Artykuł metodologiczny

Usunięcie wewnętrznego translacyjnego miejsca startowego z mRNA przy zachowaniu ekspresji białka o pełnej długości

DOI:

10.3791/63405

⸱

16 marca 2022

 ,  ,  , 
1Nora Eccles Harrison Cardiovascular Research and Training Institute, University of Utah, 2Department of Biomedical Sciences, Cedars-Sinai Medical Center

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obecny protokół opisuje pojedynczą mutację M213L w Gja1, która zachowuje pełną generację Connexin43, ale uniemożliwia translację mniejszej wewnętrznie translowanej izoformy GJA1-20k.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

System edycji genów CRISPR-Cas9, oparty na mechanizmach naprawy genomu, umożliwia szybsze i łatwiejsze generowanie zmodyfikowanych genowo modeli myszy w porównaniu z tradycyjną rekombinacją homologiczną. System CRISPR-Cas9 jest szczególnie atrakcyjny, gdy pożądana jest mutacja jednopunktowa. Białko połączenia szczelinowego, Connexin 43 (Cx43), jest kodowane przez gen Gja1, który ma pojedynczy ekson kodujący i nie może być splicowany. Jednak Gja1 wytwarza nie tylko białko Cx43 o pełnej długości, ale także do sześciu izoform skróconych na N-końcach w procesie znanym jako translacja wewnętrzna, będąca wynikiem inicjacji translacji rybosomalnej w wewnętrznych miejscach startowych AUG (metioniny). GJA1-20k jest najczęściej generowaną skróconą izoformą Cx43 inicjowaną w kodonie AUG w pozycji 213 mRNA Gja1. Ponieważ reszta 213 występuje na końcu ostatniej domeny transbłonowej Cx43, GJA1-20k jest w rzeczywistości ogonem C-końcowym Cx43 o masie 20 kDa jako niezależne białko. Poprzedni badacze zidentyfikowali w komórkach, że kluczową rolą GJA1-20k jest ułatwianie transportu półkanałów Cx43 o pełnej długości do błony komórkowej. Aby zbadać to zjawisko in vivo, wygenerowano zmutowaną mysz z mutacją punktową Gja1, która zastępuje ATG (metioninę) w reszcie 213 TTA (leucyna, mutacja M213L). Wynikiem M213L jest to, że mRNA Gja1 i Cx43 o pełnej długości są nadal generowane, ale translacja Gja1-20k jest znacznie zmniejszona. Niniejszy raport koncentruje się na wyborze miejsca enzymu restrykcyjnego w celu opracowania modelu myszy z mutacją jednego aminokwasu (Gja1M213L/M213L). Protokół ten opisuje genetycznie zmodyfikowane myszy za pomocą systemu CRISPR-Cas9 i szybkie genotypowanie poprzez połączenie PCR i leczenia enzymami restrykcyjnymi.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pełnowymiarowa izoforma Connexin 43 (Cx43) i N-końcowa skrócona izoforma, GJA1-20k, kodowane przez ten sam mRNA GJA1, ale wykorzystujące różne kodony startowe1 do zainicjowania translacji. Translacja Cx43 zachodzi w pierwszym kodonie start AUG, podczas gdy translacja GJA1-20k rozpoczyna się w AUG przy reszcie 213. Wcześniej stwierdzono, że GJA1-20k odgrywa istotną rolę w transporcie Cx43 na całej długości, stabilizacji aktyny i regulacji morfologii mitochondriów in vitro1,2,3.

Aby zrozumieć rolę GJA1-20k in vivo, wygenerowano model myszy GJA1-20k "knock-out", który zachował zdolność do tworzenia pełnej długości Cx43. Podejście polegało na użyciu systemu CRISPR-Cas9 do podstawienia pojedynczej reszty w 213 z metioniny (M) do leucyny (L) (Gja1M213L/M213L)4. Wewnętrzna mutacja M do L radykalnie zmniejsza prawdopodobieństwo wystąpienia translacji wewnętrznej, zachowując jednocześnie translację i funkcję białka o pełnej długości4. Ponieważ typ dziki (WT) i zmutowany allel mają identyczne rozmiary i prawie identyczne produkty mRNA, istnieje znaczna trudność w potwierdzeniu genotypu u myszy. Sekwencjonowanie DNA może zidentyfikować mutację, ale jest zbyt drogie i czasochłonne do rutynowego stosowania. Ogólnie rzecz biorąc, ustalono kilka szybszych metod genotypowania, takich jak reakcja łańcuchowa polimerazy w czasie rzeczywistym (RT-PCR), minisekwencjonowanie-ligacja, analiza topnienia w wysokiej rozdzielczości i oporny na leczenie system mutacji amplifikacji tetra-starterów PCR (ARMS-PCR)5,6,7,8. Jednak te alternatywne metody wymagają wielu etapów, unikalnych zasobów i/lub kilku określonych zestawów starterów, które mogą indukować niespecyficzne produkty PCR.

Ten protokół wprowadza szczegółowe podejście do celowania i edycji genów za pomocą CRISPR-Cas9 w celu stworzenia pojedynczej mutacji aminokwasu, a szybkie genotypowanie jest prezentowane w celu potwierdzenia mutacji. Identyfikacja genotypu polega na kreatywnym wykorzystaniu enzymów restrykcyjnych wykorzystujących tylko jeden zestaw starterów do identyfikacji docelowego genu. Czytelnicy są odsyłani do Reference4, aby zaobserwować głęboki elektrofizjologiczny efekt nagłej śmierci sercowej spowodowanej mutacją substytucyjną Gja1M213L/M213L, która nadal generuje białko o pełnej długości, ale nie generuje mniejszej, wewnętrznie translowanej izoformy skrócenia. Protokół ten pomoże innym modelom myszy wykorzystać mutację punktową w celu zmniejszenia wewnętrznej translacji interesującej nas izoformy, przy jednoczesnym zachowaniu ekspresji endogennego białka o pełnej długości.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

'Wszystkie protokoły opieki nad zwierzętami i badań zostały zatwierdzone przez Instytucjonalne Komitety ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt w Centrum Medycznym Cedars-Sinai i Uniwersytecie Utah. Do eksperymentów wykorzystano samice myszy C57BL/6J pozyskane ze źródeł komercyjnych w wieku 8-9 tygodni (patrz tabela materiałów).

1. Przygotowanie do celowania w geny

  1. Wybierz prowadzącą sekwencję docelową wokół docelowego miejsca mutacji kodującego M213 za pomocą algorytmu internetowego CRISPOR4,9,10 (patrz Tabela materiałów).
    UWAGA: Wybrano 20-zasadową sekwencję prowadzącą (ATTCAGAGCGAGAGACACCA), w przeciwnej nici niż sekwencja kodująca GJA1, z wynikiem MIT11 z 62, w której potencjalne miejsce rozszczepienia znajduje się po 16 zasadach poniżej kodonu, który ma być zmutowany (ATG) (Rysunek 1; cała sekwencja crRNA jest pokazana w Tabeli 1).
  2. Zsyntetyzuj crRNA i tracrRNA, które oddziałują z Cas9 jako przewodnik RNA12.
    UWAGA: Chociaż wynik MIT przewodnika RNA wynosi 62, istnieje tylko jedna potencjalna mutacja poza celem z czterema niedopasowaniami oddalonymi od PAM o więcej niż 12 zasad. Dlatego ten przewodnik RNA jest uważany za bezpieczny.
  3. Zaprojektuj oligonomit donorowy komplementarny do sekwencji prowadzącej w celu wprowadzenia pojedynczego podstawienia aminokwasu (ATG do TTA; M213L) z ramionami homologicznymi o 60 i 48 podstawach odpowiednio po stronie 5' i 3'.
    UWAGA: Ten oligo dawcy zawiera mutację punktową dla zakłócenia PAM (AGG do ACG) poprzez wprowadzenie cichej mutacji (TCC do TCG; S217S), aby uniknąć ponownej edycji po naprawie skierowanej na homologię CRISPR (HDR)13 w celu wprowadzenia zamierzonych mutacji (Rysunek 1 i Tabela 1).
  4. Użyj NaCl (200 mM stężenie końcowe) do wytrącenia 10 μg oligonukleotydów, aby zminimalizować przenoszenie soli do projądrowego buforu mikroiniekcyjnego (10 mM Tris-HCl, pH 7,5; 0,1 mM EDTA i 100 mM NaCl bez sperminy i spermidyny14).
    UWAGA: Nie myj osadu DNA 70% etanolem, ponieważ osad może rozpuścić się w roztworze.
  5. Wymieszaj 50 ng/μl oligonukleotydy donorowej, 60 ng/μl mieszanki crRNA/tracrRNA (stosunek molowy 1:1) (z kroku 1.2) i 50 ng/μl białka eSpCas9 (patrz tabela materiałów), aby uzyskać mieszaninę CRISPR w końcowej objętości 20 μl (tabela 2). Zmniejszyć stężenie oligonugo dawcy w przypadku zaobserwowania wysokiej toksyczności (np. 25 ng/μl).

2. Indukcja superowulacji, pobieranie komórek jajowych, mikroiniekcja projądrowa mieszanki CRISPR i badanie przesiewowe blastocyst

UWAGA: Ta procedura jest zgodna z wcześniej opublikowanym ogólnym protokołem14.

  1. Wstrzyknąć 5 j.m. PMSG (gonadotropina surowicy ciężarnej klaczy) (patrz tabela materiałów) w 100 μl sterylnej wody 5-10 myszy w wieku 8 tygodni przez dotrzewnowe około godziny 15:00 (dzień 1).
  2. Wstrzyknąć dawcom komórek jajowych 5 j.m. hCG (ludzkiej gonadotropiny kosmówkowej) (patrz tabela materiałów) w 100 μl sterylnej wody dawcom komórek jajowych dotrzewnowo 46-48 godzin po wstrzyknięciu PMSG (dzień 3). Zakładanie hodowli 1:1 z samcami reproduktorami.
  3. Zbierz zapłodnione jaja na podłożu M2 z hialuronidazą, przemyj trzy razy w 100 μl podłoża M2 około godziny 10:00, a następnie trzymaj w podłożu mWM15 lub KSOM16 (dzień 4) (patrz Tabela Materiałów).
  4. Wprowadź mieszaninę CRISPR (krok 1.3) do zarodków w stadium 1-komórkowym pobranych od myszy za pomocą mikroiniekcji projądrowej14 w 100 μL M2 pokrytych olejem parafinowym w plastikowym naczyniu na odwróconym mikroskopie z optyką zwiększającą kontrast wczesnym lub późnym popołudniem (Wideo 1).
    UWAGA: Mikroiniekcję projądrową mieszaniny CRISPR przeprowadzono na zarodkach w stadium 1-komórkowym po 14-16 godzinach od stosunku (p.c.). Wstrzyknięte zarodki hodowano w inkubatorze o stężeniu 5%CO2 przez kilka godzin i chirurgicznie przenoszono po 18-20 godzinach dziennie do myszy ICR biorcy, które miały zatyczkę kopulacyjną tego samego ranka.
  5. Przenieś 20-30 2-komórkowych zarodków do każdego biorcy, aby uzyskać rekombinowane zwierzęta.
    UWAGA: Postępuj zgodnie z ogólnym protokołem14 lub hoduj te zarodki w pożywce mWM lub KSOM przez 4 dni, aby sprawdzić skuteczność i zbadać toksyczność. Toksyczność mieszaniny CRISPR jest dopuszczalna, gdy co najmniej jedna trzecia wstrzykniętych zarodków osiąga wcześnie stadium w pełni rozwiniętej blastocysty z wieloma rekombinantami wśród nich. Jednocześnie ponad 90% niezmanipulowanych zarodków osiąga ten sam etap blastocysty w równoległej hodowli. Postępuj zgodnie z krokiem 2.6-2.9, aby przeprowadzić badanie przesiewowe blastcyst, które nie jest konieczne, ale można je wykonać, jeśli wolisz, aby określić ilościowo wskaźnik sukcesu HDR.
  6. Indywidualnie pobrać wczesne lub w pełni rozwinięte blastocysty za pomocą 2 μl pożywki hodowlanej, używając zatkanej końcówki pipety z mikropipeterem do pojedynczych probówek do PCR (dzień 8; Wideo 2).
  7. Poddać lizie blastocysty w 8 μl mieszaniny wytrawiającej (tak samo jak w kroku 3.2; patrz tabela materiałów) i przetwarzać w temperaturze 75 °C przez 10 minut, 95 °C przez 5 minut, a następnie schłodzić do 4 °C w celu przechowywania. Użyj 2 μl lizatu jako matrycy do PCR w mieszaninie PCR o łącznej objętości 15 μl (krok 3).
  8. Zbadaj skuteczność HDR za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym17 próbek PCR po trawieniu restrykcyjnym za pomocą NlaIII (etap 3-5).
  9. Potwierdź status ukierunkowanej rekombinacji, sekwencjonując 668 pz amplicon17 u założycieli i kolejnego potomstwa, aby potwierdzić integralność mutacji.

3. Ekstrakcja DNA

UWAGA: Myszy w 10 dniu po urodzeniu zostały wykorzystane do tego eksperymentu z powodu nagłej śmierci myszy nokautującej GJA1-20k około 2-4 tygodni po urodzeniu4. Bardziej ogólny protokół może być również zastosowany zgodnie z wcześniej opublikowanymi raportami18.

  1. Odetnij 1-3 mm czubka palca lub ogona czystymi nożyczkami i przenieś do 0,2 ml 8-paskowej probówki do PCR. Aby uniknąć zanieczyszczenia próbek palców u nóg lub ogona, użyj wstępnie oczyszczonych nożyczek lub jednego ostrza na mysz lub wyczyść przed każdą próbką za pomocą 70% etanolu lub 10% wybielacza. Jeśli ogon krwawi po pobraniu próbki, należy krótko docisnąć gazą, aby zatrzymać krwawienie. Próbki z ogona należy przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu ekstrakcji przez okres do około tygodnia.
  2. Dodać roztwór do lizy tkanek (patrz tabela materiałów) do 100 μl/probówkę i dobrze wymieszać, a następnie odwirować za pomocą miniwirówki stołowej (2 200 x g przez 10 s w temperaturze pokojowej). Upewnij się, że próbki ogona są zanurzone w roztworze.
  3. Umieść probówki na termocyklerze ustawionym przez następujący program: 75 °C na 10 minut (liza tkanek), 95 °C na 5 minut (inaktywacja) i 4 °C (trzymanie). Przechowywać lizat tkankowy w temperaturze 4 °C przez okres do tygodnia, jeżeli nie można natychmiast przeprowadzić testu PCR.

4. Amplifikacja DNA metodą PCR

  1. Przygotować roztwór do PCR zawierający 5 μl H2O bez nukleaz, 0,75 μ5 μl 10 μM starterów do przodu i do tyłu oraz 7,5 μl głównej mieszanki PCR (patrz tabela materiałów) na próbkę do nowej probówki PCR (patrz tabela 1 dla sekwencji starterów). Jeżeli jest kilka próbek, należy przeskalować zawartość do podwielokrotności 14 μl na probówkę.
  2. Dodać 1 μl lizatu tkankowego do roztworu PCR przygotowanego w kroku 3.1. Uważaj, aby nie dotknąć ogona.
  3. Dobrze wymieszać i odwirować za pomocą mini-wirówki stołowej (2 200 x g przez 10 s w temperaturze pokojowej).
  4. Ustaw lampy na termocyklerze ustawionym przez poniższy program. Produkty PCR należy przechowywać w temperaturze 4 °C przez 1-2 miesiące lub ~ 1 rok w temperaturze -20 °C.
    UWAGA: 95 °C przez 3 minuty (krok 1, początkowa denaturacja), 95 °C przez 15 s (krok 2, denaturacja), 60 °C przez 15 s (krok 2, wyżarzanie), 72 °C przez 45 s (krok 2, przedłużenie), powtórz krok 2 przez 35 cykli, 72 °C przez 10 minut (krok 3, końcowe rozszerzenie) i 4 °C (krok 4, Gospodarstwo rolne).

5. Inkubacja z enzymem restrykcyjnym

  1. Przygotować roztwór enzymatyczny zawierający 7 μl wolnego od nukleazH2O, 2 μl 10x buforu CutSmart i 1 μl enzymu restrykcyjnego NlaIII (patrz tabela materiałów). Jeżeli jest kilka próbek, pomnóż każdą zawartość, aby otrzymać mieszaninę i podwielokrotność 10 μl na probówkę.
  2. Dodać 10 μl produktu PCR otrzymanego w kroku 3 do roztworu enzymu na probówkę.
  3. Dobrze wymieszać i odwirować za pomocą mini-wirówki stołowej (2 200 x g przez 10 s w temperaturze pokojowej).
  4. Ustaw rurki na termocyklerze lub bloku grzewczym ustawionym przez poniższy program. Przechowywać produkt po inkubacji w temperaturze 4 °C przez 1-2 miesiące lub ~ 1 rok w temperaturze -20 °C.
    UWAGA: 37 °C przez 16 godzin (co najmniej 2 godziny; krótki czas inkubacji może spowodować niewystarczające rozszczepienie) i 4 °C przez trzymanie.

6. Wykrywanie prążków DNA

  1. Przygotuj 1,5% żel agarozowy zawierający barwnik w żelu DNA do elektroforezy.
    1. Dodaj 0,75 g agarozy do 50 ml buforu 1x TAE, a następnie wymieszaj i podgrzej w kuchence mikrofalowej, aż agaroza całkowicie się rozpuści. Po wystudzeniu dodać 5 μl barwnika DNA i delikatnie wymieszać.
    2. Wlej do formy żelowej (25 ml na formę) i pozwól żelowi zastygnąć. Aby uzyskać lepszą rozdzielczość i separację, w razie potrzeby zwiększ stężenie agarozy do 2,5%-4%.
  2. Załaduj 10 μl strawionego produktu PCR do studzienki. W razie potrzeby wymieszaj 6x bufor ładujący.
  3. Uruchom żel napięciem 100 V przez 35 minut
    UWAGA: Te parametry mogą wymagać optymalizacji.
  4. Obraz w świetle UV (długość fali 302 nm).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

System edycji genów CRISPR/Cas9 wytwarza mutację ATG do TTA i cichą mutację TCC do TCG odpowiednio od 56,264,279 do 56,264,281 i od 56,264,291 do 56,264,293 na chromosomie 10 myszy, lub odpowiednio od 869 do 871 i od 881 do 883 na mRNA Gja1. Mutacja ta powoduje mutację metioniny 213 do leucyny (M213L) na białku GJA1, a mutacja TTC do TTG zakłóca pobliską sekwencję PAM, aby uniknąć niepożądanej edycji genu (Figura 1). Szczegóły mutacji są opisane w poprzednim raporcie4.<...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Model myszy zmodyfikowany genowo jest powszechnym podejściem do zrozumienia funkcji genów. Ponieważ jednak wewnętrznie translowana izoforma GJA1-20k ulega translacji z tego samego mRNA Gja1 , co Cx43 o pełnej długości, opracowano strategię twórczą, aby zachować ekspresję Cx43 o pełnej długości, jednocześnie tłumiąc ekspresję GJA1-20k. Podejście to opiera się na mutacji wewnętrznego kodonu start GJA1-20k. Z pojedynczą mutacją punktową, M213 został przełączony na L na mRNA Gja1 , który skutecznie stłumił ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Projekt był wspierany przez granty National Institutes of Health (R01HL152691, R01HL138577 i R01HL159983) dla RMS.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,2 ml 8-paskowa probówka do PCRThomas Scientific1148A28
0,5 M EDTA pH 8,0Invitrogen15575-038Do projądrkowego buforu mikoriniekcyjnego
10x bufor CutSmartNew England BiolabsB7204SBufor mineralizacyjny do NlaIII
1 M Tris-HCl pH 7,5Invitrogen15567-027Do projądrkowego buforu mikoriniekcyjnego
50x TAE BufferInvitrogen24710-030
96-dołkowy termocyklerApplied BiosystemsModel # 9902
AgarozaSigma-AldrichA9539
C57BL/6JSzczep myszy Jackson Laboratory664
System obrazowania Chemidoc MPBio-radAby wykonać obraz żelu za pomocą światła UV 302 nm
białkaeSpCas9MilliporeSigmaESPCAS9PRO-50UG
Gel Lading Dye Purple (6x)New England BiolabsB7024SBufor ładujący do elektroforezy
Rękawice
hCG (ludzka gonadotropina kosmówkowa)MiliporeSigma23-073-425G
HialuronidazaMiliporeOprogramowanieSigma H3884-100MG
Image LabBio-radDo analizy obrazu żelu
Odwrócony mikroskop stereoskopowy z plasDICZeissAxiovert A1
KAPA Zestawy do genotypowania myszyRoche DiagnosticsKK7352Do lizy tkanek lub komórek, ekstrakcji DNA i wzorcowej mieszanki PCR
Pożywka do hodowli zarodkówKSOMLifeGlobalZEKS-050
laboratoryjna Coart
M2MilliporeSigmaMR015D
NlaIIINew England BiolabsR0125SDo trawienia produktu PCR
Woda wolna od nukleazAmbionAM9937Do rozcieńczania odczynników
Olej parafinowyNacalai USA2613785
Plugged 20 μ L końcówka do pipet z drobną pipetąFisherScientific02-707-171Do zbierania blastocytów
PMSG (klacz w ciąży' s gonadotropina w surowicy)ProSpec-TanyHOR-272
Chlorek soduInvitrogenAM9760GDo projądrowego buforu mikoriniekcyjnego
SYBR bezpieczny żel DNA StainInvitrogenS33102Do wykrywania prążków w żelu
tracrRNADharmaconU-002000-120Guid RNA
Pożywka

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Smyth, J. W., Shaw, R. M. Autoregulation of connexin43 gap junction formation by internally translated isoforms. Cell Reports. 5 (3), 611-618 (2013).
  2. Basheer, W. A., et al. GJA1-20k arranges actin to guide Cx43 delivery to cardiac intercalated discs. Circulation Research. 121 (9), 1069-1080 (2017).
  3. Fu, Y., et al. Cx43 isoform GJA1-20k promotes microtubule dependent mitochondrial transport. Frontiers in Physiology. 8, 905(2017).
  4. Xiao, S., et al. Auxiliary trafficking subunit GJA1-20k protects connexin-43 from degradation and limits ventricular arrhythmias. Journal of Clinical Investigation. 130 (9), 4858-4870 (2020).
  5. Syvanen, A. C. From gels to chips: "minisequencing" primer extension for analysis of point mutations and single nucleotide polymorphisms. Human Mutation. 13 (1), 1-10 (1999).
  6. Han, Y., et al. Genome-wide SNP discovery in tetraploid alfalfa using 454 sequencing and high resolution melting analysis. BMC Genomics. 12, 1-11 (2011).
  7. Han, Y., Khu, D. M., Monteros, M. J. High-resolution melting analysis for SNP genotyping and mapping in tetraploid alfalfa (Medicago sativa L.). Molecular Breeding. 29 (2), 489-501 (2012).
  8. Peng, B. Y., et al. A novel and quick PCR-based method to genotype mice with a leptin receptor mutation (db/db mice). Acta Pharmacologica Sinica. 39 (1), 117-123 (2018).
  9. Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biology. 17 (1), 148(2016).
  10. Concordet, J. P., Haeussler, M. CRISPOR: Intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens. Nucleic Acids Research. 46 (1), 242-245 (2018).
  11. Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nature Biotechnology. 31 (9), 827-832 (2013).
  12. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  13. Paquet, D., et al. Efficient introduction of specific homozygous and heterozygous mutations using CRISPR/Cas9. Nature. 533 (7601), 125-129 (2016).
  14. Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K., Nagy, A. Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. , (2014).
  15. Pomp, D., Critser, E. S., Rutledge, J. J. Lower sodium lactate in Whitten's medium improves in vitro developmental capacity of one-cell mouse embryos. Theriogenology. 29 (5), 1019-1025 (1988).
  16. Summers, M. C., McGinnis, L. K., Lawitts, J. A., Raffin, M., Biggers, J. D. IVF of mouse ova in a simplex optimized medium supplemented with amino acids. Human Reproduction. 15 (8), 1791-1801 (2000).
  17. Green, M. R. S. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Fourth Edition). , (2012).
  18. Koh, J. Y., Iwabuchi, S., Huang, Z., Harata, N. C. Rapid genotyping of animals followed by establishing primary cultures of brain neurons. Journal of Visualized Experiments. 95. (95), e51879(2015).
  19. Iyer, V., et al. No unexpected CRISPR-Cas9 off-target activity revealed by trio sequencing of gene-edited mice. PLoS Genetics. 14 (7), 1007503(2018).
  20. Nature Medicine. Keep off-target effects in focus. Nature Medicine. 24 (8), 1081(2018).
  21. Mayer, H. Optimization of the EcoRI-activity of EcoRI endonuclease. FEBS Letters. 90 (2), 341-344 (1978).
  22. Kozak, M. Point mutations close to the AUG initiator codon affect the efficiency of translation of rat preproinsulin in vivo. Nature. 308 (5956), 241-246 (1984).
  23. Kozak, M. Point mutations define a sequence flanking the AUG initiator codon that modulates translation by eukaryotic ribosomes. Cell. 44 (2), 283-292 (1986).
  24. Basheer, W. A., et al. Stress response protein GJA1-20k promotes mitochondrial biogenesis, metabolic quiescence, and cardioprotection against ischemia/reperfusion injury. JCI Insight. 3 (20), 121900(2018).
  25. Shimura, D., et al. Protective mitochondrial fission induced by stress-responsive protein GJA1-20k. Elife. 10, 69207(2021).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Edycja gen w CRISPR Cas9translacja wewn trznakoneksyna 43mutacja punktowa Gja1tworzenie modelu mysiegogenotypowanie metod PCRtrawienie enzymami restrykcyjnymielektroforeza w elu agarozowymoczyszczanie donora oligowydajno edycji genomu

Powiązane artykuły