Artykuł metodologiczny

Mikrofizjologiczny układ wątroby człowieka do oceny toksyczności wątroby indukowanej lekami in vitro

DOI:

10.3791/63389

⸱

31 stycznia 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1CN Bio Innovations Ltd

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Indukowane lekami uszkodzenie wątroby (DILI) jest główną przyczyną niepowodzenia leku. Opracowano protokół umożliwiający dokładne przewidywanie odpowiedzialności związku za DILI za pomocą systemu mikrofizjologicznego wątroby (MPS). Model wątroby wykorzystuje kokulturę pierwotnych komórek wątroby i punktów końcowych istotnych translacyjnie do oceny odpowiedzi komórkowych na leczenie.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DILI jest główną przyczyną wyczerpania w rozwoju leków, z ponad 1000 zatwierdzonych przez FDA leków, o których wiadomo, że potencjalnie powodują DILI u ludzi. Niestety, DILI często nie jest wykrywany, dopóki leki nie osiągną stadium klinicznego, co zagraża bezpieczeństwu pacjentów i prowadzi do znacznych strat dla przemysłu farmaceutycznego. Biorąc pod uwagę, że standardowe modele 2D mają ograniczenia w wykrywaniu DILI, konieczne jest opracowanie modeli in vitro, które są bardziej predykcyjne, aby poprawić translatywalność danych. Aby szczegółowo zrozumieć przyczynowość i mechanistyczne aspekty DILI, opracowano MPS ludzkiej wątroby składający się z ludzkich pierwotnych komórek miąższowych i niemiąższowych wątroby (NPC) i hodowanych w mikrotkankach 3D na zmodyfikowanym rusztowaniu pod perfuzją. Kriokonserwowane pierwotne ludzkie hepatocyty (PHH) i komórki Kupffera (HKC) hodowano wspólnie jako mikrotkanki na platformie MPS przez okres do dwóch tygodni, a każdy związek będący przedmiotem zainteresowania był wielokrotnie dawkowany na mikrotkanki wątroby w siedmiu stężeniach testowych przez okres do czterech dni. Przeanalizowano funkcjonalne punkty końcowe specyficzne dla wątroby (w tym biomarkery kliniczne, takie jak aminotransferaza alaninowa, AlAT) w celu oceny czynności wątroby. Ostre i przewlekłe narażenie na związki o różnym nasileniu DILI można ocenić, porównując odpowiedzi na mikrotkanki podawane w pojedynczej i wielokrotnej dawce. Metodologia ta została zwalidowana z szerokim zestawem ciężkich i łagodnie hepatotoksycznych związków. Poniżej przedstawiamy dane dotyczące pioglitazonu i troglitazonu, dobrze znanych związków hepatotoksycznych wycofywanych z rynku w celu powodowania niewydolności wątroby. Ogólnie rzecz biorąc, wykazano, że model MPS wątroby może być użytecznym narzędziem do oceny DILI i jego związku ze zmianami czynności wątroby. Model może być dodatkowo wykorzystany do oceny, jak nowe związki zachowują się w różnych podgrupach pacjentów oraz jak na profile toksyczności mogą wpływać stany chorobowe wątroby (np. wirusowe zapalenie wątroby, stłuszczenie wątroby).

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DILI pozostaje najczęstszą przyczyną ostrej niewydolności wątroby w USA i Europie i jest główną przyczyną zaniku związków w procesie opracowywania leków1. Prawie wszystkie klasy leków mogą powodować hepatotoksyczność, przy czym leki na ośrodkowy układ nerwowy i antybiotyki są zdecydowanie najczęstszymi metodami leczenia, które powodują DILI u pacjentów2. Hepatotoksyczność wywołana lekiem jest spowodowana złożoną interakcją czynników genetycznych, niegenetycznych i środowiskowych, prowadzącą do śmierci hepatocytów i innych typów komórek wątroby, w tym cholangiocytów i komórek śródbłonka1,3.

Czynniki wywołujące DILI można sklasyfikować na dwa sposoby: te, które powodują przewidywalne, zależne od dawki uszkodzenie wątroby lub te, które powodują idiosynkratyczne DILI, które jest rzadkie i rozwija się niezależnie od dawki leku, drogi lub czasu podania, ale jest odpowiedzialne za do jednej szóstej wszystkich ostrych niewydolności wątroby tylko w USA4. Niestety, DILI często nie jest wykrywany, dopóki leki nie osiągną klinicznych etapów procesu opracowywania leku. Ranga leczenia lekami w przypadku uszkodzenia wątroby (lub DILIrank) składa się z ponad tysiąca leków zatwierdzonych przez FDA, które są podzielone na cztery klasy w zależności od ich potencjału do wywoływania DILI, a ich stosowanie u pacjentów musi być ściśle monitorowane5.

Badanie mechanizmów hepatotoksyczności leków pozostaje bardzo trudne, dlatego też opracowano wiele modeli przedklinicznych w celu zbadania mechanizmów DILI. Obecne modele in vitro i in vivo wykorzystywane do przewidywania DILI w badaniach przedklinicznych mają kilka ograniczeń w dostarczaniu wglądu w złożone, wieloaspektowe interakcje w żywym ciele ludzkim. Nowotworowe linie komórek wątroby (tj. HepG2, HepaRG) hodowane w 2D są nadal używane we wczesnych stadiach rozwoju leku do oceny toksyczności związków kandydujących6. Mimo to te linie komórkowe pochodzą od pojedynczych dawców i wykazują nieprawidłowy poziom czynności wątroby i nie zawsze wykazują wysoką czułość w wykrywaniu DILI7,8. Jako alternatywa dla nowotworowych linii komórkowych wątroby, PHH lepiej reprezentują fizjologię ludzkiej wątroby, jeśli są odpowiednio hodowane in vitro, chociaż istnieje kilka ograniczeń związanych z ich hodowlą, takich jak krótki czas inkubacji z lekami, stosunkowo krótka długość życia, utrata ekspresji genów wątrobowych i zmiany funkcji metabolicznych leków9,10,11. PHH mogą być hodowane na białkach macierzy zewnątrzkomórkowej na standardowych płytkach do hodowli komórkowych 2D, ale wadą jest szybki spadek ich funkcji, co oznacza, że mają niską czułość (<50%) na przewidywanie DILI12.

Z drugiej strony, testowanie na modelach zwierzęcych jest powolne, kosztowne i wymaga translacji międzygatunkowej, aby ekstrapolować przewidywania na ludzi. Większość nowo opracowanych leków nie uzyskuje aprobaty, co czyni ten proces kosztownym i ryzykownym5. Ponadto, do testowania nowych modalności specyficznych dla człowieka, modele zwierzęce są mniej odpowiednie ze względu na różnice w sekwencji genów lub odpowiedzi immunologicznej w porównaniu z ludźmi13.

W związku z tym, zainteresowanie bardziej zaawansowanymi trójwymiarowymi (3D) modelami wątroby in vitro gwałtownie wzrosło. Hodowla PHH jako sferoidalnych struktur generowanych przez agregację grawitacyjną w wiszących kroplach lub na bardzo niskich powierzchniach mocowania stanowi wysokoprzepustową metodę oceny zobowiązań złożonych14. Sferoidy PHH zostały użyte do oceny DILI w tle chorobowym (np. stłuszczenie i cholestaza)15. Opracowano szeroką gamę modeli, aby uwzględnić platerowane mikrowzorzyste kokultury hepatocytów z fibroblastami zrębu 16, 3D bio-printed liver tissues17, 3D sferoidalne kultury z komórkami niemiąższowymi wątroby lub bez nich15. Jednak wszystkie te metody nadal mają wady, a hodowla PHH w bardziej fizjologicznie istotnym mikrośrodowisku może zapewnić im wyższy poziom funkcjonalności przez dłuższy czas, aby umożliwić badanie długotrwałego narażenia na potencjalne hepatotoksyczne. Dodatkowo, aby poprawić znaczenie translacyjne każdej zaawansowanej hodowli PHH in vitro, należy wykorzystać klinicznie istotne funkcjonalne punkty końcowe lub biomarkery wyjściowe toksyczności, aby umożliwić porównanie danych in vivo lub scenariuszach klinicznych18.

W tym badaniu oceniliśmy, czy model wątroby in vitro MPS, znany również jako Organ-on-a-Chip (OOC), może być użyty do zrozumienia szczegółowych mechanistycznych aspektów toksyczności wątroby. Wcześniej wykazano, że MPS utrzymuje wysoce funkcjonalne mikrotkanki wątroby 3D, pod przepływem, przez okres do 4 tygodni19. System został niedawno przetestowany przez FDA i wykazano, że ma wysoką odtwarzalność podczas wykonywania testów toksyczności leków, metabolizmu i akumulacji wewnątrzkomórkowej20. Co więcej, w porównaniu ze sferoidami i kulturami kanapkowymi, system miał bardziej stabilną funkcję i wyższą czułość w wykrywaniu toksyczności kilku leków20. Do tej pory MPS był używany w szerokim zakresie zastosowań, które obejmują ADME21, modelowanie chorób (HBV22, NAFLD23,24,25) oraz interakcje lek-lek26, co potencjalnie czyni go wysoce odpowiednim do oceny ostrego i przewlekłego DILI. Przedstawiona tu technologia stanowi alternatywę pozwalającą wypełnić lukę między bardziej tradycyjnymi hodowlami komórkowymi i modelami zwierzęcymi a badaniami klinicznymi na ludziach, posuwając się w kierunku symulacji warunków biologicznych człowieka w celu wsparcia oceny toksyczności substancji kandydujących dla wątroby na przedklinicznych etapach procesu opracowywania leku.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie prace zostały przeprowadzone w laboratorium zgodnie z rygorystycznymi procedurami bezpieczeństwa i higieny pracy oraz zgodnie z własnymi laboratoryjnymi ocenami ryzyka i SOP. Wszystkie używane urządzenia są serwisowane zgodnie z wytycznymi producenta. Komory bezpieczeństwa mikrobiologicznego (MBSC) są serwisowane co roku, a Ki-Discus (jodek potasu) testowany zgodnie z brytyjskimi standardami. Protokół jest zgodny z Kodeksem Postępowania i dyrektywami Brytyjskiego Urzędu ds. Tkanek Ludzkich (HTA) i wykorzystuje etycznie pozyskiwane pierwotne komórki ludzkie dostarczane przez dostawców, którzy w pełni spełniają ogólne wymagania dotyczące świadomej zgody (45 CFR §46.116 i §46.117) oraz Dobrej Praktyki Klinicznej (GLP), (ICH E6) oraz komitetów regulacyjnych i etycznych.

1. Przygotowanie pożywki do hodowli komórkowych

UWAGA: Przygotuj Zaawansowane podłoże DMEM do wysiewu w dniu -1 i przechowuj w temperaturze 4 °C. Przygotuj zaawansowane podłoże DMEM w dniu 1 i przechowuj w temperaturze 4 °C przez okres do 1 tygodnia.

  1. Wysiew Zaawansowanej pożywki DMEM do kokultury PHH i HKCs: Uzupełnij jedną butelkę 500 ml zaawansowanej pożywki DMEM (tabela materiałów) 18 ml koktajlu A (końcowe stężenie 3,6%) i 25 ml FBS (końcowe stężenie 5%).
  2. Konserwacja Zaawansowane podłoże DMEM do kokultury PHH i HKC: Uzupełnij jedną butelkę 500 ml zaawansowanej pożywki DMEM (tabela materiałów) 20 ml koktajlu B (końcowe stężenie 4%) i 500 nM hydrokortyzonu.
    UWAGA: Hydrokortyzon zostanie przygotowany na świeżo w dniu użycia, a kroki dotyczące przygotowania roztworu podstawowego i wymaganych rozcieńczeń są wymienione poniżej.
  3. Przygotowanie hydrokortyzonu 500 nM w podłożu Maintenance Advanced DMEM
    1. Przygotowanie wyjściowego roztworu podstawowego (20 mM): Odważyć 7,24 mg hydrokortyzonu (tabela materiałów) w szklanej fiolce o pojemności 1 ml. Zanotować dokładną ilość odważonego hydrokortyzonu i określić objętość dimetylosulfotlenku (DMSO) za pomocą następującego obliczenia:
      figure-protocol-1
    2. Przygotowanie roboczego roztworu podstawowego hydrokortyzonu 100 μM: Dodać 5 μl początkowego roztworu podstawowego 20 mM do 995 μl Advanced DMEM.
      UWAGA: Rozcieńczenie 25 μl roztworu DMSO z kroku 1 w wodzie lub pożywce daje stężenie DMSO 0,5%. W roztworze końcowym stężenie DMSO wyniesie 0,0025%. W tym przypadku dodatkowa objętość 5 μl powoduje nieznaczną zmianę całkowitej objętości.
    3. Przygotowanie roboczego roztworu hydrokortyzonu 500 nM w Advanced DMEM: Aby przygotować 1 ml roztworu hydrokortyzonu 500 nM w Advanced DMEM, dodaj 5 μl roztworu podstawowego 100 μM hydrokortyzonu do 995 μL pożywki Maintenance Advanced DMEM.

2. Przygotowanie i przygotowanie MPS (Dzień -1)

  1. Podłącz kontroler do stacji dokującej w inkubatorze do hodowli komórkowych i upewnij się, że świeży środek osuszający (tabela materiałów) został dodany do słoika ze środkiem osuszającym znajdującego się z tyłu sterownika.
    UWAGA: Jednostka sterująca z czasem pobiera wilgoć z inkubatora i jest utrzymywana w suchości za pomocą świeżego środka osuszającego.
  2. Włącz sterownik, naciskając znajdujący się za nim przełącznik kołyskowy łodzi i poczekaj 5 minut, aż system się ustabilizuje i osiągnie ciśnienie. Następnie sprawdź ekran raportu pneumatycznego, aby upewnić się, że: (i) Wyjście zbiornika ciśnieniowego osiągnęło ~2000 mBar i (ii) Wyjście zbiornika próżniowego osiągnęło ~850 mBar.
  3. Wyjmij każdą płytkę z opakowania i sprawdź wzrokowo każdą studzienkę, aby sprawdzić, czy nie ma ewentualnych wad (brakujących rusztowań, pęknięć itp.).
  4. Włóż sterownik (z założoną tabliczką) do stacji dokującej, aby sprawdzić, czy sterownik jest rozpoznawany przez stację dokującą i kontroler. Sprawdź, czy wydajność zbiornika ciśnieniowego spadła o mniej niż 100 mBar, a wydajność zbiornika próżniowego wzrosła o mniej niż 500 mBar.
  5. Zagruntować każdą studzienkę, dodając 500 μl pożywki Seeding Advanced DMEM (wstępnie podgrzanej do 37 °C) po stronie zbiornika.
  6. Na ekranie sterownika należy wybrać program Prime (przepływ w górę przez 3 minuty z prędkością 2.5 μl/s), aż płyn przejdzie przez wsporniki filtra. UWAGA: "Przepływ w górę" to ustawienie sterownika, które umożliwia przepływ mediów ze zbiornika w górę przez rusztowania w płycie LC12.
  7. Napełnij wszystkie studzienki kolejnymi 1,1 ml pożywki Seeding Advanced DMEM, aby pokryć kanał powierzchniowy. Wszystkie studzienki będą wtedy miały pełną objętość roboczą wynoszącą 1,6 ml.
  8. Umieść sterowniki z płytkami w inkubatorze o temperaturze 37 °C i 5% CO2 , podłącz do stacji dokującej i uruchom program inkubacji.
    UWAGA: Wszystkie programy użyte w eksperymencie (Prime, Incubate, Seed, Media Change) są wstępnie ustawione w systemie MPS. Zagruntuj płytki w inkubatorze, aż będą gotowe do wysiewu.

3. Siew komórek wątroby do MPS (Dzień 0)

  1. Wstępnie zweryfikuj wszystkie PHHS i HKC. Wszystkie partie PHH i HKC są wstępnie zatwierdzane wewnętrznie przed przeprowadzeniem eksperymentu z hodowlą komórkową (patrz materiał uzupełniający).
  2. Rozmrozić fiolki z komórkami PHH i HKC (tabela materiałów), trzymając fiolki równomiernie w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, aż pozostanie tylko mały odłamek lodu.
  3. Pipetować PHH bezpośrednio do probówki z wstępnie podgrzanym (37 °C) kriokonserwowanym pożywką do odzyskiwania hepatocytów CHRM (maksymalnie dwie fiolki na probówkę).
  4. Delikatnie odpipetuj komórki, a następnie użyj 1 ml CHRM, aby zmyć wszelkie pozostałe komórki z krioprobówki. Zachowaj ostrożność w stosunku do komórek podczas rozmrażania i przenoszenia do stożkowej tuby.
    UWAGA Nie mieszać fiolek podczas rozmrażania i nie pipetować ich zawartości w górę i w dół.
  5. Delikatnie odpipetować komórki HKC z krioprobówki do 10 ml lodowatego podłoża Seeding Advanced DMEM w probówce wirówkowej o pojemności 15 ml.
    UWAGA: Można połączyć do 2 fiolek HKC.
  6. Odwirować oba typy komórek w temperaturze pokojowej (RT) przy 100 x g przez 10 min. Usunąć supernatant.
  7. Ponownie zawiesić PHH w ciepłym podłożu Seeding Advanced DMEM, a HKC w lodowatym podłożu Seeding Advanced DMEM (aby zmniejszyć zlepianie się komórek), używając 1 ml na fiolkę komórek dodanych do probówki i umieść komórki na lodzie. Użyj delikatnego kołysania, aby ponownie zawiesić ogniwa.
    UWAGA: Nie należy ponownie wybudzać PHH za pomocą pipety, ponieważ może to prowadzić do śmierci komórki.
  8. Połącz zawiesiny komórek z wielu probówek (jeśli ma to zastosowanie - tj. jeśli wszystkie PHH pochodzą od tego samego dawcy), ale nie mieszaj typów komórek.
  9. Policz komórki. Należy odnotować żywotność (musi wynosić powyżej 85 % dla obu typów komórek, PHH i HKC) oraz całkowitą liczbę komórek. Jeśli żywotność komórek spadnie poniżej 85%, rozmrozić nową fiolkę z komórkami i ponownie ocenić żywotność komórek.
  10. Oblicz żywotność komórek za pomocą następującego wzoru:
    figure-protocol-2
  11. Obliczyć żądaną objętość zawiesiny komórkowej do wysiewu do każdej studzienki oraz dodatkową objętość pożywki Seeding Advanced DMEM potrzebną do zwiększenia całkowitej objętości wysiewu do 400 μL. Liczba komórek na studzienkę: 0,4 x 106 PHH i 0,04 x 106 HKC na studzienkę oraz gęstość komórek 0,25 x 106 PHHs/ml, odpowiednio 0,025 x 106 HKCs/ml.
  12. Odłącz sterownik od stacji dokującej i umieść go w MBSC.
  13. Zassać pożywkę z powyższego rusztowania do punktu zatrzymania (schodząc w dół głębokiego wcięcia na pierścieniu ustalającym), kanału i zbiornika. Pozostaw "martwą objętość" 0,2 ml w dołku hodowlanym, sięgając tuż nad rusztowanie. Należy uważać, aby nie usunąć całego podłoża znad rusztowania, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków powietrza.
  14. Dodać 400 μl pożywki Seeding Advanced DMEM do komory studziennej, zwrócić sterownik do stacji dokującej w inkubatorze i uruchomić program wymiany pożywki na 3 minuty. Program automatycznie zatrzyma się po 3 minutach.
  15. Po zakończeniu odłącz sterownik od stacji dokującej i umieść go z powrotem w MBSC.
  16. Zassać pożywkę z powyższego rusztowania w dół do punktu zatrzymania i na końcu zbiornika każdej studzienki.
  17. Ostrożnie ponownie zawiesić PHH, delikatnie kołysząc probówką, a następnie dodać wymaganą objętość zawiesiny komórkowej do każdej studzienki. Ostrożnie odpipetować zawiesinę komórek, upewnić się, że komórki równomiernie rozproszyły się na rusztowaniu płytki.
    UWAGA: Aby zapewnić dobre pokrycie całego rusztowania, należy powoli pipetować komórki na rusztowanie.
  18. Podobnie, ostrożnie ponownie zawiesić HKC i dobrze dodać zawiesiny komórek do każdej hodowli.
    UWAGA: Użyj powolnego ruchu wirowego do wysiewu HKC, aby zapewnić dobre pokrycie w całym rusztowaniu. Dwa podetapy wysiewu można rozdzielić lub dwa typy komórek można wstępnie wymieszać w odpowiedniej gęstości i wysiać jednocześnie.
  19. Gdy wszystkie studzienki zawierają oba typy komórek, umieść sterownik MPS na stacji dokującej w inkubatorze bez fizycznego podłączania go i pozostaw na 1 godzinę.
  20. Po 1 godzinie napełnij każdą studzienkę wymaganą objętością dodatkowego podłoża Seeding Advanced DMEM, aby osiągnąć 400 μL i uruchom program Seed.
  21. Po 2 minutach program automatycznie zatrzyma się, wyjmie sterownik z inkubatora i powoli doda 1000 μl pożywki Seeding Advanced DMEM do kanału (bliżej końca zbiornika niż komory studziennej), aby uzyskać całkowitą objętość 1,4 ml (z kolejnymi 200 μl objętości martwej w kanałach).
  22. Przenieś płytki do inkubatora i uruchom resztę programu Seed przez 8 h.
    UWAGA: Flow automatycznie przełączy się na program Inkubacja po 8 godzinach.

4. Zmiana mediów (Dzień 1)

  1. Odłącz sterownik od stacji dokującej i umieść go w MBSC.
  2. Wykonaj zmianę pożywki, usuwając pożywkę Seeding Advanced DMEM z komory studzienki aż do punktu zatrzymania.
  3. Dodać 400 μl pożywki Maintenance Advanced DMEM do studzienki, zwrócić sterownik do stacji dokującej w inkubatorze i uruchomić program wymiany pożywki na 3 minuty. Program automatycznie zatrzyma się po 3 minutach.
  4. Odłącz sterownik od stacji dokującej i w MBSC odessać media z komory zbiornika, kanału i punktu zatrzymania nad rusztowaniem. W tym momencie studnia hodowli zostanie zwrócona do martwej objętości.
  5. Napełnij komorę zbiornika 1,4 ml świeżego, wstępnie podgrzanego (37 °C) podłoża Maintenance Advanced DMEM.
  6. Zwróć sterownik do stacji dokującej w inkubatorze i uruchom program Inkubacja.

5. Kontrola jakości mikrotkanek wątroby (QC), pobieranie pożywki, zmiana pożywki i dawkowanie leków (Dzień 4)

  1. W dniu 4 wykonaj zmianę podłoża za pomocą pożywki Maintenance Advanced DMEM i kontroli jakości, aby upewnić się, że wysiew się powiódł.
    UWAGA: QC to proces stosowany do sprawdzania stanu zdrowia utworzonych mikrotkanek poprzez pomiar dehydrogenazy mleczanowej (LDH) i mocznika.
  2. Przed uruchomieniem kontroli jakości należy przygotować świeże roztwory podstawowe dla każdego związku do przetestowania (w pożywce Maintenance Advanced DMEM lub pożywce Maintenance Advanced DMEM zawierającej 0,1% DMSO, w zależności od rozpuszczalności każdego związku). Przygotować odpowiednie rozcieńczenia, aby uzyskać badane stężenia dla każdego związku.
  3. Odłącz sterownik i płytę rejestracyjną od stacji dokującej i przenieś do MBSC.
  4. Przenieść 50 μl pożywki z każdej studzienki za pomocą pipety na płytkę 96-dołkową w celu przeprowadzenia testu LDH (tabela materiałów) przed pobraniem próbki i 25 μl w przypadku testu mocznika (tabela materiałów).
    UWAGA: Testy LDH i mocznika zostaną wykonane zgodnie z instrukcjami producenta.
  5. Kontynuuj eksperyment po kontroli jakości, jeśli odczyty LDH są niższe niż 2 AU / 106 komórek, a mocznik jest powyżej 40 μg / dzień / 106 komórek.
    UWAGA: Albumina nie jest używana jako kontrola jakości, ponieważ jest to długi test do przeprowadzenia w danym dniu i zostanie oceniony później, po zakończeniu eksperymentu z próbek pobranych w dniu 4.
  6. Jeśli jakiekolwiek studzienki nie przejdą kontroli jakości, usuń je z projektu eksperymentalnego.
  7. Po potwierdzeniu układu eksperymentalnego należy pobrać próbki pozostałych pożywek z każdej studzienki, uważając, aby nie zakłócić hodowli komórkowej poprzez dotknięcie rusztowania. Zebrane pożywki (oznaczone jako próbki przed podaniem) należy przechowywać w temperaturze -80 °C do późniejszych badań.
  8. Wykonaj wymianę nośnika w narzędziu MBSC, wykonując kroki 4.3–4.5. Zmień studzienki na konserwację Zaawansowane podłoże DMEM o odpowiednim stężeniu leku zgodnie z projektem eksperymentalnym.
  9. Po zakończeniu włóż sterownik z powrotem do stacji dokującej w inkubatorze i uruchom program Inkubacja.

6. Pobieranie mediów, zmiana pożywki i dawkowanie leków (Dzień 6)

  1. Przygotować świeże roztwory podstawowe dla każdego związku do badania (w pożywce Maintenance Advanced DMEM lub pożywce Maintenance Advanced DMEM zawierającej 0,1% DMSO, w zależności od rozpuszczalności każdego związku). Przygotować odpowiednie rozcieńczenia, aby uzyskać badane stężenia dla każdego związku zgodnie z planem płytki.
  2. Odłącz sterownik i tabliczkę znamionową od stacji dokującej i przenieś do MBSC.
  3. Pobrać pożywkę z każdej studzienki (~ 1 ml) ręcznie za pomocą pipety, upewniając się, że nie zakłócasz hodowli komórkowej poprzez dotknięcie rusztowania, test na LDH i mocznik. Resztę pobranych pożywek należy przechowywać w temperaturze -80 °C do późniejszych analiz i oznaczać je próbkami po 48 godzinach od podania dawki.
  4. Ponownie dozuj każdą studzienkę z takim samym stężeniem leku, jak w dniu 4 i zgodnie z planem płytki, wykonując zmianę pożywki zgodnie z krokami 4.3-4.5.
  5. Po zakończeniu włóż sterownik z powrotem do stacji dokującej w inkubatorze i uruchom program Inkubacja.

7. Zakończenie eksperymentu (Dzień 8)

  1. Odłącz sterownik i tabliczkę znamionową od stacji dokującej i przenieś do MBSC.
  2. Pobieraj próbki pożywki z każdej studzienki ręcznie za pomocą pipety, uważając, aby nie zakłócić hodowli komórkowej poprzez dotknięcie rusztowania.
  3. Oznaczyć pobrane podłoża na obecność LDH i mocznika, a resztę pobranych pożywek przechowywać w temperaturze -80 °C do późniejszych badań.
  4. Przeprowadzanie testu CYP3A4-glo.
    1. Zmierz wpływ testowanych leków na aktywność cytochromu P450 CYP3A4 w PHH na koniec eksperymentu za pomocą tego testu.
    2. Odczynnik do wykrywania należy rozpuścić (dla testu CYP3A4, patrz tabela materiałów) zgodnie z instrukcjami producenta. Jeżeli odczynnik do wykrywania został uprzednio rozpuszczony i zamrożony, wyjąć go z zamrażarki w temperaturze -20 °C i pozostawić do rozmrożenia w temperaturze pokojowej.
    3. Przygotuj 20 mM standardowego D-lucyferyny zgodnie z instrukcjami producenta.
    4. Przygotować roboczą pożywkę z podłożem luminogenicznym z rozcieńczeniem Luciferin IPA w stosunku 1:1000 w pożywce Maintenance Advanced DMEM (2 ml pożywki z podłożem luminogenicznym na studzienkę).
    5. Wykonaj zmianę podłoża zgodnie z opisem w krokach 4.3-4.5 z luminogenicznym podłożem substratowym. Zapisz 500 μl podłoża luminogenicznego w szklanej fiolce o pojemności 1,5 ml (tabela materiałów) jako materiał wejściowy.
    6. Umieść sterownik z powrotem w stacji dokującej w inkubatorze i uruchom program Inkubacja na 1,5 godziny.
    7. Przygotować krzywą wzorcową D-lucyferyny w pożywce hodowlanej w probówkach o pojemności 1,5 ml zgodnie z instrukcjami producenta i odpipetować 50 μl każdego wzorca w dwóch egzemplarzach na białej, nieprzezroczystej 96-dołkowej płytce (patrz Tabela Materiałów), używając pożywki hodowlanej jako próby ślepej lub 0 μM.
    8. Po upływie tego czasu wyjmij sterownik ze stacji dokującej i pobierz próbki pożywki do testu CYP3A4, wykonując czynności 7.4.9-7.4.13.
    9. Po inkubacji przenieść 50 μl pożywki z każdej studzienki i materiału wejściowego na 96-dołkową nieprzezroczystą białą płytkę luminometryczną zawierającą wzorce. Należy zwrócić uwagę, aby pozostawić co najmniej dwa puste rzędy na nieprzezroczystej płytce między wzorcami a próbkami, aby uniknąć lekkiego przenoszenia między górnymi wzorcami a odczytami próbek.
    10. Dodaj 50 μl odczynnika do wykrywania lucyferyny do każdego dołka, aby zainicjować reakcję luminescencyjną.
    11. Inkubować płytkę w temperaturze pokojowej na wytrząsarce płytek przez 20 minut w ciemności, aby ustabilizować sygnał luminescencyjny.
    12. Zapisz luminescencję za pomocą luminometru lub kamery CCD.
    13. Wykreśl krzywą standardową, biorąc średnią z każdego punktu, a następnie odejmując średnią z pustych miejsc. Użyj równania linii, aby obliczyć tempo metabolizmu (pmol/min/106 komórek) w pozostałych próbkach, pamiętając o uwzględnieniu wszelkich wykonanych rozcieńczeń.
  5. Usuń rusztowania z płytek za pomocą pęsety i umieść je na 24-dołkowej płytce zawierającej 500 μl D-PBS (bez Ca++ i Mg++) w każdym dołku, uważając, aby nie naruszyć mikrotkanki.
  6. Rób zdjęcia każdego rusztowania za pomocą mikroskopu światła odwróconego przy powiększeniu 10x.
  7. Przeprowadzanie testu ATP (patrz tabela materiałów) zgodnie z instrukcjami producenta:
    1. Rozmrozić odczynnik w temperaturze pokojowej.
    2. Rusztowania należy umyć dwukrotnie 500 μl D-PBS (bez Ca++ i Mg++) na każdym etapie mycia.
    3. Dodać 120 μl odczynnika i 120 μl PBS do każdego rusztowania i te same objętości do pustej studzienki (będzie to służyć jako ślepa próba). Umieść płytkę pokrytą folią aluminiową na wytrząsarce i energicznie wstrząsaj (500 obr./min) przez 5 minut, a następnie 30 minut inkubacji w celu ustabilizowania sygnału luminescencji.
    4. Przenieść 100 μl zlizowanych próbek w dwóch egzemplarzach na przezroczystą płaskodenną 96-dołkową płytkę testową w celu pomiaru. Upewnij się, że ślepe studzienki nie są umieszczone obok innych studzienek pomiarowych o wysokiej luminescencji.
    5. Rejestruj luminescencję za pomocą czytnika mikropłytek.
    6. Porównaj luminescencję próbek z luminescencją wzorców, aby określić ATP wykryte przez odczynnik w próbkach.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rękopis opisuje model MPS wątroby używany do oceny DILI. MPS ułatwia generowanie mikrotkanek wątroby 3D, które są utrzymywane w stanie wysokiej funkcjonalności przez okres do 4 tygodni. PHH/HKC są wysiewane na rusztowaniach pokrytych kolagenem w celu utworzenia mikrotkanek wątroby, które są perfundowane pożywką wzrostową i po przejściu kontroli jakości dozowane są związki. W tym miejscu przedstawiono dane dotyczące troglitazonu i pioglitazonu, dwóch strukturalnie podobnych związków, ale o różnym nasileniu DILI.

W dniu 4, przed podaniem leku, oceniana jest kontrola jakości utworzonych mikrotkanek wątroby, która polega na uwalnianiu LDH i syntezie mocznika (Rysunek 1A). Kontrola jakości ma na celu potwierdzenie, że MPS wątroby wytwarza wysoce spójne i funkcjonujące mikrotkanki wątroby. Przedstawione tutaj dane pochodzą z trzech eksperymentów i wykazują dobry poziom odtwarzalności przy niskiej zmienności wewnątrz i między badaniami. Po 8-dniowym posiewie ocenia się wiele wskaźników zdrowotnych i wątrobowych (albumina, mocznik, CYP3A4, ATP), a mikrotkanki kontrolne wykazują wysoki poziom funkcjonalności wątroby i odtwarzalności (Rysunek 1B, C). Mikroskopia fazy kontrastowej i barwienie IF mikrotkanek wątroby (patrz materiał uzupełniający) wykazują wysoką konsystencję wysiewu w mikrokanałach rusztowania i ujawniają rozmieszczenie HKC w mikrotkankach PHH (Rysunek 1D)

figure-results-1
Rysunek 1: Wątroba MPS generuje wysoce powtarzalne dane i spójne mikrotkanki. (A) Wskaźniki 3D kontroli jakości mikrotkanek wątroby w 4 dniu i ocena funkcjonalności na koniec badania w 8 dniu -(B) Albumina i mocznik, (C) CY3A4 i ATP). Dane są zbierane z 3 eksperymentów; W każdym eksperymencie znajdowały się 3 powtórzenia kontrolne pojazdów. Przedstawione dane to średnia ± SD, N = 9. (D) Mikroskopia z kontrastem fazowym (10x i 20x) i IF mikrotkanek wątroby 3D wygenerowanych przez kokulturację PHH i HKC na platformie MPS wątroby do oceny DILI. Aby uwidocznić HKC, przed wysiewem HKC transdukowano wektorem adenowirusowym wykazującym ekspresję eGFP (patrz materiał uzupełniający). Pokazane są reprezentatywne mikrofotografie. Transdukcję i obrazowanie przeprowadzono jako samodzielny eksperyment mający na celu zademonstrowanie lokalizacji komórek i nie wykonano go za pomocą opisanego protokołu DILI. Komórki HKC są wstępnie zwalidowane wewnętrznie przed użyciem w eksperymentalnej hodowli komórkowej i muszą charakteryzować się niskim poziomem aktywacji po rozmrożeniu; ocenia się to poprzez pomiar biomarkerów IL-6 i TNF-alfa. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Troglitazon jest znany z tego, że powoduje ciężkie DILI; po uzyskaniu licencji na leczenie cukrzycy typu 2, został wycofany przez FDA po 3 latach na rynku ze względu na częstotliwość uszkodzeń wątroby związanych z jego stosowaniem. Do tej pory opublikowane badania na zwierzętach nie były w stanie przewidzieć, że troglitazon może powodować ciężkie uszkodzenie wątroby. Toksyczność tego związku nie została również wykryta w standardowych testach wątrobowych 2D in vitro14.

Mikrotkankom wątroby w MPS podawano troglitazon przez 96 godzin, co spowodowało ostrą reakcję toksyczną, napędzaną przez Cmax, która została wykryta przez uwolnienie ALT i LDH oraz szybkie zmniejszenie produkcji albuminy i mocznika, przy około 15 x Cmax, po ostrej ekspozycji na troglitazon (Rysunek 2A). Komórkowy punkt końcowy (zawartość ATP) i aktywność CYP3A4 (do oceny biotransformacji metabolicznej), pobrane po 96 godzinach ekspozycji, dodatkowo potwierdzona toksyczność spowodowana przez troglitazon i wartości EC:50 były wysoce porównywalne z innymi punktami końcowymi (Rysunek 2B). Obrazy z mikroskopii jasnego pola wykonane po 8-dniowej hodowli w MPS ujawniają zdrową mikrotkankę wątroby, równomiernie rozsianą w całym rusztowaniu (kontrola nośnika), w przeciwieństwie do uogólnionej śmierci/degradacji tkanki, jak widać w kontrpróbach traktowanych kontrolą pozytywną i troglitazonem w dwóch najwyższych stężeniach testowych (Rysunek 2C).

figure-results-2
Rysunek 2: Określanie ryzyka DILI dla troglitazonu przy użyciu wielu punktów końcowych hepatotoksycznych. Mikrotkanki wątroby poddano działaniu siedmiu badanych stężeń troglitazonu przez 96 godzin i porównano pod kątem (A) uwalniania LDH, uwalniania ALT, produkcji albuminy, syntezy mocznika, aktywności CYP3A4 i zawartości ATP. Niebieskie linie - 48 godzin ekspozycji (tylko punkty końcowe mediów), czerwone linie - 96 godzin ekspozycji. Kontrola pozytywna wynosiła 100 μM chloropromazyny. Wszystkie punkty końcowe są mierzone z tych samych posiewów MPS w wątrobie. Przedstawione dane są średnimi ± SD, N = 3. (B) Podsumowanie liczb E:50 wygenerowanych na podstawie danych. N.D. = dane niekreślalne. Linia = nie oznaczona. (C) Reprezentatywna mikroskopia jasnego pola mikrotkanek wątroby po 8-dniowym posiewie (powiększenie 10x). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Zbadano również toksyczność wątroby po ekspozycji na pioglitazon. Pioglitazon jest związkiem, o którym wiadomo, że ma niski poziom DILI4 i nie wywierał hepatotoksyczności w klasycznych hodowlach pierwotnych hepatocytów 2D, a nawet w niektórych bardziej zaawansowanych modelach 3D10, 11. Łagodne działanie hepatotoksyczne zaobserwowano w obu badanych punktach czasowych (Rysunek 3). Nie wykryto uwalniania LDH ani ALT; jednak po 48 godzinach zaobserwowano łagodne zmniejszenie produkcji albuminy i mocznika, przy ok. 25x Cmax (Ryc. 3A). Bardzo niewielkie zmniejszenie zawartości ATP obserwowano również przy dużych stężeniach pioglitazonu, ale nie było to znaczące. Wartości EC:50 wygenerowane z krzywych dawka-odpowiedź są przedstawione w Rysunek 3B. Mikroskopia wykazała niewielkie zmiany w mikrotkankach po 96 godzinach ekspozycji na pioglitazon w dwóch najwyższych badanych stężeniach (Rysunek 3C). Wyniki wskazują na zdolność MPS wątroby do wykrywania toksyczności związków o łagodnym nasileniu DILI.

figure-results-3
Rysunek 3: Określanie ryzyka DILI dla pioglitazonu przy użyciu wielu punktów końcowych hepatotoksycznych. Mikrotkanki wątroby poddano działaniu siedmiu badanych stężeń pioglitazonu przez 96 godzin i porównano pod kątem (A) uwalniania LDH, uwalniania ALT, wytwarzania albuminy, syntezy mocznika, aktywności CYP3A4 i zawartości ATP. Niebieskie linie - 48 godzin ekspozycji (tylko punkty końcowe mediów), czerwone linie - 96 godzin ekspozycji. Kontrola pozytywna wynosiła 100 μM chloropromazyny. Wszystkie punkty końcowe są mierzone z tych samych posiewów MPS w wątrobie. Przedstawione dane są średnimi ± SD, N = 3. (B) Podsumowanie liczb EC:50 wygenerowanych na podstawie danych. N.D. = dane niekreślalne. Linia = nie oznaczona. (C) Reprezentatywna mikroskopia jasnego pola mikrotkanek wątroby po 8-dniowym posiewie (powiększenie 10x). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Oceniając wszystkie funkcjonalne punkty końcowe i biomarkery wyjściowe toksyczności, które mogą reprezentować scenariusze in vivo lub kliniczne (uwalnianie LDH, synteza mocznika, produkcja albuminy, aktywność CYP3A4, zawartość ATP, uwalnianie ALT) i potwierdzając dane wygenerowane dla obu badanych związków dawkowanych w siedmiopunktowym zakresie dawek przez 48 h i 96 h, wygenerowano mapę cieplną, która daje "sygnaturę hepatotoksyczności", pomoc w identyfikacji związków o różnym poziomie zagrożenia DILI (Rysunek 4).

figure-results-4
Rysunek 4: Określanie "sygnatury toksyczności" za pomocą MPS wątroby. Mapa cieplna przedstawiająca troglitazon i pioglitazon z sześciu funkcjonalnych punktów końcowych specyficznych dla wątroby (uwalnianie LDH, synteza mocznika, wytwarzanie albuminy, uwalnianie ALT, aktywność CYP3A4 i zawartość ATP) po 48 i 96 godzinach ekspozycji na siedmiopunktowy zakres dawek. Każda wartość jest generowana jako średnia, N = 3 i normalizowana w celu uzyskania próbek kontrolnych. Wartości na kolorowych paskach reprezentują zwiększenie zagięcia w stosunku do kontrolek linii bazowej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Materiał uzupełniający: Obrazowanie mikrotkanek pod mikroskopem fluorescencyjnym i wstępna kwalifikacja komórek. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MPS zostały zaprojektowane w celu podsumowania jednostek funkcjonalnych narządów ludzkich in vitro i zostały opracowane w celu wyeliminowania ograniczeń konwencjonalnych modeli hodowli komórkowych3D 27. Wątroba jest jednym z najbardziej modelowanych narządów wykorzystujących MPS i opracowano wiele różnych systemów. Ludzka wątroba jest odpowiedzialna za metabolizm leków i wytwarzanie toksycznych metabolitów leków, a jej funkcja jest kluczowym elementem modelowania rozwoju leków, w tym oceny odpowiedzialności związków za DILI28. Tutaj wprowadziliśmy nową metodę oceny DILI za pomocą MPS wątroby; Protokół umożliwia uzyskanie wglądu mechanistycznego dla każdego badanego związku w celu określenia, w jaki sposób może on powodować DILI, a także jest bardzo czułym i solidnym testem. Mikrotkanki wątroby powstają na płytkach MPS, które są kokulturą PHH i HKC i są wysoce funkcjonalne z wysokim poziomem produkcji albumin i mocznika, a także wysoką aktywnością CYP3A4 w porównaniu ze standardowymi modelami wątroby in vitro 20.

Choć opisywany tu model DILI może służyć jako przydatne narzędzie w późniejszych etapach badań przedklinicznych w procesie opracowywania leku, to ma też kilka ograniczeń. Podobnie jak większość MPS dostępnych obecnie na rynku, jest to platforma o niskiej przepustowości, a zatem trudniejsza do wykorzystania w badaniach przesiewowych na dużą skalę. Model DILI, składający się z mikrotkanek powstałych w wyniku kokulturacji PHH i HKC, również nie jest w stanie w pełni uchwycić złożoności ludzkiej wątroby, a dalsza optymalizacja poprzez włączenie różnych typów komórek (np. komórek odpornościowych) byłaby korzystna dla zwiększenia wartości istniejącego modelu. Ten jednonarządowy MPS można również połączyć z innymi platformami narządowymi, które mogą dzielić wspólne medium i umożliwiać przesłuchy narządów na poziomie komórkowym lub hormonalnym, co może pomóc w lepszym zrozumieniu mechanistycznych spostrzeżeń dotyczących toksyczności, które nie ograniczają się tylko do samej wątroby. Ponadto, jak każda stosunkowo nowa technologia, może być uważana za kosztowną, a tym samym o ograniczonej dostępności.

MPS to platforma służąca do opracowywania modeli organotypowych tkanek jedno- lub wieloludzkich. System składa się ze sterownika, kabla pępowinowego i sterownika MPS, do którego wkładana jest płytka (rysunek 5A). Każda płytka MPS wątroby ma 12 niezależnych otwartych studzienek do hodowli pierwotnych komórek wątroby w 3D na zmodyfikowanych rusztowaniach. Podsumowując, system jest sprawdzany pod kątem kontroli jakości, a płytki są zalewane w dniu -1, PHH i HKC są wysiewane na płytki w dniu zerowym (rysunek 5B, patrz 1). Wbudowane mikropompy ułatwiają krążenie pożywek do hodowli komórkowych przez rusztowania, aby ułatwić tworzenie mikrotkanek 3D (ryc. 5B, patrz 2). Utworzone mikrotkanki są poddawane kontroli jakości w dniu 4, podawane w różnych stężeniach każdego związku co 48 godzin przez 4 dni i oznaczane pod kątem biomarkerów końcowych w dniu 8 (Figura 5C). Eksperymentalny harmonogram testu DILI na płytce MPS przedstawiono na rysunku 5D.

figure-discussion-1
Rysunek 5: System mikrofizjologiczny i eksperymentalny harmonogram standardowego testu DILI. (A) System mikrofizjologiczny wraz z jego elementami: kontrolerem (1), kablem pępowinowym (2), stacją dokującą (3), sterownikiem MPS (4) i płytką LC12 (5). (B) Wysiewanie PHH i HKC na płytce LC12 w dniu 1 (1) i wbudowane mikropompy ułatwiają cyrkulację pożywek do hodowli komórkowych z regulowanymi prędkościami przepływu przez mikrotkanki 3D wysiane na rusztowaniach (2). (C) Zdejmowanie rusztowań po zakończeniu badania. (D) Eksperymentalny harmonogram. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Podczas wykonywania protokołu ważne jest, aby przed uruchomieniem przeprowadzono solidną kontrolę jakości systemu, sprawdzenie, czy system działa prawidłowo pneumatycznie, a płyty eksploatacyjne zostały sprawdzone wizualnie i skutecznie zagruntowane, aby zapewnić równomierną funkcjonalność we wszystkich studzienkach. Posiadanie wysokiej jakości pierwotnych komórek ludzkich jest niezbędne dla tego protokołu, a hepatocyty znane są z konsekwentnego przylegania w eksperymentach z hodowlą komórkową i tworzenia interakcji 3D. Rozmrażanie tych komórek jest również krytycznym krokiem, ponieważ pierwotne hepatocyty nie powinny być ponownie zawieszane przez pipetowanie, ponieważ może to szybko doprowadzić do śmierci komórki. Żywotność komórek powyżej 85% ma kluczowe znaczenie dla udanego wysiewu, ponieważ duże ilości resztek komórkowych będą zakłócać tworzenie mikrotkanek 3D. Kontrola jakości uformowanych mikrotkanek wątroby w 4. dniu jest również ważna, a użytkownik musi upewnić się, że mierzone są dopuszczalne poziomy LDH i mocznika, ponieważ parametry poza zakresem mogą wskazywać na tworzenie tkanek o niskiej jakości i umożliwiać proste rozwiązywanie problemów. Wreszcie, hydrokortyzon stosowany w pożywce do hodowli komórkowych musi być przygotowany świeży w dniu użycia, aby zapobiec niepożądanej degradacji, która mogłaby mieć wpływ na funkcjonalność hodowli komórkowych, ponieważ jest on niezbędny do utrzymania funkcjonalności metabolicznej hepatocytów.

Pomimo znacznej złożoności, MPS wątroby nie zawiera wszystkich typów komórek ludzkiej wątroby. Możliwe jest dodanie kolejnych typów komórek do modelu24,29 w celu zwiększenia znaczenia fizjologicznego, ale należy je dodawać tylko z wyraźnym uzasadnieniem kontekstu użycia. Do badania DILI PHH są kluczowym typem komórek, a włączenie HKC do tego modelu pozwala na określenie pewnych odpowiedzi immunologicznych. Należy również zauważyć, że PHH wyizolowane z ludzkiej wątroby i dostępne na rynku kriokonserwowane PHH wykazują pewne różnice w zależności od partii. Wykazaliśmy tutaj, że protokół ten daje powtarzalne wyniki, gdy jest stosowany z wysokiej jakości preparatami komórek. Można się jednak spodziewać pewnych różnic między partiami, które można jeszcze bardziej przezwyciężyć, korzystając z połączonych partii wielu darczyńców. Ograniczenia te można przezwyciężyć poprzez zastosowanie komórek podobnych do hepatocytów zróżnicowanych z iPSC, które podsumowują wiele właściwości funkcjonalnych PHH i które zostały wykorzystane w procesie opracowywania leków30. HKC wykazują również dużą zmienność partii i wysoki poziom aktywacji po rozmrożeniu; w związku z tym dawcy HKC są wstępnie zwalidowani wewnętrznie przed zastosowaniem w eksperymentalnej hodowli komórkowej (kohodowla z zwalidowanymi PHH) i muszą mieć niski poziom aktywacji po rozmrożeniu; ocenia się to poprzez pomiar biomarkerów IL-6 i TNF-alfa (patrz materiał uzupełniający).

Przedstawione tutaj dane potwierdzają, że test może dokładnie wykrywać DILI, pomagając w identyfikacji substancji hepatotoksycznych, które mogą nie zostać wykryte przez 2D 10,11, a nawet niektóre modele 3D. Dane generowane za pomocą MPS nadal nie są wykorzystywane jako standard przez przemysł farmaceutyczny do składania wniosków regulacyjnych lub do celów badań przesiewowych leków ze względu na brak standaryzacji i harmonizacji procesów, w tym odtwarzalności między lokalizacjami20. Zaprezentowane tutaj dane i podejścia eksperymentalne rozwiązują ten problem, pokazując, że model wątroby może być rutynowo i solidnie stosowany w badaniach przesiewowych DILI w celu dokładnego przewidywania odpowiedzialności nowych związków.

Pomiar szeregu punktów końcowych w celu uzyskania "sygnatury hepatotoksyczności", pomoc w identyfikacji związków o różnym poziomie zagrożenia DILI (w tym związków niewykrywalnych innymi metodami in vitro) oraz ujawnienie ich mechanizmów toksyczności. Technologia ta może wypełnić lukę między tradycyjną hodowlą komórkową i modelami zwierzęcymi z jednej strony, a badaniami klinicznymi na ludziach, posuwając się w kierunku symulacji warunków biologicznych człowieka do przedklinicznej oceny toksyczności wątroby w ramach procesu opracowywania leku.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszyscy autorzy są pracownikami CN Bio Innovations Limited.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CN Bio Innovations Ltd. sfinansowało to badanie.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
24-dołkowe płytki klastrowe do hodowli komórkowych z płaskim dnemCorning3524
96-dołkowe przezroczyste płytki testowe, płaskie dno przezroczyste tworzywo sztuczneGreiner655101
96-dołkowe czarne płaskie dnoCorning3915
96 Well Biała/przezroczysta płyta dolna, powierzchnia TCThermoScientific165306
Advanced DMEM (1x)Gibco12491015Pożywki do hodowli komórkowych.
AssayMax Albumina Zestaw ELISAAssayProEA3201-1Rozcieńczenie 1:250. Punkt czasowy Dzień 4, 6 i 8.
Koktajl utrzymania komórek B, (Pierwotne suplementy podtrzymujące hepatocyty)GibcoCM4000
CellTiter-Glo 3D Test żywotności komórekPromegaG9682Rozcieńczenie 1:1. Punkt czasowy Dzień 8.
Chlorpromazyna HClSigma AldrichC8138
Chromacol niebieskie pokrywki, 9 mm Autosampler Nasadki gwintowane na fiolkiThermoScientific9-SCK(B)-ST1Fiolki szklane
Fiolki Chromacol, 9 mm fiolki z przezroczystym szkłemKomory2-SVW
klasy 2 - Trimat2 1500 wydechRoztwory
powietrza zamkniętegoProbówki stożkowe 50 mlGreiner227261
Kriokonserwowane pożywki do odzyskiwania hepatocytów (CHRM)ThermoFisher ScientificGibco CM7000
Kriokonserwowane pierwotne hepatocyty ludzkieBioIVT EuropeLot. RAS
CytoTox 96 Zestaw do oznaczania cytotoksyczności (LDH) PromegaG1781Rozcieńczenie - brak. Punkt czasowy Dzień 4, 6 i 8
>Model analizy danych wykorzystany do wygenerowania wykresu i krzywych EC:50 to regresja nieliniowa (dopasowanie krzywej) asymetryczna sigmoidalna, 5PL, gdzie X jest logarytmem (stężenieGraphPad Prism 9
Jednorazowe jednostki filtrujące PES 500 mlFisher Scientific15913307
Jednorazowe miski na pipety 50 mlFisher Scientific12369175
DMSO (dimetylosulfotlenek)Sigma-AldrichSigma D2650
Dulbeco' s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami bez Ca2+ i Mg2+ (D-PBS)ThermoFisher Scientific14190-144
Easy Reader Stożkowe probówki wirówkowe z polipropylenu 15 mlFisher Scientific 11889640
Surowica bydlęcapłodu Gibco10500064
Zestaw ELISA ludzkiego ALT Abcam  ab 234578Rozcieńczenie 1:5. Punkt czasowy: Dzień 6 i 8.
Ludzkie kriokonserwowane komórki KupfferaLonza Europe Lot. 190088KC
hydrokortyzonMerckH0888-1G
Modele inkubatorów: Nowy Brunszwik  Galaxy 170 S, Nowy Brunszwik  Galaxy 170 R oraz CellXpert® Silnik C170.EppendorfWszystkie serwisowane rocznie; dokumenty dostępne na życzenie.
Mikroskop odwróconyLeica DMIL LED
MPS znany jako Organ-on-a-Chip (OOC)CN Bio Innovations Ltd.
Płyta MPS LC-12CN Bio Innovations Sp. z o.o.
Neubauer Ulepszony jednorazowy hemocytometr C-Chip (2 kanały)Cambridge BioscienceDHC-N01-50
P450-Glo CYP3A4 System oznaczania i badań przesiewowych RozcieńczaniePromegaV9002- brak. Punkt czasowy, Dzień 8
Platforma MPS PhysioMimixCN Bio Innovations Ltd.
PioglitazoneMedChemExpress TocrisHY-13956/CS-1700
Zestaw do oznaczania mocznika Quantichrom – Systemy testów biologicznychSystemy testów biologicznychDY970-05Rozcieńczenie 1:2, jeśli początkowy odczyt jest zbyt wysoki. Punkt czasowy Dzień 4, 6 i 8.
Żel krzemionkowySigma-AldrichS7625
Oprogramowanie używane do analizy i generowania wszystkich wykresów toGraphPad Prism 9
Stripettes 10 mLFisher Scientific11839660
Stripettes 25 mLFisher Scientific11839181
Płytka do rozmrażania Cocktail A, (Primary Hepatocyte Thawing and Plating Supplements)GibcoCM3000
TroglitazoneMedChemExpress Tocris97322-87-7
Roztwór błękitu trypanowego, 0,4%15250061Gibco
Probówki 1,5 mlGreiner616201
Waga wagowa - model PA214C i AV213COhaus Corp
bezpieczeństwa mikrobiologicznego ThermoScientific : ,

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lisi, D. M. Drug-induced liver injury: An overview. US Pharmacist. 41 (12), 30-34 (2016).
  2. Kuna, L., et al. Models of drug induced liver injury (DILI)-current issues and future perspectives. Current Drug Metabolism. 19 (10), 830-838 (2018).
  3. Katarey, D., Verma, S. Drug-induced liver injury. Clinical Medicine. 16 (6), London, England. 104-109 (2016).
  4. Kullak-Ublick, G. A., et al. Drug-induced liver injury: recent advances in diagnosis and risk assessment Recent advances in clinical practice. Gut. 66, 1154-1164 (2017).
  5. Dirven, H., et al. Performance of pre-clinical models in predicting drug-induced liver injury in humans: a systematic review. Scientific Reports. 11 (1), 6403(2021).
  6. Donato, M. T., Lahoz, A., Castell, J. V., Gomez-Lechon, M. J. Cell lines: a tool for in vitro drug metabolism studies. Current Drug Metabolism. 9 (1), 1-11 (2008).
  7. Wilkening, S., Stahl, F., Bader, A. Comparison of primary human hepatocytes and hepatoma cell line HepG2 with regard to their biotransformation properties. Drug Metabolism and Disposition. 31 (8), 1035-1042 (2003).
  8. Gerets, H. H. J., et al. Characterization of primary human hepatocytes, HepG2 cells, and HepaRG cells at the mRNA level and CYP activity in response to inducers and their predictivity for the detection of human hepatotoxins. Cell Biology and Toxicology. 28 (2), 69-87 (2012).
  9. Grainger, C. I., Greenwell, L. L., Lockley, D. J., Martin, G. P., Forbes, B. Culture of Calu-3 cells at the air interface provides a representative model of the airway epithelial barrier. Pharmaceutical Research. 23 (7), 1482-1490 (2006).
  10. Li, F., Cao, L., Parikh, S., Zuo, R. Three-dimensional spheroids with primary human liver cells and differential roles of kupffer cells in drug-induced liver injury. Journal of Pharmaceutical Sciences. 109 (6), 1912-1923 (2020).
  11. Proctor, W. R., et al. Utility of spherical human liver microtissues for prediction of clinical drug-induced liver injury. Archives of Toxicology. 91 (8), 2849-2863 (2017).
  12. Lin, C., Khetani, S. R. Advances in engineered liver models for investigating drug-induced liver injury. BioMed Research International. 2016, 1829148(2016).
  13. Olson, H., et al. Concordance of the toxicity of pharmaceuticals in humans and in animals. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 32 (1), 56-67 (2000).
  14. Bell, C. C., et al. Comparison of hepatic 2D sandwich cultures and 3D spheroids for long-term toxicity applications: A multicenter study. Toxicological Sciences. 162 (2), 655-666 (2018).
  15. Bell, C. C., et al. Characterization of primary human hepatocyte spheroids as a model system for drug-induced liver injury, liver function and disease. Scientific Reports. 6, 25187(2016).
  16. Khetani, S. R., et al. Use of micropatterned co-cultures to detect compounds that cause drug-induced liver injury in humans. Toxicological Sciences. 132 (1), 107-117 (2013).
  17. Ma, X., et al. Deterministically patterned biomimetic human iPSC-derived hepatic model via rapid 3D bioprinting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the united States of America. 113 (8), 2206-2211 (2016).
  18. Dieterle, P. Y. M., Dieterle, F. Tissue-specific, non-invasive toxicity biomarkers: translation from pre-clinical safety assessment to clinical safety monitoring. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 5 (9), 1023-1038 (2009).
  19. Rowe, C., et al. Perfused human hepatocyte microtissues identify reactive metabolite-forming and mitochondria-perturbing hepatotoxins. Toxicology in Vitro. 46, 29-38 (2018).
  20. Rubiano, A., et al. Characterizing the reproducibility in using a liver microphysiological system for assaying drug toxicity, metabolism, and accumulation. Clinical and Translational Science. 14 (3), 1049-1061 (2021).
  21. Tsamandouras, N., Kostrzewski, T., Stokes, C. L., Griffith, L. G., Hughes, D. J., Cirit, M. Quantitative assessment of population variability in hepatic drug metabolism using a perfused three-dimensional human liver microphysiological system. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 360 (1), 95-105 (2017).
  22. Ortega-Prieto, A. M., et al. 3D microfluidic liver cultures as a physiological pre-clinical tool for hepatitis B virus infection. Nature Communications. 9 (1), 682(2018).
  23. Kostrzewski, T., et al. Three-dimensional perfused human in vitro model of non-alcoholic fatty liver disease. World Journal of Gastroenterology. 23 (2), 204-215 (2017).
  24. Kostrzewski, T., et al. A microphysiological system for studying nonalcoholic steatohepatitis. Hepatology Communications. 4 (1), 77-91 (2020).
  25. Vacca, M., et al. Bone morphogenetic protein 8B promotes the progression of non-alcoholic steatohepatitis. Nature Metabolism. 2 (6), 514-531 (2020).
  26. Long, T. J., et al. Modeling therapeutic antibody-small molecule drug-drug interactions using a three-dimensional perfusable human liver co-culture platforms. Drug Metabolism and Disposition. 44, 1940-1948 (2016).
  27. Bai, J., Wang, C. Organoids and microphysiological systems: New tools for ophthalmic drug discovery. Frontiers in Pharmacology. 11, 407(2020).
  28. Ribeiro, A. J. S., Yang, X., Patel, V., Madabushi, R., Strauss, D. G. Liver microphysiological systems for predicting and evaluating drug effects. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 106 (1), 139-147 (2019).
  29. Clark, A. M., et al. A microphysiological system model of therapy for liver micrometastases hhs public access. Experimental Biology and Medicine (Maywood). 239 (9), 1170-1179 (2014).
  30. Qosa, H., Ribeiro, A. J. S., Hartman, N. R., Volpe, D. A. Characterization of a commercially available line of iPSC hepatocytes as models of hepatocyte function and toxicity for regulatory purposes. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 110, 107083(2021).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Hepatotoksyczno polekowatoksyczno in vitroludzkie mikrotkanki w trobowepierwotne ludzkie hepatocytykom rki Kupffera3D hodowla kom rkowabiomarkery w trobowetest ALTodpowied na dawk

Powiązane artykuły