Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Metoda krok po kroku do wykrywania przeciwciał neutralizujących przeciwko AAV za pomocą kolorymetrycznego testu komórkowego

4.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63419

⸱

7 grudnia 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Baker Heart and Diabetes Institute, 2Department of Physiology, Anatomy and Microbiology, La Trobe University, 3Florey Institute of Neuroscience and Mental Health, University of Melbourne, 4Department of Physiology, Centre for Muscle Research (CMR), The University of Melbourne, 5Department of Diabetes, Central Clinical School, Monash University, 6Baker Department of Cardiometabolic Health, The University of Melbourne, 7Department of Physiology and Department of Medicine Alfred Hospital, Monash University

W tym artykule

Podsumowanie

Kompleksowy protokół laboratoryjny i przepływ pracy analizy są opisane dla szybkiego, opłacalnego i prostego testu kolorymetrycznego opartego na komórkach do wykrywania elementów neutralizujących przeciwko AAV6.

Streszczenie

Rekombinowane wirusy związane z adenowirusami (rAAV) okazały się bezpiecznym i skutecznym wektorem do transferu materiału genetycznego w celu leczenia różnych schorzeń zarówno w laboratorium, jak i w klinice. Jednak istniejące wcześniej przeciwciała neutralizujące (NAb) przeciwko kapsydom AAV stanowią ciągłe wyzwanie dla skutecznego podawania terapii genowych zarówno w dużych modelach eksperymentalnych na zwierzętach, jak i w populacjach ludzkich. Wstępne badania przesiewowe w kierunku odporności gospodarza na AAV są konieczne, aby zapewnić skuteczność terapii genowych opartych na AAV zarówno jako narzędzia badawczego, jak i jako klinicznie opłacalnego środka terapeutycznego. Protokół ten opisuje kolorymetryczny test in vitro w celu wykrycia czynników neutralizujących przeciwko serotypowi 6 AAV (AAV6). Test wykorzystuje reakcję między AAV kodującym gen reporterowy fosfatazy alkalicznej (AP) a jego substratem NBT / BCIP, który po połączeniu generuje nierozpuszczalną, ilościową purpurową plamę.

W tym protokole, próbki surowicy są łączone z AAV wyrażającym AP i inkubowane, aby umożliwić wystąpienie potencjalnej aktywności neutralizującej. Mieszanina surowicy wirusa jest następnie dodawana do komórek, aby umożliwić transdukcję wirusa wszelkich AAV, które nie zostały zneutralizowane. Substrat NBT/BCIP jest dodawany i ulega reakcji chromogennej, odpowiadającej transdukcji wirusa i aktywności neutralizującej. Proporcja zabarwionego obszaru jest określana ilościowo za pomocą bezpłatnego narzędzia programowego do generowania mian neutralizujących. Test ten wykazuje silną dodatnią korelację między zabarwieniem a stężeniem wirusa. Ocena próbek surowicy owiec przed i po podaniu rekombinowanego AAV6 doprowadziła do dramatycznego wzrostu aktywności neutralizującej (od 125 do >10 000-krotny wzrost). Test wykazał odpowiednią czułość do wykrycia aktywności neutralizującej w rozcieńczeniach surowicy w >1:32 000. Ten test zapewnia prostą, szybką i opłacalną metodę wykrywania NAb przeciwko AAV.

Wprowadzenie

Wirusy związane z adenowirusami (AAV) są coraz częściej wykorzystywane jako wektory do dostarczania terapii genowych do próbnych metod leczenia różnych schorzeń, które wpływają na układ sercowo-naczyniowy, płucny, krążenia, oczny i ośrodkowy układ nerwowy1,2,3,4,5. Popularność wektorów AAV jako wiodącej platformy terapii genowej wynika z ich pozytywnego profilu bezpieczeństwa, długotrwałej ekspresji transgenu i szerokiego zakresu tropizmów specyficznych dla tkanki1,6. Pomyślne wyniki badań na zwierzętach utorowały drogę do ponad pięćdziesięciu badań klinicznych terapii genowej AAV, które z powodzeniem osiągnęły swoje punkty końcowe skuteczności7, a także do wprowadzenia na rynek pierwszego dostępnego na rynku leku terapii genowej AAV zatwierdzonego przez amerykańską Agencję ds. Żywności i Leków8. Po początkowych sukcesach, AAV nadal zyskuje na popularności w sektorach badań podstawowych i klinicznych jako wektor z wyboru i jest obecnie jedyną terapią genową in vivo zatwierdzoną do użytku klinicznego w USA i Europie9. Niemniej jednak obecność istniejących wcześniej przeciwciał neutralizujących (NAb) przeciwko kapsydom wektorów AAV pozostaje przeszkodą zarówno dla badań przedklinicznych, jak i skuteczności badań klinicznych. NAb są obecne zarówno w naiwnych populacjach ludzkich, jak i zwierzęcych i hamują transdukcję genów po podaniu in vivo wektora AAV1. Seropozytywność AAV jest kryterium wykluczającym dla większości badań klinicznych terapii genowej, dlatego wstępne badania przesiewowe w kierunku odporności gospodarza mają kluczowe znaczenie zarówno w laboratorium, jak i w klinice. Ustanowienie testu, który może wykryć obecność NAb przeciwko AAV, jest niezbędnym krokiem w przygotowaniu każdego projektu badawczego opartego na terapii genowej AAV. Ten raport koncentruje się na AAV6, który był przedmiotem zainteresowania badaczy ze względu na jego wydajną i selektywną transdukcję w mięśniach prążkowanych (serce i mięśnie szkieletowe)1,10,11,12. Terapia genowa jest uważana za obiecującą strategię celowania w serce, ponieważ trudno jest celować konkretnie w serce bez inwazyjnych zabiegów na otwartym sercu.

Aktywność neutralizująca jest zazwyczaj określana za pomocą komórkowego testu inhibicyjnego in vitro lub in vivo. In vivo (in vivo) Testy NAb zwykle polegają na podawaniu surowicy od osoby badanej (np. Człowieka lub dużego zwierzęcia) myszom, a następnie AAV z genem reporterowym, a następnie testowaniu ekspresji genu reporterowego lub odpowiadającego mu antygenu. Testy in vitro określają miana NAb poprzez inkubację surowicy lub osocza od człowieka lub dużego zwierzęcia w seryjnych rozcieńczeniach rekombinowanym AAV (rAAV), który wyraża gen reporterowy. Komórki są zakażone mieszaniną surowicy i wirusa, a stopień zahamowania ekspresji genu reporterowego jest oceniany w porównaniu z kontrolą. Testy in vitro są szeroko stosowane do badań przesiewowych NAb ze względu na ich stosunkowo niższy koszt, szybkość testowania oraz większą zdolność do standaryzacji i walidacji13,14 w porównaniu z testami in vivo. Testy in vivo są często zgłaszane jako mające większą czułość15,16, ale to samo twierdzenie zostało wysunięte w odniesieniu do testów in vitro14,17.

Do tej pory, testy in vitro NAb głównie wykorzystywały luminescencję (lucyferazy) jako gen reporterowy do wykrywania neutralizacji. Chociaż metoda oparta na świetle ma zalety w wielu kontekstach, kolorymetryczny/chromogenny test NAb może być korzystny w niektórych okolicznościach. Testy kolorymetryczne do oceny neutralizacji zostały z powodzeniem zastosowane w przypadku innych wirusów, takich jak grypa i adenowirus18,19. Ich atrakcyjność wynika z ich prostoty, niższych kosztów i wymogu korzystania wyłącznie z codziennej aparatury i narzędzi laboratoryjnych20. Testy NAb, które wykorzystują gen reporterowy oparty na luminescencji, wymagają kosztownych zestawów substratów, luminometru i odpowiedniego oprogramowania do analizy21. Ten test kolorymetryczny ma tę zaletę, że wymaga jedynie mikroskopu świetlnego i bardzo taniego podłoża. Doniesienia na temat czułości testów kolorymetrycznych i luminescencyjnych przyniosły sprzeczne wyniki. Jedno z badań sugerowało, że testy ELISA oparte na luminescencji wykazują większą czułość i porównywalną odtwarzalność z testami kolorymetrycznymi22, podczas gdy inne wykazało, że testy ELISA oparte na kolorymetrii nadają większą czułość23. W tym miejscu przedstawiono szczegółowy protokół testu NAb in vitro przeciwko AAV, który wykorzystuje reakcję chromogenną między AAV kodującym gen reporterowy fosfatazy alkalicznej (AP) a substratem nitro niebieskiego tetrazolu / 5-bromo-4-chloro-3-indolilofosforanu (NBT / BCIP). Ten protokół krok po kroku został opracowany w oparciu o poprzedni raport, w którym wykorzystano gen reporterowy hPLAP (ludzka fosfataza alkaliczna łożyska) (AAV6-hPLAP) do wykrywania aktywności neutralizującej przeciwko AAV24. Ten test jest opłacalny, efektywny czasowo, łatwy w konfiguracji i wymaga minimalnych umiejętności technicznych, sprzętu laboratoryjnego i odczynników. Co więcej, prostota tego testu daje mu potencjał do optymalizacji pod kątem szerokich zastosowań w różnych typach komórek, tkanek lub serotypów wirusów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie aspekty opieki nad zwierzętami i przeprowadzania eksperymentów zostały wykonane zgodnie z wytycznymi Florey Institute of Neuroscience and Mental Health oraz Australian Code for the Care and Use of Animals for Scientific Purposes zgodnie z referencją25. W badaniu wykorzystano owce rasy Merino w wieku od 1,5 do 3 lat. Schematyczny przegląd protokołu analizy przedstawiono na Rysunku 1.

Schemat testu inhibicji transdukcji komórkowej, przedstawiający komórki HT1080, metodę rozcieńczania, inkubację i mikroskopię.
Rycina 1: Schemat protokołu testu NAb. (A) Wizualna reprezentacja testu NAb ilustrująca główne etapy trwalszego, trzydniowego protokołu. W skrócie: komórki są hodowane i wysiewane przez noc. Następnego dnia przygotowuje się rozcieńczenia seryjne surowicy, inkubuje je z AAV, a następnie inkubuje z komórkami przez noc. Kolejnego dnia komórki są utrwalane, przemywane, inkubowane, łączone z substratem i ponownie inkubowane, po czym następuje obrazowanie i kwantyfikacja. (B) Reprezentatywne obrazy kontroli sygnału minimalnego (całkowita inhibicja AAV), kontroli sygnału maksymalnego (brak inhibicji) oraz próbki surowicy owczej z inhibicją sygnału na poziomie ~50%. Pasek skali = 0.5 mm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

1. Przygotowanie wstępne

  1. W przypadku oceny u owiec: pobrać krew do probówek z aktywatorem krzepnięcia i separatorem serum o pojemności 8 mL (patrz Tabela materiałów), pozostawić próbkę krwi w temperaturze pokojowej (RT) przez 20-30 min, a następnie wirować przy 2,100 x g przez 15 min. Przezroczysty supernatant tworzący się na górze probówek to surowica. Przenieść klarowną fazę wodną do probówek do mikrocentryfugi i przechowywać w temperaturze -80 °C.
    UWAGA: Surowica w temperaturze -80 °C pozostaje stabilna przez ok. 5 lat. Krew pobrano z żyły szyjnej za pomocą igły 16 G (z odciętym ścięciem) i strzykawki od zwierząt świadomych.
  2. Przeprowadzić inaktywację cieplną płodowej surowicy bydlęcej (FBS), umieszczając ją w kąpieli wodnej w temperaturze 56 °C przez 30 min i okresowo delikatnie mieszając. Dla zapewnienia precyzji umieścić termometr w drugiej butelce zawierającej równą objętość wody i włożyć ją do kąpieli wodnej w tym samym czasie co butelkę z FBS. Odliczanie czasu rozpocząć w momencie, gdy termometr osiągnie 56 °C.
  3. W każdym kolejnym kroku wykonywanym w komorze do hodowli komórkowej stosować odpowiednią technikę aseptyczną i zasady hodowli komórkowej26,27. Przed użyciem spryskać 70% etanolem wszystkie przedmioty oraz wnętrze komory, a po zakończeniu pracy wyczyścić 1% podchlorynem sodu.
  4. Przygotować kompletne podłoże DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium), łącząc DMEM z wysoką zawartością glukozy (4,5 g/L) (89%) z inaktywowaną cieplnie surowicą FBS (10%) i penicyliną ze streptomycyną (1%). Połączyć składniki i przefiltrować za pomocą sterylnego systemu filtracji próżniowej (rozmiar porów 0,22 µm, membrana polietersulfonowa) (patrz Tabela materiałów). Kompletne podłoże DMEM przechowywać w temperaturze 4 °C, owinięte w folię.
  5. Wykultywować komórki HT1080 (patrz Tabela materiałów) i pasażować w kolbie kwadratowej o powierzchni 75 cm2 zgodnie z opisem w Literaturze28. Przygotować wiele mrożonych zapasów komórek. Nie używać komórek po 20 pasażach, ponieważ dalsze pasażowanie może wpłynąć na wyniki analizy.

2. Dzień 1 - Wysiewanie komórek

  1. Przeprowadzić pasaż komórek HT1080 po osiągnięciu przez nie konfluencji na poziomie ~80%.
  2. Podgrzać do 37 °C w kąpieli wodnej całkowitą pożywkę DMEM (przygotowaną w kroku 1.4), 0,05% trypsynę z EDTA oraz 1x roztwór soli fizjologicznej w buforze fosforanowym (PBS). Usunąć pożywkę wzrostową z pasażowanych komórek za pomocą systemu aspiracyjnego.
    UWAGA: W niniejszym protokole cała aspiracja odbywa się przy użyciu systemu próżniowego z rurką podłączoną do sterylnej pipety serologicznej o objętości 5 mL.
  3. Przemyć komórki 10 mL podgrzanego (37 °C) 1x PBS, a następnie poddać trypsynizacji przez 3-4 min w 4 mL podgrzanej 0,05% trypsyny z EDTA, aby odczepić komórki od kolby.
  4. Zneutralizować działanie trypsyny, dodając 6 mL podgrzanej całkowitej pożywki DMEM, a następnie przenieść komórki pipetą do probówki 50 mL. Obliczyć liczbę i stężenie żywych komórek przy użyciu hemocytometru i metody wykluczania błękitu trypanowego29.
  5. Rozcieńczyć komórki do stężenia 1 x 105 komórek/mL w podgrzanej całkowitej pożywce DMEM. Wysiać 100 µL zawiesiny komórek na studzienkę do przezroczystych płytek 96-dołkowych z płaskim dnem (1 x 104 komórek na studzienkę). Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C, w atmosferze 5% dwutlenku węgla (CO2) przez noc, przez 16-22 h.

3. Dzień 2. – Zakażanie komórek

  1. Wyjąć płytkę/płytki z inkubatora i za pomocą mikroskopu świetlnego potwierdzić, że komórki są równomiernie rozmieszczone w studzienkach, a konfluencja wynosi ~50%. Jeśli konfluencja nie mieści się w zakresie 45%-55%, należy powtórzyć protokół z „Dnia 1” i odpowiednio dostosować początkową koncentrację komórek.
  2. Przygotować rozcieńczenia szeregowe badanych próbek surowicy w probówkach do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL, używając podgrzanej wcześniej pełnej pożywki DMEM jako rozcieńczalnika. Tabela 1 przedstawia schemat kaskady rozcieńczeń dla próbek wykonywanych w trzech powtórzeniach.
    1. Aby wykonać test w trzech powtórzeniach, przygotować roztwór roboczy AAV6-hPLAP o stężeniu 7,5 x 106 genomów wektora (vg)/µL (patrz Tabela materiałów), rozcieńczając roztwór zapasowy wirusa w 1x PBS.
    2. Do każdej probówki zawierającej 264 µL rozcieńczenia surowicy/pożywki dodać 66 µL roztworu roboczego wirusa o stężeniu 7,5 x 106 vg/µL (całkowita objętość rozcieńczenia 330 µL, patrz Tabela 1).
      UWAGA: Jest to odporny test, który nie wymaga idealnych warunków hodowli. Jednak aby zapewnić dokładną kwantyfikację i niezawodność każdego uruchomienia testu, konieczne jest uwzględnienie następujących elementów na wszystkich płytkach w tych samych warunkach doświadczalnych: (1) kontroli zawierającej tylko wirusa i pożywkę, (2) kontroli zawierającej tylko pożywkę oraz (3) próbki kontrolnej dodatniej NAb. Opisana objętość (330 µL) obejmuje próbki w trzech powtórzeniach + 10% zapasu mieszaniny surowicy i wirusa. W celu dokładnego określenia aktywności neutralizującej zdecydowanie zaleca się wykonywanie powtórzeń.
  3. Wymieszać rozcieńczenia wirusa/surowicy poprzez pipetowanie, a następnie umieścić probówki z mieszaninami wirusa i surowicy w inkubatorze w temperaturze 37 °C, przy 5% CO2 na 30 min, aby umożliwić ewentualną neutralizację.
  4. Do każdej studzienki na płytce 96-dołkowej zawierającej 1 x 104 komórek/studzienkę nanieść 100 µL mieszaniny wirusa/surowicy dla każdego rozcieńczenia.
    UWAGA: Pozwoli to uzyskać końcową koncentrację wirusa odpowiadającą wielokrotności infekcji (MOI) wynoszącej 15k wirusów/komórkę w każdej studzience. Tabela 2 przedstawia przykładowy układ próbek na płytce 96-dołkowej dla oceny próbek do rozcieńczenia 1/512.
  5. Owinąć płytkę 96-dołkową zawierającą komórki, surowicę i AAV-hPLAP folią i umieścić w inkubatorze w temperaturze 37 °C, przy 5% CO2 na noc przez 16-24 h, aby umożliwić wniknięcie AAV do komórek.
Oznaczenie kaskady rozcieńczeńRozcieńczenie3 x próbka (240 μL) + 10% objętości buforu (24 μL)Stosunek surowicy:pożywki
Rozcieńczenie 1 (D1)1/2264 μL surowicy + 264 μL pożywki50:50
Rozcieńczenie 2 (D2)1/4264 μL D1 + 264 μL pożywki25:75
Rozcieńczenie 3 (D3)1/8264 μL D2 + 264 μL pożywki12.5:87.5
Rozcieńczenie 4 (D4)1/16264 μL D3 + 264 μL pożywki6.25:93.75
Rozcieńczenie 5 (D5)1/32264 μL D4 + 264 μL pożywki3.13:96.87
Rozcieńczenie 6 (D6)1/64264 μL D5 + 264 μL pożywki1.56:98.44
Rozcieńczenie 7 (D7)1/128264 μL D5 + 264 μL pożywki0.78:99.22
Rozcieńczenie 8 (D8)1/256264 μL D5 + 264 μL pożywki0.39:99.61
Rozcieńczenie 9 (D9)1/512264 μL D7 + 264 μL pożywki0.2:99.8
Rozcieńczenie 10 (D10)1/2048132 μL D8 + 396 μL pożywki0.05:99.95
Rozcieńczenie 11 (D11)1/8192132 μL D9 + 396 μL pożywki0.01:99.99
Rozcieńczenie 12 (D12)1/32768132 μL D10 + 396 μL pożywki0.003:99.997

Tabela 1: Objętości surowicy i rozcieńczalnika wymagane do przygotowania rozcieńczeń seryjnych surowicy w trzech powtórzeniach.

Próbka surowicy nr 1Próbka surowicy nr 2Próbka surowicy nr 3Przeciwciała monoklonalne (mAB), kontrole i dodatkowe próbki
123456789101112
A1/21/21/21/21/21/21/21/21/250 ng MAb50 ng przeciwciała monoklonalnego (MAb)50 ng przeciwciał monoklonalnych (MAb)
B1/41/41/41/41/41/41/41/41/45 ng przeciwciała monoklonalnego (MAb)5 ng przeciwciał monoklonalnych (MAb)5 ng przeciwciała monoklonalnego (MAb)
C1/81/81/81/81/81/81/81/81/80,5 ng przeciwciał monoklonalnych (MAb)0,5 ng przeciwciał monoklonalnych (MAb)0,5 ng przeciwciała monoklonalnego (MAb)
D1/161/161/161/161/161/161/161/161/16MO (-C)MO (-C)MO (-C)
E1/321/321/321/321/321/321/321/321/32VO (+C)VO (+C)VO (+C)
F1/641/641/641/641/641/641/641/641/64Próbka nr 1 1/512Próbka nr 1 1/512Próbka nr 1 1/512
G1/2561/2561/2561/2561/2561/2561/2561/2561/256Próbka nr 2 1/512Próbka nr 2 1/512Próbka nr 2 1/512
H1/5121/5121/5121/5121/5121/5121/5121/5121/512Próbka nr 3 1/512Próbka nr 3 1/512Próbka nr 3 1/512

Tabela 2: Przykładowy układ płytki 96-dołkowej do oceny naiwnych próbek surowicy w rozcieńczeniach od 1/2 do 1/512. Wyższe rozcieńczenia są włączane do analizy w przypadku oceny próbki znanej jako pozytywna pod kątem przeciwciał neutralizujących AAV (próbki po podaniu) lub gdy wymagany jest wyższy miano. MO (-C): Kontrola zawierająca wyłącznie medium. VO (+C): Kontrola zawierająca wyłącznie wirusa i medium. mAb: Przeciwciało monoklonalne przeciwko AAV (pozytywna kontrola NAb).

4. Dzień 3 – utrwalanie i dodawanie substratu do komórek

  1. Podgrzać wcześniej porcję 1x PBS do 37 °C (~25 ml/płytka 96-dołkową). Schłodzić osobne alikwoty PBS (~25 ml/płytka 96-dołkową) oraz dwukrotnie destylowaną wody H2O (DDW, ~25 mL/płytkę 96-dołkową) do 4 °CRozpuścić pellet BCIP/NBT (patrz Tabela materiałów) w 10 ml podwójnie destylowanej wody (DDW) w 50 ml stożkowatej probówce do wirowania poprzez mieszanie w wstrząsaniu (10 ml jest wystarczające dla 2 płytek 96-dołkowych).
  2. Odssać medium z dołków płytki 96-dołkowej za pomocą pipety serologicznej lub podobnego urządzenia podłączonego do systemu aspiracyjnego lub wyciągu z dygestorium. Ostrożnie umieścić końcówkę pipety serologicznej w dołku i usunąć medium, uważając, aby nie uszkodzić przytwierdzonych komórek.
    1. Dodać 50 µL do każdego dołka przy użyciu pipety 4% PFA w temperaturze pokojowej. Plate owinąć folią i pozostawić w temperaturze pokojowej na 10 min w celu utrwalenia komórek.
      OSTRZEŻENIE: Paraformaldehyd (PFA) jest prawdopodobnym kancerogenem i jest toksyczny w przypadku kontaktu ze skórą lub oczami oraz po inhalacji. Należy z nim pracować w dygestorium, stosując odpowiednie środki ochrony osobistej oraz maskę ochronną. Przygotować świeży 4% roztwór PFA rozpuszczony w PBS (wymagane ok. 7 ml na płytkę 96-dołkową).
  3. Przemyć i odessać komórki za pomocą 200 µL z 1x PBS w temperaturze pokojowej. Powtórzyć ten krok dwukrotnie.
    UWAGA: Wielokanałowa pipeta jest wydajną opcją do wykonywania etapów pipetowania.
  4. Pipeta 200 µL podgrzanego wcześniej PBS do każdej studzienki, owinąć płytkę folią i inkubować w temperaturze 65 °C przez 90 min w celu denaturacji endogennej aktywności fosfatazy alkalicznej30.
  5. Odssać zawartość dołków i przemyć komórki za pomocą 200 µL zimna (4 °C) PBS. Ponownie odessać, przemyć w 200 µl zimnej wody destylowanej i ponownie ją odessaj.
  6. Pipeta 50 µL rozpuszczonego BCIP/NBT (przygotowanego w kroku 4.1) do każdej studzienki.
  7. Owiń płytkę folią i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 2–24 h.
    UWAGA: Należy zachować spójność czasu inkubacji pomiędzy poszczególnymi seriami; elastyczność czasowa umożliwia użytkownikom fotografowanie studzienek albo w 3. dniu, albo w dniu następnym.
  8. Za pomocą kamery do mikroskopu świetlnego należy wykonać zdjęcia każdej studzienki przy użyciu obiektywu 4x, dbając o zachowanie stałego czasu ekspozycji, balansu bieli oraz ustawień oświetlenia dla wszystkich przeprowadzonych analiz.
    1. Ustaw każdy dołek w identyczny sposób i upewnij się, że krawędzie dołków nie są widoczne na zdjęciach. Zapisz zdjęcia w formacie TIF lub podobnym.
      UWAGA: Konkretne ustawienia będą się różnić w zależności od mikroskopu, jednak kwantyfikacja będzie najskuteczniejsza, jeśli oświetlenie tła będzie intensywne i spójne we wszystkich dołkach (Rycina 1B).

5. Ilościowe określenie aktywności neutralizującej przy użyciu programu ImageJ

  1. Pobrać i zainstalować bezpłatne oprogramowanie „ImageJ” (patrz Tabela materiałów).
  2. Otworzyć obraz do analizy w programie ImageJ, wybierając File > Open (Rycina 2).
  3. W przypadku obrazów kolorowych przekształcić je na skalę szarości, wybierając Image > Type > 8-bit.
  4. Kliknąć Image > Adjust > Threshold. Dostosować próg tak, aby wszystkie kolorowe obszary zostały zaznaczone na czerwono, pomijając tło. Po dodaniu NBT/BCIP kolorowy produkt odłoży się w obszarze wokół komórek wykazujących ekspresję hPLAP.
    UWAGA: Zaleca się stosowania tych samych ustawień progu dla wszystkich obrazów zarejestrowanych na tej samej płytce.
  5. Kliknąć Analyze > Set Measurements, zaznaczyć pola wyboru Area, Limit to Threshold, Area Fraction oraz Display label, a następnie kliknąć Ok.
  6. Aby określić odczyt sygnału (procent zabarwienia) dla danej studni, kliknąć Analyze > Measure. Kolumna „% Area” w wyskakującym oknie wyświetla odczyt sygnału.
  7. Przeprowadzić kwantyfikację dla wszystkich powtórzeń próbek. Wykluczyć studnie zanieczyszczone, wykazujące nierównomierny rozkład komórek lub różnice w gęstości komórkowej bądź oświetleniu.
    UWAGA: Przykłady studni, które należy rozważyć do wykluczenia, znajdują się na Rycini uzupełniającej 1. Zazwyczaj z płytki 96-dołkowej może wymagać wykluczenia 3-4 studnie. Rycina 2 przedstawia wizualizację procesu kwantyfikacji z użyciem programu ImageJ.

Kroki analizy obrazu w oprogramowaniu z regulacją progu i wynikami procentowego pokrycia.
Rysunek 2: Kroki wyznaczania procentowego zabarwienia przy użyciu oprogramowania ImageJ. (A) Otwórz obraz do analizy w oprogramowaniu ImageJ. (B) Konwertuj obraz na 8-bitową skalę szarości. (C) Otwórz okno progu (threshold). (D) Dostosuj maksymalny próg tak, aby wszystkie kolorowe obszary zostały objęte, ale obszar tła nie (próg ten powinien być spójny dla całej płytki). (E) Wybierz menu rozwijane „Analyze”, kliknij „Set measurements” i zaznacz „Area”, „Area fraction”, „Limit threshold” oraz „Display label”, a następnie kliknij „OK”. (F) Kliknij „Measure”, aby zmierzyć obszar pokrycia. Wartość % area wskazuje proporcję zabarwionego obrazu. Można ją następnie wykorzystać wraz z próbkami kontrolnymi do wyznaczenia miana TI50. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

6. Wyznaczenie miana hamowania transdukcji (TI50)

  1. Wyznacz średni odczyt z powtórzeń (stosując kroki opisane w punkcie 5) dla następujących próbek: (1) kontroli zawierającej tylko medium (odczyt sygnału podstawowego). (2) kontroli zawierającej tylko wirusa i medium (maksymalny odczyt sygnału). (3) próbek surowicy z wirusem.
  2. Oblicz procent inhibicji, korzystając z następującego wzoru:
    100 - [(odczyt sygnału próbki testowej (wirus + badana próbka surowicy) - odczyt sygnału podstawowego (kontrola z samym medium)) / (maksymalny odczyt sygnału (tylko medium i wirus) - odczyt sygnału podstawowego) x 100] = % inhibicji transdukcji13.
  3. Oblicz % inhibicji transdukcji dla wszystkich powtórzeń każdego rozcieńczenia dla wszystkich próbek, korzystając ze wzoru w punkcie 6.2. Wyznacz średnią inhibicję transdukcji pomiędzy powtórzeniami technicznymi dla każdego rozcieńczenia dla wszystkich próbek i kontroli.
  4. Oblicz miano 50% inhibicji transdukcji (miano TI50) dla badanej próbki, określając najniższe rozcieńczenie próbki, które daje 50% lub wyższą inhibicję transdukcji aktywności hPLAP. Na przykład, jeśli rozcieńczenie 1/8 próbki wykazuje inhibicję transdukcji większą niż 50% na podstawie obliczeń wykonanych w punkcie 6.2 (a rozcieńczenie 1/4 nie wykazuje), miano TI50 należy podać jako 1/8.

7. Oznaczanie zneutralizowanych cząsteczek AAV

  1. Oblicz liczbę zneutralizowanych cząsteczek AAV na µL surowicy dla danej próbki, stosując poniższy wzór:
    ((MOI x liczba komórek/dołek) / (objętość surowicy / czynnik rozcieńczenia miana TI50)) / 2 = liczba zneutralizowanych cząsteczek AAV / µL surowicy9.
    UWAGA: Dzielenie przez 2 wynika z faktu, że TI50 mierzy 50% zneutralizowanych cząsteczek. Dla próbki, która daje miano TI50 wynoszące 1/4 (25% surowicy, 75% rozcieńczalnika), w której w teście zużyto 80 μL nierozcieńczonej surowicy i zastosowano MOI 15k na 1 x 104 wysianych komórek, należy przeprowadzić następujące obliczenia: ((15000 x 10000) / (80/4)) / 2 = 3,75x106 zneutralizowanych cząsteczek / µL surowicy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Test transdukcji w celu ustalenia optymalnej dawki wirusa dla pokrycia płytki
Do niniejszego testu wybrano komórki HT1080, dobrze poznaną linię komórkową włókniaka. Stężenie 1 x 104 komórek HT1080/dołek zapewniło ~50% konfluencji komórek w każdym dołku płytki 96-dołkowej. Aby określić optymalne stężenie wirusa dla testu, w trzech powtórzeniach dodano rAAV kodujący gen reporterowy hPLAP (ludzką łożyskową fosfatazę alkaliczną) (AAV6-hPLAP)31 w zakresie stężeń cząstek ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W niniejszym raporcie opisano test kolorymetryczny, który ocenia zakres neutralizacji AAV w danej próbce surowicy poprzez ocenę reakcji chromogennej odpowiadającej stopniowi transdukcji wirusa in vitro. Opracowanie protokołu opierało się na znanej reakcji chromogennej między enzymem fosfatazą alkaliczną a NBT/BCIP, który jest szeroko stosowany jako narzędzie do barwienia do wykrywania celów białkowych w zastosowaniach takich jak immunohistochemia oraz jako narzędzie reporterowe do oceny transdukcji wirusa 24,33,...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

To badanie zostało sfinansowane przez National Health and Medical Research Council Project Grant dla JRM i CJT (ID 1163732) oraz częściowo przez Program Wsparcia Infrastruktury Operacyjnej Rządu Wiktorii. SB jest wspierany przez wspólne stypendium doktoranckie Baker Heart and Diabetes Institute-La Trobe University. KLW jest wspierany przez The Shine On Foundation i Future Leader Fellowship od National Heart Foundation of Australia (ID 102539). JRM jest wspierany przez National Health and Medical Research Council Senior Research Fellowship (ID 1078985).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,05% Trypsyna/EDTAGibco25300-054
50 ml stożkowa probówka wirówkowaFalcon14-432-22Lub odpowiednik
75 cm2 kwadratowyFalcon353136Lub równoważna
96-dołkowa płaska płytkaFalcon353072
AAV6-CMV-hPLAP WektorBadania mięśni & Therapeutics Lab (University of Melbourne, Australia) AAV6-CMV-hPLAP może być dostarczony na życzenie.
Mysie przeciwciało monoklonalne anty-AAV6 (nienaruszone cząstki)
BCIP/NBTSIGMAFASTB5655
Szafa
Pipeta5 i 10 ml wkładki
do paskówPłodowa surowica bydlęcaGibco10099-141
Hemocytometr
o wysokim poziomie glukozy Zmodyfikowane podłoże Eagle Medium (DMEM)Gibco11965118
HT1080 Oprogramowanie
ImageJBezpłatnie dostępne:
37 &stopnie; C, 5% CO2
Light mikroskop z kamerąMożliwość robienia zdjęć z obiektywem 4x
Piekarnik Dla65 ° C inkubacja
ParaformaldehydMERCK30525-89-4
Penicylina StreptomycynaGibco15140-122
Sól fizjologiczna
Pipety i końcówki20 μ L, 200 μ L & Pojedyncze pipety i końcówki 1 ml 200 μ Pipeta wielokanałowa L
Filtr szybkiego uwalniania StericupMilliporeS2GPU10RESłuży do łączenia odczynników do pożywek
Roztwór błękitu trypanowegoSigma-AldrichT8154
PROBÓWKA PRÓŻNIOWA 8 ml CAT Separator surowicy Aktywator skrzepówGreiner BIO-ONE455071Służy do zbierania i przetwarzania surowicy od owiec
Kąpiel
z folii aluminiowej, (ADK6)PROGEN 610159 Przeciwciało monoklonalne kontroli dodatniej bezpieczeństwa do hodowli komórek i tkanek elektroniczna ATCC Inkubator https://imagej.nih.gov/ij/download.html buforowana fosforanami wodna

Bibliografia

  1. Bass-Stringer, S., et al. Adeno-associated virus gene therapy: Translational progress and future prospects in the treatment of heart failure. Heart, Lung and Circulation. 27 (11), 1285-1300 (2018).
  2. Casey, G. A., Papp, K. M., MacDonald, I. M. Ocular gene therapy with adeno-associated virus vectors: current outlook for patients and researchers. Journal of Ophthalmic and Vision Research. 15 (3), 396-399 (2020).
  3. Lykken, E. A., Shyng, C., Edwards, R. J., Rozenberg, A., Gray, S. J. Recent progress and considerations for AAV gene therapies targeting the central nervous system. Journal of Neurodevelopmental Disorders. 10 (1), 16(2018).
  4. Guggino, W. B., Cebotaru, L. Adeno-Associated Virus (AAV) gene therapy for cystic fibrosis: Current barriers and recent developments. Expert Opinion on Biological Therapy. 17 (10), 1265-1273 (2017).
  5. Perrin, G. Q., Herzog, R. W., Markusic, D. M. Update on clinical gene therapy for hemophilia. Blood. 133 (5), 407-414 (2019).
  6. Wang, D., Tai, P. W. L., Gao, G. Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery. Nature Reviews Drug Discovery. 18 (5), 358-378 (2019).
  7. Kuzmin, D. A., et al. The clinical landscape for AAV gene therapies. Nature Reviews Drug Discovery. 20 (3), 173-174 (2021).
  8. Russell, S., et al. Efficacy and safety of voretigene neparvovec (AAV2-hRPE65v2) in patients with RPE65-mediated inherited retinal dystrophy: A randomised, controlled, open-label, phase 3 trial. Lancet. 390 (10097), 849-860 (2017).
  9. Weber, T. Anti-AAV Antibodies in AAV gene therapy: Current challenges and possible solutions. Frontiers in Immunology. 12, 658399(2021).
  10. Weeks, K. L., et al. Phosphoinositide 3-kinase p110alpha is a master regulator of exercise-induced cardioprotection and PI3K gene therapy rescues cardiac dysfunction. Circulation: Heart Failure. 5 (4), 523-534 (2012).
  11. Gregorevic, P., et al. Systemic delivery of genes to striated muscles using adeno-associated viral vectors. Nature Medicine. 10 (8), 828-834 (2004).
  12. Bernardo, B. C., et al. Gene delivery of medium chain acyl-coenzyme A dehydrogenase induces physiological cardiac hypertrophy and protects against pathological remodelling. Clinical Science (London). 132 (3), 381-397 (2018).
  13. Meliani, A., et al. Determination of anti-adeno-associated virus vector neutralizing antibody titer with an in vitro reporter system. Human Gene Therapy Methods. 26 (2), 45-53 (2015).
  14. Falese, L., et al. Strategy to detect pre-existing immunity to AAV gene therapy. Gene Therapy. 24 (12), 768-778 (2017).
  15. Wang, D., et al. Adeno-Associated virus neutralizing antibodies in large animals and their impact on brain intraparenchymal gene transfer. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 11, 65-72 (2018).
  16. Wang, M., et al. Prediction of adeno-associated virus neutralizing antibody activity for clinical application. Gene Therapy. 22 (12), 984-992 (2015).
  17. Kruzik, A., et al. Detection of biologically relevant low-titer neutralizing antibodies against adeno-associated virus require sensitive in vitro assays. Human Gene Therapy Methods. 30 (2), 35-43 (2019).
  18. Lehtoranta, L., Villberg, A., Santanen, R., Ziegler, T. A novel, colorimetric neutralization assay for measuring antibodies to influenza viruses. Journal of Virological Methods. 159 (2), 271-276 (2009).
  19. Johnston, P. B., Grayston, J. T., Loosli, C. G. Adenovirus neutralizing antibody determination by colorimetric assay. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 94 (2), 338-343 (1957).
  20. Xiaoli Zhu, T. G. Nano-Inspired Biosensors for Protein Assay with Clinical Applications. , Elsevier. 237-264 (2019).
  21. Jungmann, A., Muller, O., Rapti, K. Cell-based measurement of neutralizing antibodies against adeno-associated virus (AAV). Methods in Molecular Biology. 1521, 109-126 (2017).
  22. Samineni, S., et al. Optimization, comparison, and application of colorimetric vs. chemiluminescence based indirect sandwich ELISA for measurement of human IL-23. Journal of Immunoassay and Immunochemistry. 27 (2), 183-193 (2006).
  23. Siddiqui, J., Remick, D. G. Improved sensitivity of colorimetric compared to chemiluminescence ELISAs for cytokine assays. Journal of Immunoassay and Immunochemistry. 24 (3), 273-283 (2003).
  24. Arnett, A. L., Garikipati, D., Wang, Z., Tapscott, S., Chamberlain, J. S. Immune responses to rAAV6: The Influence of canine parvovirus vaccination and neonatal administration of viral vector. Frontiers in Microbiology. 2, 220(2011).
  25. National Health and Medical Research Council. Australian code for the care and use of animals for scientific purposes. National Health and Medical Research Council. , Canberra, Australia. Available from: https://www.nhmrc.gov.au/about-us/publications/australian-code-care-and-use-animals-scientific-purposes (2013).
  26. Coecke, S., et al. Guidance on good cell culture practice. A report of the second ECVAM task force on good cell culture practice. Alternatives to Laboratory Animals. 33 (3), 261-287 (2005).
  27. Journal of Visualized Experiments. General Laboratory Techniques. Journal of Visualized Experiments Database. , (2018).
  28. AAV-HT1080 Cells. Stratagene. , Available from: https://www.chem-agilent.com/pdf/strata/240109.pdf (2003).
  29. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. 111 (3), 1-3 (2015).
  30. Bieber, S., et al. Extracorporeal delivery of rAAV with metabolic exchange and oxygenation. Scientific Reports. 3, 1538(2013).
  31. Winbanks, C. E., Beyer, C., Qian, H., Gregorevic, P. Transduction of skeletal muscles with common reporter genes can promote muscle fiber degeneration and inflammation. PLoS One. 7 (12), 51627(2012).
  32. Thomas, C. J., et al. Evidence that the MEK/ERK but not the PI3K/Akt pathway is required for protection from myocardial ischemia-reperfusion injury by 3',4'-dihydroxyflavonol. European Journal of Pharmacology. 758, 53-59 (2015).
  33. Barger, A., et al. Use of alkaline phosphatase staining to differentiate canine osteosarcoma from other vimentin-positive tumors. Veterinary Pathology. 42 (2), 161-165 (2005).
  34. Gregorevic, P., et al. Evaluation of vascular delivery methodologies to enhance rAAV6-mediated gene transfer to canine striated musculature. Molecular Therapy. 17 (8), 1427-1433 (2009).
  35. Sharma, A., Ghosh, A., Hansen, E. T., Newman, J. M., Mohan, R. R. Transduction efficiency of AAV 2/6, 2/8 and 2/9 vectors for delivering genes in human corneal fibroblasts. Brain Research Bulletin. 81 (2-3), 273-278 (2010).
  36. Smejkal, G. B., Kaul, C. A. Stability of nitroblue tetrazolium-based alkaline phosphatase substrates. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 49 (9), 1189-1190 (2001).
  37. Falese, L., et al. Strategy to detect pre-existing immunity to AAV gene therapy. Gene Therapy. 24 (12), 768-778 (2017).
  38. Orlowski, A., et al. Successful transduction with AAV Vectors after selective depletion of anti-aav antibodies by immunoadsorption. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 16, 192-203 (2020).
  39. Goossens, K., et al. Differential microRNA expression analysis in blastocysts by whole mount in situ hybridization and reverse transcription quantitative polymerase chain reaction on laser capture microdissection samples. Analytical Biochemistry. 423 (1), 93-101 (2012).
  40. Entrican, G., Wattegedera, S. R., Griffiths, D. J. Exploiting ovine immunology to improve the relevance of biomedical models. Molecular Immunology. 66 (1), 68-77 (2015).
  41. Walters, E. M., Prather, R. S. Advancing swine models for human health and diseases. Molecular Medicine. 110 (3), 212-215 (2013).
  42. Rapti, K., et al. Neutralizing antibodies against AAV serotypes 1, 2, 6, and 9 in sera of commonly used animal models. Molecular Therapy. 20 (1), 73-83 (2012).
  43. Tellez, J., et al. Characterization of naturally-occurring humoral immunity to AAV in sheep. PLoS One. 8 (9), 75142(2013).
  44. Gupta, S., et al. Recommendations for the validation of cell-based assays used for the detection of neutralizing antibody immune responses elicited against biological therapeutics. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 55 (5), 878-888 (2011).
  45. Gupta, S., et al. Recommendations for the design, optimization, and qualification of cell-based assays used for the detection of neutralizing antibody responses elicited to biological therapeutics. Journal of Immunological Methods. 321 (1-2), 1-18 (2007).
  46. Shankar, G., et al. Recommendations for the validation of immunoassays used for detection of host antibodies against biotechnology products. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 48 (5), 1267-1281 (2008).
  47. U.S. Department of Health and Human Services Food and Drug Administration. Center for Drug Evaluation and Research (CDER). Immunogenicity Testing of Therapeutic Protein Products — Developing and Validating Assays for Anti-Drug Antibody Detection. U.S. Department of Health and Human Services Food and Drug Administration. , (2019).
  48. Baatartsogt, N., et al. A sensitive and reproducible cell-based assay via secNanoLuc to detect neutralizing antibody against adeno-associated virus vector capsid. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 22, 162-171 (2021).
  49. Watano, R., Ohmori, T., Hishikawa, S., Sakata, A., Mizukami, H. Utility of micro mini pigs for evaluating liver-mediated gene expression in the presence of neutralizing antibody against vector capsid. Gene Therapy. 27 (9), 427-434 (2020).
  50. Majowicz, A., et al. Therapeutic hFIX activity achieved after single AAV5-hFIX treatment in Hemophilia B patients and NHPs with pre-existing anti-AAV5 NABs. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 14, 27-36 (2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Wykrywanie przeciwciał neutralizującychKolorymetryczny test AAV6Rekombinowany AAVNeutralizacja w surowicyReporter w postaci fosfatazy alkalicznejTransdukcja wirusowaAnaliza w programie ImageJWielokrotność infekcji (MOI)Test przeciwciał monoklonalnych
Metoda krok po kroku do wykrywania przeciwciał neutralizujących przeciwko AAV za pomocą kolorymetrycznego testu komórkowego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.