTiter-Glo 3D Test żywotności komórekPromegaG9682Rozcieńczenie 1:1. Punkt czasowy Dzień 8.
Chlorpromazyna HClSigma AldrichC8138
Chromacol niebieskie pokrywki, 9 mm Autosampler Nasadki gwintowane na fiolkiThermoScientific9-SCK(B)-ST1Fiolki szklane
Fiolki Chromacol, 9 mm fiolki z przezroczystym szkłemKomory2-SVW
klasy 2 - Trimat2 1500 wydechRoztwory
powietrza zamkniętegoProbówki stożkowe 50 mlGreiner227261
Kriokonserwowane pożywki do odzyskiwania hepatocytów (CHRM)ThermoFisher ScientificGibco CM7000
Kriokonserwowane pierwotne hepatocyty ludzkieBioIVT EuropeLot. RAS
CytoTox 96 Zestaw do oznaczania cytotoksyczności (LDH) PromegaG1781Rozcieńczenie - brak. Punkt czasowy Dzień 4, 6 i 8
>Model analizy danych wykorzystany do wygenerowania wykresu i krzywych EC:50 to regresja nieliniowa (dopasowanie krzywej) asymetryczna sigmoidalna, 5PL, gdzie X jest logarytmem (stężenieGraphPad Prism 9
Jednorazowe jednostki filtrujące PES 500 mlFisher Scientific15913307
Jednorazowe miski na pipety 50 mlFisher Scientific12369175
DMSO (dimetylosulfotlenek)Sigma-AldrichSigma D2650
Dulbeco' s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami bez Ca2+ i Mg2+ (D-PBS)ThermoFisher Scientific14190-144
Easy Reader Stożkowe probówki wirówkowe z polipropylenu 15 mlFisher Scientific 11889640
Surowica bydlęcapłodu Gibco10500064
Zestaw ELISA ludzkiego ALT Abcam  ab 234578Rozcieńczenie 1:5. Punkt czasowy: Dzień 6 i 8.
Ludzkie kriokonserwowane komórki KupfferaLonza Europe Lot. 190088KC
hydrokortyzonMerckH0888-1G
Modele inkubatorów: Nowy Brunszwik  Galaxy 170 S, Nowy Brunszwik  Galaxy 170 R oraz CellXpert® Silnik C170.EppendorfWszystkie serwisowane rocznie; dokumenty dostępne na życzenie.
Mikroskop odwróconyLeica DMIL LED
MPS znany jako Organ-on-a-Chip (OOC)CN Bio Innovations Ltd.
Płyta MPS LC-12CN Bio Innovations Sp. z o.o.
Neubauer Ulepszony jednorazowy hemocytometr C-Chip (2 kanały)Cambridge BioscienceDHC-N01-50
P450-Glo CYP3A4 System oznaczania i badań przesiewowych RozcieńczaniePromegaV9002- brak. Punkt czasowy, Dzień 8
Platforma MPS PhysioMimixCN Bio Innovations Ltd.
PioglitazoneMedChemExpress TocrisHY-13956/CS-1700
Zestaw do oznaczania mocznika Quantichrom – Systemy testów biologicznychSystemy testów biologicznychDY970-05Rozcieńczenie 1:2, jeśli początkowy odczyt jest zbyt wysoki. Punkt czasowy Dzień 4, 6 i 8.
Żel krzemionkowySigma-AldrichS7625
Oprogramowanie używane do analizy i generowania wszystkich wykresów toGraphPad Prism 9
Stripettes 10 mLFisher Scientific11839660
Stripettes 25 mLFisher Scientific11839181
Płytka do rozmrażania Cocktail A, (Primary Hepatocyte Thawing and Plating Supplements)GibcoCM3000
TroglitazoneMedChemExpress Tocris97322-87-7
Roztwór błękitu trypanowego, 0,4%15250061Gibco
Probówki 1,5 mlGreiner616201
Waga wagowa - model PA214C i AV213COhaus Corp
bezpieczeństwa mikrobiologicznego ThermoScientific : ,

Bibliografia

  1. Lisi, D. M. Drug-induced liver injury: An overview. US Pharmacist. 41 (12), 30-34 (2016).
  2. Kuna, L., et al. Models of drug induced liver injury (DILI)-current issues and future perspectives. Current Drug Metabolism. 19 (10), 830-838 (2018).
  3. Katarey, D., Verma, S. Drug-induced liver injury. Clinical Medicine. 16 (6), London, England. 104-109 (2016).
  4. Kullak-Ublick, G. A., et al. Drug-induced liver injury: recent advances in diagnosis and risk assessment Recent advances in clinical practice. Gut. 66, 1154-1164 (2017).
  5. Dirven, H., et al. Performance of pre-clinical models in predicting drug-induced liver injury in humans: a systematic review. Scientific Reports. 11 (1), 6403(2021).
  6. Donato, M. T., Lahoz, A., Castell, J. V., Gomez-Lechon, M. J. Cell lines: a tool for in vitro drug metabolism studies. Current Drug Metabolism. 9 (1), 1-11 (2008).
  7. Wilkening, S., Stahl, F., Bader, A. Comparison of primary human hepatocytes and hepatoma cell line HepG2 with regard to their biotransformation properties. Drug Metabolism and Disposition. 31 (8), 1035-1042 (2003).
  8. Gerets, H. H. J., et al. Characterization of primary human hepatocytes, HepG2 cells, and HepaRG cells at the mRNA level and CYP activity in response to inducers and their predictivity for the detection of human hepatotoxins. Cell Biology and Toxicology. 28 (2), 69-87 (2012).
  9. Grainger, C. I., Greenwell, L. L., Lockley, D. J., Martin, G. P., Forbes, B. Culture of Calu-3 cells at the air interface provides a representative model of the airway epithelial barrier. Pharmaceutical Research. 23 (7), 1482-1490 (2006).
  10. Li, F., Cao, L., Parikh, S., Zuo, R. Three-dimensional spheroids with primary human liver cells and differential roles of kupffer cells in drug-induced liver injury. Journal of Pharmaceutical Sciences. 109 (6), 1912-1923 (2020).
  11. Proctor, W. R., et al. Utility of spherical human liver microtissues for prediction of clinical drug-induced liver injury. Archives of Toxicology. 91 (8), 2849-2863 (2017).
  12. Lin, C., Khetani, S. R. Advances in engineered liver models for investigating drug-induced liver injury. BioMed Research International. 2016, 1829148(2016).
  13. Olson, H., et al. Concordance of the toxicity of pharmaceuticals in humans and in animals. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 32 (1), 56-67 (2000).
  14. Bell, C. C., et al. Comparison of hepatic 2D sandwich cultures and 3D spheroids for long-term toxicity applications: A multicenter study. Toxicological Sciences. 162 (2), 655-666 (2018).
  15. Bell, C. C., et al. Characterization of primary human hepatocyte spheroids as a model system for drug-induced liver injury, liver function and disease. Scientific Reports. 6, 25187(2016).
  16. Khetani, S. R., et al. Use of micropatterned co-cultures to detect compounds that cause drug-induced liver injury in humans. Toxicological Sciences. 132 (1), 107-117 (2013).
  17. Ma, X., et al. Deterministically patterned biomimetic human iPSC-derived hepatic model via rapid 3D bioprinting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the united States of America. 113 (8), 2206-2211 (2016).
  18. Dieterle, P. Y. M., Dieterle, F. Tissue-specific, non-invasive toxicity biomarkers: translation from pre-clinical safety assessment to clinical safety monitoring. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 5 (9), 1023-1038 (2009).
  19. Rowe, C., et al. Perfused human hepatocyte microtissues identify reactive metabolite-forming and mitochondria-perturbing hepatotoxins. Toxicology in Vitro. 46, 29-38 (2018).
  20. Rubiano, A., et al. Characterizing the reproducibility in using a liver microphysiological system for assaying drug toxicity, metabolism, and accumulation. Clinical and Translational Science. 14 (3), 1049-1061 (2021).
  21. Tsamandouras, N., Kostrzewski, T., Stokes, C. L., Griffith, L. G., Hughes, D. J., Cirit, M. Quantitative assessment of population variability in hepatic drug metabolism using a perfused three-dimensional human liver microphysiological system. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 360 (1), 95-105 (2017).
  22. Ortega-Prieto, A. M., et al. 3D microfluidic liver cultures as a physiological pre-clinical tool for hepatitis B virus infection. Nature Communications. 9 (1), 682(2018).
  23. Kostrzewski, T., et al. Three-dimensional perfused human in vitro model of non-alcoholic fatty liver disease. World Journal of Gastroenterology. 23 (2), 204-215 (2017).
  24. Kostrzewski, T., et al. A microphysiological system for studying nonalcoholic steatohepatitis. Hepatology Communications. 4 (1), 77-91 (2020).
  25. Vacca, M., et al. Bone morphogenetic protein 8B promotes the progression of non-alcoholic steatohepatitis. Nature Metabolism. 2 (6), 514-531 (2020).
  26. Long, T. J., et al. Modeling therapeutic antibody-small molecule drug-drug interactions using a three-dimensional perfusable human liver co-culture platforms. Drug Metabolism and Disposition. 44, 1940-1948 (2016).
  27. Bai, J., Wang, C. Organoids and microphysiological systems: New tools for ophthalmic drug discovery. Frontiers in Pharmacology. 11, 407(2020).
  28. Ribeiro, A. J. S., Yang, X., Patel, V., Madabushi, R., Strauss, D. G. Liver microphysiological systems for predicting and evaluating drug effects. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 106 (1), 139-147 (2019).
  29. Clark, A. M., et al. A microphysiological system model of therapy for liver micrometastases hhs public access. Experimental Biology and Medicine (Maywood). 239 (9), 1170-1179 (2014).
  30. Qosa, H., Ribeiro, A. J. S., Hartman, N. R., Volpe, D. A. Characterization of a commercially available line of iPSC hepatocytes as models of hepatocyte function and toxicity for regulatory purposes. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 110, 107083(2021).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Hepatotoksyczno polekowatoksyczno in vitroludzkie mikrotkanki w trobowepierwotne ludzkie hepatocytykom rki Kupffera3D hodowla kom rkowabiomarkery w trobowetest ALTodpowied na dawk
Mikrofizjologiczny układ wątroby człowieka do oceny toksyczności wątroby indukowanej lekami in vitro
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.