Artykuł metodologiczny

Test biologiczny do stosowania miejscowego w celu ilościowego określenia toksyczności insektycydów dla komarów i muszek owocowych

9.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63391

⸱

19 stycznia 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Evolution and Medicine, School of Life Sciences, Arizona State University, 2United States Department of Agriculture, Agricultural Research Service, Center for Medical, Agricultural and Veterinary Entomology

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy metodologię i znaczenie testu biologicznego do stosowania miejscowego do pomiaru podatności na insektycydy u komarów i muszek owocowych. Prezentowany test jest wysokoprzepustowy, wykorzystuje masę owadów - co pozwala na obliczenie zrelatywizowanej dawki śmiertelnej zamiast stężenia - i prawdopodobnie ma mniejszą zmienność niż inne podobne metody.

Streszczenie

Ciągłe stosowanie środków owadobójczych dla zdrowia publicznego i rolnictwa doprowadziło do powszechnej odporności na insektycydy i utrudnienia metod kontroli. Nadzór nad odpornością na insektycydy populacji komarów jest zwykle przeprowadzany za pomocą testów biologicznych butelek Centrów Kontroli i Prewencji Chorób (CDC) lub testów probówkowych Światowej Organizacji Zdrowia (WHO). Jednak metody te mogą skutkować wysokim stopniem zmienności danych dotyczących śmiertelności ze względu na zmienny kontakt insektycydów z owadami, stosunkowo niewielką liczbę badanych organizmów, duże różnice w masie między populacjami oraz stale zmieniające się warunki środowiskowe, prowadzące do zmiennych wyników. W artykule przedstawiono test biologiczny do stosowania miejscowego, zaadaptowany jako wysokoprzepustowy fenotypowy test biologiczny zarówno dla komarów, jak i muszek owocowych, do testowania dużej liczby owadów w zakresie stężeń insektycydów.

Ten test 1) zapewnia konsekwentne leczenie i kontakt insektycydów z każdym organizmem, 2) tworzy wysoce specyficzne krzywe dawka-odpowiedź, które uwzględniają różnice w średniej masie między szczepami i płciami (co jest szczególnie ważne dla organizmów zebranych w terenie), oraz 3) pozwala na obliczenie statystycznie rygorystycznej mediany dawek śmiertelnych (LD50), które są niezbędne do porównań współczynników oporności – alternatywnego podejścia do nadzoru w stosunku do śmiertelności po podaniu dawki diagnostycznej, które jest również stosowane do nadzoru nad opornością na larwobójcze. Test ten będzie narzędziem uzupełniającym do dokładnego fenotypowania populacji komarów i, jak pokazano na przykładzie muszek owocowych, można go łatwo przystosować do stosowania z innymi owadami. Twierdzimy, że ten test pomoże wypełnić lukę między genotypową i fenotypową odpornością na insektycydy u wielu gatunków owadów.

Wprowadzenie

Komary są odpowiedzialne za ponad 700 000 zgonów rocznie z powodu chorób, które przenoszą na ludzi, przy czym ponad połowa tych zgonów jest spowodowana samą malarią1. Główną metodą zapobiegania przenoszeniu malarii i innych chorób przenoszonych przez wektory jest stosowanie insektycydów, często w postaci długotrwałych siatek owadobójczych lub oprysków resztkowych w pomieszczeniach2. Jednak odporność na insektycydy jest szeroko rozpowszechniona wśród komarów i innych wektorów owadów, a także szkodników rolniczych3,4. Aby skutecznie radzić sobie z odpornością, nadzór ma kluczowe znaczenie5. W tym celu potrzebne są bardzo dokładne i wysokoprzepustowe metody wykrywania odporności. Obecnie najbardziej rozpowszechnionymi narzędziami do monitorowania odporności komarów na insektycydy są test probówkowy WHO6 oraz test biologiczny CDC w butelce7. W przypadku muszek owocowych metoda aplikacji kontaktu resztkowego (podobna do testu biologicznego butelki CDC) jest powszechnie stosowanym testem biologicznym insektycydów8,9,10. Jednak zmienność danych z tych metod jest zazwyczaj wysoka, a pomiary tego samego laboratoryjnego szczepu komara wahają się od ~ 20-70% śmiertelności w testach butelkowych CDC i 0-50% w testach probówkowych WHO po wystawieniu na dawki subletalne 11. Taka zmienność jest zaskakująca, ponieważ oczekuje się, że ograniczona zmienność genetyczna w większości szczepów laboratoryjnych doprowadzi do ograniczonej zmienności wrażliwości na insektycydy w populacji. Niemniej jednak nadal obserwuje się duży poziom zmienności w wynikach testów biologicznych.

Potencjalne źródła tej zmienności mogą wynikać z niejednorodnej ekspozycji na insektycydy między próbkami w teście biologicznym z powodu pośredniej ekspozycji na insektycydy przez powierzchnię, niejednorodnych skutków środowiskowych, normalnej zmienności biologicznej między osobnikami o tym samym genotypie oraz zmienności masy próbek tej samej populacji12. Rzadziej stosowaną metodą o większej powtarzalności jest test biologiczny do stosowania miejscowego. W tym teście środek owadobójczy jest bezpośrednio nakładany na każdy insect13,14, usuwając czynnik niejednorodnej ekspozycji różnych próbek w ramach tego samego testu. Jednak ze względu na powolny przepływ tej metody, nie jest ona rutynowo stosowana jako narzędzie do monitorowania wrażliwości na insektycydy dla populacji komarów. W artykule przedstawiono zmodyfikowany protokół testu biologicznego do stosowania miejscowego, który pozwala na ekspozycję o wyższej przepustowości, jednocześnie korygując zmiany masy owadów, parametr korelujący ze zmianami podatności na insektycydy12. Zmniejszenie hałasu i związanych z masą zmian w danych dotyczących śmiertelności spowodowanych zmiennym narażeniem na insektycydy pozwoliłoby na dokładniejszy nadzór nad odpornością techniczną11,15. Takie dane można wykorzystać do dokładniejszego powiązania oporności fenotypowej z markerami genetycznymi, parametrami dopasowania i/lub kompetencjami wektorowymi. Ponadto pokazujemy, w jaki sposób ten test można łatwo dostosować do innych gatunków owadów, stosując test biologiczny do stosowania miejscowego na muszkach owocowych, mniejszych gatunkach owadów.

Głównym ograniczeniem wyżej wymienionych zastosowań kontaktu resztkowego jest to, że ekspozycja na insektycydy może się różnić w zależności od próbki w ramach tego samego testu. W przypadku testów biologicznych CDC w butelkach i metody kontaktowej narażenie na insektycydy może się różnić w zależności od powtórzeń tego samego testu. Owady są wystawione na działanie środka owadobójczego, który jest rozprowadzany po wewnętrznej stronie szklanej butelki (metoda biologiczna i kontaktowa CDC) lub na impregnowanych papierach (test probówkowy WHO). Stężenie insektycydu na obu powierzchniach (szkle i papierze) jest znane i z góry określone na podstawie badań przesiewowych różnych gatunków o znanych genotypach. Jednak ilość, która może zostać potencjalnie wchłonięta przez owada, może się znacznie różnić w zależności od użytej powierzchni, składników mieszaniny insektycydów oraz tego, jak jednorodnie środek owadobójczy jest rozprowadzany na materiale powierzchniowym16,17. W teście biologicznym CDC powłoka owadobójcza po wewnętrznej stronie butelki zależy od procedur zastosowanych przez każde laboratorium i użytkownika. W teście probówkowym WHO bibułki nasączone środkami owadobójczymi są produkowane centralnie, a zatem najprawdopodobniej są dość jednorodne we wszystkich laboratoriach. Jednak w teście probówkowym WHO rurka ekspozycyjna pozwala próbkom wylądować i spocząć na metalowej siatce, która nie jest narażona na działanie środków owadobójczych, co prowadzi do potencjalnej niejednorodnej ekspozycji na insektycydy wśród próbek w każdym teście. Rzeczywista ilość środka owadobójczego pobranego i wchłoniętego przez próbki za pomocą każdej metody wymaga dalszego zbadania18.

Dodatkowo, test biologiczny z butelki CDC, test probówkowy WHO i metoda kontaktowa są najczęściej używane jako testy progowe testujące tylko jedno z góry określone stężenie insektycydu. Takie podejście może dokładnie wykryć obecność oporności i jest cenne dla nadzoru oporności (zwłaszcza gdy oporność się rozprzestrzenia). Jednak testy progowe nie mogą określić ilościowo siły oporności, co może być bardziej predykcyjne dla skuteczności narzędzi interwencyjnych. Jeśli w tych metodach stosuje się wiele stężeń insektycydów, można je wykorzystać jako testy intensywności. Testy intensywności dla testu biologicznego w butelce CDC i testu probówkowego WHO zostały wprowadzone poprzez testowanie 5 i 10 razy wcześniej ustalonych dawek dyskryminujących, aby wypełnić tę lukę w nadzorze6,19. Zapewniając większą zdolność do różnicowania między opornymi populacjami, 3-5 (z góry określonych) dawek zapewnia ograniczoną rozdzielczość do obliczenia stężeń śmiertelnych. Dodatkowo w takich testach wykorzystuje się komary o różnych rozmiarach. Jednak masa jest ważna do zmierzenia, ponieważ większe próbki mogą wymagać większej dawki do zabicia, ponieważ efektywna dawka na jednostkę masy będzie znacznie niższa niż w przypadku mniejszego organizmu12. Obliczenie zrelatywizowanej dawki śmiertelnej (ilość środka owadobójczego na masę owada) byłoby bardziej użytecznym wskaźnikiem niż bardziej powszechne stężenie śmiertelne (np. ilość środka owadobójczego na powierzchnię), ponieważ uwzględnia zmienność masy owadów między płciami, populacjami i genotypami. Takie dane pomogłyby wypełnić lukę między odpornością genotypową i fenotypową w laboratorium i w terenie, a także mogłyby zapewnić łatwy sposób obliczania wymaganego stężenia aplikacyjnego w celu leczenia populacji owadów o znanej średniej masie.

Użycie masowo zrelatywizowanych dawek śmiertelnych, które zabijają 50% okazów (LD50) zawiera również kilka innych korzyści. Ocena toksyczności określonego związku w mg/kg (= ng/mg) jest standardem w toksykologii ludzkiej i weterynaryjnej14, a wartości LD50 znajdują się w kartach charakterystyki materiału. Dawki śmiertelne pozwalają również na bezpośrednie porównanie toksyczności między różnymi substancjami chemicznymi w stosunku do danego gatunku lub tą samą substancją chemiczną w stosunku do różnych gatunków20, a także na ocenę wysokiej jakości nowych insektycydów i chemikaliów13. Ponadto LD50 może zapewnić bardziej znaczące i dokładne współczynniki oporności niż te uzyskane na podstawie wyników śmiertelności po podaniu diagnostycznym, co może skutkować przeszacowaniem poziomu oporności występującej w populacji. W związku z tym test ten byłby odpowiedni dla rutynowych programów nadzoru, zapewniając bardziej rygorystyczne monitorowanie oporności w oparciu o masowo relatywizowane dawki śmiertelne pochodzące z większej liczby próbek niż jest to zalecane dla innych testów biologicznych21.

Metoda miejscowego stosowania została wykorzystana w nadzorze nad wrażliwością komarów i much na insektycydy jako alternatywa dla standardowych testów biologicznych wrażliwości na insektycydy, gdy odporność jest już znana lub podejrzewana22,23, a także do nadzoru nad niektórymi szkodnikami24 w celu dokładniejszej oceny profili odporności i wewnętrznej toksyczności insektycydów21. W testach biologicznych do stosowania miejscowego insektycyd nakłada się na każdy organizm, co powoduje minimalną różnicę w ekspozycji na insektycydy. W artykule przedstawiono nieco zmodyfikowaną i ulepszoną metodę, która pozwala na zastosowanie środków owadobójczych do dużej liczby owadów w krótkim czasie, przy jednoczesnej kontroli masy owadów22. Ta metoda o wyższej przepustowości i dobrym poziomie odtwarzalności może być użytecznym dodatkowym narzędziem do rutynowego monitorowania wrażliwości na insektycydy.

Protokół

UWAGA: Insektycydy mogą stwarzać zagrożenia dla ludzi, zwierząt i środowiska25. Zaleca się zachowanie ostrożności, przejście odpowiedniego szkolenia oraz stosowanie środków ochrony osobistej. Należy ściśle przestrzegać kart charakterystyki materiałów dla wszystkich użytych insektycydów i rozpuszczalników.

1. Hodowla okazów

  1. Hodowla dorosłych komarów w wieku 3-5 dni.
    UWAGA: Poniższy protokół odzwierciedla warunki hodowli Aedes aegypti, ściśle według wytycznych Organizacji Narodów Zjednoczonych ds. Wyżywienia i Rolnictwa26.
    1. Hodować komary na wszystkich etapach cyklu życiowego w temperaturze 27 ± 1 °C i wilgotności względnej 75 ± 5% przy 12-godzinnym cyklu światła i ciemności (12:12 h).
    2. Wylęgać jaja komarów poprzez zanurzenie ich w wodzie dejonizowanej z dodatkiem drożdży26 lub umieszczenie zanurzonych jaj w komorze próżniowej na 30 min.
      UWAGA: Obie metody zmniejszają zawartość tlenu w wodzie i zwiększają odsetek wylęgu27.
    3. Karmić nowo wylęgłe larwy pokarmem dla ryb (lub równoważną dietą, np. mieloną karmą dla kotów) w tacach, utrzymując jak najbardziej zbliżoną gęstość larw w poszczególnych tacach, ponieważ gęstość larw wpływa na rozwój12 (np. 200-250 larw na tacę zawierającą łącznie 1,5 L wody).
    4. Karmić larwy co drugi dzień, aż osiągną stadium poczwarki (około 7-10 dni), zwiększając ilość pokarmu w razie potrzeby.
      UWAGA: Przy zbyt małej ilości pokarmu wzrost larw będzie zahamowany, a larwy mogą zacząć się zjadać. Przy zbyt dużej ilości pokarmu larwy mogą ginąć, co prowadzi do zepsucia się wody.
    5. Po pojawieniu się poczwarek przenosić je codziennie do miseczki z wodą w klatkach dla dorosłych komarów i zapewnić 10% roztwór sacharozy ad libitum.
    6. Odnotować pierwszy dzień wylohacji dorosłych osobników. Usunąć pozostałe poczwarki z klatki 2 dni po rozpoczęciu wylohacji.
      UWAGA: Samce komarów wykluwają się szybciej. Odnotowywać wylohację samców i samic oddzielnie i zapewnić wystarczającą liczbę obu płci do każdego testu.
    7. Odczekać 3 dni po usunięciu poczwarek, aby uzyskać komary w wieku 3-5 dni do przeprowadzenia testów.
  2. Hodowla muszek owocówek (zgodnie z ogólnymi protokołami Uniwersytetu w Zurychu28).
    1. Hodować szczepy Drosophila w butelkach hodowlanych w temperaturze 23 ± 1 °C i wilgotności względnej 60 ± 5% przy 12-godzinnym cyklu światła i ciemności (12:12 h).
      UWAGA: Butelki hodowlane Drosophila powinny zawierać 75 mL standardowej pożywki dla muszek, którą najpierw wlewa się w formie płynnej na dno butelek, a następnie pozostawia do zastygnięcia przez noc.
    2. Przenosić kolonie do nowych butelek z świeżą pożywką co dwa tygodnie, aby zapobiec przeludnieniu i rozwojowi pleśni. W tym celu ogłuszyć muszki za pomocą ręcznego dozownika dwutlenku węgla (CO2), przenieść znieczulone muszki na papier do ważenia umieszczony na wkładzie chłodzącym lub stole chłodniczym, a następnie przenieść muszki do nowej butelki za pomocą pędzelka z cienkim włosiem. Należy pamiętać, aby podczas tego procesu trzymać butelki na boku, aby zapobiec wpadnięciu muszek do pożywki i ich utonięciu.

2. Przygotowanie formulacji insektycydów metodą grawimetryczną

  1. Przygotować pierwszy roztwór zapasowy metodą grawimetryczną, korzystając z wagi analitycznej o dokładności 0,1 mg wewnątrz dygestorium.
    UWAGA: Metoda grawimetryczna wykorzystuje masę do pomiaru ilości dodanego insektycydu i rozpuszczalnika. Praktyka standardowa (metoda wolumetryczna) wymaga użycia wagi analitycznej do pomiaru ilości dodanego (stałego) insektycydu podczas przygotowania pierwszego roztworu zapasowego; jednak ilość dodanego rozpuszczalnika oraz wszystkie kolejne rozcieńczenia są mierzone wyłącznie objętościowo. Metoda grawimetryczna charakteryzuje się wyższą dokładnością i jestTherefore preferowana.
    1. Określić docelowe stężenie insektycydu i docelową objętość (zalecane maksymalnie 10 mL w przypadku stosowania probówek stożkowych 15 mL, aby zapobiec rozlaniu podczas przechowywania w zamrażarce) dla pierwszego roztworu zapasowego i obliczyć, ile substancji czynnej (AI) insektycydu należy dodać, korzystając z równania (1):
       figure-protocol-1 (1)
    2. Przygotować probówkę do przechowywania (zalecane probówki stożkowe 15 mL dla większych objętości, probówki do mikrowirówki z nakrętką 1,5 mL dla objętości 1 mL lub mniejszych) i opisać ją nazwą insektycydu i rozpuszczalnika, docelowym stężeniem oraz datą przygotowania. Umieścić probówkę z zakrętką na wadze w statywie lub uchwycie i wytarować wagę.
    3. Odważyć do probówki wymaganą ilość stałego lub ciekłego AI insektycydu ustaloną w kroku 2.1.1. (np. deltametrynę użytą w danych reprezentatywnych) i zapisać masę.
    4. Wytarować wagę i dodać do probówki wymaganą objętość rozpuszczalnika (równą objętości docelowej), natychmiast zamknąć zakrętkę i zapisać masę. Zakrętkę probówki należy zamknąć niezwłocznie po dodaniu rozpuszczalnika (tutaj użyto acetonu), aby uniknąć odparowania, a następnie wymieszać roztwór.
    5. Zapisać temperaturę w pomieszczeniu. Niektóre rozpuszczalniki, takie jak aceton, mogą wykazywać znaczące zmiany objętości (a w konsekwencji gęstości) w zależności od temperatury.
    6. W przypadku natychmiastowego przechowywania, owinąć zakrętkę probówki parafilmem (aby ograniczyć odparowanie), umieścić ją w statywie/uchwycie do probówek (aby zachować pionową pozycję i zapobiec wyciekom), owinąć folią (aby zapobiec ekspozycji na UV), umieścić w szczelnej plastikowej torebce (aby ograniczyć odparowanie) i włożyć torebkę do zamrażarki w temperaturze -20 °C. Jeśli roztwór nie jest przechowywany natychmiast, należy upewnić się, że zakrętka jest zabezpieczona i owinąć probówkę folią lub umieścić w pojemniku chroniącym przed światłem.
    7. Obliczyć rzeczywiste stężenie roztworu zapasowego (mg/mL), dzieląc masę dodanego AI insektycydu przez objętość dodanego rozpuszczalnika (oraz objętość dodanego insektycydu, jeśli jest on w formie ciekłej). Aby obliczyć objętość dodanego rozpuszczalnika (lub ciekłego insektycydu), należy podzielić masę dodaną przez znaną gęstość odpowiadającą zapisanej temperaturze.
    8. Obliczyć gęstość (g/mL) roztworu zapasowego, dzieląc całkowitą masę dodaną (insektycydu i rozpuszczalnika) przez całkowitą objętość dodaną (rozpuszczalnika i insektycydu, jeśli jest on w formie ciekłej). Sposób przeliczania masy cieczy na objętość opisano w kroku 2.1.7.
  2. Wykonać rozcieńczenia seryjne początkowego roztworu zapasowego w stosunku 10%. W razie potrzeby wykorzystać te rozcieńczenia seryjne do stworzenia wstępnej krzywej zależności dawka-odpowiedź, aby określić docelowy zakres stężeń insektycydu do bioanalizy.
    1. Obliczyć objętość roztworu zapasowego insektycydu oraz rozpuszczalnika, którą należy dodać do każdej probówki (np. 1 mL roztworu zapasowego insektycydu rozcieńczonego w 9 mL rozpuszczalnika dla 10 mL rozcieńczenia stanowiącego 10% poprzedniego stężenia).
    2. Wymieszać roztwór zapasowy w wirówce typu vortex przez 10 s. Wytarować na wadze wcześniej opisaną pierwszą probówkę do rozcieńczeń. Za pomocą pipety dodać wymaganą objętość roztworu zapasowego do pierwszej probówki. Natychmiast zamknąć zakrętki obu probówek i zapisać masę w pierwszej probówce do rozcieńczeń.
    3. Ponownie wytarować pierwszą probówkę do rozcieńczeń i dodać wymaganą objętość rozpuszczalnika. Natychmiast zamknąć zakrętkę, zapisać masę dodanego rozpuszczalnika i mieszać pierwsze rozcieńczenie w vortexie przez 10 s.
    4. Powtórzyć kroki 2.2.2 i 2.2.3 dla pozostałych rozcieńczeń.
    5. Przechowywać wszystkie rozcieńczenia zgodnie z opisem w kroku 2.1.6.
    6. Obliczyć rzeczywiste stężenia rozcieńczeń, postępując zgodnie z krokiem 2.1.7.
    7. Obliczyć gęstość każdego rozcieńczenia insektycydu, dzieląc całkowitą masę dodaną (roztworu insektycydu i rozpuszczalnika) przez całkowitą objętość dodaną (roztworu insektycydu i rozpuszczalnika). Dla każdego rozcieńczenia seryjnego należy użyć gęstości poprzedniego rozcieńczenia zapasowego insektycydu, aby obliczyć gęstość nowego rozcieńczenia zgodnie z równaniem (2):
      figure-protocol-2 (2)
  3. Opcjonalnie: Przygotować rozcieńczenia insektycydu w mniejszych przyrostach metodą rozcieczeń seryjnych.
    1. Wybrać stężenia i objętości każdego nowego roztworu, korzystając z krzywej zależności dawka-odpowiedź początkowych rozcieńczeń seryjnych, poprzednich prób lub literatury przedmiotu.
      UWAGA: Wybrane stężenia powinny skutkować zakresem śmiertelności 0-100%, przy minimum trzech stężeniach z tego zakresu, aby umożliwić analizę Probit.
    2. Wykorzystać rozcieńczenia seryjne jako roztwory zapasowe do sporządzenia każdego nowego rozcieńczenia i postępować zgodnie z krokiem 2.2, aby utworzyć nowe rozcieńczenia pomiędzy rozcieńczeniami 10-krotnymi.
  4. Opcjonalnie: Wykonać alikwotowanie roztworu insektycydu. Jeśli przygotowano większe objętości roztworów insektycydu, należy rozdzielić je na alikwoty do probówek z nakrętką 1,5 mL, aby uniknąć kontaminacji, odparowania i degradacji roztworów zapasowych w wyniku częstego przenoszenia i ekspozycji na światło.
    1. Aliquotować roztwory, zaczynając od najniższego stężenia i kierując się ku najwyższemu, aby ograniczyć potencjalną kontaminację. Każdy roztwór zapasowy należy wymieszać w vortexie przez 10 s przed otwarciem i pipetowaniem wymaganej objętości (np. 0,5 mL) do wcześniej opisanej probówki z nakrętką.
    2. Przechowywać alikwoty w pojemniku odpornym na światło w zamrażarce w temperaturze -20 °C.
      UWAGA: Zaleca się regularną (miesięczną) wymianę alikwotów na małe nowe alikwoty pobierane bezpośrednio z zapasowych rozcieńczeń pestycydów. Ograniczy to możliwość przeniesienia kontaminacji do innych eksperymentów lub zmian wynikających z odparowania bądź degradacji UV podczas pracy z próbkami na stole laboratoryjnym. Protokół można w tym miejscu przerwać i wznowić nawet po latach, pod warunkiem, że roztwory insektycydu są przechowywane prawidłowo (patrz krok 2.1.6) w zamrażarce w temperaturze -20 °C.
  5. Przed przechowywaniem zaznaczyć poziom menisku markerem permanentnym, aby monitorować odparowanie rozpuszczalnika. Podczas pobierania roztworu insektycydu w celu wykonania alikwotów, należy zaznaczać menisk za każdym razem po pobraniu roztworu.

3. Przygotowanie stanowiska do bioanalizy aplikacji miejscowej

UWAGA: Zaleca się pracę w namiocie laboratoryjnym do obsługi owadów, co ułatwia odławianie uciekających komarów lub much. Zdjęcia namiotu do obsługi owadów znajdują się w Rysunku uzupełniającym S1.

  1. Wyjąć potrzebne roztwory insektycydów z zamrażarki, natychmiast wymieszać w wortexie, a następnie umieścić w odpornym na światło pojemniku w temperaturze pokojowej, aby insektycydy ogrzały się do temperatury pokojowej przed użyciem.
    UWAGA: Substancje czynne insektycydów mogą oddzielać się od rozpuszczalnika w niższych temperaturach. Dodatkowo objętość acetonu zmienia się wraz z temperaturą, co może zmienić dawkę naniesionego insektycydów. Pomieszanie roztworów i doprowadzenie ich do temperatury pokojowej pomaga zapewnić spójność podczas stosowania roztworów insektycydów.
  2. Przygotować wszystkie niezbędne narzędzia i materiały do testu aplikacji miejscowej w namiocie do obsługi owadów, zgodnie z Tabelą Materiałów.
  3. Oczyścić cylinder strzykawki i igłę acetonem klasy analitycznej, wykonując 5 płukań na każdą porcję acetonu. Powtórzyć tę czynność z 5 oddzielnymi porcjami, co da łącznie 25 płukań. Elementy strzykawki i pipety powtarzalnej przedstawiono na Ryc. uzupełniającej S2.
    1. Przygotować 5 probówek do mikrocentryfugi, z których każda zawiera 0,5 mL acetonu.
    2. Napełnić cylinder strzykawki 0,025 mL acetonu z pierwszej probówki, a następnie wypchnąć aceton do pojemnika na odpady, szybko naciskając tłok. Powtórzyć tę czynność jeszcze cztery razy, aby wykonać łącznie pięć płukań acetonem z tej samej porcji. Następnie całkowicie napełnić cylinder strzykawki powietrzem i wypchnąć powietrze wraz z ewentualnymi pozostałościami acetonu do pojemnika na odpady. Powtórzyć tę czynność jeszcze dwa razy, aby wykonać trzy „płukania” powietrzem.
    3. Powtórzyć krok 3.3.2 dla pozostałych 4 probówek z acetonem.
    4. Utworzyć poduszkę powietrzną w cylindrze między tłokiem strzykawki a górną częścią igły, lekko cofając tłok do wnętrza cylindra (~5 mm).
      UWAGA: Ta poduszka powietrzna chroni tłok przed kontaktem z roztworami insektycydów i zmniejsza przenoszenie insektycydów.
    5. Odstawić strzykawkę do momentu rozpoczęcia aplikacji miejscowej.
  4. Stworzyć legendę zawierającą dawki do podania i przypisać losowe identyfikatory za pomocą generatorów liczb lub liter losowych (patrz Plik uzupełniający 1).
  5. Oznaczyć plastikowe kubki z osobna losowymi identyfikatorami w celu przeprowadzenia ślepej oceny śmiertelności.
    UWAGA: W razie potrzeby protokół można w tym miejscu przerwać i wznowić w innym dniu lub o innej godzinie. Jeśli przerwa potrwa dłużej niż kilka godzin, zaleca się powtórzenie kroku 3.3, aby upewnić się, że strzykawka jest czysta, oraz ponowne umieszczenie roztworów insektycydów w zamrażarce do czasu około godziny przed podaniem dawek owadom, a następnie powtórzenie kroku 3.1.

4. Przygotowanie preparatów do miejscowego bioanalizy. Proceduralny przegląd przedstawiono na Rysunku 1

  1. Sortowanie i ważenie komarów 
    1. Używając aspiratora napędzanego ssaniem przez inhalację, odessać pożądaną liczbę dorosłych komarów w wieku 3-5 dni niezbędnych do analizy, wliczając nadmiar w celu uwzględnienia osobników uszkodzonych. Przenieść komary do probówki stożkowej (do 100 komarów na probówkę), umieszczając końcówkę aspiratora w probówce z owiniętą wokół niej watą, a następnie delikatnie wydmuchując powietrze i stukając aspiratorem. Użyć waty do zatkania probówki po wyjęciu końcówki aspiratora, a następnie zamknąć ją zakrętką. Unikać napełniania aspiratora i probówek zbyt dużą liczbą komarów naraz, ponieważ zwiększa to stres u owadów i może prowadzić do ich śmierci.
    2. Krótko unieruchomić komary w probówkach, umieszczając je na minimum 10 min w temperaturze 4 °C lub zakopując je w lodzie w pojemniku do lodu.
      UWAGA: Komary mogą być przechowywane w temperaturze 2 °C przez kilka godzin przy minimalnej śmiertelności29; jednak najlepiej jest zminimalizować czas przebywania komarów na lodzie, aby ograniczyć potencjalne negatywne skutki.
    3. Przenieść unieruchomione komary do namiotu do manipulacji owadami i ostrożnie wysypać je na plastikową tackę (np. szalkę Petriego) umieszczoną na lodzie. Wysypywać tylko około 50 komarów naraz, aby upewnić się, że każdy styka się z chłodną tacką pod spodem i pozostaje unieruchomiony.
    4. Posortować komary według płci, delikatnie chwytając je za odnóża (lub skrzydła) pęsetą i umieszczając każdą płeć w oddzielnym pojemniku. Podczas sortowania liczyć liczbę komarów każdej płci i przestać po osiągnięciu pożądanej liczby. Podczas sortowania odrzucać wszystkie komary, które są okaleczone (np. brak odnóży) lub są nadmiernie duże (np. nienaturalnie powiększony odwłok) bądź małe (łatwo rozróżnialne gołym okiem jako mniejsze od średniej wielkości komara w danej populacji).
      UWAGA: Chwytanie komarów za wyrostki redukuje uszkodzenia strukturalne ich miękkich głównych części ciała (np. odwłoka).
    5. Zarejestrować wagę każdego pojemnika z komarami używając wagi analitycznej z precyzją 0.1 mg.
      1. Umieścić na wadze pusty pojemnik z szalką Petriego jako pokrywką i wytarować wagę. Wsypać komary do pojemnika, nałożyć pokrywkę i umieścić pojemnik na wadze.
      2. Zarejestrować łączną wagę i liczbę osobników w arkuszu wyników (patrz Supplemental File 2). Natychmiast umieścić pojemnik z osobnikami z powrotem na lodzie, aby utrzymać je w unieruchomieniu.
      3. Powtarzać kroki 4.1.5.1-4.1.5.2, aż wszystkie pojemniki z osobnikami zostaną zważone.
    6. Podzielić przygotowane komary na grupy po 20-25 osobników w oddzielnych pojemnikach umieszczonych na lodzie i oznaczonych losowymi identyfikatorami. Podczas przenoszenia komarów dążyć do ograniczenia stresu i uszkodzeń fizycznych powodowanych przez pęsetę. W idealnym przypadku chwytać komary pęsetą tylko 1-2 razy: raz podczas sortowania/ważenia i potencjalnie drugi raz podczas przenoszenia do pojemników eksperymentalnych.
      UWAGA: Idealna liczba komarów na pojemnik to 20-25, co jest wystarczające dla powtórzenia, pozwala na rozsądną ocenę śmiertelności i nie powinno prowadzić do stresu lub śmierci wywołanej zagęszczeniem w pojemniku.
  2. Sortowanie i ważenie muszek owocówek
    1. Zanestetyzować muszki za pomocą CO2 przez 7 s.
      UWAGA: Jeśli muszki są wystawione na działanie CO2 przez więcej niż 7 s, mogą mieć problemy z pełzaniem i lataniem po przebudzeniu30.
    2. Wysypać muszki na okład lodowy owinięty papierem do pracy laboratoryjnej i użyć pędzla z cienkim włosiem, aby oddzielić i policzyć samce i samice.
    3. Użyć pędzla, aby delikatnie zebrać wybrane muszki i umieścić je w czystej, pustej butelce zapasowej. Wybrać taką samą liczbę samców i samic muszek owocówek (np. 15 samców i 15 samic) i oznaczyć butelki zapasowe nazwą szczepu oraz całkowitą liczbą muszek (np. Canton-S, 30 muszek).
      UWAGA: Ważne jest, aby zachować równą liczbę samic i samców muszek owocówek, ponieważ samce mogą wykazywać zwiększoną agresję wobec siebie po usunięciu ich z obecności samic31. Dlatego, aby uniknąć śmiertelności lub obrażeń niezwiązanych z insektycydem, najlepiej jest zachować równą liczbę samców i samic (lub całkowicie pominąć samce).
    4. Zarejestrować wagę każdej butelki z muszkami owocówkami za pomocą wagi analitycznej.
      1. Umieścić na wadze pustą fiolkę (oznaczoną losowym identyfikatorem, patrz krok 3.4) z szalką Petriego jako pokrywką i wytarować wagę.
        UWAGA: Do muszek owocówek zaleca się stosowanie fiolek szklanych, ponieważ znacznie redukują one ładunki elektrostatyczne.
      2. Zanestetyzować butelkę z muszkami owocówkami odpowiadającą losowemu identyfikatorowi fiolki za pomocą CO2 przez 7 s.
      3. Wysypać muszki owocówki na papier do ważenia i użyć go jako lejka do wprowadzenia muszek do fiolki. Nałożyć pokrywkę z szalki Petriego na fiolkę z muszkami i umieścić ją na wadze.
      4. Zarejestrować łączną wagę i liczbę osobników w arkuszu wyników, a następnie natychmiast umieścić fiolkę z muszkami owocówkami w pojemniku z lodem, z wciąż nałożoną pokrywką, aby zapobiec ucieczce muszek.
      5. Powtarzać kroki 4.2.4.1-4.2.4.4 dla każdej butelki z muszkami owocówkami.
  3. Po zakończeniu powyższych kroków niezwłocznie przejść do następnej sekcji.

5. Naświetlanie próbek

  1. Napełnij strzykawkę odpowiednim stężeniem insektycydu. Zacznij od najniższej dawki, przechodząc do najwyższego stężenia dla każdej grupy organizmów. Aby uniknąć marnotrawstwa, nabierz do strzykawki tylko niezbędną objętość insektycydu oraz zalecane dodatkowe 2 µL.
  2. Przesyp okazy na papier wagowy umieszczony na tacy na lodzie. Rozdziel okazy, które znajdują się blisko siebie, używając czystego, wolnego od insektycydów pędzla lub patyczka higienicznego, aby umożliwić łatwy dostęp do każdego osobnika podczas dawkowania. W przypadku komarów użyj pędzla również po to, aby upewnić się, że każdy okaz leży na grzbiecie, a jego strona brzuszna jest skierowana do góry.
  3. Za pomocą strzykawki nanieś jedną kroplę roztworu insektycydu (lub acetonu w przypadku grupy kontrolnej) na obszar brzuszny klatki piersiowej i odwłoka u komarów oraz na grzbiet u muszek owocówek. Nanieś kroplę o objętości 0,2 µL (co wymaga strzykawki 10 µL) w przypadku mniejszych owadów, takich jak muszki owocówki, oraz kroplę 0,5 µL (co wymaga strzykawki 25 µL) w przypadku komarów.
    UWAGA: Wrażliwość na insektycyd nie różni się znacząco między głównymi częściami ciała (takimi jak głowa, klatka piersiowa i odwłok) a wyrostkami (takimi jak skrzydła, nogi lub trąbka)32. W związku z tym miejsce aplikacji nie musi być precyzyjnie określone, o ile kropla z dawką zostanie naniesiona na główny tułów. Obszar brzuszny klatki piersiowej i odwłoka wybrano dla komarów, ponieważ często leżą one na grzbiecie po znokautowaniu, natomiast grzbiet wybrano dla muszek owocówek, ponieważ często leżą one na brzuchu po znokautowaniu. Zmniejszona specyfika miejsca aplikacji pomaga zwiększyć wydajność tej metody.
  4. Natychmiast przelej okazy z powrotem do opisanego plastikowego kubka i przykryj go siatką zabezpieczoną gumką recepturką. Umieść kubek w tacy transportowej i zanotuj na kubku wszystkie okazy, które zostały zabite, uszkodzone lub uciekły w trakcie tego procesu (aby wykluczyć je z końcowego przeliczenia osobników w tym kubku). Dla pierwszego kubka zapisz godzinę zakończenia dawkowania.
  5. Wymień papier wagowy, na którym umieszczano okazy, aby uniknąć kontaminacji insektycydem pomiędzy dawkami.
  6. Powtarzaj dawkowanie dla każdego kubka, aż wszystkie okazy zostaną poddane działaniu odpowiednich stężeń insektycydu, a następnie zapisz godzinę zakończenia dawkowania wszystkich osobników.
  7. Zapewnij 10% roztwór sacharozy do każdego kubka za pomocą nasączonej kulki waty i odstaw kubki do czasu oceny śmiertelności następnego dnia. Przechowuj komary w temperaturze 27 ± 1 °C przy wilgotności względnej 75 ± 5%5, a muszki owocówki w temperaturze 23 ± 1 °C przy wilgotności względnej 60 ± 5%.
    UWAGA: Należy uważać podczas wyciskania kulek waty, aby uniknąć nadmiernego lub niewystarczającego nasączenia. Kulki waty powinny być wilgotne, ale nie ociekające. Ociekająca woda cukrowa w kubku może prowadzić do śmierci okazów, a tym samym wpłynąć na ocenę śmiertelności wywołanej przez insektycyd.

6. Ocena śmiertelności

  1. Odnotuj śmiertelność osobników po 24 h od rozpoczęcia ekspozycji na insektycyd. Komary klasyfikuj jako żywe, jeśli potrafią latać i utrzymywać się w pozycji pionowej; jako martwe, jeśli są nieruchome lub wykazują ataksję (niezdolność do stania lub startu do lotu), zgodnie z opisem WHO6. Analogiczną ocenę śmiertelności przeprowadź w przypadku muszek owocówek8,33.
    UWAGA: Aby ocenić śmiertelność opóźnioną, można dodatkowo przeprowadzić pomiary po 48 i 72 h, codziennie wymieniając wodę z cukrem.
  2. Po odnotowaniu śmiertelności wszystkie kubki z osobnikami umieść w szczelnym worku w zamrażarce na co najmniej 1 h, aby upewnić się, że wszystkie osobniki są martwe przed utylizacją lub dalszym wykorzystaniem (np. do analiz molekularnych lub chemicznych).

7. Wykonanie powtórzeń

  1. Powtórz kroki 3-6 na nowej serii okazów, dbając o to, aby powtórzenia wykonywać o tej samej porze każdego dnia, ponieważ podatność na insektycydy może zmieniać się w zależności od pory dnia34.
  2. Zapewnij minimum 3 powtórzenia dla każdego stężenia w celu dokładnego oszacowania dawki śmiertelnej powodującej śmierć 50% okazów (LD50). Uwzględnij więcej powtórzeń w przypadku zaobserwowania wysokiego poziomu zmienności.
  3. Zakończ analizę po zebraniu wszystkich danych.

8. Analiza wyników

  1. Zapisz dane w programie do arkuszy kalkulacyjnych i użyj klucza identyfikatorów losowych w celu odszyfrowania danych (patrz krok 3.4). Zapisz dane jako plik tekstowy (patrz przykładowe dane w Pliku uzupełniającym 3) do analizy w programie statystycznym R35 (patrz przykładowy kod R w Pliku uzupełniającym 4) lub innym wybranym oprogramowaniu36.
  2. W programie komputerowym przeprowadź następującą analizę. Przykładowy kod R znajduje się w Pliku uzupełniającym 4.
    1. Oblicz dawkę insektycydu (ng) na masę osobnika (mg) zgodnie z poniższym równaniem (3):
      figure-protocol-3 (3)
    2. Oblicz śmiertelność i zastosuj wzór Abbotta37, aby skorygować śmiertelność w odniesieniu do śmiertelności zaobserwowanej w każdej grupie kontrolnej37. Alternatywnie można użyć wzoru Schneidera-Orelliego (1947) do korekty śmiertelności38. Przy zastosowaniu dowolnego z tych wzorów wprowadź korektę do wszystkich danych, niezależnie od śmiertelności w każdej grupie kontrolnej, zgodnie z wcześniejszym opisem37 i implementacją39, chyba że dane kontrolne są wyjątkowo wysokie (patrz omówienie poniżej).
      UWAGA: Wzór Abbotta oraz równoważne alternatywy, takie jak wzór Schneidera-Orelliego, korygują wartości śmiertelności proporcjonalnie do poziomu śmiertelności niezaobserwowanej w grupach kontrolnych i nie spowodują spadku śmiertelności w naczyniach, w których wystąpiła 100% śmiertelność. Więcej informacji znajduje się w cytowanych referencjach dla tych wzorów.
    3. Przekształć skorygowane dane o śmiertelności w wartości probit (jednostka prawdopodobieństwa)40 i przeprowadź regresję liniową między dawką insektycydu a przekształconymi danymi o śmiertelności. Użyj testu chi-kwadrat, aby ocenić dopasowanie modelu (modeli) liniowych.
      UWAGA: Wartości śmiertelności równe 0 (0% śmiertelności) lub 1 (100% śmiertelności) są usuwane z danych przed wykonaniem transformacji probit. Jest to konieczne ze względu na naturę transformacji probit. W związku z tym dane na wykresie nie będą obejmować kontroli pozytywnych ani negatywnych ani żadnych innych danych, które skutkowały 0% lub 100% śmiertelności (po zastosowaniu korekty Abbotta).
    4. Oblicz LD50 oraz 95% przedziały ufności (CIs) dla szczepu, populacji i/lub płci osobnika zgodnie z wcześniej opublikowanymi metodami39,41,42.
    5. UWAGA: Jeśli 95% CIs dwóch szczepów nie nakładają się, oznacza to, że szczepy te wykazują istotnie różną odpowiedź na dawkę.
    6. Jeśli jest to właściwe, oblicz współczynniki oporności (RRs), dzieląc LD50 badanego szczepu przez LD50 szczepu referencyjnego/kontrolnego.

figure-protocol-4
Rysunek 1: Schemat protokołu badania aplikacji miejscowej. Protokół badania aplikacji miejscowej rozpoczyna się od (A) sortowania okazów na lodzie, następnie (B) ważenia okazów na wadze analitycznej, (C) dawkowania roztworów insektycydu na okazy oraz (D) 24-godzinnego okresu oczekiwania po ekspozycji na insektycydu z dostępem do 10% roztworu sacharozy ad libitum (poprzez nasączoną watkę), a następnie oceny śmiertelności. Czerwone strzałki wskazują miejsce aplikacji docelowego insektycydu dla komarów (po lewej) i muszek owocówek (po prawej). Należy pamiętać, że obraz nie jest zachowany w skali. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wyniki

Te reprezentatywne wyniki przedstawiają dwa różne szczepy Ae. aegypti: Rockefeller (ROCK) oraz wyizolowany szczep polowy z Florydy o znanych mutacjach odporności na knockdown F1534C i V1016I (genotyp IICC). Dodatkowo zaprezentowano Drosophila melanogaster (szczep Canton: S).

Rysunek 2 oraz Rysunek 3 przedstawiają odpowiedź na dawkę każdego z organizmów z podziałem na badane szczepy i płeć zgodnie z powyższym protokołem. Ponieważ nie zaobserwowano różnic między krzywymi odpowiedź-dawka dla samców i samic komarów w obrębie każdego szczepu (t = 1.70, p = 0.098 dla ROCK i t = 0.64, p = 0.527 dla IICC), dane dla obu płci w ramach każdego szczepu komarów zostały połączone. Relatywna względem masy LD50 dla ROCK i IICC wynosi odpowiednio 0.008 ng/mg (95% CI: 0-0.104) oraz 0.336 ng/mg (95% CI: 0.235-0.438). Przedziały ufności 95% dla tych wartości nie nakładają się, co wskazuje na istotnie różne odpowiedzi na dawkę w badanych szczepach. RR szczepu IICC (w stosunku do szczepu ROCK) wynosi 41.7, co według WHO jest uznawane za wysoką oporność5. Dla muszek owocówek Canton-S relatywna względem masy LD50 wynosi 0.213 ng/mg (95% CI: 0-0.490).

figure-results-1
Rycina 2: Reprezentatywne dane dotyczące komarów uzyskane za pomocą bioanalizy z zastosowaniem aplikacji miejscowej. Reprezentatywne dane zależności dawka-odpowiedź z bioanalizy z zastosowaniem aplikacji miejscowej zgodnie z powyższym protokołem z użyciem deltametryny i komarów: (A) samice szczepów Ae. aegypti ROCK (n = 880) i IICC (n = 550), (B) samce szczepów Ae. aegypti ROCK (n = 880) i IICC (n = 569). Stężenia testowe deltametryny wynosiły od 0.00075 ng/µL do 9.68705 ng/µL, a dawka zastosowanej deltametryny (ng) w przeliczeniu na średnią masę komara (mg) jest przedstawiona na osi x. Śmiertelność pokazano jako proporcję na osi y. Czarna linia przechodząca przez każdy zbiór punktów danych reprezentuje regresję liniową specyficzną dla szczepu i płci. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

figure-results-2
Rysunek 3: Reprezentatywne dane dotyczące muszek owocówek z zastosowaniem bioanalizy aplikacji miejscowej. Reprezentatywne dane zależności efektu od dawki z bioanalizy aplikacji miejscowej przeprowadzonej zgodnie z powyższym protokołem z użyciem deltametryny i muszek owocówek: szczep Canton-S D. melanogaster (n = 1014). Stężenia testowe deltametryny wynosiły od 0,00499 do 5,02876 ng/µL, a na osi x naniesiono dawkę podanej deltametryny (ng) w przeliczeniu na średnią masę muszki owocówki (mg). Śmiertelność przedstawiono jako proporcję na osi y. Czarna linia reprezentuje regresję liniową. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Rycina uzupełniająca S1: Blatowy namiot do obsługi owadów. Blatowy namiot do obsługi owadów jest używany w celu łatwiejszego chwytania uciekających komarów lub much podczas testu aplikacji miejscowej. Konstrukcja jest zamknięta na zdjęciu A i otwarta na zdjęciu B. Konstrukcja ta została wykonana z rur PVC i tkaniny z gęstej siatki. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rycina uzupełniająca S2: Strzykawka i aplikator powtarzalny. Strzykawka i aplikator powtarzalny używane do dawkowania substancji owadom. Główne elementy obejmują: 1) igłę, 2) cylinder strzykawki, 3) tłok, 4) aplikator powtarzalny oraz 5) przycisk aplikatora. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 1: Skrypt randomizacji: Skrypt randomizacji służący do tworzenia bezstronnych etykiet dla wszystkich kubków w każdym eksperymencie. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 2: Arkusz oceny śmiertelności: Arkusz oceny śmiertelności ułatwiający ocenę śmiertelności. Arkusz zawiera również miejsca na zapisanie wszystkich innych istotnych informacji, o których wspomniano w protokole, takich jak godziny rozpoczęcia i zakończenia aplikacji insektycydu. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 3: Przykładowe dane dotyczące śmiertelności: Przykładowy plik z danymi użyty do stworzenia Rysunku 2. Opisy nagłówków kolumn są następujące: "id" = kod identyfikacyjny każdego punktu danych; "species" = nazwa gatunku (np. Aedes aegypti); "insecticide" = nazwa insektycydu zastosowanego miejscowo (np. deltametryna); "strain" = nazwa szczepu komarów (np. ROCK); "date" = data rozpoczęcia aplikacji miejscowej; "sex" = płeć komarów; "age" = wiek komarów (młode = 3-5 dni; stare = 4 tygodnie); "total.mosq" = całkowita liczba komarów zważonych w partii; "weight" = masa (mg) wszystkich komarów w partii; "concentration" = stężenie insektycydu (µg/mL); "syringe" = objętość kropli (mL) z strzykawki; "dose" = ilość substancji czynnej insektycydu zastosowana dla każdego komara (ng); "total" = liczba komarów w każdym kubku; "dead" = liczba martwych komarów w każdym kubku. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 4: Kod analizy w programie R: Przykładowy kod R, który można wykorzystać do przeprowadzenia analizy probitowej (zgodnie z opisem w kroku 8 protokołu). Reprezentatywne wyniki (dostępne w uzupełniającym pliku z przykładowymi danymi) można przetworzyć za pomocą tego kodu R. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

W artykule przedstawiono dostosowany protokół do stosowania miejscowego u komarów i muszek owocowych. Procedurę tę można łatwo dostosować do stosowania w terenie i z innymi organizmami, ponieważ wymaga minimalnego specjalistycznego sprzętu. Poniżej omówiono krytyczne kroki tego protokołu, potencjalne modyfikacje, porady dotyczące rozwiązywania problemów, ograniczenia metody i znaczenie tej metody.

Krytyczne kroki w protokole: W protokole znajdują się trzy krytyczne kroki, które, jeśli zostaną wykonane nieprawidłowo, mogą drastycznie wpłynąć na wyniki testu biologicznego: dokładność stężenia insektycydów, knockdown próbki i ocena śmiertelności.

Dokładność stężenia insektycydów:
Niezwykle ważne jest, aby dysponować dokładnymi roztworami insektycydów w celu uzyskania powtarzalnych krzywych dawka-odpowiedź i znaczących wyników. Wolumetryczne podejście do przygotowania roztworu insektycydu jest bardziej powszechne w literaturze zarówno w przypadku testu biologicznego CDC w butelce7, jak i do stosowania miejscowego 13,14,43. Jednak opisane tutaj podejście grawimetryczne jest z natury dokładniejsze ze względu na uwzględnienie temperatury poprzez uwzględnienie gęstości (specyficznej dla temperatury), co prowadzi do dokładniejszego przygotowania preparatu.

Powalenie próbki:
Strącanie próbek jest kluczowym elementem tej metody i pozwala na dokładne podanie środka owadobójczego i pomiary masy. Jednak powalanie organizmów nieuchronnie wiąże się z ryzykiem stresu fizycznego i uszkodzeń, jak wykazano wcześniej30. Dlatego należy zachować ostrożność i ostrożność podczas strącania próbek, aby upewnić się, że i) każda próbka jest powalana przez podobny czas, ii) długość powalania jest ograniczona do minimum oraz iii) metoda powalania jest spójna dla wszystkich próbek. Dodatkowo zaleca się przetestowanie metody knockdown oddzielnie, przed zastosowaniem insektycydu, aby upewnić się, że metoda jest skuteczna i nie wywołuje śmiertelności kontrolnej większej niż 10%. Początkowy test może potrwać dłużej dla niedoświadczonego użytkownika, co prowadzi do dłuższego czasu powalenia. Dlatego należy zachować ostrożność podczas interpretacji wyników pierwszych testów.

Ocena śmiertelności:
Ocena śmiertelności może być trudna, zwłaszcza gdy środek owadobójczy nie zabija całkowicie, a jedynie powala lub okalecza komara lub muchę. Dlatego ważne jest, aby zdawać sobie sprawę z tego, w jaki sposób insektycyd wpływa na organizm docelowy i przed rozpoczęciem mieć jasną definicję "martwych" (lub powalonych) organizmów. Ponadto zaleca się, aby ta sama osoba oceniła śmiertelność między dawkami i powtórzeniami w celu zmniejszenia zmienności.

Modyfikacje protokołu: Do tego protokołu można zastosować kilka modyfikacji opisanych poniżej, aby poprawić jego wszechstronność i dostępność.

Dostosowanie testu do mniejszych lub większych owadów:
W przypadku stosowania mniejszych lub większych próbek zaleca się stosowanie odpowiednio mniejszej lub większej objętości środka owadobójczego. Na przykład dostosowaliśmy protokół dotyczący komarów do muszek owocowych, zmniejszając dawkę 0,5 μl do dawki 0,2 μl. Upewnij się, że wybrano właściwy rozmiar strzykawki dla wybranej objętości dawki.

Dostosowanie testu do owadów polnych:
W przypadku stosowania owadów polnych mogą występować większe różnice w wielkości owadów. Dlatego zaleca się ważenie owadów w mniejszych grupach (np. na filiżankę) zamiast jako dużej grupy (np. wszystkie owady użyte w jednym eksperymencie). Może to pomóc w uchwyceniu potencjalnej zmienności podatności na insektycydy związanej z różnicami w masie owadów polowych.

Modyfikacje wyposażenia:
Namiot do obsługi owadów: Dozowanie próbki można wykonać pod namiotem do obsługi owadów, który jest po prostu zbudowany z rury PVC i moskitiery. Może to stanowić alternatywę dla zamkniętego pomieszczenia (np. owadobójczego) i pomóc wyeliminować potencjalne zanieczyszczenie środkami owadobójczymi na obszarach, na których może wystąpić hodowla owadów. Ten namiot do obsługi owadów jest łatwy w budowie i tani (~ 70 USD). Alternatywnie można kupić klatkę do obsługi owadów (~ 425 USD).

Stół chłodzący: Okłady z lodu lub tacki z lodem mogą być używane do powalania próbki i/lub utrzymywania próbki w stanie powalonym.

Inkubator: Inkubatory są zalecane do hodowli próbki i przetrzymywania próbki przez 24 godziny po zastosowaniu środków owadobójczych. Jeśli inkubator nie jest dostępny, można go zbudować. Sprzęt potrzebny do zbudowania inkubatora obejmuje izolowany pojemnik, nawilżacz, kable grzewcze, regulator wilgotności i temperatury oraz światło, co powinno dać całkowity koszt ~ 170 USD, zgodnie z poprzednimi metodamii rozszerzając je.

Kubki do trzymania: Chociaż plastikowe kubki są używane do sortowania i przechowywania poddanej działaniu substancji próbki, odpowiednią alternatywą byłyby kubki papierowe wyłożone woskiem lub szklane pojemniki.

Modyfikacja organizmu i etapu życia:
Metoda ta jest bardzo elastyczna do stosowania z innymi wektorami, owadami i/lub stawonogami, takimi jak komary Culex quinquefasciatus 32, muchy domowe32 i karaluchy45, a także z niedorosłymi etapami życia, takimi jak larwy komarów46.

Miejscowa modyfikacja lokalizacji aplikacji:
Ta metoda opisuje stosowanie środka owadobójczego na brzuszną część klatki piersiowej i brzucha w przypadku komarów (oraz grzbiet w przypadku muszek owocowych). Można jednak użyć innych miejsc aplikacji, o ile miejsce ekspozycji jest spójne. Konsystencja jest ważna, ponieważ wrażliwość na insektycydy może się różnić w zależności od miejsca aplikacji32.

Porady dotyczące rozwiązywania problemów: Ta metoda składa się z kilku kroków, które początkowo są trudne. Poniżej opisano niektóre z najczęstszych problemów, które można napotkać.

Wyciekające/parujące roztwory insektycydów:
Insektycydy są zwykle rozpuszczone w acetonie, wysoce lotnym związku. Oznacza to, że aceton szybko odparowuje w temperaturze pokojowej, zwiększając z czasem stężenie insektycydów. Jeśli wydaje się, że roztwory insektycydów przeciekają lub parują, przerób roztwory, upewnij się, że pokrywka probówki jest szczelnie założona i dwukrotnie sprawdź, czy protokoły przechowywania są prawidłowo przestrzegane (np. używany jest parafilm, a probówki są przechowywane w pozycji pionowej). Jeśli nieszczelność będzie się utrzymywać, spróbuj napełnić probówki mniejszą objętością, aby zapewnić więcej miejsca na zmianę objętości, której aceton doświadcza w różnych temperaturach. Dodatkowo, jeśli używasz acetonu jako rozpuszczalnika, upewnij się, że probówki są przystosowane do przechowywania acetonu (np. tworzywa FEP, TFE i PFA). W przypadku stosowania hydrofobowych środków owadobójczych należy przechowywać roztwory w szklanych fiolkach (ponieważ hydrofobowe środki owadobójcze mniej przylegają do szkła niż plastik). Dobrą praktyką jest również oznaczanie menisku roztworu przed przechowywaniem w celu monitorowania parowania.

Dryft masy na mikrowadze podczas ważenia organizmów:
Jeśli odczyt masy na wadze dryfuje (powoli idzie w górę lub w dół), może to być spowodowane zakłóceniami statycznymi. Dryft występuje najczęściej podczas ważenia organizmów w przedmiotach z tworzyw sztucznych, ponieważ plastik może łatwo zatrzymywać ładunek elektrostatyczny. Aby tego uniknąć, pod ważonym pojemnikiem z tworzywa sztucznego można umieścić papier do ważenia lub użyć pojemnika innego niż plastikowy, takiego jak szkło.

Nieprawidłowe wyniki śmiertelności:
Istnieje wiele sposobów, przez które wyniki śmiertelności mogą wydawać się nienormalne, takie jak obserwacja wysokiej śmiertelności w grupie kontrolnej lub wysokiej/niskiej śmiertelności we wszystkich dawkach insektycydów. Zapoznaj się z poniższymi przypadkami, aby zapoznać się z rozwiązywaniem problemów w każdym scenariuszu.

Wysoka śmiertelność z grupy kontrolnej
Jeśli śmiertelność w grupie kontrolnej jest wysoka (10% lub więcej), należy ocenić metodę knockdown i czas trwania powalania próbek. Jeśli to możliwe, skróć czas, na jaki próbki są powalające. Inne potencjalne czynniki, które należy wziąć pod uwagę w przypadku wysokiej śmiertelności w grupie kontrolnej, obejmują i) sprawdzenie, czy ustawienia inkubatora są prawidłowe - nienormalne temperatury i/lub wilgotność mogą prowadzić do zwiększonej śmiertelności. Temperaturę i wilgotność należy sprawdzić za pomocą niezależnego rejestratora danych. ii) Ocena postępowania z owadami. Zbyt częste lub zbyt brutalne obchodzenie się z owadami może prowadzić do wysokiej śmiertelności. iii) Sprawdzenie, czy nie ma zanieczyszczenia insektycydami w 100% acetonie użytym do leczenia grupy kontrolnej lub na oprzyrządowaniu. Wymień aceton i wyczyść wszystkie instrumenty acetonem lub etanolem. Unikaj zanieczyszczeń, często wymieniając rękawice, zapobiegając rozlaniu i czyszcząc narzędzia. Należy zauważyć, że w pliku uzupełniającym 3 maksymalnie dwa komary padły w kubkach kontrolnych (tylko aceton). Ten poziom śmiertelności nie jest uważany za wysoki (wynosi mniej niż 10%), a zatem nie było powodów do niepokoju.

Wysoka śmiertelność we wszystkich narażonych grupach (ale nie w grupach kontrolnych)
Do testów należy stosować niższe stężenia insektycydów lub mniejsze objętości dawek. Stosowane dawki mogą być większe od dawki minimalnej, która nie spowoduje śmiertelności. Użyj kilku 10-krotnych rozcieńczeń, aby określić prawidłowy zakres dawek i wykluczyć zanieczyszczenie. Aby uniknąć zanieczyszczenia, rozpocznij dozowanie od najniższego stężenia i dąż do najwyższego stężenia. Dodatkowo upewnij się, że cały używany sprzęt jest regularnie czyszczony acetonem i/lub etanolem, dawki stosowane do próbki są bardzo małe, a nawet najmniejsze zanieczyszczenie krzyżowe może wpłynąć na wyniki.

Niska śmiertelność we wszystkich narażonych grupach
Używaj wyższych stężeń insektycydów. Stosowane dawki mogą być zbyt niskie, aby spowodować śmiertelność w populacji. Aby określić prawidłowy zakres dawek, należy wystawić próbki na działanie kilku dodatkowych 10-krotnie skoncentrowanych dawek. Upewnij się, że roztwory insektycydów nie wygasły ani nie uległy degradacji (potencjalnie z powodu wysokiej temperatury lub ekspozycji na światło). Jeśli roztwory straciły ważność lub istnieje podejrzenie, że uległy degradacji, należy je ponownie przygotować i upewnić się, że przestrzegane są odpowiednie warunki przechowywania.

Niespójna śmiertelność między powtórzeniami/dniami
Pora dnia, w której owady są narażone na działanie środka owadobójczego, może wpływać na wyrażony poziom oporności, zwłaszcza w przypadku oporności metabolicznej34. Powtarzaj ten protokół w tym samym oknie czasowym każdego dnia, aby uniknąć pory dnia jako potencjalnej zmiennej przyczyniającej się do zmian śmiertelności. Inne potencjalne czynniki przyczyniające się do niespójnej śmiertelności między powtórzeniami obejmują i) zróżnicowane hodowanie próbek między eksperymentami. Upewnij się, że wszystkie okazy są w tym samym przedziale wiekowym, są hodowane w tej samej temperaturze i o podobnej gęstości oraz mają dostęp do pokarmu. ii) stężenia insektycydów pogarszające się z czasem lub stające się bardziej skoncentrowane w wyniku parowania acetonu. Przerób roztwory i zapewnij odpowiednie warunki przechowywania. iii) Niespójna ocena śmiertelności. Upewnij się, że ta sama osoba ocenia śmiertelność lub opracuj jasny protokół, który będzie konsekwentnie stosowany w całym zespole. Stosuj ślepą punktację, aby zmniejszyć stronniczość w ocenie śmiertelności.

Owady przyklejające się do powierzchni tacki do sortowania:
Aceton reaguje z tworzywami sztucznymi stosowanymi w tym protokole, takimi jak szalki Petriego. Próbka prawdopodobnie przylgnie do powierzchni, jeśli użyje acetonu na szalkach Petriego lub podobnych plastikowych powierzchniach. Tego przyparcia można uniknąć, wykładając tacę sortowniczą papierem wagowym lub używając tacki do sortowania z tworzywa sztucznego. Ponadto kondensacja na powierzchni tworzywa sztucznego na tacy sortującej lub kubkach może prowadzić do przywierania owadów do kondensacji lub próbka może być zbyt zimna i potencjalnie zamarznąć na powierzchni. Dostosuj metodę knockdown, aby zmniejszyć kondensację, jednocześnie zapobiegając nadmiernemu wychłodzeniu/zamarznięciu próbek (np. umieść papier wagowy między próbkami a plastikową tacą do sortowania).

Błędy analizy języka R:
Po zebraniu danych dotyczących śmiertelności podczas analizy mogą wystąpić różne komplikacje. Najczęstszym powodem, dla którego kod R nie może wykonać akcji dla pliku danych, jest to, że format danych nie jest zgodny z kodem (np. nagłówki kolumn i/lub puste komórki). Jeśli pojawią się poważniejsze komplikacje, zapoznaj się ze stronami pomocy języka R wbudowanymi w Rstudio35.

Ograniczenia opisanej powyżej metody aplikacji miejscowej:
Wchłanianie insektycydów metodą stosowania miejscowego nie naśladuje naturalnej ekspozycji:
Miejscowe stosowanie na główny korpus nie jest naturalnym sposobem wchłaniania insektycydów. Na polu owady najczęściej wchłaniają insektycydy przez nogi przez czas, w którym mają kontakt z powierzchnią potraktowaną środkiem owadobójczym lub na skrzydłach przez małe cząsteczki aerozolu47,48, a nie przez szybką ekspozycję na powierzchnię brzuszną. Jednak bezpośrednie zastosowanie znanej dawki insektycydu dokładnie ustali fenotypową odpowiedź na insektycydy, potrzebną do badań genetycznych i ewolucyjnych lub porównań podatności na insektycydy w przestrzeni lub czasie. W związku z tym podejście to jest korzystne dla testowania odporności technicznej, ale nie mierzy bezpośrednio oporu praktycznego (skuteczności rzeczywistego narzędzia interwencyjnego w warunkach polowych15). Należy jednak zauważyć, że obecne standardowe metody (np. testy probówkowe WHO i testy biologiczne CDC w butelkach) również nie mogą wychwytywać ani naśladować ekspozycji na insektycydy w aerozolu (tj. przez zamgławianie) w terenie.

Testy do stosowania miejscowego mogą oceniać tylko insektycydy absorpcyjne:
Metoda ta jest przeznaczona do insektycydów, które działają poprzez kontakt i absorpcję insektycydu, a nie do stosowania z doustnymi środkami owadobójczymi, takimi jak kwas borowy powszechnie stosowany w atrakcyjnych toksycznych przynętach cukrowych49.

Znaczenie metody:
Metoda stosowania miejscowego rozszerza dobrze ugruntowane standardy testów biologicznych insektycydów poprzez obliczenie dawki śmiertelnej (nie stężenia) i pomiar odporności technicznej (niepraktycznej)15. Poniżej podano zalety i wady tej metody w porównaniu z istniejącymi testami wrażliwości na insektycydy.

Obliczanie dawki śmiertelnej:
Metoda ta określa śmiertelną dawkę insektycydu, a nie śmiertelne stężenie, które CDC i WHO stosują w testach biologicznych do ustalenia dawki dyskryminującej11. Dawka śmiertelna jest bardziej znacząca, ponieważ jest to ilościowo określona ilość środka owadobójczego, o którym wiadomo, że powoduje śmiertelność. Natomiast stężenie śmiertelne nie bierze pod uwagę, ile insektycydu organizm faktycznie nabywa. Korzystając z obliczania dawki śmiertelnej, różnice między profilami podatności zależnymi od płci lub wielkości mogą być dokładniej obserwowane i określane ilościowo, co czyni ten pomiar jeszcze bardziej wszechstronnym.

Odporność techniczna:
Ta metoda ocenia rezystancję techniczną, która jest rezystancją mierzoną w znormalizowanych, kontrolowanych środowiskach. Takie pomiary są odpowiednie do monitorowania rozprzestrzeniania się oporności na insektycydy i łączenia oporności fenotypowej z potencjalnymi markerami15. Ze względu na zmniejszoną zmienność śmiertelności wynikającą z testu biologicznego do stosowania miejscowego, pozwala on na lepszą identyfikację nowych markerów oporności. Jednak ze względu na nienaturalne narażenie komarów na insektycydy, test ten nie jest odpowiedni do oceny skuteczności określonej interwencji w określonej populacji. Do pomiarów takiej praktycznej odporności potrzebne są inne testy15.

Zdolność adaptacji próbki:
Metodę tę można ćwiczyć na innych ważnych stawonogach, takich jak szkodniki upraw (np. Stonka ziemniaczana), szkodniki domowe (np. karaluchy i pluskwy) lub zapylacze (np. pszczoły) przy prostych zmianach w podejściu knockdown i/lub dawce, objętości i/lub stężeniu insektycydu (jak opisano powyżej). Łatwość adaptacji może pomóc w analogii badań nad odpornością na insektycydy w różnych dziedzinach badań. Zastosowanie wartości LD50 zamiast stężenia śmiertelnego, które zabija 50% okazów (LC50), pozwala na dokładne porównanie między gatunkami.

Koszt:
Podobnie jak w przypadku testów biologicznych CDC w butelkach i testów probówkowych WHO, koszty przeprowadzenia testu do stosowania miejscowego są minimalne (patrz tabela materiałów). Niezbędnymi elementami wyposażenia są strzykawka (około 70 USD) i dozownik (około 100 USD), które są wielokrotnego użytku we wszystkich testach.

Liczba potrzebnych próbek:
Należy użyć co najmniej 20-25 próbek na kubek testowy do stosowania miejscowego. Zaleca się badanie co najmniej pięciu stężeń insektycydów w jednym doświadczeniu, przy czym dla procedury zaleca się co najmniej trzy powtórzenia. Ogólnie rzecz biorąc, daje to co najmniej 300-375 próbek potrzebnych do pełnego testu, co jest porównywalne z liczbą próbek potrzebnych do wykonania testów intensywności oporności za pomocą testów probówkowych WHO lub testów biologicznych CDC w butelkach. Jeśli jednak zmniejszona zmienność zostanie osiągnięta za pomocą testu biologicznego do stosowania miejscowego, ta sama liczba próbek może prowadzić do większej mocy statystycznej do porównywania danych dotyczących wrażliwości w przestrzeni lub czasie.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

To badanie zostało wsparte nagrodą CAREER przyznaną SH przez National Science Foundation pod numerem 2047572. Dziękujemy Damienowi Riverze za pomoc w hodowli muszek owocowych i przygotowaniu do testu do stosowania miejscowego, dr Ganetzky'emu z University of Wisconsin-Madison za podzielenie się szczepem muszki owocowej Canton-S, Centrom Kontroli i Prewencji Chorób za udostępnienie szczepu Rockefellera oraz Centrum Entomologii Medycznej, Rolniczej i Weterynaryjnej Departamentu Rolnictwa Stanów Zjednoczonych za udostępnienie szczepu izoliny IICC. Rysunek 1 został stworzony za pomocą BioRender.com.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Probówki do mikrowirówek 1,5 mlThomas Scientific20A00L068Przechowywanie podwielokrotności acetonu
1,5 ml probówki z nakrętkąThomas Scientific1182K23Zbiornik na rozcieńczalniki do insektycydów
Probówki stożkowe 15 mlVWR339651Przechowywanie rozcieńczalników owadobójczych
20 ml szklane fiolki scyntylacyjneFisher Scientific0334125DWażenie muszek owocowych
25 μ Strzykawka LFisher Scientific14815288Aplikator do stosowania miejscowego
AcetonFisher ScientificAC423240040ACS 99,6%, 4 L
Aedes aegypti (szczep ICC)USDA CMAVENAOdporny na insektycydy
Aedes aegypti (szczep Rockefellera)CDCNAPodatny na insektycydy
Skala analitycznaFisher Scientific14-557-409Precyzja do 0,1 mg
AspiratorAmazon6.49986E+11Urządzenie do zbierania komarów
Papier stołowyVWR89126-794Miejsce pod przestrzenią roboczą
Waciki bawełnianeAmazonB092S8JVQNSłuży do sortowania owadów
Kulki z watyAmazonB0769MKZWTUżyj do roztworu
DozownikFisher Scientific1482225Repeater pipettor
Drosophila melanogaster (szczep Canton-S)University of Wisconsin-MadisonNAPodatny na insektycydy
Pędzle malarskie z cienką końcówkąAmazonB07KT2X1BKSłuży do sortowania owadów
Butelki na muchy owocoweFisher ScientificAS355Zastosowanie do hodowli i sortowania muszki owocowe
Ręczny dozownik CO2Fisher ScientificNC1710679Służy do powalania owadów
Kubki do trzymania AmazonB08DXG7V1SPrzezroczysty plastikowy
okład z loduAmazonB08QDWMMW5Służy do powalania muszek owocowych
Tacki na lódAmazon9301085269Służy do powalania owadów
Owad kleszcze AmazonB07B4767WRKleszcze do owadów
Środek owadobójczySigma-Aldrich Inc45423-250MGDeltametryna
Etykietowanie NaklejkiAmazonB07Q4X9GWX3/4" Kolorowe kropki
Taśma do etykietowaniaAmazonB00X6A1GYKBiała taśma
SiatkaAmazonB07F2PHHWVSłuży do zakrywania kubków i owadów Namiot manipulacyjny
szalki PetriegoFisher ScientificFB0875712H371100 mm x 15 mm
PVC RuraLowe' s23971Materiały namiotowe do obchodzenia się z owadami
GumkiAmazonB00006IBRUSłuży do zabezpieczania siatki/siatki na kubkach
SacharozaAmazonB01J78INO0Granulowany biały cukier
Papier wagowyVWR12578-1654" x 4"
sacharozy

Bibliografia

  1. World Health Organization. Vector-borne diseases. World Health Organization. , https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/vector-borne-diseases (2020).
  2. World Health Organization. Global plan for insecticide resistance management in malaria vectors. World Health Organization. , https://apps.who.int/iris/handle/10665/44846 (2012).
  3. Liu, N. Insecticide resistance in mosquitoes: impact, mechanisms, and research directions. Annual Review of Entomology. 60 (1), 537-559 (2015).
  4. Hemingway, J., Ranson, H. Insecticide resistance in insect vectors of human disease. Annual Review of Entomology. 45 (1), 371-391 (2000).
  5. World Health Organization. Monitoring and managing insecticide resistance in Aedes mosquito populations. World Health Organization. , https://apps.who.int/iris/handle/10665/204588 (2016).
  6. World Health Organization. Test procedures for insecticide resistance monitoring in malaria vector mosquitoes (Second edition). World Health Organization. , http://www.who.int/malaria/publications/atoz/9789241511575/en/ (2016).
  7. McAllister, J. C., Scott, M. CONUS manual for evaluating insecticide resistance in mosquitoes using the CDC bottle bioassay kit. Centers for Disease Control and Prevention. , https://www.cdc.gov/zika/pdfs/CONUS-508.pdf (2020).
  8. Duneau, D., et al. Signatures of insecticide selection in the genome of Drosophila melanogaster. G3: Genes, Genomes, Genetics. 8 (11), 3469-3480 (2018).
  9. Pittendrigh, B., Reenan, R., ffrench-Constant, R. H., Ganetzky, B. Point mutations in the Drosophila sodium channel gene para associated with resistance to DDT and pyrethroid insecticides. Molecular & General Genetics: MGG. 256 (6), 602-610 (1997).
  10. Rinkevich, F. D., Du, Y., Dong, K. Diversity and convergence of sodium channel mutations involved in resistance to pyrethroids. Pesticide Biochemistry and Physiology. 106 (3), 93-100 (2013).
  11. Lissenden, N., et al. Review and meta-analysis of the evidence for choosing between specific pyrethroids for programmatic purposes. Insects. 12 (9), 826(2021).
  12. Owusu, H. F., Chitnis, N., Müller, P. Insecticide susceptibility of Anopheles mosquitoes changes in response to variations in the larval environment. Scientific Reports. 7 (1), 3667(2017).
  13. Brito-Sierra, C. A., Kaur, J., Hill, C. A. Protocols for testing the toxicity of novel insecticidal chemistries to mosquitoes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (144), e57768(2019).
  14. Burgess, E. R., King, B. H., Geden, C. J. Oral and topical insecticide response bioassays and associated statistical analyses used commonly in veterinary and medical entomology. Journal of Insect Science. 20 (6), 1-9 (2020).
  15. Namias, A., Jobe, N. B., Paaijmans, K. P., Huijben, S. The need for practical insecticide-resistance guidelines to effectively inform mosquito-borne disease control programs. eLife. 10 (1), 65655(2021).
  16. Zhu, X., et al. Manipulating solid forms of contact insecticides for infectious disease prevention. Journal of the American Chemical Society. 141 (1), 16858-16864 (2019).
  17. Dang, K., Singham, G. V., Doggett, S. L., Lilly, D. G., Lee, C. Y. Effects of different surfaces and insecticide carriers on residual insecticide bioassays against bed bugs, Cimex spp. (Hemiptera: Cimicidae). Journal of Economic Entomology. 110 (2), 558-566 (2017).
  18. Spielmeyer, A., Schetelig, M. F., Etang, J. High-throughput analysis of insecticides on malaria vectors using liquid chromatography tandem mass spectrometry. PLoS ONE. 14 (2), 0211064(2019).
  19. Bagi, J., et al. When a discriminating dose assay is not enough: measuring the intensity of insecticide resistance in malaria vectors. Malaria Journal. 14 (1), 210(2015).
  20. Pridgeon, J. W., Becnel, J. J., Clark, G. G., Linthicum, K. J. Permethrin induces overexpression of multiple genes in Aedes aegypti. Journal of Medical Entomology. 46 (3), 1-8 (2009).
  21. World Health Organization. Guidelines for efficacy testing of insecticides for indoor and outdoor ground-applied space spray applications. World Health Organization. , https://apps.who.int/iris/handle/10665/70070 (2009).
  22. Estep, A. S., et al. Quantification of permethrin resistance and kdr alleles in Florida strains of Aedes aegypti (L.) and Aedes albopictus (Skuse). PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (10), 0006544(2018).
  23. Waits, C. M., et al. A comparative analysis of resistance testing methods in Aedes albopictus (Diptera: Culicidae) from St. Johns County, Florida. Florida Entomologist. 100 (3), 571-577 (2017).
  24. Kostromytska, O. S., Wu, S., Koppenhöfer, A. M. Diagnostic dose assays for the detection and monitoring of resistance in adults from Listronotus maculicollis (Coleoptera: Curculionidae) populations. Journal of Economic Entomology. 111 (5), 2329-2339 (2018).
  25. Aktar, W., Sengupta, D., Chowdhury, A. Impact of pesticides use in agriculture: their benefits and hazards. Interdisciplinary Toxicology. 2 (1), 1-12 (2009).
  26. Maïga, H., et al. Guidelines for routine colony maintenance of Aedes mosquito species. IAEA Physical and Chemical Sciences. , http://www-naweb.iaea.org/nafa/ipc/public/guidelines-for-routine-colony-maintenance-of-Aedes-mosquito-species-v1.0.pdf (2017).
  27. Gjullin, C. M., Hegarty, C. P., Bollen, W. B. The necessity of a low oxygen concentration for the hatching of aedes mosquito eggs. Journal of Cellular Physiology. 17 (2), 193-202 (1941).
  28. Stocker, H., Gallant, P. Getting started: an overview on raising and handling Drosophila. Methods in Molecular Biology. 420 (1), 27-44 (2008).
  29. Jass, A., Yerushalmi, G. Y., Davis, H. E., Donini, A., MacMillan, H. A. An impressive capacity for cold tolerance plasticity protects against ionoregulatory collapse in the disease vector Aedes aegypti. Journal of Experimental Biology. 222 (1), 214056(2019).
  30. Bartholomew, N. R., Burdett, J. M., Vandenbrooks, J. M., Quinlan, M. C., Call, G. B. Impaired climbing and flight behaviour in Drosophila melanogaster following carbon dioxide anaesthesia. Scientific Reports. 5 (1), 15298(2015).
  31. Jung, Y., Kennedy, A., Chiu, H., Mohammad, F., Claridge-Chang, A., Anderson, D. J. Neurons that function within an integrator to promote a persistent behavioral state in Drosophila. Neuron. 105 (2), 322-333 (2020).
  32. Aldridge, R. L., Kaufman, P. E., Bloomquist, J. R., Gezan, S. A., Linthicum, K. J. Impact of topical application site on the efficacy of permethrin and malathion to Culex quinquefasciatus. Journal of the American Mosquito Control Association. 32 (4), 300-307 (2016).
  33. Rinkevich, F. D., et al. Distinct roles of the DmNav and DSC1 channels in the action of DDT and pyrethroids. Neuro Toxicology. 47 (1), 99-106 (2015).
  34. Balmert, N. J., Rund, S. S. C., Ghazi, J. P., Zhou, P., Duffield, G. E. Time-of-day specific changes in metabolic detoxification and insecticide resistance in the malaria mosquito Anopheles gambiae. Journal of Insect Physiology. 64 (1), 30-39 (2014).
  35. R Core Team. R: a language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing. R Core Team. , https://www.r-project.org/ (2021).
  36. Ritz, C., Baty, F., Streibig, J. C., Gerhard, D. Dose-response analysis using R. PLoS ONE. 10 (12), 0146021(2015).
  37. Abbott, W. S. A method of computing the effectiveness of an insecticide. Journal of the American Mosquito Control Association. 3 (2), 302-303 (1987).
  38. Ravichandran, S. Data analysis through SAS with special emphasis on Probit analysis. National Academy of Agricultural Research Management (NAARM). , https://naarm.org.in/VirtualLearning/vic/e-chapters/Probit_Analysis-ravichandran.pdf (2021).
  39. Smith, L. B., et al. CYP-mediated resistance and cross-resistance to pyrethroids and organophosphates in Aedes aegypti in the presence and absence of kdr. Pesticide Biochemistry and Physiology. 160 (1), 119-126 (2019).
  40. Finney, D. J. Probit Analysis. , Cambridge University Press. Cambridge, England. (1971).
  41. Silva, J. J., Kouam, C. N., Scott, J. G. Levels of cross-resistance to pyrethroids conferred by the Vssc knockdown resistance allele 410L+1016I+1534C in Aedes aegypti. PLOS Neglected Tropical Diseases. 15 (7), 0009549(2021).
  42. Fan, Y., Scott, J. G. The F1534C voltage-sensitive sodium channel mutation confers 7- to 16-fold resistance to pyrethroid insecticides in Aedes aegypti. Pest Management Science. 76 (1), 2251-2259 (2020).
  43. Miller, A. L. E., Tindall, K., Leonard, B. R. Bioassays for monitoring insecticide resistance. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (46), e2129(2010).
  44. Glunt, K. D., et al. Long-lasting insecticidal nets no longer effectively kill the highly resistant Anopheles funestus of southern Mozambique. Malaria Journal. 14 (1), 298(2015).
  45. ffrench-Constant, R. H., Roush, R. T. Resistance detection and documentation: the relative roles of pesticidal and biochemical assays. Pesticide Resistance in Arthropods. Roush, R. T., Tabashnik, B. E. , Springer. Boston, MA. (1990).
  46. Akdag, K., et al. Synthesis and larvicidal and adult topical activity of some hydrazide-hydrazone derivatives against Aedes aegypti. Marmara Pharmaceutical Journal. 18 (1), 120-125 (2014).
  47. Richards, S. L., Byrd, B. D., Reiskind, M. H., White, A. V. Assessing insecticide resistance in adult mosquitoes: perspectives on current methods. Environmental Health Insights. 14 (1), (2020).
  48. Cooperband, M., Golden, F., Clark, G., Jany, W., Allan, S. Prallethrin-induced excitation increases contact between sprayed ultra-low volume droplets and flying mosquitoes (Diptera: Culicidae) in a wind tunnel. Journal of Medical Entomology. 47 (1), 1099-1106 (2010).
  49. Barbosa, D. S., Rodrigues, M. M. S., Silva, A. A. E. Evaluation of attractive toxic sugar baits (ATSB) against Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) in laboratory. Tropical Biomedicine. 36 (2), 578-586 (2019).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

oporno komar wbiotest na muszkach owoc wkachkrzywa dawka odpowiedrednia dawka letalnawska nik oporno cibiotest fenotypowyekspozycja na insektycyddawka relatywizowana do masy
Test biologiczny do stosowania miejscowego w celu ilościowego określenia toksyczności insektycydów dla komarów i muszek owocowych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.