Artykuł metodologiczny

Metoda krok po kroku do wykrywania przeciwciał neutralizujących przeciwko AAV za pomocą kolorymetrycznego testu komórkowego

DOI:

10.3791/63419

⸱

7 grudnia 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Baker Heart and Diabetes Institute, 2Department of Physiology, Anatomy and Microbiology, La Trobe University, 3Florey Institute of Neuroscience and Mental Health, University of Melbourne, 4Department of Physiology, Centre for Muscle Research (CMR), The University of Melbourne, 5Department of Diabetes, Central Clinical School, Monash University, 6Baker Department of Cardiometabolic Health, The University of Melbourne, 7Department of Physiology and Department of Medicine Alfred Hospital, Monash University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kompleksowy protokół laboratoryjny i przepływ pracy analizy są opisane dla szybkiego, opłacalnego i prostego testu kolorymetrycznego opartego na komórkach do wykrywania elementów neutralizujących przeciwko AAV6.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rekombinowane wirusy związane z adenowirusami (rAAV) okazały się bezpiecznym i skutecznym wektorem do transferu materiału genetycznego w celu leczenia różnych schorzeń zarówno w laboratorium, jak i w klinice. Jednak istniejące wcześniej przeciwciała neutralizujące (NAb) przeciwko kapsydom AAV stanowią ciągłe wyzwanie dla skutecznego podawania terapii genowych zarówno w dużych modelach eksperymentalnych na zwierzętach, jak i w populacjach ludzkich. Wstępne badania przesiewowe w kierunku odporności gospodarza na AAV są konieczne, aby zapewnić skuteczność terapii genowych opartych na AAV zarówno jako narzędzia badawczego, jak i jako klinicznie opłacalnego środka terapeutycznego. Protokół ten opisuje kolorymetryczny test in vitro w celu wykrycia czynników neutralizujących przeciwko serotypowi 6 AAV (AAV6). Test wykorzystuje reakcję między AAV kodującym gen reporterowy fosfatazy alkalicznej (AP) a jego substratem NBT / BCIP, który po połączeniu generuje nierozpuszczalną, ilościową purpurową plamę.

W tym protokole, próbki surowicy są łączone z AAV wyrażającym AP i inkubowane, aby umożliwić wystąpienie potencjalnej aktywności neutralizującej. Mieszanina surowicy wirusa jest następnie dodawana do komórek, aby umożliwić transdukcję wirusa wszelkich AAV, które nie zostały zneutralizowane. Substrat NBT/BCIP jest dodawany i ulega reakcji chromogennej, odpowiadającej transdukcji wirusa i aktywności neutralizującej. Proporcja zabarwionego obszaru jest określana ilościowo za pomocą bezpłatnego narzędzia programowego do generowania mian neutralizujących. Test ten wykazuje silną dodatnią korelację między zabarwieniem a stężeniem wirusa. Ocena próbek surowicy owiec przed i po podaniu rekombinowanego AAV6 doprowadziła do dramatycznego wzrostu aktywności neutralizującej (od 125 do >10 000-krotny wzrost). Test wykazał odpowiednią czułość do wykrycia aktywności neutralizującej w rozcieńczeniach surowicy w >1:32 000. Ten test zapewnia prostą, szybką i opłacalną metodę wykrywania NAb przeciwko AAV.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wirusy związane z adenowirusami (AAV) są coraz częściej wykorzystywane jako wektory do dostarczania terapii genowych do próbnych metod leczenia różnych schorzeń, które wpływają na układ sercowo-naczyniowy, płucny, krążenia, oczny i ośrodkowy układ nerwowy1,2,3,4,5. Popularność wektorów AAV jako wiodącej platformy terapii genowej wynika z ich pozytywnego profilu bezpieczeństwa, długotrwałej ekspresji transgenu i szerokiego zakresu tropizmów specyficznych dla tkanki1,6. Pomyślne wyniki badań na zwierzętach utorowały drogę do ponad pięćdziesięciu badań klinicznych terapii genowej AAV, które z powodzeniem osiągnęły swoje punkty końcowe skuteczności7, a także do wprowadzenia na rynek pierwszego dostępnego na rynku leku terapii genowej AAV zatwierdzonego przez amerykańską Agencję ds. Żywności i Leków8. Po początkowych sukcesach, AAV nadal zyskuje na popularności w sektorach badań podstawowych i klinicznych jako wektor z wyboru i jest obecnie jedyną terapią genową in vivo zatwierdzoną do użytku klinicznego w USA i Europie9. Niemniej jednak obecność istniejących wcześniej przeciwciał neutralizujących (NAb) przeciwko kapsydom wektorów AAV pozostaje przeszkodą zarówno dla badań przedklinicznych, jak i skuteczności badań klinicznych. NAb są obecne zarówno w naiwnych populacjach ludzkich, jak i zwierzęcych i hamują transdukcję genów po podaniu in vivo wektora AAV1. Seropozytywność AAV jest kryterium wykluczającym dla większości badań klinicznych terapii genowej, dlatego wstępne badania przesiewowe w kierunku odporności gospodarza mają kluczowe znaczenie zarówno w laboratorium, jak i w klinice. Ustanowienie testu, który może wykryć obecność NAb przeciwko AAV, jest niezbędnym krokiem w przygotowaniu każdego projektu badawczego opartego na terapii genowej AAV. Ten raport koncentruje się na AAV6, który był przedmiotem zainteresowania badaczy ze względu na jego wydajną i selektywną transdukcję w mięśniach prążkowanych (serce i mięśnie szkieletowe)1,10,11,12. Terapia genowa jest uważana za obiecującą strategię celowania w serce, ponieważ trudno jest celować konkretnie w serce bez inwazyjnych zabiegów na otwartym sercu.

Aktywność neutralizująca jest zazwyczaj określana za pomocą komórkowego testu inhibicyjnego in vitro lub in vivo. In vivo (in vivo) Testy NAb zwykle polegają na podawaniu surowicy od osoby badanej (np. Człowieka lub dużego zwierzęcia) myszom, a następnie AAV z genem reporterowym, a następnie testowaniu ekspresji genu reporterowego lub odpowiadającego mu antygenu. Testy in vitro określają miana NAb poprzez inkubację surowicy lub osocza od człowieka lub dużego zwierzęcia w seryjnych rozcieńczeniach rekombinowanym AAV (rAAV), który wyraża gen reporterowy. Komórki są zakażone mieszaniną surowicy i wirusa, a stopień zahamowania ekspresji genu reporterowego jest oceniany w porównaniu z kontrolą. Testy in vitro są szeroko stosowane do badań przesiewowych NAb ze względu na ich stosunkowo niższy koszt, szybkość testowania oraz większą zdolność do standaryzacji i walidacji13,14 w porównaniu z testami in vivo. Testy in vivo są często zgłaszane jako mające większą czułość15,16, ale to samo twierdzenie zostało wysunięte w odniesieniu do testów in vitro14,17.

Do tej pory, testy in vitro NAb głównie wykorzystywały luminescencję (lucyferazy) jako gen reporterowy do wykrywania neutralizacji. Chociaż metoda oparta na świetle ma zalety w wielu kontekstach, kolorymetryczny/chromogenny test NAb może być korzystny w niektórych okolicznościach. Testy kolorymetryczne do oceny neutralizacji zostały z powodzeniem zastosowane w przypadku innych wirusów, takich jak grypa i adenowirus18,19. Ich atrakcyjność wynika z ich prostoty, niższych kosztów i wymogu korzystania wyłącznie z codziennej aparatury i narzędzi laboratoryjnych20. Testy NAb, które wykorzystują gen reporterowy oparty na luminescencji, wymagają kosztownych zestawów substratów, luminometru i odpowiedniego oprogramowania do analizy21. Ten test kolorymetryczny ma tę zaletę, że wymaga jedynie mikroskopu świetlnego i bardzo taniego podłoża. Doniesienia na temat czułości testów kolorymetrycznych i luminescencyjnych przyniosły sprzeczne wyniki. Jedno z badań sugerowało, że testy ELISA oparte na luminescencji wykazują większą czułość i porównywalną odtwarzalność z testami kolorymetrycznymi22, podczas gdy inne wykazało, że testy ELISA oparte na kolorymetrii nadają większą czułość23. W tym miejscu przedstawiono szczegółowy protokół testu NAb in vitro przeciwko AAV, który wykorzystuje reakcję chromogenną między AAV kodującym gen reporterowy fosfatazy alkalicznej (AP) a substratem nitro niebieskiego tetrazolu / 5-bromo-4-chloro-3-indolilofosforanu (NBT / BCIP). Ten protokół krok po kroku został opracowany w oparciu o poprzedni raport, w którym wykorzystano gen reporterowy hPLAP (ludzka fosfataza alkaliczna łożyska) (AAV6-hPLAP) do wykrywania aktywności neutralizującej przeciwko AAV24. Ten test jest opłacalny, efektywny czasowo, łatwy w konfiguracji i wymaga minimalnych umiejętności technicznych, sprzętu laboratoryjnego i odczynników. Co więcej, prostota tego testu daje mu potencjał do optymalizacji pod kątem szerokich zastosowań w różnych typach komórek, tkanek lub serotypów wirusów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie aspekty opieki nad zwierzętami i eksperymentów zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Florey Institute of Neuroscience and Mental Health oraz Australijskim Kodeksem Opieki i Wykorzystywania Zwierząt do Celów Naukowych zgodnie z Reference25. Do badania wykorzystano 1,5-3-letnie owce merynosów. Schematyczny przegląd protokołu testu znajduje się w Rysunek 1.

Diagram testu hamowania transdukcji z seryjnymi rozcieńczeniami, inkubacją komórek i wynikami mikroskopii.
Rysunek 1: Schemat ideowy protokołu testu NAb. (A) Wizualna reprezentacja testu NAb ilustrująca podstawowe kroki związane z protokołem trzydniowym. Krótko mówiąc, komórki są hodowane i platerowane przez noc. Następnego dnia przygotowuje się seryjne rozcieńczenia surowicy, inkubuje się je z AAV, a następnie inkubuje z komórkami przez noc. Następnego dnia komórki są utrwalane, myte, inkubowane, łączone z substratem i ponownie inkubowane, a następnie obrazowane i oznaczane ilościowo. (B) Reprezentatywne obrazy minimalnej kontroli sygnału (całkowite zahamowanie AAV), maksymalnej kontroli sygnału (brak inhibicji) oraz próbki surowicy owczej z ~50% inhibicją. Podziałka = 0,5 mm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

1. Wstępne przygotowanie

  1. Do oceny u owiec: zebrać krew w probówkach z aktywatorem skrzepów separatora surowicy o pojemności 8 ml (patrz tabela materiałów), pozostawić próbkę krwi w temperaturze pokojowej (RT) na 20-30 minut, a następnie odwirować w temperaturze 2 100 x g przez 15 minut. Przezroczystym supernatantem, który tworzy się w górnej części probówek, jest surowica. Klarowną fazę wodną przelać do probówek do mikrowirówek i przechowywać w temperaturze -80 °C.
    UWAGA: Surowica w temperaturze -80 °C pozostaje stabilna przez ~5 lat. Krew pobierano z żyły szyjnej za pomocą igły 16 G (odcięta końcówka) i strzykawki od przytomnych zwierząt.
  2. Podgrzać płodową surowicę bydlęcą (FBS), umieszczając ją w łaźni wodnej o temperaturze 56 °C na 30 minut i mieszać z przerwami. Dla precyzji umieść termometr w drugiej butelce zawierającej równoważną objętość wody i dodaj go do łaźni grzewczej w tym samym czasie, co butelkę FBS. Rozpocznij odmierzanie czasu, gdy termometr osiągnie 56 °C.
  3. Stosuj odpowiednią technikę aseptyczną i praktykę hodowli komórkowej dla wszystkich kolejnych etapów wykonywanych w kapturze do hodowli komórkowych26,27. Przed użyciem spryskaj 70% etanolem wszystkie przedmioty i kaptur, a po zakończeniu wyczyść 1% podchlorynem sodu.
  4. Stwórz kompletną pożywkę Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), łącząc DMEM o wysokiej stężeniu glukozy (4,5 g/l) (89%) z inaktywowanym termicznie FBS (10%) i penicyliną Streptomycyną (1%). Połączyć i przefiltrować za pomocą sterylnego systemu filtracji próżniowej (wielkość porów 0,22 μm, membrana polieterosulfonowa) (patrz tabela materiałów). Przechowywać kompletny DMEM zawinięty w folię w temperaturze 4 °C.
  5. Umieść komórki HT1080 (patrz Tabela materiałów) i przejdź przez nią w kolbie kwadratowej o średnicy 75 cm2, zgodnie z opisem w Reference28. Utwórz wiele zamrożonych zasobów komórek. Nie należy używać komórek po 20 pasażach, ponieważ dalsze pasażowanie może wpłynąć na wyniki testu.

2. Dzień 1 - Posiewanie komórek

  1. Przejście komórek HT1080, gdy osiągną ~80% konfluencji.
  2. Wstępnie podgrzej kompletny DMEM (przygotowany w kroku 1.4), 0,05% trypsyny-EDTA i 1x sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) do temperatury 37 °C w łaźni wodnej. Usunąć pożywkę wzrostową z pasażowanych komórek za pomocą systemu aspiracji.
    UWAGA: Wszystkie aspiracje w tym protokole wykorzystują system próżniowy z rurką podłączoną do sterylnej pipety serologicznej o pojemności 5 ml.
  3. Umyj komórki w 10 ml wstępnie podgrzanego (37 °C) 1x PBS i trypsynizuj komórki przez 3-4 minuty w 4 ml wstępnie podgrzanej 0,05% trypsyny-EDTA, aby odłączyć komórki od kolby.
  4. Dezaktywuj trypsynę, dodając 6 ml wstępnie podgrzanego kompletnego DMEM i pipetuj komórki do probówki o pojemności 50 ml. Oblicz liczbę i stężenie żywotnych komórek za pomocą hemocytometru i metody wykluczania błękitu trypanowego29.
  5. Rozcieńczyć komórki do stężenia 1 x 105 komórek/ml we wstępnie podgrzanym kompletnym DMEM. Wysiewaj 100 μl komórek/studzienkę do przezroczystych, 96-dołkowych, płaskodennych płytek (1 x 10,4 komórki na studzienkę). Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C, 5% dwutlenku węgla (CO2 ) przez noc przez 16-22 godziny.

3. Dzień 2 - Zakażenie komórek

  1. Wyjąć płytkę (płytki) z inkubatora i użyć mikroskopu świetlnego, aby potwierdzić, że komórki są równomiernie rozproszone w studzienkach i że konfluencja wynosi ~50%. Jeśli komórki nie znajdują się w zakresie zbiegu 45%-55%, powtórz protokół "Dzień 1" i odpowiednio dostosuj początkowe stężenie komórek.
  2. Generuj seryjne rozcieńczenia próbek surowicy będących przedmiotem zainteresowania w probówkach mikrowirówek o pojemności 1,5 ml, używając wstępnie podgrzanego kompletnego DMEM jako rozcieńczalnika. W tabeli 1 przedstawiono sposób wytwarzania kaskady rozcieńczania dla próbek pobranych z trzech egzemplarzy.
    1. Aby przeprowadzić test w trzech powtórzeniach, należy przygotować 7,5 x 106 genomów wektorowych (vg)/μL roztworu roboczego AAV6-hPLAP (patrz tabela materiałów), rozcieńczając roztwór podstawowy wirusa w 1x PBS.
    2. Dodać 66 μl roztworu roboczego wirusa o sile 7,5 x 106 vg/μl do każdej probówki zawierającej 264 μl rozcieńczenia surowicy/pożywki (330 μl całkowitej objętości/rozcieńczenia, patrz tabela 1).
      UWAGA: Jest to solidny test, który nie wymaga idealnych warunków hodowli. Jednakże, aby dokładnie określić ilościowo i zapewnić, że każda seria testów jest wiarygodna, konieczne jest uwzględnienie następujących elementów: (1) kontroli tylko wirusa i pożywki, (2) kontroli tylko pożywki oraz (3) próbki kontroli pozytywnej NAb na wszystkich płytkach w tych samych warunkach doświadczalnych. Opisana objętość (330 μl) odpowiada trzykrotnym próbkom +10% mieszaniny surowicy i wirusa. Wykonywanie powtórzeń jest wysoce zalecane w celu dokładnego określenia aktywności neutralizującej.
  3. Wymieszać rozcieńczenia wirusa/surowicy przez pipetowanie i umieścić probówki zawierające mieszaninę wirusa/surowicy w inkubatorze w temperaturze 37 °C, 5% CO2 na 30 minut, aby umożliwić potencjalną neutralizację.
  4. Odpipetować 100 μl mieszaniny wirus/surowica do każdego dołka na 96-dołkowej płytce zawierającej 1 x 104 komórek/basenik dla każdego rozcieńczenia.
    UWAGA: Spowoduje to wygenerowanie końcowego stężenia wirusa wynoszącego 15 tys. wirusów/wielokrotność infekcji komórkowej (MOI) w każdym dołku. Tabela 2 zawiera przykładowy układ 96-dołkowych płytek do pomiaru próbek w rozcieńczeniu 1/512.
  5. Owinąć 96-dołkową płytkę zawierającą komórki, surowicę i AAV-hPLAP w folię i umieścić w inkubatorze w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez noc przez 16-24 godziny, aby umożliwić przedostanie się AAV do komórek.
Zobacz materiał
Etykieta kaskadowa rozcieńczaniaRozcieńczeniu3 x próbka (240 μL) + 10% objętości buforu (24 μL)Stosunek surowicy do podłoża
Rozcieńczenie 1 (D1)1/2264 μL surowicy 264 μL podłożaGodzina 50:50
Rozcieńczenie 2 (D2)1/4264 μL D1 + 264 μLgodz. 25:75
Rozcieńczenie 3 (D3)1/8264 μL D2 +264μL podłoża12.5:87.5
Rozcieńczenie 4 (D4)1/16264 μL D3 +264 μL podłoża6.25:93.75
Rozcieńczenie 5 (D5)1/32264 μL D4 +264 μL podłoża3.13:96.87
Rozcieńczenie 6 (D6)1/64264 μL D5 +264 μL podłoża1.56:98.44
Rozcieńczenie 7 (D7)1/128264 μL D5 +264 μL podłoża0.78:99.22
Rozcieńczenie 8 (D8)1/256264 μL D5 +264 μL podłoża0.39:99.61
Rozcieńczenie 9 (D9)1/512264 μL D7 + 264 μL podłoża0,2:99,8
Rozcieńczenie 10 (D10)1/2048132 μL D8 + 396 μL0.05:99.95
Rozcieńczenie 11 (D11)Numer katalogowy 1/8192132 μL D9 + 396 μL podłoża0.01:99.99
Rozcieńczenie 12 (D12)1/32768132 μL D10 + 396 μL podłoża0.003:99.997

Tabela 1: Objętości surowicy i rozcieńczalnika wymagane do wytworzenia seryjnych rozcieńczeń surowicy w trzech egzemplarzach.

Zobacz materiał Zobacz materiał Zobacz materiał Zobacz materiał Zobacz materiał Zobacz materiał Zobacz materiał Zobacz materiał Zobacz materiał
Próbka surowicy #1Próbka surowicy #2Próbka surowicy #3Mono AB (mAB), kontrole i dodatkowe próbki
1cyfra arabska3456789101112
ZA1/21/21/21/21/21/21/21/21/250 ng MAb50 ng MAb50 ng MAb
W1/41/41/41/41/41/41/41/41/45 ng MAb5 ng MAb5 ng MAb
Z1/81/81/81/81/81/81/81/81/80,5 ng MAb0,5 ng MAb0,5 ng MAb
D1/161/161/161/161/161/161/161/161/16MO (-C)MO (-C)MO (-C)
E1/321/321/321/321/321/321/321/321/32Głos (+C)Głos (+C)Głos (+C)
Z1/641/641/641/641/641/641/641/641/64Próbka #1 1/512Próbka #1 1/512Próbka #1 1/512
Z1/2561/2561/2561/2561/2561/2561/2561/2561/256Próbka #2 1/512Próbka #2 1/512Próbka #2 1/512
H1/5121/5121/5121/5121/5121/5121/5121/5121/512Próbka #3 1/512Próbka #3 1/512Próbka #3 1/512

Tabela 2: Przykładowy układ płytki 96-dołkowej do oceny próbek surowicy naiwnej w rozcieńczeniach od 1/2 do 1/512. Wyższe rozcieńczenia są włączane do testu, jeśli ocenia się próbkę, o której wiadomo, że jest dodatnia pod kątem AAV NAbs (próbki po podaniu) lub jeśli wymagane jest wyższe miano. MO (-C): Sterowanie tylko za pomocą nośnika. VO (+C): Kontrola tylko wirusów i multimediów. mAb: Przeciwciało monoklonalne przeciwko AAV (kontrola pozytywna NAb).

4. Dzień 3 - Utrwalanie i dodawanie substratu do komórek

  1. Podgrzej podwielokrotność 1x PBS do temperatury 37 °C (~25 ml/płytka 96-dołkowa). Schłodzić oddzielne porcje PBS (~25 ml/96-dołkowa płytka) i podwójnie destylowaneH2O(DDW, ~25 mL/96-dołkowa płytka) do 4 °C. Rozpuścić osad BCIP/NBT (patrz Tabela materiałów) w 10 ml DDW w stożkowej probówce wirówkowej o pojemności 50 ml przez wirowanie (10 ml wystarcza na 2 x 96-dołkowe płytki).
  2. Odessać pożywkę z dołków 96-dołkowej płytki za pomocą pipety serologicznej lub podobnego elementu podłączonego do systemu aspiracji opartego na ssaniu lub odkurzacza pod wyciągiem. Delikatnie umieścić końcówkę pipety serologicznej w studzience i usunąć pożywkę, uważając, aby nie naruszyć przylegających komórek.
    1. Dodaj 50 μl RT 4% PFA do każdego dołka za pomocą pipety. Zawiń płytkę w folię i pozostaw ją w temperaturze RT na 10 minut, aby utrwalić komórki.
      UWAGA: Paraformaldehyd (PFA) jest prawdopodobnym czynnikiem rakotwórczym i jest toksyczny w kontakcie ze skórą, oczami lub wdychaniu. Trzymaj w dygestorium z odpowiednim wyposażeniem ochrony osobistej oraz maską na twarz. Przygotuj świeży 4% PFA rozcieńczony w PBS (wymagane ~ 7 ml na 96-dołkową płytkę).
  3. Przemyć i odessać komórki za pomocą 200 μl RT 1x PBS. Powtórz ten krok dwukrotnie.
    UWAGA: Pipeta wielokanałowa jest skuteczną opcją na wszystkich etapach pipetowania.
  4. Pobrać pipetą 200 μl wstępnie podgrzanego PBS do każdego dołka, owinąć płytkę folią i inkubować w temperaturze 65 °C przez 90 minut w celu denaturacji endogennej fosfatazy alkalicznej30.
  5. Odessać studzienki i przemyć komórki 200 μl zimnego (4 °C) PBS. Ponownie odessać, przemyć 200 μl zimnego DDW i ponownie odessać.
  6. Odpipetować 50 μl rozpuszczonego BCIP/NBT (przygotowanego w kroku 4.1) do każdej studzienki.
  7. Owinąć płytkę w folię i inkubować w temperaturze pokojowej przez 2-24 godz.
    UWAGA: Bądź konsekwentny w czasie inkubacji między biegami; Elastyczność czasowa pozwala użytkownikom fotografować studnie zarówno w dniu 3, jak i następnego dnia.
  8. Korzystając z kamery mikroskopu świetlnego, zrób zdjęcia każdej studzienki za pomocą soczewki obiektywowej 4x, upewniając się, że ta sama ekspozycja, balans bieli i ustawienia światła są konsekwentnie używane we wszystkich wykonywanych testach.
    1. Ustaw każdą studzienkę identycznie i upewnij się, że krawędzie studni nie są widoczne na zdjęciach. Zapisuj zdjęcia w formacie TIF lub podobnym.
      UWAGA: Konkretne ustawienia będą się różnić w zależności od mikroskopu, ale oznaczanie ilościowe będzie najbardziej skuteczne, jeśli oświetlenie tła będzie wysokie i spójne we wszystkich studzienkach (Rysunek 1B).

5. Kwantyfikacja w celu określenia aktywności neutralizującej za pomocą ImageJ

  1. Pobierz i zainstaluj bezpłatnie dostępne oprogramowanie "ImageJ" (patrz Spis materiałów).
  2. Otwórz obraz do analizy w ImageJ, wybierając Plik > Otwórz (Rysunek 2).
  3. Jeśli używasz kolorowych obrazów, przekonwertuj je na skalę szarości, wybierając opcję Obraz > Typ > 8-bitowy.
  4. Kliknij Obraz> Dostosuj > próg. Dostosuj próg, aż wszystkie kolorowe obszary zostaną pokolorowane na czerwono, ale tło nie. Po dodaniu NBT/BCIP kolorowy produkt osadza się w obszarze wokół komórek wyrażających hPLAP.
    UWAGA: Zaleca się używanie tego samego ustawienia progu dla wszystkich obrazów zarejestrowanych na tej samej płycie.
  5. Kliknij Analizuj > Ustaw pomiary i zaznacz pola wyboru Obszar, Ogranicz do progu, Ułamek obszaru i Wyświetl etykietę, a następnie kliknij OK.
  6. Aby określić odczyt sygnału (procent zabarwienia) danego dołka, kliknij Analizuj > Mierz. Kolumna "% Obszar" w wyskakującym okienku wyświetla odczyt sygnału.
  7. Przeprowadzić ocenę ilościową dla wszystkich kontrprób próbek. Należy wykluczyć wszelkie zanieczyszczone studnie, studzienki wykazujące nierównomierny rozkład komórek lub studzienki różniące się gęstością komórek lub oświetleniem.
    UWAGA: Patrz rysunek uzupełniający 1, aby zapoznać się z przykładami studni, które powinny być brane pod uwagę przy wyłączeniu. Zazwyczaj 3-4 dołki mogą wymagać wykluczenia z płytki 96-dołkowej. Rysunek 2 przedstawia wizualną reprezentację procesu kwantyfikacji za pomocą ImageJ.

Proces analizy obrazu; wykres regulacji progu; Interfejs oprogramowania do pomiaru pokrycia.
Rysunek 2: Kroki do określania procentowego zabarwienia za pomocą oprogramowania ImageJ. (A) Otwórz obraz do analizy za pomocą oprogramowania ImageJ. (B) Przekonwertuj obraz na 8-bitową skalę szarości. (C) Otwórz okno progu. (D) Dostosuj maksymalny próg tak, aby wszystkie kolorowe obszary były zakryte, ale obszar tła nie był (ten próg powinien być spójny na całej płycie). (E) Wybierz pole rozwijane "Analizuj", kliknij "Ustaw pomiary" i zaznacz "Obszar", "Ułamek obszaru", "Próg graniczny" i "Wyświetl etykietę", a następnie kliknij "OK". (F) Kliknij "Zmierz", aby zmierzyć pokryty obszar. Obszar % wskazuje proporcję obrazu, która została pokolorowana. Można go następnie wykorzystać z próbkami kontrolnymi w celu określenia miana TI50. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

6. Oznaczanie miana zahamowania transdukcji (TI50)

  1. Określ średni odczyt z powtórzeń (wykonując czynności opisane w kroku 5) dla następujących elementów: (1) Kontrola tylko nośnika (odczyt sygnału podstawowego). (2) Kontrola tylko wirusa + nośnika (maksymalny odczyt sygnału). (3) Wirus + próbki surowicy będące przedmiotem zainteresowania.
  2. Obliczyć procentową zawartość zahamowania, korzystając z następującego wzoru:
    100 - [(Odczyt sygnału próbki testowej (wirus + próbka surowicy będąca przedmiotem zainteresowania) - odczyt sygnału linii bazowej (kontrola tylko nośnika)) / (maksymalny odczyt sygnału (tylko nośnik i wirus) - odczyt sygnału bazowego) x 100] = % Zatrzymanie transdukcji13.
  3. Obliczyć procentową inhibicję transdukcji ze wszystkich kontrprób każdego rozcieńczenia dla wszystkich próbek, stosując wzór z ppkt 6.2. Określić średnią inhibicję transdukcji między kontrpróbami technicznymi dla każdego rozcieńczenia dla wszystkich próbek i prób kontrolnych.
  4. Obliczyć 50% miano zahamowania transdukcji (miano TI50) próbki będącej przedmiotem zainteresowania, określając najmniejsze rozcieńczenie próbki, które daje 50% lub większe zahamowanie aktywności transdukcji hPLAP. np. jeżeli rozcieńczenie próbki w stosunku 1:8 ma zahamowanie transdukcji większe niż 50% na podstawie obliczeń przeprowadzonych w ppkt 6.2 (a rozcieńczenie w stosunku 1:4 nie powoduje zahamowania transdukcji), podać miano TI50 jako 1/8.

7. Oznaczanie zneutralizowanych cząstek AAV

  1. Obliczyć liczbę zneutralizowanych cząstek AAV na μl surowicy dla danej próbki, stosując następujący wzór:
    ((MOI x liczba komórek/studzienka) / (objętość surowicy / współczynnik rozcieńczenia miana TI50)) / 2 = zneutralizowane cząstki AAV / μL surowicy9.
    UWAGA: Dzielenie przez 2 odpowiada za TI50 mierzący 50% zneutralizowanych cząstek. Dla próbki, która daje miano TI50 1/4 (25% surowicy, 75% rozcieńczalnika), w której w teście użyto 80 μl nierozcieńczonej surowicy i MOI 15k posiażonego na 1 x 104 komórkach, stosuje się następujące obliczenia: ((15000 x 10000) / (80/4)) / 2 = 3,75x106 zneutralizowanych cząstek / μL surowicy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Test transdukcji w celu ustalenia optymalnej dawki wirusa dla pokrycia płytki
Do tego testu wybrano komórki HT1080, dobrze znaną linię komórkową włókniakomięsaka. Stężenie 1 x 104 komórek HT1080 / studzienka zapewniało ~50% konfluencji komórek w każdym dołku 96-dołkowej płytki. Aby określić optymalne stężenie wirusa dla testu, rAAV kodujący gen reporterowy hPLAP (ludzka fosfataza alkaliczna łożyska) (AAV6-hPLAP)31 dodano w trzech egzemplarzach w zakresie stężeń cząs...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W niniejszym raporcie opisano test kolorymetryczny, który ocenia zakres neutralizacji AAV w danej próbce surowicy poprzez ocenę reakcji chromogennej odpowiadającej stopniowi transdukcji wirusa in vitro. Opracowanie protokołu opierało się na znanej reakcji chromogennej między enzymem fosfatazą alkaliczną a NBT/BCIP, który jest szeroko stosowany jako narzędzie do barwienia do wykrywania celów białkowych w zastosowaniach takich jak immunohistochemia oraz jako narzędzie reporterowe do oceny transdukcji wirusa 24,33,...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie zostało sfinansowane przez National Health and Medical Research Council Project Grant dla JRM i CJT (ID 1163732) oraz częściowo przez Program Wsparcia Infrastruktury Operacyjnej Rządu Wiktorii. SB jest wspierany przez wspólne stypendium doktoranckie Baker Heart and Diabetes Institute-La Trobe University. KLW jest wspierany przez The Shine On Foundation i Future Leader Fellowship od National Heart Foundation of Australia (ID 102539). JRM jest wspierany przez National Health and Medical Research Council Senior Research Fellowship (ID 1078985).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,05% Trypsyna/EDTAGibco25300-054
50 ml stożkowa probówka wirówkowaFalcon14-432-22Lub odpowiednik
75 cm2 kwadratowyFalcon353136Lub równoważna
96-dołkowa płaska płytkaFalcon353072
AAV6-CMV-hPLAP WektorBadania mięśni & Therapeutics Lab (University of Melbourne, Australia) AAV6-CMV-hPLAP może być dostarczony na życzenie.
Mysie przeciwciało monoklonalne anty-AAV6 (nienaruszone cząstki)
BCIP/NBTSIGMAFASTB5655
Szafa
Pipeta5 i 10 ml wkładki
do paskówPłodowa surowica bydlęcaGibco10099-141
Hemocytometr
o wysokim poziomie glukozy Zmodyfikowane podłoże Eagle Medium (DMEM)Gibco11965118
HT1080 Oprogramowanie
ImageJBezpłatnie dostępne:
37 &stopnie; C, 5% CO2
Light mikroskop z kamerąMożliwość robienia zdjęć z obiektywem 4x
Piekarnik Dla65 ° C inkubacja
ParaformaldehydMERCK30525-89-4
Penicylina StreptomycynaGibco15140-122
Sól fizjologiczna
Pipety i końcówki20 μ L, 200 μ L & Pojedyncze pipety i końcówki 1 ml 200 μ Pipeta wielokanałowa L
Filtr szybkiego uwalniania StericupMilliporeS2GPU10RESłuży do łączenia odczynników do pożywek
Roztwór błękitu trypanowegoSigma-AldrichT8154
PROBÓWKA PRÓŻNIOWA 8 ml CAT Separator surowicy Aktywator skrzepówGreiner BIO-ONE455071Służy do zbierania i przetwarzania surowicy od owiec
Kąpiel
z folii aluminiowej, (ADK6)PROGEN 610159 Przeciwciało monoklonalne kontroli dodatniej bezpieczeństwa do hodowli komórek i tkanek elektroniczna ATCC Inkubator https://imagej.nih.gov/ij/download.html buforowana fosforanami wodna

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bass-Stringer, S., et al. Adeno-associated virus gene therapy: Translational progress and future prospects in the treatment of heart failure. Heart, Lung and Circulation. 27 (11), 1285-1300 (2018).
  2. Casey, G. A., Papp, K. M., MacDonald, I. M. Ocular gene therapy with adeno-associated virus vectors: current outlook for patients and researchers. Journal of Ophthalmic and Vision Research. 15 (3), 396-399 (2020).
  3. Lykken, E. A., Shyng, C., Edwards, R. J., Rozenberg, A., Gray, S. J. Recent progress and considerations for AAV gene therapies targeting the central nervous system. Journal of Neurodevelopmental Disorders. 10 (1), 16(2018).
  4. Guggino, W. B., Cebotaru, L. Adeno-Associated Virus (AAV) gene therapy for cystic fibrosis: Current barriers and recent developments. Expert Opinion on Biological Therapy. 17 (10), 1265-1273 (2017).
  5. Perrin, G. Q., Herzog, R. W., Markusic, D. M. Update on clinical gene therapy for hemophilia. Blood. 133 (5), 407-414 (2019).
  6. Wang, D., Tai, P. W. L., Gao, G. Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery. Nature Reviews Drug Discovery. 18 (5), 358-378 (2019).
  7. Kuzmin, D. A., et al. The clinical landscape for AAV gene therapies. Nature Reviews Drug Discovery. 20 (3), 173-174 (2021).
  8. Russell, S., et al. Efficacy and safety of voretigene neparvovec (AAV2-hRPE65v2) in patients with RPE65-mediated inherited retinal dystrophy: A randomised, controlled, open-label, phase 3 trial. Lancet. 390 (10097), 849-860 (2017).
  9. Weber, T. Anti-AAV Antibodies in AAV gene therapy: Current challenges and possible solutions. Frontiers in Immunology. 12, 658399(2021).
  10. Weeks, K. L., et al. Phosphoinositide 3-kinase p110alpha is a master regulator of exercise-induced cardioprotection and PI3K gene therapy rescues cardiac dysfunction. Circulation: Heart Failure. 5 (4), 523-534 (2012).
  11. Gregorevic, P., et al. Systemic delivery of genes to striated muscles using adeno-associated viral vectors. Nature Medicine. 10 (8), 828-834 (2004).
  12. Bernardo, B. C., et al. Gene delivery of medium chain acyl-coenzyme A dehydrogenase induces physiological cardiac hypertrophy and protects against pathological remodelling. Clinical Science (London). 132 (3), 381-397 (2018).
  13. Meliani, A., et al. Determination of anti-adeno-associated virus vector neutralizing antibody titer with an in vitro reporter system. Human Gene Therapy Methods. 26 (2), 45-53 (2015).
  14. Falese, L., et al. Strategy to detect pre-existing immunity to AAV gene therapy. Gene Therapy. 24 (12), 768-778 (2017).
  15. Wang, D., et al. Adeno-Associated virus neutralizing antibodies in large animals and their impact on brain intraparenchymal gene transfer. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 11, 65-72 (2018).
  16. Wang, M., et al. Prediction of adeno-associated virus neutralizing antibody activity for clinical application. Gene Therapy. 22 (12), 984-992 (2015).
  17. Kruzik, A., et al. Detection of biologically relevant low-titer neutralizing antibodies against adeno-associated virus require sensitive in vitro assays. Human Gene Therapy Methods. 30 (2), 35-43 (2019).
  18. Lehtoranta, L., Villberg, A., Santanen, R., Ziegler, T. A novel, colorimetric neutralization assay for measuring antibodies to influenza viruses. Journal of Virological Methods. 159 (2), 271-276 (2009).
  19. Johnston, P. B., Grayston, J. T., Loosli, C. G. Adenovirus neutralizing antibody determination by colorimetric assay. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 94 (2), 338-343 (1957).
  20. Xiaoli Zhu, T. G. Nano-Inspired Biosensors for Protein Assay with Clinical Applications. , Elsevier. 237-264 (2019).
  21. Jungmann, A., Muller, O., Rapti, K. Cell-based measurement of neutralizing antibodies against adeno-associated virus (AAV). Methods in Molecular Biology. 1521, 109-126 (2017).
  22. Samineni, S., et al. Optimization, comparison, and application of colorimetric vs. chemiluminescence based indirect sandwich ELISA for measurement of human IL-23. Journal of Immunoassay and Immunochemistry. 27 (2), 183-193 (2006).
  23. Siddiqui, J., Remick, D. G. Improved sensitivity of colorimetric compared to chemiluminescence ELISAs for cytokine assays. Journal of Immunoassay and Immunochemistry. 24 (3), 273-283 (2003).
  24. Arnett, A. L., Garikipati, D., Wang, Z., Tapscott, S., Chamberlain, J. S. Immune responses to rAAV6: The Influence of canine parvovirus vaccination and neonatal administration of viral vector. Frontiers in Microbiology. 2, 220(2011).
  25. National Health and Medical Research Council. Australian code for the care and use of animals for scientific purposes. National Health and Medical Research Council. , Canberra, Australia. Available from: https://www.nhmrc.gov.au/about-us/publications/australian-code-care-and-use-animals-scientific-purposes (2013).
  26. Coecke, S., et al. Guidance on good cell culture practice. A report of the second ECVAM task force on good cell culture practice. Alternatives to Laboratory Animals. 33 (3), 261-287 (2005).
  27. Journal of Visualized Experiments. General Laboratory Techniques. Journal of Visualized Experiments Database. , (2018).
  28. AAV-HT1080 Cells. Stratagene. , Available from: https://www.chem-agilent.com/pdf/strata/240109.pdf (2003).
  29. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. 111 (3), 1-3 (2015).
  30. Bieber, S., et al. Extracorporeal delivery of rAAV with metabolic exchange and oxygenation. Scientific Reports. 3, 1538(2013).
  31. Winbanks, C. E., Beyer, C., Qian, H., Gregorevic, P. Transduction of skeletal muscles with common reporter genes can promote muscle fiber degeneration and inflammation. PLoS One. 7 (12), 51627(2012).
  32. Thomas, C. J., et al. Evidence that the MEK/ERK but not the PI3K/Akt pathway is required for protection from myocardial ischemia-reperfusion injury by 3',4'-dihydroxyflavonol. European Journal of Pharmacology. 758, 53-59 (2015).
  33. Barger, A., et al. Use of alkaline phosphatase staining to differentiate canine osteosarcoma from other vimentin-positive tumors. Veterinary Pathology. 42 (2), 161-165 (2005).
  34. Gregorevic, P., et al. Evaluation of vascular delivery methodologies to enhance rAAV6-mediated gene transfer to canine striated musculature. Molecular Therapy. 17 (8), 1427-1433 (2009).
  35. Sharma, A., Ghosh, A., Hansen, E. T., Newman, J. M., Mohan, R. R. Transduction efficiency of AAV 2/6, 2/8 and 2/9 vectors for delivering genes in human corneal fibroblasts. Brain Research Bulletin. 81 (2-3), 273-278 (2010).
  36. Smejkal, G. B., Kaul, C. A. Stability of nitroblue tetrazolium-based alkaline phosphatase substrates. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 49 (9), 1189-1190 (2001).
  37. Falese, L., et al. Strategy to detect pre-existing immunity to AAV gene therapy. Gene Therapy. 24 (12), 768-778 (2017).
  38. Orlowski, A., et al. Successful transduction with AAV Vectors after selective depletion of anti-aav antibodies by immunoadsorption. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 16, 192-203 (2020).
  39. Goossens, K., et al. Differential microRNA expression analysis in blastocysts by whole mount in situ hybridization and reverse transcription quantitative polymerase chain reaction on laser capture microdissection samples. Analytical Biochemistry. 423 (1), 93-101 (2012).
  40. Entrican, G., Wattegedera, S. R., Griffiths, D. J. Exploiting ovine immunology to improve the relevance of biomedical models. Molecular Immunology. 66 (1), 68-77 (2015).
  41. Walters, E. M., Prather, R. S. Advancing swine models for human health and diseases. Molecular Medicine. 110 (3), 212-215 (2013).
  42. Rapti, K., et al. Neutralizing antibodies against AAV serotypes 1, 2, 6, and 9 in sera of commonly used animal models. Molecular Therapy. 20 (1), 73-83 (2012).
  43. Tellez, J., et al. Characterization of naturally-occurring humoral immunity to AAV in sheep. PLoS One. 8 (9), 75142(2013).
  44. Gupta, S., et al. Recommendations for the validation of cell-based assays used for the detection of neutralizing antibody immune responses elicited against biological therapeutics. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 55 (5), 878-888 (2011).
  45. Gupta, S., et al. Recommendations for the design, optimization, and qualification of cell-based assays used for the detection of neutralizing antibody responses elicited to biological therapeutics. Journal of Immunological Methods. 321 (1-2), 1-18 (2007).
  46. Shankar, G., et al. Recommendations for the validation of immunoassays used for detection of host antibodies against biotechnology products. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 48 (5), 1267-1281 (2008).
  47. U.S. Department of Health and Human Services Food and Drug Administration. Center for Drug Evaluation and Research (CDER). Immunogenicity Testing of Therapeutic Protein Products — Developing and Validating Assays for Anti-Drug Antibody Detection. U.S. Department of Health and Human Services Food and Drug Administration. , (2019).
  48. Baatartsogt, N., et al. A sensitive and reproducible cell-based assay via secNanoLuc to detect neutralizing antibody against adeno-associated virus vector capsid. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 22, 162-171 (2021).
  49. Watano, R., Ohmori, T., Hishikawa, S., Sakata, A., Mizukami, H. Utility of micro mini pigs for evaluating liver-mediated gene expression in the presence of neutralizing antibody against vector capsid. Gene Therapy. 27 (9), 427-434 (2020).
  50. Majowicz, A., et al. Therapeutic hFIX activity achieved after single AAV5-hFIX treatment in Hemophilia B patients and NHPs with pre-existing anti-AAV5 NABs. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 14, 27-36 (2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Wykrywanie przeciwcia neutralizuj cychKolorymetryczny test AAV6Rekombinowany AAVNeutralizacja w surowicyReporter w postaci fosfatazy alkalicznejTransdukcja wirusowaAnaliza w programie ImageJWielokrotno infekcji MOITest przeciwcia monoklonalnych

Powiązane artykuły