Test biologiczny do stosowania miejscowego w celu ilościowego określenia toksyczności insektycydów dla komarów i muszek owocowych

Podsumowanie

Opisujemy metodologię i znaczenie testu biologicznego do stosowania miejscowego do pomiaru podatności na insektycydy u komarów i muszek owocowych. Prezentowany test jest wysokoprzepustowy, wykorzystuje masę owadów - co pozwala na obliczenie zrelatywizowanej dawki śmiertelnej zamiast stężenia - i prawdopodobnie ma mniejszą zmienność niż inne podobne metody.

Streszczenie

Ciągłe stosowanie środków owadobójczych dla zdrowia publicznego i rolnictwa doprowadziło do powszechnej odporności na insektycydy i utrudnienia metod kontroli. Nadzór nad odpornością na insektycydy populacji komarów jest zwykle przeprowadzany za pomocą testów biologicznych butelek Centrów Kontroli i Prewencji Chorób (CDC) lub testów probówkowych Światowej Organizacji Zdrowia (WHO). Jednak metody te mogą skutkować wysokim stopniem zmienności danych dotyczących śmiertelności ze względu na zmienny kontakt insektycydów z owadami, stosunkowo niewielką liczbę badanych organizmów, duże różnice w masie między populacjami oraz stale zmieniające się warunki środowiskowe, prowadzące do zmiennych wyników. W artykule przedstawiono test biologiczny do stosowania miejscowego, zaadaptowany jako wysokoprzepustowy fenotypowy test biologiczny zarówno dla komarów, jak i muszek owocowych, do testowania dużej liczby owadów w zakresie stężeń insektycydów.

Ten test 1) zapewnia konsekwentne leczenie i kontakt insektycydów z każdym organizmem, 2) tworzy wysoce specyficzne krzywe dawka-odpowiedź, które uwzględniają różnice w średniej masie między szczepami i płciami (co jest szczególnie ważne dla organizmów zebranych w terenie), oraz 3) pozwala na obliczenie statystycznie rygorystycznej mediany dawek śmiertelnych (LD₅₀), które są niezbędne do porównań współczynników oporności – alternatywnego podejścia do nadzoru w stosunku do śmiertelności po podaniu dawki diagnostycznej, które jest również stosowane do nadzoru nad opornością na larwobójcze. Test ten będzie narzędziem uzupełniającym do dokładnego fenotypowania populacji komarów i, jak pokazano na przykładzie muszek owocowych, można go łatwo przystosować do stosowania z innymi owadami. Twierdzimy, że ten test pomoże wypełnić lukę między genotypową i fenotypową odpornością na insektycydy u wielu gatunków owadów.

Wprowadzenie

Komary są odpowiedzialne za ponad 700 000 zgonów rocznie z powodu chorób, które przenoszą na ludzi, przy czym ponad połowa tych zgonów jest spowodowana samą malarią¹. Główną metodą zapobiegania przenoszeniu malarii i innych chorób przenoszonych przez wektory jest stosowanie insektycydów, często w postaci długotrwałych siatek owadobójczych lub oprysków resztkowych w pomieszczeniach². Jednak odporność na insektycydy jest szeroko rozpowszechniona wśród komarów i innych wektorów owadów, a także szkodników rolniczych^3,4. Aby skutecznie radzić sobie z odpornością, nadzór ma kluczowe znaczenie⁵. W tym celu potrzebne są bardzo dokładne i wysokoprzepustowe metody wykrywania odporności. Obecnie najbardziej rozpowszechnionymi narzędziami do monitorowania odporności komarów na insektycydy są test probówkowy WHO⁶ oraz test biologiczny CDC w butelce⁷. W przypadku muszek owocowych metoda aplikacji kontaktu resztkowego (podobna do testu biologicznego butelki CDC) jest powszechnie stosowanym testem biologicznym insektycydów^8,9,10. Jednak zmienność danych z tych metod jest zazwyczaj wysoka, a pomiary tego samego laboratoryjnego szczepu komara wahają się od ~ 20-70% śmiertelności w testach butelkowych CDC i 0-50% w testach probówkowych WHO po wystawieniu na dawki subletalne ¹¹. Taka zmienność jest zaskakująca, ponieważ oczekuje się, że ograniczona zmienność genetyczna w większości szczepów laboratoryjnych doprowadzi do ograniczonej zmienności wrażliwości na insektycydy w populacji. Niemniej jednak nadal obserwuje się duży poziom zmienności w wynikach testów biologicznych.

Potencjalne źródła tej zmienności mogą wynikać z niejednorodnej ekspozycji na insektycydy między próbkami w teście biologicznym z powodu pośredniej ekspozycji na insektycydy przez powierzchnię, niejednorodnych skutków środowiskowych, normalnej zmienności biologicznej między osobnikami o tym samym genotypie oraz zmienności masy próbek tej samej populacji¹². Rzadziej stosowaną metodą o większej powtarzalności jest test biologiczny do stosowania miejscowego. W tym teście środek owadobójczy jest bezpośrednio nakładany na każdy insect^13,14, usuwając czynnik niejednorodnej ekspozycji różnych próbek w ramach tego samego testu. Jednak ze względu na powolny przepływ tej metody, nie jest ona rutynowo stosowana jako narzędzie do monitorowania wrażliwości na insektycydy dla populacji komarów. W artykule przedstawiono zmodyfikowany protokół testu biologicznego do stosowania miejscowego, który pozwala na ekspozycję o wyższej przepustowości, jednocześnie korygując zmiany masy owadów, parametr korelujący ze zmianami podatności na insektycydy¹². Zmniejszenie hałasu i związanych z masą zmian w danych dotyczących śmiertelności spowodowanych zmiennym narażeniem na insektycydy pozwoliłoby na dokładniejszy nadzór nad odpornością techniczną^11,15. Takie dane można wykorzystać do dokładniejszego powiązania oporności fenotypowej z markerami genetycznymi, parametrami dopasowania i/lub kompetencjami wektorowymi. Ponadto pokazujemy, w jaki sposób ten test można łatwo dostosować do innych gatunków owadów, stosując test biologiczny do stosowania miejscowego na muszkach owocowych, mniejszych gatunkach owadów.

Głównym ograniczeniem wyżej wymienionych zastosowań kontaktu resztkowego jest to, że ekspozycja na insektycydy może się różnić w zależności od próbki w ramach tego samego testu. W przypadku testów biologicznych CDC w butelkach i metody kontaktowej narażenie na insektycydy może się różnić w zależności od powtórzeń tego samego testu. Owady są wystawione na działanie środka owadobójczego, który jest rozprowadzany po wewnętrznej stronie szklanej butelki (metoda biologiczna i kontaktowa CDC) lub na impregnowanych papierach (test probówkowy WHO). Stężenie insektycydu na obu powierzchniach (szkle i papierze) jest znane i z góry określone na podstawie badań przesiewowych różnych gatunków o znanych genotypach. Jednak ilość, która może zostać potencjalnie wchłonięta przez owada, może się znacznie różnić w zależności od użytej powierzchni, składników mieszaniny insektycydów oraz tego, jak jednorodnie środek owadobójczy jest rozprowadzany na materiale powierzchniowym^16,17. W teście biologicznym CDC powłoka owadobójcza po wewnętrznej stronie butelki zależy od procedur zastosowanych przez każde laboratorium i użytkownika. W teście probówkowym WHO bibułki nasączone środkami owadobójczymi są produkowane centralnie, a zatem najprawdopodobniej są dość jednorodne we wszystkich laboratoriach. Jednak w teście probówkowym WHO rurka ekspozycyjna pozwala próbkom wylądować i spocząć na metalowej siatce, która nie jest narażona na działanie środków owadobójczych, co prowadzi do potencjalnej niejednorodnej ekspozycji na insektycydy wśród próbek w każdym teście. Rzeczywista ilość środka owadobójczego pobranego i wchłoniętego przez próbki za pomocą każdej metody wymaga dalszego zbadania¹⁸.

Dodatkowo, test biologiczny z butelki CDC, test probówkowy WHO i metoda kontaktowa są najczęściej używane jako testy progowe testujące tylko jedno z góry określone stężenie insektycydu. Takie podejście może dokładnie wykryć obecność oporności i jest cenne dla nadzoru oporności (zwłaszcza gdy oporność się rozprzestrzenia). Jednak testy progowe nie mogą określić ilościowo siły oporności, co może być bardziej predykcyjne dla skuteczności narzędzi interwencyjnych. Jeśli w tych metodach stosuje się wiele stężeń insektycydów, można je wykorzystać jako testy intensywności. Testy intensywności dla testu biologicznego w butelce CDC i testu probówkowego WHO zostały wprowadzone poprzez testowanie 5 i 10 razy wcześniej ustalonych dawek dyskryminujących, aby wypełnić tę lukę w nadzorze^6,19. Zapewniając większą zdolność do różnicowania między opornymi populacjami, 3-5 (z góry określonych) dawek zapewnia ograniczoną rozdzielczość do obliczenia stężeń śmiertelnych. Dodatkowo w takich testach wykorzystuje się komary o różnych rozmiarach. Jednak masa jest ważna do zmierzenia, ponieważ większe próbki mogą wymagać większej dawki do zabicia, ponieważ efektywna dawka na jednostkę masy będzie znacznie niższa niż w przypadku mniejszego organizmu¹². Obliczenie zrelatywizowanej dawki śmiertelnej (ilość środka owadobójczego na masę owada) byłoby bardziej użytecznym wskaźnikiem niż bardziej powszechne stężenie śmiertelne (np. ilość środka owadobójczego na powierzchnię), ponieważ uwzględnia zmienność masy owadów między płciami, populacjami i genotypami. Takie dane pomogłyby wypełnić lukę między odpornością genotypową i fenotypową w laboratorium i w terenie, a także mogłyby zapewnić łatwy sposób obliczania wymaganego stężenia aplikacyjnego w celu leczenia populacji owadów o znanej średniej masie.

Użycie masowo zrelatywizowanych dawek śmiertelnych, które zabijają 50% okazów (LD₅₀) zawiera również kilka innych korzyści. Ocena toksyczności określonego związku w mg/kg (= ng/mg) jest standardem w toksykologii ludzkiej i weterynaryjnej¹⁴, a wartości LD₅₀ znajdują się w kartach charakterystyki materiału. Dawki śmiertelne pozwalają również na bezpośrednie porównanie toksyczności między różnymi substancjami chemicznymi w stosunku do danego gatunku lub tą samą substancją chemiczną w stosunku do różnych gatunków²⁰, a także na ocenę wysokiej jakości nowych insektycydów i chemikaliów¹³. Ponadto LD₅₀ może zapewnić bardziej znaczące i dokładne współczynniki oporności niż te uzyskane na podstawie wyników śmiertelności po podaniu diagnostycznym, co może skutkować przeszacowaniem poziomu oporności występującej w populacji. W związku z tym test ten byłby odpowiedni dla rutynowych programów nadzoru, zapewniając bardziej rygorystyczne monitorowanie oporności w oparciu o masowo relatywizowane dawki śmiertelne pochodzące z większej liczby próbek niż jest to zalecane dla innych testów biologicznych²¹.

Metoda miejscowego stosowania została wykorzystana w nadzorze nad wrażliwością komarów i much na insektycydy jako alternatywa dla standardowych testów biologicznych wrażliwości na insektycydy, gdy odporność jest już znana lub podejrzewana^22,23, a także do nadzoru nad niektórymi szkodnikami²⁴ w celu dokładniejszej oceny profili odporności i wewnętrznej toksyczności insektycydów²¹. W testach biologicznych do stosowania miejscowego insektycyd nakłada się na każdy organizm, co powoduje minimalną różnicę w ekspozycji na insektycydy. W artykule przedstawiono nieco zmodyfikowaną i ulepszoną metodę, która pozwala na zastosowanie środków owadobójczych do dużej liczby owadów w krótkim czasie, przy jednoczesnej kontroli masy owadów²². Ta metoda o wyższej przepustowości i dobrym poziomie odtwarzalności może być użytecznym dodatkowym narzędziem do rutynowego monitorowania wrażliwości na insektycydy.

Protokół

UWAGA: Insektycydy mogą powodować zagrożenia dla ludzi, zwierząt i środowiska²⁵. Zdecydowanie zaleca się ostrożność, szkolenie i środki ochrony osobistej. Należy postępować zgodnie z kartami charakterystyki substancji niebezpiecznych dla wszystkich stosowanych środków owadobójczych i rozpuszczalników.

1. Próbki tylne

1. Tylne 3-5-dniowe dorosłe komary.
   UWAGA: Poniższy protokół odzwierciedla warunki hodowli Aedes aegypti, ściśle przestrzegając wytycznych Organizacji Narodów Zjednoczonych ds. Wyżywienia i Rolnictwa²⁶.
   1. Tylne komary we wszystkich stadiach życia w temperaturze 27 ± 1 °C i wilgotności względnej 75 ± 5% przy 12:12 h cykli światła i ciemności.
   2. Wykluwaj jaja komarów, zanurzając je w wodzie dejonizowanej i dodając drożdże²⁶, lub umieść zanurzone jaja w komorze próżniowej na 30 min.
      UWAGA: Obie metody zmniejszają zawartość tlenu w wodzie i zwiększają hatching²⁷.
   3. Podawaj nowo wyklute larwy pokarmem dla ryb (lub równoważną dietą, taką jak mielona karma dla kotów) w tacach i utrzymuj gęstość larw tak samo, jak to możliwe między tacami, ponieważ gęstość larw wpływa na rozwój¹² (np. 200-250 larw na tacę zawierającą łącznie 1,5 l wody).
   4. Karm larwy co drugi dzień, aż osiągną stadium poczwarki (około 7-10 dni), zwiększając ilość pokarmu w razie potrzeby.
      UWAGA: Przy zbyt małym karmieniu wzrost larw zostanie zahamowany, a larwy mogą zjadać się nawzajem. Przy zbyt dużym nakarmieniu larwy mogą umrzeć, powodując zanieczyszczenie wody.
   5. Gdy poczwarki się rozwiną, przenoś je codziennie do miski z wodą w klatkach dla dorosłych komarów i podawaj 10% roztwór sacharozy ad libitum.
   6. Zapisz pierwszy dzień pojawienia się dorosłego osobnika. Pozostałe poczwarki należy usunąć z klatki 2 dni po rozpoczęciu wzejścia.
      UWAGA: Samce komarów pojawiają się szybciej. Zwróć uwagę na pojawienie się samców i samic osobno i upewnij się, że wystarczająca liczba samców i samic jest dostępna dla każdego testu.
   7. Odczekaj 3 dni po usunięciu poczwarek, aby uzyskać 3-5-dniowe komary do testów.
2. Muszki owocowe z tyłu (luźno zgodne z protokołami Uniwersytetu w Zurychu²⁸).
   1. Tylne szczepy Drosophila w butelkach magazynowych w temperaturze 23 ± 1 °C i wilgotności względnej 60 ± 5% przy 12:12 h cykli światła i ciemności.
      UWAGA: Butelki bulionowe Drosophila powinny zawierać 75 ml standardowego podłoża muchowego, które najpierw wlewa się w postaci płynu na dno butelek, a następnie pozostawia do zestalenia się na noc.
   2. Przenoś kolonie do nowych butelek bulionowych ze świeżą żywnością co dwa tygodnie, aby zapobiec przeludnieniu i rozwojowi pleśni. Aby to zrobić, strącić muchy za pomocą ręcznego dozownika dwutlenku węgla (CO₂ ), przenieść znieczulone muchy na papier wagowy na opakowaniu z lodu lub stole chłodzącym i przeczesać muchy do świeżej butelki bulionowej za pomocą pędzla z cienką końcówką. Pamiętaj, aby podczas tego procesu trzymać butelki na bokach, aby muchy nie wpadły do jedzenia i nie utonęły.

2. Przygotuj preparaty owadobójcze przy użyciu metody grawimetrycznej

1. Przygotować pierwszy roztwór podstawowy zgodnie z podejściem grawimetrycznym, używając wagi analitycznej z dokładnością do 0,1 mg w dygestoriach.
   UWAGA: Podejście grawimetryczne wykorzystuje masę do pomiaru ilości dodanego środka owadobójczego i rozpuszczalnika. Standardowa praktyka (podejście wolumetryczne) będzie wymagała wagi analitycznej do pomiaru ilości (stałego) środka owadobójczego dodanego podczas przygotowywania pierwszego roztworu podstawowego; Jednakże ilość dodanego rozpuszczalnika i wszystkie następujące po nim rozcieńczenia są mierzone wyłącznie objętościowo. Podejście grawimetryczne ma wyższy poziom dokładności i dlatego jest preferowane.
   1. Określić docelowe stężenie insektycydu i objętość docelową (zaleca się maksymalnie 10 ml w przypadku stosowania stożkowych probówek o pojemności 15 ml, aby zapobiec rozlaniu podczas przechowywania w zamrażarce) dla pierwszego roztworu podstawowego i obliczyć, ile aktywnego składnika owadobójczego (AI) należy dodać, używając Eq (1):
      (1)
   2. Przygotuj probówkę do przechowywania (probówka stożkowa 15 ml zalecana dla większych objętości, probówki z nakrętką do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml zalecane dla objętości 1 ml lub mniejszej) i oznacz etykietą nazwę środka owadobójczego i rozpuszczalnika, stężenie docelowe i datę przygotowania. Umieść probówkę i pokrywkę na wadze w stojaku lub uchwycie i wytaruj wagę.
   3. Zważyć żądaną ilość stałego lub ciekłego środka owadobójczego AI określoną na podstawie kroku 2.1.1. (np. deltametryny użytej do reprezentatywnych danych) do probówki i zapisać masę.
   4. Wytaruj wagę i dodaj żądaną objętość rozpuszczalnika (odpowiadającą objętości docelowej) do probówki, natychmiast zamknij pokrywkę i zapisz masę. Zamknij pokrywę probówki natychmiast po dodaniu rozpuszczalnika (zastosowano tutaj aceton), aby uniknąć parowania i wymieszać roztwór.
   5. Zapisz temperaturę w pomieszczeniu. Niektóre rozpuszczalniki, takie jak aceton, mogą powodować znaczne zmiany objętości (a co za tym idzie gęstości) w zależności od temperatury.
   6. W przypadku natychmiastowego przechowywania owiń wieczko probówki w parafilm (w celu zmniejszenia parowania), umieść ją w stojaku/uchwycie na probówki (aby utrzymać ją w pozycji pionowej i zapobiec wyciekom), przykryj folią (aby zapobiec ekspozycji na promieniowanie UV), umieść ją w zamykanej plastikowej torbie (aby zmniejszyć parowanie) i umieść torbę w zamrażarce o temperaturze -20 °C. Jeśli nie jest przechowywany natychmiast, upewnij się, że pokrywka jest zabezpieczona i przykryj folią lub pojemnikiem zabezpieczonym przed światłem.
   7. Obliczyć rzeczywiste stężenie roztworu podstawowego (mg/ml), dzieląc masę dodanego środka owadobójczego AI przez objętość dodanego rozpuszczalnika (i objętość dodanego środka owadobójczego, jeśli jest w postaci płynnej). Aby obliczyć objętość dodanego rozpuszczalnika (lub płynnego środka owadobójczego), podziel dodaną masę przez znaną gęstość, która jest odpowiednia dla zarejestrowanej temperatury.
   8. Obliczyć gęstość (g/ml) roztworu podstawowego, dzieląc całkowitą masę dodanego środka (insektycyd i rozpuszczalnik) przez całkowitą objętość dodanego (rozpuszczalnika i insektycydu, jeżeli jest w postaci płynnej). Patrz krok 2.1.7, aby zapoznać się z przeliczeniem masy cieczy na objętość.
2. Początkowy roztwór podstawowy należy rozcieńczyć seryjnie przez 10% rozcieńczenia. W razie potrzeby należy użyć tych seryjnych rozcieńczeń do stworzenia początkowej krzywej dawka-odpowiedź w celu określenia docelowego zakresu stężeń insektycydów dla testu biologicznego.
   1. Obliczyć objętość roztworu podstawowego insektycydu i rozpuszczalnika, który należy dodać do każdej probówki (np. 1 ml roztworu podstawowego insektycydu rozcieńczonego w 9 ml rozpuszczalnika w celu rozcieńczenia 10% poprzedniego stężenia w 10 ml).
   2. Wirować roztwór podstawowy przez 10 sekund. Ścierać wstępnie oznaczoną pierwszą probówkę rozcieńczającą na skali. Dodać wymaganą objętość roztworu podstawowego do pierwszej probówki z rozcieńczaniem za pomocą pipety. Natychmiast zamknąć pokrywę obu probówek i zapisać masę w pierwszej probówce do rozcieńczania.
   3. Ponownie wytarować pierwszą probówkę rozcieńczania i dodać wymaganą objętość rozpuszczalnika. Natychmiast zamknij pokrywkę, zapisz masę dodanego rozpuszczalnika i wiruj pierwsze rozcieńczenie przez 10 sekund.
   4. Powtórzyć kroki 2.2.2 i 2.2.3 dla pozostałych rozcieńczeń.
   5. Przechowywać wszystkie rozcieńczenia w sposób opisany powyżej w kroku 2.1.6.
   6. Obliczyć rzeczywiste stężenia rozcieńczeń, postępując zgodnie z krokiem 2.1.7.
   7. Obliczyć gęstość każdego rozcieńczenia środka owadobójczego, dzieląc całkowitą masę dodanego środka owadobójczego (roztwór insektycydu i rozpuszczalnik) przez całkowitą objętość dodanego środka owadobójczego (roztwór insektycydu i rozpuszczalnik). Dla każdego seryjnego rozcieńczenia należy użyć gęstości poprzedniego rozcieńczenia insektycydu podstawowego, aby obliczyć gęstość nowego rozcieńczenia zgodnie z Eq (2):
      (2)
3. Opcjonalnie: Tworzyć rozcieńczenia insektycydów z mniejszymi przyrostami przez seryjne rozcieńczanie.
   1. Wybrać stężenia i objętości każdego nowego roztworu do wykonania za pomocą krzywej dawka-odpowiedź początkowych rozcieńczeń seryjnych, poprzednich prób lub opublikowanej literatury.
      UWAGA: Wybrane stężenia powinny skutkować zakresem śmiertelności 0-100%, przy czym minimum trzy stężenia z tego zakresu pozwalają na analizę Probit.
   2. Użyć seryjnych rozcieńczeń jako roztworów podstawowych do każdego nowego rozcieńczenia i postępować zgodnie z krokiem 2.2, aby utworzyć nowe rozcieńczenia między 10-krotnymi rozcieńczeniami.
4. Opcjonalnie: Podwielokrotnić roztwór środka owadobójczego. W przypadku sporządzania większych objętości roztworów insektycydów, należy podzielić roztwory na probówki z nakrętką o pojemności 1,5 ml, aby uniknąć zanieczyszczenia, parowania i degradacji roztworów podstawowych w wyniku częstego obchodzenia się z nimi i wystawienia na działanie światła.
   1. Roztwory należy podzielić na porcje, zaczynając od najniższego stężenia i dążyć do najwyższego stężenia, aby zmniejszyć potencjalne zanieczyszczenie. Wymieszać każdy roztwór podstawowy, wirując przez 10 sekund, a następnie otworzyć i odpipetować żądaną objętość (np. 0,5 ml) do wstępnie oznaczonej probówki z nakrętką.
   2. Porcje należy przechowywać w odpornym na światło pojemniku w zamrażarce o temperaturze -20 °C.
      UWAGA: Zaleca się regularną (comiesięczną) wymianę podwielokrotności na małe nowe podwielokrotności pobrane bezpośrednio z podstawowych rozcieńczeń pestycydów. Ograniczy to możliwość przeniesienia zanieczyszczenia do innych eksperymentów lub zmian spowodowanych parowaniem lub degradacją UV podczas użytkowania próbek na stanowisku laboratoryjnym. W tym miejscu protokół może zostać wstrzymany i wznowiony nawet po latach, o ile roztwory insektycydów są odpowiednio przechowywane (patrz krok 2.1.6) i przechowywane w zamrażarce o temperaturze -20 °C.
5. Użyj markera permanentnego, aby oznaczyć łąkotkę przed przechowywaniem, aby monitorować parowanie rozpuszczalnika. Podczas usuwania roztworu insektycydu w celu uzyskania podwielokrotności, należy oznaczyć menisk za każdym razem, gdy roztwór jest usuwany.

3. Przygotuj miejscowe miejsce do przeprowadzania testów biologicznych

UWAGA: Zaleca się pracę w namiocie do walki z owadami dla łatwiejszego wyłapywania uciekających komarów lub much. Patrz rysunek uzupełniający S1, aby zobaczyć zdjęcia namiotu do obchodzenia się z owadami.

1. Wyjmij potrzebne roztwory insektycydów z zamrażarki, natychmiast zwiruj i umieść je w odpornym na światło pojemniku w temperaturze pokojowej, aby insektycydy mogły ogrzać się do temperatury pokojowej przed użyciem.
   UWAGA: Insektycydy AI mogą oddzielać się od rozpuszczalnika w niższych temperaturach. Dodatkowo objętość acetonu zmienia się wraz z temperaturą, co może zmienić zastosowaną dawkę środka owadobójczego. Mieszanie roztworów i pozostawienie ich do ogrzania do temperatury pokojowej pomaga zapewnić spójność podczas stosowania roztworów insektycydów.
2. Określ wszystkie potrzebne narzędzia i materiały do testu do stosowania miejscowego w namiocie do obchodzenia się z owadami, jak podano w tabeli materiałów.
3. Oczyścić cylinder strzykawki i igłę acetonem klasy analitycznej, wykonując 5 płukań na każdą porcję acetonu. Uzupełnij to 5 oddzielnymi porcjami, co daje w sumie 25 prań. Patrz rysunek uzupełniający S2 dla części strzykawki i pipety powtarzalnej.
   1. Ustawić 5 probówek do mikrowirówek po 0,5 ml acetonu każda.
   2. Napełnić cylinder strzykawki 0,025 ml acetonu z pierwszej probówki, a następnie wylać aceton do pojemnika na odpady, szybko naciskając tłok. Powtórz jeszcze cztery razy, aby zakończyć w sumie pięć płukań acetonem z tej samej podwielokrotności acetonu. Następnie całkowicie napełnić cylinder strzykawki powietrzem i usunąć powietrze oraz ewentualne resztki acetonu do pojemnika na odpady. Powtórz jeszcze dwa razy, aby zakończyć trzy "prania" powietrzem.
   3. Powtórzyć krok 3.3.2 dla pozostałych 4 probówek acetonu.
   4. Utworzyć kieszeń powietrzną w cylindrze między tłokiem strzykawki a górną częścią igły, pociągając tłok lekko do góry do cylindra (~5 mm).
      UWAGA: Ta kieszeń powietrzna chroni tłok przed kontaktem z roztworami insektycydów i zmniejsza przenoszenie insektycydów.
   5. Odstawić strzykawkę na bok do momentu, gdy będzie gotowa do stosowania miejscowego.
4. Utwórz klucz zawierający dawki, które mają zostać zastosowane, i przypisz losowe identyfikatory zgodnie z generatorami liczb losowych lub liter (patrz plik uzupełniający 1).
5. Oznacz plastikowe kubki losowym identyfikatorem do oceny śmiertelności na ślepo.
   UWAGA: W razie potrzeby protokół można wstrzymać w tym miejscu i ponownie uruchomić w późniejszym dniu i o innej godzinie. Jeśli podczas przerwy minie więcej niż kilka godzin, zaleca się powtórzenie kroku 3.3, aby upewnić się, że strzykawka jest czysta, i umieszczenie roztworów insektycydów z powrotem w zamrażarce do około godziny przed dozowaniem owadów, a następnie powtórzenie kroku 3.1.

4. Przygotuj próbki do miejscowego testu biologicznego. Zobacz Rysunek 1, aby zapoznać się z przeglądem procedur

1. Sortuj i waż komary
   1. Za pomocą aspiratora zasilanego ssaniem z inhalacji odessać pożądaną liczbę 3-5-dniowych dorosłych komarów potrzebnych do testu, w tym nadmiar w celu uwzględnienia uszkodzonych osobników. Przenieś komary do stożkowej rurki (do 100 komarów w tubce), umieszczając końcówkę aspiratora w tubie z bawełną owiniętą wokół końcówki, a następnie delikatnie wydychaj i postukaj w aspirator. Użyj bawełny, aby zatkać rurkę po wyjęciu końcówki aspiratora, a następnie nakręć pokrywką. Unikaj napełniania aspiratora i rurek zbyt dużą liczbą komarów jednocześnie, ponieważ powoduje to dodatkowy stres u komarów i może spowodować śmierć.
   2. Na krótko powalić komary w probówkach, umieszczając je na co najmniej 10 minut w temperaturze 4 °C lub zakopując je pod lodem w tacce na lód.
      UWAGA: Komary mogą być trzymane w temperaturze 2 °C przez kilka godzin przy minimalnej śmiertelności²⁹; Najlepiej jednak zminimalizować czas, przez jaki komary przebywają na lodzie, aby zmniejszyć potencjalne negatywne skutki.
   3. Przenieś powalone komary do namiotu do walki z owadami i ostrożnie wysyp komary na plastikową tackę (np. szalkę Petriego) umieszczoną na lodzie. Wlej tylko około 50 komarów na raz, aby upewnić się, że każdy z nich dotknie chłodnej tacy pod nim i pozostanie powalony.
   4. Posortuj komary według płci, delikatnie podnosząc je za nogę (lub skrzydła) kleszczami i umieść każdą płeć w osobnym kubku. Policz liczbę komarów każdej płci podczas sortowania i zatrzymaj się, gdy zostanie osiągnięta żądana liczba. Podczas sortowania usuń wszelkie komary, które są zranione (np. brakuje nóg) lub są bardzo duże (np. nienormalnie powiększony brzuch) lub małe (łatwe do odróżnienia gołym okiem jako mniejsze niż średni rozmiar komara w tej populacji).
      UWAGA: Obchodzenie się z komarami przez przydatki zmniejsza uszkodzenia strukturalne ich miękkich ciał pierwotnych (np. brzucha).
   5. Zapisać wagę każdej filiżanki komarów za pomocą wagi analitycznej z dokładnością do 0,1 mg.
      1. Umieść pustą filiżankę z szalką Petriego jako pokrywkę na wadze i wytaruj wagę. Wlej komary do pojemnika, umieść pokrywkę na górze i umieść pojemnik na wadze.
      2. Zapisać łączną masę i liczbę próbek na arkuszu punktacji (zob. plik uzupełniający 2). Natychmiast umieść kubek z próbkami z powrotem na lodzie, aby je unieruchomić.
      3. Powtarzać kroki 4.1.5.1-4.1.5.2, aż wszystkie kubki z próbkami zostaną zważone.
   6. Przygotowane komary podziel na grupy po 20-25 sztuk w osobnych kubkach umieszczonych na lodzie oznaczonym losowymi identyfikatorami. Podczas przenoszenia komarów staraj się zmniejszyć stres i uszkodzenia fizyczne spowodowane przez kleszcze. Najlepiej zbierać komary za pomocą kleszczy tylko 1-2 razy: raz do sortowania/ważenia i ewentualnie drugi raz do przeniesienia do kubków eksperymentalnych.
      UWAGA: Idealna liczba komarów na filiżankę to 20-25, co wystarcza do powtórzenia, jest rozsądne do oceny śmiertelności i nie powinno powodować stresu/śmierci w kubku wywołanym gęstością.
2. Sortuj i waż muszki owocówki
   1. Znieczulić muchy za pomocą CO₂ przez 7 s.
      UWAGA: Jeśli muchy są wystawione na działanie CO₂ przez więcej niż 7 sekund, mogą mieć problemy z czołganiem się i lataniem po przebudzeniu³⁰.
   2. Wlej muchy na worek z lodem zawinięty w papier stołowy i za pomocą pędzla z cienką końcówką oddziel i policz samce i samice.
   3. Za pomocą pędzla delikatnie podnieś wybrane muchy i umieść je w czystej, pustej butelce bulionowej. Wybierz równą liczbę samców i samic muszek owocowych (np. 15 samców i 15 samic) i oznacz butelki bulionowe nazwą szczepu i sumą muszek owocowych (np. Canton-S, 30 much).
      UWAGA: Ważne jest, aby mieć równą liczbę samic i samców muszek owocowych, ponieważ samce muszek owocowych mogą doświadczać zwiększonej agresji wobec siebie nawzajem po usunięciu ich sprzed samicy³¹. Dlatego, aby uniknąć śmiertelności lub obrażeń spowodowanych przez środki nieowadobójcze, najlepiej jest mieć równą liczbę samców i samic (lub całkowicie pominąć samce muszek owocowych).
   4. Zapisać wagę każdej butelki muszek owocowych za pomocą wagi analitycznej.
      1. Umieść pustą fiolkę (oznaczoną losowym identyfikatorem, patrz krok 3.4) z szalką Petriego jako pokrywkę na wadze i wytaruj wagę.
         UWAGA: Szklane fiolki są zalecane do stosowania z muszkami owocowymi, ponieważ znacznie zmniejszają elektryzowanie się.
      2. Znieczulij butelkę muszek owocowych odpowiadającą losowemu identyfikatorowi fiolki za pomocą CO₂ przez 7 sekund.
      3. Wylej muszki owocówki na papier wagowy i użyj papieru jako lejka do wprowadzenia much do fiolki. Umieść pokrywkę szalki Petriego na fiolce z muszkami owocowymi i umieść ją na wadze.
      4. Zapisać łączną masę i liczbę próbek na arkuszu wyników, a następnie natychmiast umieścić fiolkę z muszkami owocowymi w tacce z lodem, z pokrywką nadal na górze, aby zapobiec ucieczce much
      .
      5. Powtórzyć kroki 4.2.4.1-4.2.4.4 dla każdej butelki muszek owocówek.
3. Po wykonaniu powyższych kroków natychmiast przejdź do następnej sekcji.

5. Próbki dawek

1. Załadować do strzykawki odpowiednie stężenie środka owadobójczego. Zacznij od najmniej skoncentrowanej dawki i dąż do najbardziej skoncentrowanej dawki dla każdej grupy organizmów. Aby zapobiec marnotrawstwu, należy załadować strzykawkę tylko potrzebną objętością środka owadobójczego oraz zalecanymi dodatkowymi 2 μl.
2. Przesyp próbki na papier wagowy umieszczony na tacy na lodzie. Oddziel próbki, które znajdują się blisko siebie, za pomocą czystego, wolnego od środków owadobójczych pędzla lub wacika, aby umożliwić łatwy dostęp do każdej próbki w celu dozowania. W przypadku komarów użyj pędzla również, aby upewnić się, że każdy okaz leży na grzbiecie, a jego brzuszna powierzchnia jest skierowana do góry.
3. Za pomocą strzykawki nanieść jedną kroplę roztworu środka owadobójczego (lub acetonu do kontroli) na brzuszną część klatki piersiowej i brzucha w przypadku komarów oraz na grzbiet w przypadku muszek owocowych. Zastosuj kroplę 0,2 μl (która wymaga strzykawki 10 μl) w przypadku mniejszych owadów, takich jak muszki owocowe, i kroplę 0,5 μl (która wymaga strzykawki 25 μl) w przypadku komarów.
   UWAGA: Wrażliwość na środki owadobójcze nie różni się znacząco między głównymi częściami ciała (takimi jak głowa, klatka piersiowa i brzuch) w porównaniu z przydatkami (takimi jak skrzydła, nogi lub trąbka)³². W związku z tym miejsce podania nie musi być dokładne, o ile kropla dawki jest podawana do pierwotnego ciała. Brzuszna część klatki piersiowej i brzucha są wybierane dla komarów, ponieważ często leżą na stronie grzbietowej po powaleniu, podczas gdy grzbiet jest wybierany dla muszek owocowych, ponieważ często leżą na stronie brzusznej po powaleniu. Ta zmniejszona specyficzność miejsca aplikacji pomaga zwiększyć przepustowość tej metody.
4. Natychmiast wlej próbki z powrotem do oznaczonego plastikowego kubka i przykryj kubek siatką i gumką. Umieść kubek na tacy do przechowywania i zanotuj na kubku wszystkie okazy, które zostały zabite, uszkodzone lub uciekły w tym procesie (aby wykluczyć je z końcowej liczby próbek w tym kubku). W przypadku pierwszej filiżanki należy zanotować czas zakończenia dawkowania.
5. Wymień papier (papiery) wagowy(-e), na którym umieszcza się próbki, aby uniknąć zanieczyszczenia insektycydami między dawkami.
6. Powtarzaj dozowanie dla każdej filiżanki, aż wszystkie próbki zostaną dozowane z odpowiednimi stężeniami insektycydów i zapisz czas zakończenia, kiedy wszystkie próbki zostały dozowane.
7. Dostarczyć 10% roztwór sacharozy do każdej filiżanki za pomocą nasączonego wacika i odstawić kubki na bok do czasu oceny śmiertelności następnego dnia. Przechowuj komary w temperaturze 27 ± 1 °C przy wilgotności względnej 75 ± 5%⁵, a muszki owocowe w temperaturze 23 ± 1 °C przy wilgotności względnej 60 ± 5%.
   UWAGA: Zachowaj ostrożność podczas ściskania wacików, aby uniknąć przesycenia lub niedoświetlenia. Waciki powinny być wilgotne, ale nie kapiące. Kapiąca woda z cukrem w kubku może prowadzić do śmiertelności próbek, a tym samym wpływać na ocenę śmiertelności środka owadobójczego.

6. Oceń śmiertelność

1. Zapisać śmiertelność próbki po 24 godzinach od rozpoczęcia ekspozycji na środki owadobójcze. Klasyfikuj komary jako żywe, jeśli potrafią latać i utrzymywać się w pozycji pionowej; jako martwe, jeśli są unieruchomione lub ataksyjne (niezdolne do stania lub startu do lotu), zgodnie z opisem WHO⁶. Postępuj zgodnie z tą samą oceną śmiertelności muszek owocowych^8,33.
   UWAGA: Aby ocenić śmiertelność opóźnioną, śmiertelność można dodatkowo ocenić po 48 i 72 godzinach przy codziennych podmianach wody z cukrem.
2. Po stwierdzeniu śmiertelności należy umieścić wszystkie kubki z próbkami w zamkniętej torbie w zamrażarce na co najmniej 1 godzinę, aby upewnić się, że wszystkie próbki są martwe przed usunięciem lub późniejszym użyciem (np. analiza molekularna lub chemiczna).

7. Wykonaj replikacje

1. Powtórz kroki 3-6 na nowym zestawie próbek, uważając, aby wykonywać powtórzenia o tej samej porze każdego dnia, ponieważ podatność na insektycydy może się zmieniać w zależności od pory dnia³⁴.
2. Zapewnić co najmniej 3 powtórzenia dla każdego stężenia w celu dokładnego oszacowania dawki śmiertelnej, która zabija 50% próbek (LD₅₀). Uwzględnij więcej powtórzeń, jeśli zaobserwuje się wysoki poziom zmienności.
3. Zakończ analizę po zebraniu wszystkich danych.

8. Przeanalizuj wyniki

1. Zapisz dane w programie arkusza kalkulacyjnego i użyj losowego klucza identyfikatora, aby zdemaskować dane (krok 3.4). Zapisz dane jako plik tekstowy (patrz przykładowe dane w pliku uzupełniającym 3) do analizy w programie statystycznym R³⁵ (patrz przykładowy kod R w pliku uzupełniającym 4) lub innym wybranym oprogramowaniu³⁶.
2. W oprogramowaniu wykonaj następującą analizę. Zobacz plik uzupełniający 4, aby zapoznać się z przykładowym kodem języka R.
   1. Obliczyć dawkę insektycydu (ng) na masę próbki (mg) zgodnie z równaniem (3) poniżej:
      (3)
   2. Oblicz śmiertelność i zastosuj formułę Abbotta³⁷, aby skorygować śmiertelność w stosunku do śmiertelności obserwowanej w każdej grupie kontrolnej³⁷. Alternatywnie, użyj wzoru Schneidera-Orelliego (1947), aby skorygować śmiertelność³⁸. W przypadku dowolnej formuły zastosuj poprawkę do wszystkich danych bez względu na śmiertelność w każdej kontroli, jak opisano wcześniej³⁷ i implemented³⁹, chyba że dane kontrolne są niezwykle wysokie (patrz dyskusja poniżej).
      UWAGA: Formuła Abbotta i równoważne alternatywy, takie jak formuła Schneidera-Orelliego, dostosowują wartości śmiertelności proporcjonalnie do stopnia śmiertelności niezaobserwowanej w grupie kontrolnej i nie spowodują zmniejszenia śmiertelności w przypadku bańek, które miały 100% śmiertelność. Aby uzyskać więcej informacji, zobacz cytowane odwołania dla tych formuł.
   3. Przekształć skorygowane dane dotyczące śmiertelności w wartości probit (jednostka prawdopodobieństwa) ⁴⁰ i wykonaj regresję liniową między dawką insektycydu a przekształconymi danymi dotyczącymi śmiertelności. Użyj testu chi-kwadrat, aby ocenić dopasowanie modelu liniowego (modeli) liniowego.
      UWAGA: Wartości śmiertelności 0 (0% śmiertelności) lub 1 (100% śmiertelności) są usuwane z danych przed zakończeniem transformacji probitu. Jest to konieczne ze względu na charakter transformacji probitowej. W związku z tym dane przedstawione na wykresie nie będą zawierać kontroli dodatnich lub ujemnych ani żadnych innych danych, które skutkowały śmiertelnością na poziomie 0% lub 100% (po zastosowaniu poprawki Abbotta).
   4. Oblicz₅₀ i 95% przedziały ufności (CI) LD dla szczepu, populacji i/lub płci próbki, postępując zgodnie z wcześniej opublikowanymi metodami^39,41,42.
   5. UWAGA: Jeśli 95% CI dwóch szczepów nie nakłada się na siebie, szczepy mają znacznie różne reakcje na dawkę.
   6. W stosownych przypadkach należy obliczyć współczynniki rezystancji (RR), dzieląc LD₅₀ odkształcenia będącego przedmiotem zainteresowania przez LD₅₀ odkształcenia odniesienia/kontrolnego.

Rysunek 1: Schemat protokołu testów do stosowania miejscowego. Protokół testu stosowania miejscowego rozpoczyna się od (A) sortowania próbek na lodzie, a następnie (B) ważenia próbek na wadze analitycznej, (C) dozowania próbek roztworem (roztworami) insektycydu oraz (D) 24-godzinnego okresu oczekiwania po ekspozycji na insektycyd z dostępem do 10% roztworu sacharozy ad libitum (za pomocą nasączonego wacika), a następnie ocena śmiertelności. Czerwone strzałki wskazują docelowe miejsce aplikacji środka owadobójczego dla komarów (po lewej) i muszek owocowych (po prawej). Zwróć uwagę, że obraz nie jest skalowany. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Wyniki

Te reprezentatywne wyniki obejmują dwa różne szczepy Ae. aegypti, Rockefellera (ROCK), oraz izolowany szczep terenowy z Florydy o znanych mutacjach odporności na knockdown F1534C i V1016I (genotyp IICC). Dodatkowo występuje Drosophila melanogaster (szczep Canton: S).

Rysunek 2 i Rysunek 3 ilustruje reakcję każdego organizmu na dawkę według szczepu i płci testowaną zgodnie z powyższym protokołem. Ponieważ nie zaobserwowano różnic między krzywymi dawka-odpowiedź samców i samic komarów w obrębie każdego szczepu (t = 1,70, p = 0,098 dla ROCK i t = 0,64, p = 0,527 dla IICC), dane od obu płci w obrębie każdego szczepu komara połączono. Masowo relatywizowany LD₅₀ dla ROCK i IICC wynosi odpowiednio 0,008 ng/mg (95% CI: 0-0,104) i 0,336 ng/mg (95% CI: 0,235-0,438). 95% CI tych wartości nie nakłada się na siebie, co wskazuje na istotnie różne reakcje szczepów na dawkę. RR szczepu IICC (w stosunku do szczepu ROCK) wynosi 41,7, co według WHO jest uważane za wysoce odporne⁵. Dla muszek owocowych Canton-S masowo relatywizowany LD₅₀ wynosi 0,213 ng / mg (95% CI: 0-0,490).

Rysunek 2: Reprezentatywne dane komarów za pomocą miejscowego testu biologicznego. Reprezentatywne dane dotyczące dawka-odpowiedź z testu biologicznego do stosowania miejscowego zgodnie z powyższym protokołem z wykorzystaniem deltametryny i komarów: (A) żeńskie szczepy Ae. aegypti ROCK (n = 880) i IICC (n = 550), (B) męskie szczepy Ae. aegypti ROCK (n = 880) i IICC (n = 569). Stężenia testowe deltametryny wahały się od 0,00075 ng/μL do 9,68705 ng/μL, a zastosowana dawka deltametryny (ng) na średnią masę komara (mg) znajduje odzwierciedlenie na osi x. Śmiertelność jest pokazana jako proporcja na osi y. linia przechodząca przez każdy klaster punktów danych reprezentuje regresję liniową specyficzną dla szczepu i płci. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Reprezentatywne dane muszek owocowych przy użyciu miejscowego testu biologicznego. Reprezentatywne dane dotyczące dawka-odpowiedź z testu biologicznego do stosowania miejscowego zgodnie z powyższym protokołem z użyciem deltametryny i muszek owocowych: szczep D. melanogaster Canton-S (n = 1014). Stężenia testowe deltametryny wahały się od 0,00499 do 5,02876 ng/μL, a zastosowana dawka deltametryny (ng) na średnią masę muszki owocowej (mg) znajduje odzwierciedlenie na osi x. Śmiertelność jest pokazana jako proporcja na osi y. linia reprezentuje regresję liniową. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek uzupełniający S1: Stołowy namiot do walki z owadami. Stołowy namiot do obsługi owadów służy do łatwiejszego chwytania uciekających komarów lub much podczas testu aplikacji miejscowej. Struktura jest zamknięta w A i otwarta w B. Konstrukcja ta została zbudowana z rury PVC i tkaniny o drobnych oczkach. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający S2: Jednostka strzykawki i aplikatora repeatera. Strzykawka i aplikator repeatera służący do dozowania owadów. Główne części to 1) igła, 2) cylinder strzykawki, 3) tłok, 4) repeater i 5) przycisk repeatera. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 1: Skrypt randomizacyjny: Skrypt randomizacji do tworzenia bezstronnych etykiet dla wszystkich filiżanek każdego eksperymentu. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 2: Arkusz oceny śmiertelności: Arkusz oceny śmiertelności wspomagający ocenę śmiertelności. Arkusz zawiera również miejsca, w których można zapisać wszystkie inne ważne informacje do zapisania, o których mowa w protokole, takie jak czas rozpoczęcia i zakończenia stosowania środka owadobójczego. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 3: Przykładowe dane dotyczące śmiertelności: Przykładowy plik danych użyty do stworzenia Rysunek 2. Opisy nagłówków kolumn są następujące: "id" = kod identyfikacyjny każdego punktu danych; "gatunek" = nazwa gatunku (np. Aedes aegypti); »insektycyd« = nazwa środka owadobójczego stosowanego miejscowo (np. Deltametryna); »szczep« = nazwa szczepu komara (np. ROCK); "data" = data rozpoczęcia aplikacji miejscowej; "seks" = seks komarów; "wiek" = wiek komarów (młody = 3-5 dni; stary = 4 tygodnie); "total.mosq" = całkowita liczba komarów ważonych w partii; »waga« = waga (mg) wszystkich komarów w partii; »stężenie« = stężenie środka owadobójczego (μg/ml); "strzykawka" = objętość kropli (ml) strzykawki; "dawka" = ilość aktywnego składnika owadobójczego zastosowanego na każdego komara (ng); "ogółem" = liczba komarów w każdym kubku; "martwy" = liczba martwych komarów w każdej filiżance. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 4: Kod analizy R: Przykładowy kod R, który może być użyty do zakończenia analizy Probit (zgodnie z opisem w kroku 8 protokołu). Reprezentatywne wyniki (dostępne za pośrednictwem uzupełniającego przykładowego pliku danych) mogą być używane z tym kodem języka R. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

W artykule przedstawiono dostosowany protokół do stosowania miejscowego u komarów i muszek owocowych. Procedurę tę można łatwo dostosować do stosowania w terenie i z innymi organizmami, ponieważ wymaga minimalnego specjalistycznego sprzętu. Poniżej omówiono krytyczne kroki tego protokołu, potencjalne modyfikacje, porady dotyczące rozwiązywania problemów, ograniczenia metody i znaczenie tej metody.

Krytyczne kroki w protokole: W protokole znajdują się trzy krytyczne kroki, które, jeśli zostaną wykonane nieprawidłowo, mogą drastycznie wpłynąć na wyniki testu biologicznego: dokładność stężenia insektycydów, knockdown próbki i ocena śmiertelności.

Dokładność stężenia insektycydów:
Niezwykle ważne jest, aby dysponować dokładnymi roztworami insektycydów w celu uzyskania powtarzalnych krzywych dawka-odpowiedź i znaczących wyników. Wolumetryczne podejście do przygotowania roztworu insektycydu jest bardziej powszechne w literaturze zarówno w przypadku testu biologicznego CDC w butelce⁷, jak i do stosowania miejscowego 13,14,43. Jednak opisane tutaj podejście grawimetryczne jest z natury dokładniejsze ze względu na uwzględnienie temperatury poprzez uwzględnienie gęstości (specyficznej dla temperatury), co prowadzi do dokładniejszego przygotowania preparatu.

Powalenie próbki:
Strącanie próbek jest kluczowym elementem tej metody i pozwala na dokładne podanie środka owadobójczego i pomiary masy. Jednak powalanie organizmów nieuchronnie wiąże się z ryzykiem stresu fizycznego i uszkodzeń, jak wykazano wcześniej³⁰. Dlatego należy zachować ostrożność i ostrożność podczas strącania próbek, aby upewnić się, że i) każda próbka jest powalana przez podobny czas, ii) długość powalania jest ograniczona do minimum oraz iii) metoda powalania jest spójna dla wszystkich próbek. Dodatkowo zaleca się przetestowanie metody knockdown oddzielnie, przed zastosowaniem insektycydu, aby upewnić się, że metoda jest skuteczna i nie wywołuje śmiertelności kontrolnej większej niż 10%. Początkowy test może potrwać dłużej dla niedoświadczonego użytkownika, co prowadzi do dłuższego czasu powalenia. Dlatego należy zachować ostrożność podczas interpretacji wyników pierwszych testów.

Ocena śmiertelności:
Ocena śmiertelności może być trudna, zwłaszcza gdy środek owadobójczy nie zabija całkowicie, a jedynie powala lub okalecza komara lub muchę. Dlatego ważne jest, aby zdawać sobie sprawę z tego, w jaki sposób insektycyd wpływa na organizm docelowy i przed rozpoczęciem mieć jasną definicję "martwych" (lub powalonych) organizmów. Ponadto zaleca się, aby ta sama osoba oceniła śmiertelność między dawkami i powtórzeniami w celu zmniejszenia zmienności.

Modyfikacje protokołu: Do tego protokołu można zastosować kilka modyfikacji opisanych poniżej, aby poprawić jego wszechstronność i dostępność.

Dostosowanie testu do mniejszych lub większych owadów:
W przypadku stosowania mniejszych lub większych próbek zaleca się stosowanie odpowiednio mniejszej lub większej objętości środka owadobójczego. Na przykład dostosowaliśmy protokół dotyczący komarów do muszek owocowych, zmniejszając dawkę 0,5 μl do dawki 0,2 μl. Upewnij się, że wybrano właściwy rozmiar strzykawki dla wybranej objętości dawki.

Dostosowanie testu do owadów polnych:
W przypadku stosowania owadów polnych mogą występować większe różnice w wielkości owadów. Dlatego zaleca się ważenie owadów w mniejszych grupach (np. na filiżankę) zamiast jako dużej grupy (np. wszystkie owady użyte w jednym eksperymencie). Może to pomóc w uchwyceniu potencjalnej zmienności podatności na insektycydy związanej z różnicami w masie owadów polowych.

Modyfikacje wyposażenia:
Namiot do obsługi owadów: Dozowanie próbki można wykonać pod namiotem do obsługi owadów, który jest po prostu zbudowany z rury PVC i moskitiery. Może to stanowić alternatywę dla zamkniętego pomieszczenia (np. owadobójczego) i pomóc wyeliminować potencjalne zanieczyszczenie środkami owadobójczymi na obszarach, na których może wystąpić hodowla owadów. Ten namiot do obsługi owadów jest łatwy w budowie i tani (~ 70 USD). Alternatywnie można kupić klatkę do obsługi owadów (~ 425 USD).

Stół chłodzący: Okłady z lodu lub tacki z lodem mogą być używane do powalania próbki i/lub utrzymywania próbki w stanie powalonym.

Inkubator: Inkubatory są zalecane do hodowli próbki i przetrzymywania próbki przez 24 godziny po zastosowaniu środków owadobójczych. Jeśli inkubator nie jest dostępny, można go zbudować. Sprzęt potrzebny do zbudowania inkubatora obejmuje izolowany pojemnik, nawilżacz, kable grzewcze, regulator wilgotności i temperatury oraz światło, co powinno dać całkowity koszt ~ 170 USD, zgodnie z poprzednimi metodamiⁱ rozszerzając je.

Kubki do trzymania: Chociaż plastikowe kubki są używane do sortowania i przechowywania poddanej działaniu substancji próbki, odpowiednią alternatywą byłyby kubki papierowe wyłożone woskiem lub szklane pojemniki.

Modyfikacja organizmu i etapu życia:
Metoda ta jest bardzo elastyczna do stosowania z innymi wektorami, owadami i/lub stawonogami, takimi jak komary Culex quinquefasciatus ³², muchy domowe³² i karaluchy⁴⁵, a także z niedorosłymi etapami życia, takimi jak larwy komarów⁴⁶.

Miejscowa modyfikacja lokalizacji aplikacji:
Ta metoda opisuje stosowanie środka owadobójczego na brzuszną część klatki piersiowej i brzucha w przypadku komarów (oraz grzbiet w przypadku muszek owocowych). Można jednak użyć innych miejsc aplikacji, o ile miejsce ekspozycji jest spójne. Konsystencja jest ważna, ponieważ wrażliwość na insektycydy może się różnić w zależności od miejsca aplikacji³².

Porady dotyczące rozwiązywania problemów: Ta metoda składa się z kilku kroków, które początkowo są trudne. Poniżej opisano niektóre z najczęstszych problemów, które można napotkać.

Wyciekające/parujące roztwory insektycydów:
Insektycydy są zwykle rozpuszczone w acetonie, wysoce lotnym związku. Oznacza to, że aceton szybko odparowuje w temperaturze pokojowej, zwiększając z czasem stężenie insektycydów. Jeśli wydaje się, że roztwory insektycydów przeciekają lub parują, przerób roztwory, upewnij się, że pokrywka probówki jest szczelnie założona i dwukrotnie sprawdź, czy protokoły przechowywania są prawidłowo przestrzegane (np. używany jest parafilm, a probówki są przechowywane w pozycji pionowej). Jeśli nieszczelność będzie się utrzymywać, spróbuj napełnić probówki mniejszą objętością, aby zapewnić więcej miejsca na zmianę objętości, której aceton doświadcza w różnych temperaturach. Dodatkowo, jeśli używasz acetonu jako rozpuszczalnika, upewnij się, że probówki są przystosowane do przechowywania acetonu (np. tworzywa FEP, TFE i PFA). W przypadku stosowania hydrofobowych środków owadobójczych należy przechowywać roztwory w szklanych fiolkach (ponieważ hydrofobowe środki owadobójcze mniej przylegają do szkła niż plastik). Dobrą praktyką jest również oznaczanie menisku roztworu przed przechowywaniem w celu monitorowania parowania.

Dryft masy na mikrowadze podczas ważenia organizmów:
Jeśli odczyt masy na wadze dryfuje (powoli idzie w górę lub w dół), może to być spowodowane zakłóceniami statycznymi. Dryft występuje najczęściej podczas ważenia organizmów w przedmiotach z tworzyw sztucznych, ponieważ plastik może łatwo zatrzymywać ładunek elektrostatyczny. Aby tego uniknąć, pod ważonym pojemnikiem z tworzywa sztucznego można umieścić papier do ważenia lub użyć pojemnika innego niż plastikowy, takiego jak szkło.

Nieprawidłowe wyniki śmiertelności:
Istnieje wiele sposobów, przez które wyniki śmiertelności mogą wydawać się nienormalne, takie jak obserwacja wysokiej śmiertelności w grupie kontrolnej lub wysokiej/niskiej śmiertelności we wszystkich dawkach insektycydów. Zapoznaj się z poniższymi przypadkami, aby zapoznać się z rozwiązywaniem problemów w każdym scenariuszu.

Wysoka śmiertelność z grupy kontrolnej
Jeśli śmiertelność w grupie kontrolnej jest wysoka (10% lub więcej), należy ocenić metodę knockdown i czas trwania powalania próbek. Jeśli to możliwe, skróć czas, na jaki próbki są powalające. Inne potencjalne czynniki, które należy wziąć pod uwagę w przypadku wysokiej śmiertelności w grupie kontrolnej, obejmują i) sprawdzenie, czy ustawienia inkubatora są prawidłowe - nienormalne temperatury i/lub wilgotność mogą prowadzić do zwiększonej śmiertelności. Temperaturę i wilgotność należy sprawdzić za pomocą niezależnego rejestratora danych. ii) Ocena postępowania z owadami. Zbyt częste lub zbyt brutalne obchodzenie się z owadami może prowadzić do wysokiej śmiertelności. iii) Sprawdzenie, czy nie ma zanieczyszczenia insektycydami w 100% acetonie użytym do leczenia grupy kontrolnej lub na oprzyrządowaniu. Wymień aceton i wyczyść wszystkie instrumenty acetonem lub etanolem. Unikaj zanieczyszczeń, często wymieniając rękawice, zapobiegając rozlaniu i czyszcząc narzędzia. Należy zauważyć, że w pliku uzupełniającym 3 maksymalnie dwa komary padły w kubkach kontrolnych (tylko aceton). Ten poziom śmiertelności nie jest uważany za wysoki (wynosi mniej niż 10%), a zatem nie było powodów do niepokoju.

Wysoka śmiertelność we wszystkich narażonych grupach (ale nie w grupach kontrolnych)
Do testów należy stosować niższe stężenia insektycydów lub mniejsze objętości dawek. Stosowane dawki mogą być większe od dawki minimalnej, która nie spowoduje śmiertelności. Użyj kilku 10-krotnych rozcieńczeń, aby określić prawidłowy zakres dawek i wykluczyć zanieczyszczenie. Aby uniknąć zanieczyszczenia, rozpocznij dozowanie od najniższego stężenia i dąż do najwyższego stężenia. Dodatkowo upewnij się, że cały używany sprzęt jest regularnie czyszczony acetonem i/lub etanolem, dawki stosowane do próbki są bardzo małe, a nawet najmniejsze zanieczyszczenie krzyżowe może wpłynąć na wyniki.

Niska śmiertelność we wszystkich narażonych grupach
Używaj wyższych stężeń insektycydów. Stosowane dawki mogą być zbyt niskie, aby spowodować śmiertelność w populacji. Aby określić prawidłowy zakres dawek, należy wystawić próbki na działanie kilku dodatkowych 10-krotnie skoncentrowanych dawek. Upewnij się, że roztwory insektycydów nie wygasły ani nie uległy degradacji (potencjalnie z powodu wysokiej temperatury lub ekspozycji na światło). Jeśli roztwory straciły ważność lub istnieje podejrzenie, że uległy degradacji, należy je ponownie przygotować i upewnić się, że przestrzegane są odpowiednie warunki przechowywania.

Niespójna śmiertelność między powtórzeniami/dniami
Pora dnia, w której owady są narażone na działanie środka owadobójczego, może wpływać na wyrażony poziom oporności, zwłaszcza w przypadku oporności metabolicznej³⁴. Powtarzaj ten protokół w tym samym oknie czasowym każdego dnia, aby uniknąć pory dnia jako potencjalnej zmiennej przyczyniającej się do zmian śmiertelności. Inne potencjalne czynniki przyczyniające się do niespójnej śmiertelności między powtórzeniami obejmują i) zróżnicowane hodowanie próbek między eksperymentami. Upewnij się, że wszystkie okazy są w tym samym przedziale wiekowym, są hodowane w tej samej temperaturze i o podobnej gęstości oraz mają dostęp do pokarmu. ii) stężenia insektycydów pogarszające się z czasem lub stające się bardziej skoncentrowane w wyniku parowania acetonu. Przerób roztwory i zapewnij odpowiednie warunki przechowywania. iii) Niespójna ocena śmiertelności. Upewnij się, że ta sama osoba ocenia śmiertelność lub opracuj jasny protokół, który będzie konsekwentnie stosowany w całym zespole. Stosuj ślepą punktację, aby zmniejszyć stronniczość w ocenie śmiertelności.

Owady przyklejające się do powierzchni tacki do sortowania:
Aceton reaguje z tworzywami sztucznymi stosowanymi w tym protokole, takimi jak szalki Petriego. Próbka prawdopodobnie przylgnie do powierzchni, jeśli użyje acetonu na szalkach Petriego lub podobnych plastikowych powierzchniach. Tego przyparcia można uniknąć, wykładając tacę sortowniczą papierem wagowym lub używając tacki do sortowania z tworzywa sztucznego. Ponadto kondensacja na powierzchni tworzywa sztucznego na tacy sortującej lub kubkach może prowadzić do przywierania owadów do kondensacji lub próbka może być zbyt zimna i potencjalnie zamarznąć na powierzchni. Dostosuj metodę knockdown, aby zmniejszyć kondensację, jednocześnie zapobiegając nadmiernemu wychłodzeniu/zamarznięciu próbek (np. umieść papier wagowy między próbkami a plastikową tacą do sortowania).

Błędy analizy języka R:
Po zebraniu danych dotyczących śmiertelności podczas analizy mogą wystąpić różne komplikacje. Najczęstszym powodem, dla którego kod R nie może wykonać akcji dla pliku danych, jest to, że format danych nie jest zgodny z kodem (np. nagłówki kolumn i/lub puste komórki). Jeśli pojawią się poważniejsze komplikacje, zapoznaj się ze stronami pomocy języka R wbudowanymi w Rstudio³⁵.

Ograniczenia opisanej powyżej metody aplikacji miejscowej:
Wchłanianie insektycydów metodą stosowania miejscowego nie naśladuje naturalnej ekspozycji:
Miejscowe stosowanie na główny korpus nie jest naturalnym sposobem wchłaniania insektycydów. Na polu owady najczęściej wchłaniają insektycydy przez nogi przez czas, w którym mają kontakt z powierzchnią potraktowaną środkiem owadobójczym lub na skrzydłach przez małe cząsteczki aerozolu^47,48, a nie przez szybką ekspozycję na powierzchnię brzuszną. Jednak bezpośrednie zastosowanie znanej dawki insektycydu dokładnie ustali fenotypową odpowiedź na insektycydy, potrzebną do badań genetycznych i ewolucyjnych lub porównań podatności na insektycydy w przestrzeni lub czasie. W związku z tym podejście to jest korzystne dla testowania odporności technicznej, ale nie mierzy bezpośrednio oporu praktycznego (skuteczności rzeczywistego narzędzia interwencyjnego w warunkach polowych¹⁵). Należy jednak zauważyć, że obecne standardowe metody (np. testy probówkowe WHO i testy biologiczne CDC w butelkach) również nie mogą wychwytywać ani naśladować ekspozycji na insektycydy w aerozolu (tj. przez zamgławianie) w terenie.

Testy do stosowania miejscowego mogą oceniać tylko insektycydy absorpcyjne:
Metoda ta jest przeznaczona do insektycydów, które działają poprzez kontakt i absorpcję insektycydu, a nie do stosowania z doustnymi środkami owadobójczymi, takimi jak kwas borowy powszechnie stosowany w atrakcyjnych toksycznych przynętach cukrowych⁴⁹.

Znaczenie metody:
Metoda stosowania miejscowego rozszerza dobrze ugruntowane standardy testów biologicznych insektycydów poprzez obliczenie dawki śmiertelnej (nie stężenia) i pomiar odporności technicznej (niepraktycznej)¹⁵. Poniżej podano zalety i wady tej metody w porównaniu z istniejącymi testami wrażliwości na insektycydy.

Obliczanie dawki śmiertelnej:
Metoda ta określa śmiertelną dawkę insektycydu, a nie śmiertelne stężenie, które CDC i WHO stosują w testach biologicznych do ustalenia dawki dyskryminującej¹¹. Dawka śmiertelna jest bardziej znacząca, ponieważ jest to ilościowo określona ilość środka owadobójczego, o którym wiadomo, że powoduje śmiertelność. Natomiast stężenie śmiertelne nie bierze pod uwagę, ile insektycydu organizm faktycznie nabywa. Korzystając z obliczania dawki śmiertelnej, różnice między profilami podatności zależnymi od płci lub wielkości mogą być dokładniej obserwowane i określane ilościowo, co czyni ten pomiar jeszcze bardziej wszechstronnym.

Odporność techniczna:
Ta metoda ocenia rezystancję techniczną, która jest rezystancją mierzoną w znormalizowanych, kontrolowanych środowiskach. Takie pomiary są odpowiednie do monitorowania rozprzestrzeniania się oporności na insektycydy i łączenia oporności fenotypowej z potencjalnymi markerami¹⁵. Ze względu na zmniejszoną zmienność śmiertelności wynikającą z testu biologicznego do stosowania miejscowego, pozwala on na lepszą identyfikację nowych markerów oporności. Jednak ze względu na nienaturalne narażenie komarów na insektycydy, test ten nie jest odpowiedni do oceny skuteczności określonej interwencji w określonej populacji. Do pomiarów takiej praktycznej odporności potrzebne są inne testy¹⁵.

Zdolność adaptacji próbki:
Metodę tę można ćwiczyć na innych ważnych stawonogach, takich jak szkodniki upraw (np. Stonka ziemniaczana), szkodniki domowe (np. karaluchy i pluskwy) lub zapylacze (np. pszczoły) przy prostych zmianach w podejściu knockdown i/lub dawce, objętości i/lub stężeniu insektycydu (jak opisano powyżej). Łatwość adaptacji może pomóc w analogii badań nad odpornością na insektycydy w różnych dziedzinach badań. Zastosowanie wartości LD₅₀ zamiast stężenia śmiertelnego, które zabija 50% okazów (LC₅₀), pozwala na dokładne porównanie między gatunkami.

Koszt:
Podobnie jak w przypadku testów biologicznych CDC w butelkach i testów probówkowych WHO, koszty przeprowadzenia testu do stosowania miejscowego są minimalne (patrz tabela materiałów). Niezbędnymi elementami wyposażenia są strzykawka (około 70 USD) i dozownik (około 100 USD), które są wielokrotnego użytku we wszystkich testach.

Liczba potrzebnych próbek:
Należy użyć co najmniej 20-25 próbek na kubek testowy do stosowania miejscowego. Zaleca się badanie co najmniej pięciu stężeń insektycydów w jednym doświadczeniu, przy czym dla procedury zaleca się co najmniej trzy powtórzenia. Ogólnie rzecz biorąc, daje to co najmniej 300-375 próbek potrzebnych do pełnego testu, co jest porównywalne z liczbą próbek potrzebnych do wykonania testów intensywności oporności za pomocą testów probówkowych WHO lub testów biologicznych CDC w butelkach. Jeśli jednak zmniejszona zmienność zostanie osiągnięta za pomocą testu biologicznego do stosowania miejscowego, ta sama liczba próbek może prowadzić do większej mocy statystycznej do porównywania danych dotyczących wrażliwości w przestrzeni lub czasie.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Probówki do mikrowirówek 1,5 ml	Thomas Scientific	20A00L068	Przechowywanie podwielokrotności acetonu
1,5 ml probówki z nakrętką	Thomas Scientific	1182K23	Zbiornik na rozcieńczalniki do insektycydów
Probówki stożkowe 15 ml	VWR	339651	Przechowywanie rozcieńczalników owadobójczych
20 ml szklane fiolki scyntylacyjne	Fisher Scientific	0334125D	Ważenie muszek owocowych
25 μ Strzykawka L	Fisher Scientific	14815288	Aplikator do stosowania miejscowego
Aceton	Fisher Scientific	AC423240040	ACS 99,6%, 4 L
Aedes aegypti (szczep ICC)	USDA CMAVE	NA	Odporny na insektycydy
Aedes aegypti (szczep Rockefellera)	CDC	NA	Podatny na insektycydy
Skala analityczna	Fisher Scientific	14-557-409	Precyzja do 0,1 mg
Aspirator	Amazon	6.49986E+11	Urządzenie do zbierania komarów
Papier stołowy	VWR	89126-794	Miejsce pod przestrzenią roboczą
Waciki bawełniane	Amazon	B092S8JVQN	Służy do sortowania owadów
Kulki z waty	Amazon	B0769MKZWT	Użyj do roztworu
Dozownik	Fisher Scientific	1482225	Repeater pipettor
Drosophila melanogaster (szczep Canton-S)	University of Wisconsin-Madison	NA	Podatny na insektycydy
Pędzle malarskie z cienką końcówką	Amazon	B07KT2X1BK	Służy do sortowania owadów
Butelki na muchy owocowe	Fisher Scientific	AS355	Zastosowanie do hodowli i sortowania muszki owocowe
Ręczny dozownik CO2	Fisher Scientific	NC1710679	Służy do powalania owadów
Kubki do trzymania Amazon		B08DXG7V1S	Przezroczysty plastikowy
okład z lodu	Amazon	B08QDWMMW5	Służy do powalania muszek owocowych
Tacki na lód	Amazon	9301085269	Służy do powalania owadów
Owad	kleszcze Amazon	B07B4767WR	Kleszcze do owadów
Środek owadobójczy	Sigma-Aldrich Inc	45423-250MG	Deltametryna
Etykietowanie Naklejki	Amazon	B07Q4X9GWX	3/4" Kolorowe kropki
Taśma do etykietowania	Amazon	B00X6A1GYK	Biała taśma
Siatka	Amazon	B07F2PHHWV	Służy do zakrywania kubków i owadów Namiot manipulacyjny
szalki Petriego	Fisher Scientific	FB0875712H371	100 mm x 15 mm
PVC Rura	Lowe' s	23971	Materiały namiotowe do obchodzenia się z owadami
Gumki	Amazon	B00006IBRU	Służy do zabezpieczania siatki/siatki na kubkach
Sacharoza	Amazon	B01J78INO0	Granulowany biały cukier
Papier wagowy	VWR	12578-165	4" x 4"