Artykuł metodologiczny

Ruchliwość pojedynczych cząsteczek i klastrów dwukierunkowej kinezyny-5 Cin8 oczyszczonej z komórek S. cerevisiae

2.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63425

⸱

2 lutego 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, Ben-Gurion University of the Negev, Israel, 2Department of Biotechnology Engineering, Ben-Gurion University of the Negev, Israel

W tym artykule

Informacja o sprostowaniu

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Podsumowanie

Dwukierunkowa mitoza kinezyna-5 Cin8 gromadzi się w klastrach, które rozdzielają się i łączą podczas swojej ruchliwości. Akumulacja w gromadach zmienia również prędkość i kierunkowość Cin8. W tym miejscu opisano protokół oznaczania ruchliwości z oczyszczonym Cin8-GFP oraz analizy właściwości ruchliwych pojedynczych cząsteczek i klastrów Cin8.

Streszczenie

Mitotyczne bipolarne silniki kinezynowe-5 pełnią podstawowe funkcje w dynamice wrzeciona. Silniki te wykazują strukturę homo-tetrameryczną z dwiema parami katalitycznych domen motorycznych, położonymi na przeciwległych końcach kompleksu aktywnego. Ta unikalna architektura umożliwia silnikom kinezyny-5 sieciowanie i przesuwanie antyrównoległych mikrotubul wrzeciona (MT), zapewniając w ten sposób siłę skierowaną na zewnątrz, która oddziela bieguny wrzeciona. Wcześniej uważano, że silniki Kinesin-5 są skierowane wyłącznie na plus-end. Jednak ostatnie badania wykazały, że kilka grzybowych silników kinezyny-5 jest skierowanych na poziomie pojedynczej cząsteczki i może zmieniać kierunkowość w różnych warunkach eksperymentalnych. Saccharomyces cerevisiae kinesin-5 Cin8 jest przykładem takiego dwukierunkowego białka motorycznego: w warunkach wysokiej siły jonowej pojedyncze cząsteczki Cin8 poruszają się w kierunku ujemnym końca MT. Wykazano również, że Cin8 tworzy ruchliwe gromady, głównie na ujemnym końcu MT, a takie grupowanie pozwala Cin8 na zmianę kierunku i powolną, ukierunkowaną ruchliwość na dodatnim końcu. Ten artykuł zawiera szczegółowy protokół dla wszystkich etapów pracy z kinezyną-5 Cin8 znakowaną GFP, od nadekspresji białka w komórkach S. cerevisiae i jego oczyszczania do testu ruchliwości pojedynczej cząsteczki in vitro. Nowo opracowana metoda opisana tutaj pomaga rozróżnić pojedyncze cząsteczki i klastry Cin8 na podstawie ich intensywności fluorescencji. Metoda ta umożliwia odrębną analizę ruchliwości pojedynczych cząsteczek i klastrów Cin8, zapewniając tym samym charakterystykę zależności ruchliwości Cin8 od wielkości jego klastra.

Wprowadzenie

Duża liczba zdarzeń związanych z motylicznością w komórkach eukariotycznych jest zapośredniczona przez funkcję białek motorowych. Motory te przemieszczają się wzdłuż filamentów cytoszkieletu: filamentów aktynowych oraz mikrotubul (MT), przekształcając energię chemiczną hydrolizy ATP w siły kinetyczne i mechaniczne niezbędne do napędzania biologicznej motyliczności wewnątrz komórek. Oparty na MT białko Cin8 z S. cerevisiae jest bipolarnym, homotetramerycznym motorem z rodziny kinezyn-5, który sieciuje mikrotubule wrzeciona i przesuwa je względem siebie1. Cin8 pełni kluczowe funkcje podczas mitozy, w procesie budowy wrzeciona2,3,4 oraz wydłużania wrzeciona podczas anafazy5,6,7. Wcześniej wykazano, że Cin8 jest motorem dwukierunkowym, który zmienia kierunkowość w zależności od różnych warunków eksperymentalnych. Na przykład, w warunkach wysokiej siły jonowej pojedyncze motory Cin8 poruszają się w stronę końców minus mikrotubul, podczas gdy w klastrach, w testach poślizgu MT z wieloma motorami oraz pomiędzy antyrównoległymi MT, motory Cin8 poruszają się głównie w stronę końców plus mikrotubul8,9,10,1,12. Odkrycia te były wysoce nieoczekiwane z kilku powodów. Po pierwsze, Cin8 posiada katalityczną domenę motorową na N-końcu, a uważano wcześniej, że takie motory są wyłącznie skierowane w stronę końców plus, podczas gdy wykazano, że na poziomie pojedynczych cząsteczek Cin8 jest skierowany w stronę końców minus. Po drugie, wierzono, że motory kinezynowe są jednokierunkowe (skierowane albo w stronę końców minus, albo plus), natomiast wykazano, że Cin8 jest dwukierunkowy, w zależności od warunków eksperymentalnych. Wreszcie, ze względu na orientację MT we wrzecionie mitotycznym, klasyczną rolę motorów kinezyn-5 w rozdzielaniu biegunów wrzeciona podczas jego budowy i anafazy B można było wyjaśnić jedynie poprzez ich motyliczność skierowaną w stronę końców plus na mikrotubulach, które sieciują1,13. Po pierwszych doniesieniach o dwukierunkowości Cin8 wykazano, że kilka innych motorów kinezynowych również jest dwukierunkowych14,15,16, co wskazuje, że dwukierunkowa motyliczność motorów kinezynowych może być częstsza, niż wcześniej sądzono.

Wcześniej zgłoszono, że w komórkach Cin8 również porusza się w sposób dwukierunkowy8, co wspiera tezę, że dwukierunkowa ruchliwość niektórych motorów kinesyny-5 jest istotna dla ich funkcji wewnątrzkomórkowych. Ponadto, ponieważ trzy raportowane jako dwukierunkowe motory kinesyny-5 pochodzą z komórek grzybów, niedawno zaproponowano możliwą rolę dwukierunkowości motorów kinesyny-5 w takich komórkach10. Zgodnie z tym modelem, w zamkniętej mitozie komórek grzybów, w której otoczka jądrowa nie ulega rozpadowi podczas mitozy, motory kinesyny-5 dostarczają początkowej siły rozdzielającej bieguny wrzeciona przed jego pełnym uformowaniem. Aby zrealizować to zadanie, przed rozdzieleniem biegunów wrzeciona, motory kinesyny-5 lokalizują się w pobliżu biegunów dzięki ruchliwości skierowanej do końca minus pojedynczych MT jądrowych. Po osiągnięciu tej pozycji motory kinesyny-5 gromadzą się, zmieniają kierunkowość, przechwytują i sieciują MT pochodzące z sąsiednich biegunów wrzeciona. Następnie motory kinesyny-5 zapewniają początkową separację biegunów poprzez ruchliwość skierowaną do końca plus na sieciowanych przez siebie MT. Według tego modelu, zarówno ruchliwość skierowana do końca minus na pojedynczych MT, jak i ruchliwość skierowana do końca plus na sieciowanych MT podczas ślizgania antyrównoległego są niezbędne, aby motory kinesyny-5 grzybów mogły pełnić swoje role w budowie wrzeciona1,13.

Ogólnym celem opisanego метода jest otrzymanie wysokiej czystości grzybiczej kinezyny-5 Cin8 z etykietą GFP oraz przeprowadzenie analiz ruchomości pojedynczych cząsteczek (Rycina 1), przy jednoczesnej oddzielnej analizie ruchomości pojedynczych cząsteczek i skupisk Cin8. Rozróżnienie między pojedynczymi cząsteczkami a skupiskami jest istotne, ponieważ jednym z czynników, które wykazano, że wpływają na kierunkowość Cin8, jest jej gromadzenie się w skupiskach na mikrotubulach (MT)10,12. Alternatywne analizy ruchomości, takie jak testy poślizgu po powierzchni MT oraz testy przesuwania MT, nie dostarczają informacji na temat aktywności pojedynczych białek motorowych17,18. Opisane tutaj niezawodne metody analizy i badania ruchomości pojedynczych cząsteczek zostały z sukcesem zastosowane do charakterystyki różnych aspektów motorów kinezyny-5, Cin8 i Kip110,1,12,14,19,20.

W niniejszym materiale przedstawiono szczegółowy protokół nadekspresji i oczyszczania Cin8, polimeryzacji MT oraz analizy ruchliwości pojedynczych cząsteczek. Ponadto opisano analizy służące do rozróżnienia pojedynczych cząsteczek od skupisk Cin8 oraz wyznaczania prędkości pojedynczych motorów i skupisk za pomocą analizy średniego przesunięcia (MD) i średniego kwadratu przesunięcia (MSD). Celem tego protokołu jest pomóc badaczom w wizualizacji wszystkich etapów procedur oraz wspomóc rozwiązywanie problemów w tego typu analizach.

figure-introduction-1
Rycina 1: Schematyczna reprezentacja testu ruchliwości pojedynczych cząsteczek. Biotynilowane fluorescencyjne mikrotubule (MT) są przytwierdzone do szklanej powierzchni pokrytej awidyną, która oddziałuje z przytwiecioną do powierzchni biotynilowaną BSA. Zielona strzałka przedstawia kierunek ruchu pojedynczych cząsteczek Cin8 w warunkach wysokiej siły jonowej. +/- reprezentują polarność MT. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie buforów i odczynników

  1. Bufory
    1. -Leu aa dropout mix: Wymieszać po 2 g adeniny, uracylu, tryptofanu, histydyny, lizyny i metioniny i przechowywać w temperaturze pokojowej.
    2. Selektywne podłoże dla drożdży z rafinozą (1 L): Wymieszać 6,7 g bazy azotowej dla drożdży (z siarczanem amonu), 2 g mieszaniny -Leu aa dropout mix oraz 20 g rafinozy w wodzie dwukrotnie destylowanej, mieszając (bez podgrzewania) do pełnego rozpuszczenia. Roztwór przefiltrować przez filtr 0,22 µm do sterylnej butelki.
    3. Bufor lizujący: Przygotować 25 mL roztworu w wodzie trzykrotnie destylowanej (TDW) składającego się z 50 mM Tris, 30 mM Pipes, 50 mM KCl, 10% glicerolu, 1,5 mM β-merkaptoetanolu, 1 mM MgCl2, 0,1 mM ATP oraz 0,1% Triton X-10. pH dostosować do 8 za pomocą 6 M HCl.
    4. Bufor elucyjny: Przygotować 10 mL roztworu w TDW składającego się z 50 mM Tris, 30 mM Pipes, 50 mM KCl, 350 mM imidazolu, 10% glicerolu, 1,5 mM β-merkaptoetanolu, 1 mM MgCl2, 0,1 mM ATP oraz 0,1% Triton X-10. pH dostosować do 7,2 za pomocą 6 M HCl.
    5. Bufor P12: Przygotować 10 mL roztworu w TDW składającego się z 12 mM Pipes, 1 mM EGTA i 2 mM MgCl2. pH dostosować do 6,9 za pomocą 10 M NaOH.
    6. Bufor BRB80: Przygotować 50 mL roztworu składającego się z 80 mM Pipes, 1 mM EGTA i 2 mM MgCl2 w wodzie ultrapure. pH dostosować do 6,9 za pomocą 10 M NaOH.
    7. Ogólny bufor do tubuliny (GTB): Przygotować 50 mL roztworu składającego się z 80 mM Pipes, 0,5 mM EGTA i 2 mM MgCl2 w wodzie ultrapure. pH dostosować do 6,9 za pomocą 10 M NaOH.
    8. Roztwór Tris-Pipes: Przygotować 40 mL roztworu 1 M Tris-0,6 M Pipes, mieszając 6,055 g Tris i 9,07 g Pipes w TDW, a następnie dostosować pH do 7,2 za pomocą 6 M HCl. Uzupełnić objętość końcową do 50 mL za pomocą TDW.
      UWAGA: Bufory P12, BRB80 i Tris-Pipes są wykorzystywane do przygotowania roztworów zapasowych do testu ruchliwości. Bufory te można przygotowywać w dużych ilościach, rozdzielać do probówek 1,5 mL, zamrażać gwałtownie i przechowywać w temperaturze -20 °C.
  2. Roztwory zapasowe do testu ruchliwości
    1. Tubulina (10 mg mL-1): Rozpuścić 1 mg liofilizowanej tubuliny w 10 µL zimnego (4 °C) ogólnego buforu do tubuliny (GTB). Alikwoty po 1 µL zamrozić gwałtownie i przechowywać w temperaturze -80 °C.
    2. Tubulina biotynylowana (1 mg mL-1): Rozpuścić 20 µg liofilizowanej tubuliny w 20 µL zimnego GTB. Alikwoty po 1 µL zamrozić gwałtownie i przechowywać w temperaturze -80 °C.
    3. Tubulina znakowana rhodaminą (1 mg mL-1): Rozpuścić 20 µg liofilizowanej tubuliny w 20 µL zimnego GTB. Alikwoty po 0,5 µL zamrozić gwałtownie i przechowywać w temperaturze -80 °C.
    4. GMPCPP (10 µM): GMPCPP otrzymuje się od dostawcy jako roztwór wodny o objętości 10 µL i przechowuje w temperaturze -80 °C. Fiolkę z GMPCPP rozmrozić na lodzie. Przygotować alikwoty po 1 µL, zamrozić gwałtownie i przechowywać w temperaturze -80 °C.
    5. ATP: Przygotować 50 µL roztworu 100 mM ATP w buforze 0,5 M Tris (pH 8). Alikwoty po 2 µL zamrozić gwałtownie i przechowywać w temperaturze -20 °C.
    6. MgCl2: Przygotować 1 mL roztworu 20 mM MgCl2 w buforze P12. Alikwoty po 5 µL przechowywać w temperaturze -20 °C.
    7. Kazeina: Przygotować 1 mL roztworu kazeiny o stężeniu 5 mg mL-1 w buforze BRB 80. Alikwoty po 10 µL zamrozić gwałtownie i przechowywać w temperaturze -20 °C.
    8. D-glukoza: Przygotować 1 mL roztworu 1 M D-glukozy w buforze P12. Alikwoty po 10 µL przechowywać w temperaturze -20 °C.
    9. Oksydaza glukozowa: Przygotować 1 mL roztworu oksydazy glukozowej o stężeniu 10 mg mL-1 w buforze P12. Alikwoty po 2 µL zamrozić gwałtownie i przechowywać w temperaturze -20 °C.
    10. Katalaza: Przygotować 1 mL roztworu katalazy o stężeniu 0,8 mg mL-1 w buforze P12. Alikwoty po 2 µL zamrozić gwałtownie i przechowywać w temperaturze -20 °C.
    11. Ditiotreitol (DTT): Przygotować w komorze okapu 1 mL roztworu 1 M DTT w buforze P12. Alikwoty po 10 µL zamrozić gwałtownie i przechowywać w temperaturze -20 °C.
    12. Fosforan kreatyny: Przygotować 1 mL roztworu 1 M fosforanu kreatyny w buforze P12. Alikwoty po 2 µL zamrozić gwałtownie i przechowywać w temperaturze -20 °C.
    13. Kreatynofosfokinaza: Przygotować 1 mL roztworu kreatynofosfokinazy o stężeniu 5 mg mL-1 w 0,25 M glicylo-glicynie, pH 7,4. Alikwoty po 2 µL zamrozić gwałtownie i przechowywać w temperaturze -20 °C.
    14. EGTA: Przygotować roztwór 10 mM EGTA w wodzie ultrapure i przechowywać w temperaturze pokojowej.
    15. KCl: Przygotować roztwór 1 M KCl w wodzie ultrapure i przechowywać w temperaturze pokojowej.
  3. Bufor do ruchliwości i mieszanina reakcyjna
    1. Bufor do ruchliwości (MB) z 145 mM KCl, zapas 2x: Przygotować 1 mL zapasu 2x buforu do ruchliwości, mieszając 10 µL wcześniej przygotowanego roztworu Tris-Pipes, 20 µL 10 mM EGTA, 290 µL KCl i 590 µL TDW. Bufor przechowywać na lodzie.
    2. Mieszanina reakcyjna do testu ruchliwości: Przygotować mieszaninę reakcyjną do testu ruchliwości zgodnie z Tabelą 1 i przechowywać ją na lodzie.
ObjętośćRoztwór stokowyNazwa odczynnika
50 µL2XMB (z kroku 1.3.1)
40 µL-TDW (destylowana woda)
1 µL10 mMATP
1 µL20 mMMgCl2
2 µL5 mg/mlKazeina
1 µL1 MGlukoza
1 µL1 MDTT
1 µL10 mg/mlOksydaza glukozowa
1 µL8 mg/mlKatalaza
1 µL1 MFosfokreatyna
1 µL5 mg/mlKinaza kreatynowa
100 µLSuma

Tabela 1.

2. Nadekspresja i oczyszczanie Cin8 z *S. cerevisiae* komórki

  1. Hodować komórki S. cerevisiae zawierające plazmid do nadekspresji Cin8-GFP-6His do fazy wzrostu wykładniczego (OD60 = 0,6-0,8) w 1 L selektywnego podłoża dla drożdży uzupełnionego o 2% rafinozy (patrz krok 1.1.2) w temperaturze 28 °C12.
  2. Indukować nadekspresję Cin8-GFP-6His poprzez dodanie 2% galaktozy. Monitorować wzrost kultury drożdży, mierząc absorbancję przy 60 nm.
  3. Pięć godzin po dodaniu galaktozy zebrać komórki poprzez wirowanie przy 4 0 x g przez 15 min w temperaturze 4 °C, zawiesić komórki w buforze do lizy i zamrozić w ciekłym N2.
    UWAGA: Zamrożone komórki można przechowywać w temperaturze -80 °C do późniejszego użycia lub natychmiast rozetrzeć w ciekłym N2.
  4. Rozetrzeć zamrożone komórki w ciekłym N2 przy użyciu schłodzonego moździerza i tłuczka. Podczas rozcierania dodawać ciekły N2, aby utrzymać ekstrakty w stanie zamrożonym. Zazwyczaj wymaga to 4-5 krotnego dodania ciekłego N2.
  5. Monitorować lizę komórek podczas obserwacji pod mikroskopem fazowo-kontrastowym lub DIC.
  6. Wymrozić rozcierane komórki i wirować przy 21 0 x g przez 30 min w temperaturze 4 °C. Nanieść supernatant na kolumnę przepływową grawitacyjną wypełnioną 2 mL Ni-NTA i uprzednio równoważoną buforem do lizy. Pozostawić supernatant do przepływu przez kolumnę.
  7. Przemyć kolumnę pięcioma objętościami kolumny buforem do lizy, a następnie pięcioma objętościami kolumny buforem do lizy uzupełnionym o 25 mM imidazolu.
  8. Eluować Cin8-GFP-6His buforem do elucji (patrz krok 1.1.4).
  9. Analizować eluowane próbki za pomocą frakcjonowania SDS-PAGE, a następnie barwienia błękitem Coomassie i analizy western blot z użyciem przeciwciała α-GFP19.
  10. Połączyć frakcje zawierające Cin8-GFP-6His (kroki 2.8 i 2.9). Następnie oczyścić je za pomocą chromatografii wykluczania wielkości (SEC) przy szybkości przepływu 0,5 mL min-1 i maksymalnym ciśnieniu kolumny 1,5 MPa, przy jednoczesnym monitorowaniu absorbancji przy 280 nm i emisji fluorescencji GFP przy wzbudzeniu 48 nm (Rysunek 2A).
  11. Zebrać frakcje odpowiadające tetramerowi Cin8-GFP i przeanalizować je za pomocą SDS-PAGE i western blottingu (patrz krok 2.9) (Rysunek 2B).
  12. Oszacować stężenie białka za pomocą spektrofotometrii lub testów biochemicznych, takich jak test Bradforda, test BCA itp.
  13. Rozdzielić wybrane frakcje na alikwoty, szybko zamrozić w ciekłym N2 i przechowywać do użycia w temperaturze -80 °C. Te oczyszczone próbki białka można wykorzystać przez 6 miesięcy.
    UWAGA: Cin8-GFP jest nadeksponowane i oczyszczone z deficytnego pod względem proteaz szczepu S. cerevisiae zawierającego plazmid 2 µm do nadekspresji Cin8-GFP-6His z promotora indukowanego galaktozą, LGY 4093: MATα, leu2-3,12, reg-1-501, ura3-52, pep4-3, prb1-12, gal1, pOS7 (2µ, LEU2, PGAL1-CIN8-GFP-6HIS). Szczep drożdży i plazmid są dostępne na żądanie.

figure-protocol-1
Rycina 2: Oczyszczanie Cin8-GFP. (A) Chromatogram wykluczania sterycznego oczyszczonego za pomocą Ni-NTA białka Cin8-GFP, z ciągłą detekcją fluorescencji GFP przy wzbudzeniu 48 nm i emisji przy ~510 nm. Tetramer Cin8-GFP eluiuje przy ~10 mL z kolumny SEC (oznaczony strzałką). (B) Żel SDS-PAGE barwiony Coomassie (góra) oraz western blot z przeciwciałem α-GFP (dół) frakcji Cin8-GFP eluiowanych z SEC. Próbki w ścieżkach są następujące: M – marker masy cząsteczkowej, Ni2+- próbka Cin8-GFP oczyszczona za pomocą Ni-NTA naniesiona na kolumnę SEC, frakcje GF: frakcja odpowiadająca elucji Cin8-GFP z SEC, jak zaznaczono na panelu A. Strzałka po prawej stronie wskazuje wielkość monomeru Cin8-GFP (oczekiwaną na SDS-PAGE). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

3. Test ruchliwości pojedynczych cząsteczek z oczyszczonym białkiem Cin8

  1. Polimeryzacja mikrotubul (MT) znakowanych biotyną i rhodaminą, stabilizowanych GMPCPP.
    1. Rozpocząć polimeryzację MT, mieszając następujące składniki w probówce 1,5 mL: 1 µL białka tubuliny w stężeniu 10 mg/mL, 1 µL tubuliny biotynulowanej w stężeniu 1 mg/mL, 0,5 µL tubuliny znakowanej rhodaminą w stężeniu 1 mg/mL, 1 µL GMPCPP 10 mM oraz 6,5 µL ogólnego buforu do tubuliny (GTB). Inkubować mieszaninę przez 1 h w temperaturze 37 °C.
    2. Po polimeryzacji MT dodać 80 µL ciepłego (37 °C) buforu GTB, dokładnie wymieszać i odwirować przy 16 50 x g przez 20 min.
    3. Odlać supernatant i ostrożnie resuspendować osad, pipetując w górę i w dół 50 µL ciepłego GTB. Suspension przechowywać w temperaturze 28 °C.
    4. Obejrzeć MT pod mikroskopem fluorescencyjnym, korzystając z kanału rhodaminy 647 nm (Rysunek 3A).
      UWAGA: Aby uzyskać biotynulowane i znakowane fluorescencyjnie MT, reakcja polimeryzacji musi zawierać tubulinę nieznakowaną oraz tubuliny biotynulowane i znakowane fluorescencyjnie. W niniejszym protokole zastosowano tubulinę znakowaną rhodaminą, lecz można użyć również innych koniugatów fluorescencyjnych.
  2. Montaż komory przepływowej
    1. Zmontować komorę przepływową, przyklejając cztery paski dwustronnej taśmy (~4 cm x ~3 mm) na zaawansowanym szkiełku obiektowym z klejem (równolegle do dłuższej krawędzi i w odstępach ~3-4 mm), aby stworzyć trzy „ścieżki” między paskami taśmy. Zdjąć papier ochronny z pasków taśmy i położyć silanizowaną lamelkę10 na paskach taśmy, tworząc trzy komory przepływowe o objętości ~10 µL.
  3. Immobilizacja MT na powierzchni powlekanej awidyną (Rysunek 1)
    1. Powlec silanizowaną lamelkę, wprowadzając za pomocą mikropipety do komory przepływowej 15 µL biotynulowanej albuminy surowicy bydlęcej (b-BSA, rozpuszczonej w GTB) w stężeniu 1 mg/mL. Po 5 min wypłukać komorę 80 µL GTB.
    2. Następnie, analogicznie do kroku 3.3.1, wprowadzić do komory przepływowej 15 µL awidyny w stężeniu 1 mg/mL (rozpuszczonej w GTB), która wiąże się z b-BSA. Po 5 min wypłukać komorę 80 µL GTB.
    3. Pasywować powierzchnię silanizowanej lamelki, używając 20 µL 1% poloksameru. Po 3 min wypłukać 80 µL GTB.
    4. Przytwierdzić biotynulowane MT (krok 3.1) do lamelki powlekanej b-BSA-awidyną, wprowadzając 20 µL MT, zazwyczaj rozcieńczonych 1:20 w GTB. Inkubować szkiełka w pozycji odwróconej, tj. z lamelką skierowaną w dół w ciemnej komorze wilgotnościowej (np. w czarence Petriego z mokrym ręcznikiem papierowym) przez 5 min w temperaturze pokojowej. Następnie wypłukać 20 µL GTB.
    5. Wprowadzić 30 µL mieszaniny reakcyjnej do badania motylości (patrz krok 1.3.2) do komory przepływowej.
    6. Rozcieńczyć motory Cin8-GFP (krok 2.13) w 20 µL mieszaniny reakcyjnej do badania motylości (patrz Tabela 1) (zazwyczaj do końcowego stężenia 5-10 µM). Wprowadzić je do komory przepływowej i niezwłocznie obrazować ruch motorów wzdłuż MT.
  4. Obrazowanie motylości motorów
    UWAGA: Wiązanie MT oraz motylość motorów monitorowano za pomocą odwróconego mikroskopu epifluorescencyjnego wyposażonego w lampę łukową rtęciową, obiektyw 10x/1,4 NA oraz dwa zestawy filtrów przepustowych dla fluorescencji: jeden o długości fali 647 nm (dla rhodaminy) i drugi o długości fali 48 nm (dla GFP).
    1. Nanieść kroplę oleju imersyjnego na obiektyw mikroskopu. Umieścić komorę przepływową na stoliku mikroskopu fluorescencyjnego lamelką skierowaną w dół, w stronę obiektywu.
    2. Włączyć kanał rhodaminy, aby ustawić ostrość na MT przytwierdzonych do powierzchni lamelki, i uzyskać obraz z czasem ekspozycji 20 ms, korzystając z oprogramowania Micro-Manager ImageJ-Fiji21.
    3. Włączyć kanał GFP i uzyskać 90 obrazów time-lapse z odstępem 1 s i ekspozycją 80 ms w celu analizy motylości Cin8-GFP.

figure-protocol-2
Rysunek 3: Mikrotubule (MT) oraz związane z nimi białka Cin8-GFP. (A) Obrazy z dwóch pól (lewego i prawego) dla MT spolimeryzowanych zgodnie z protokołem opisanym w kroku 3.1 i obrazowanych obiektywem 10x, jak opisano w kroku 3.4. (B) Obrazy z dwóch pól (lewego i prawego) dla białek Cin8-GFP (dolne panele, oznaczone strzałkami) przyłączonych do MT pokazanych w górnych panelach. Pasek skali: 4 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

4. Analiza motywności

UWAGA: Wszystkie analizy obrazów oraz generowanie kymografów należy przeprowadzić przy użyciu oprogramowania ImageJ-Fiji.

  1. Generowanie kymografu
    1. Otwórz film z serii czasowej (time-lapse) oraz odpowiadający mu obraz pola MT. Zsynchronizuj te dwa okna, wybierając następującą opcję: Analyze > Tools > Synchronize Windows.
    2. Zaznacz jedno MT, korzystając z opcji Segmented Line, a następnie użyj karty Analyze > Multi Kymograph, aby uzyskać kymograf.
  2. Wyznaczanie wielkości klastrów Cin8-GFP (tj. liczby cząsteczek Cin8 w klastrze)
    1. Wykonaj odejmowanie tła oraz korekcję nierównomiernego oświetlenia, korzystając z opcji Process > Subtract Background. Ustaw wartość Rolling Ball Radius na 10 pikseli i zaznacz opcję Sliding Paraboloid.
    2. Śledź średnią intensywność fluorescencji konkretnego nieruchomego motoru Cin8-GFP (Rysunek 3B) jako funkcję czasu w obrębie koła o promieniu 4 pikseli, używając wtyczki TrackMate w oprogramowaniu ImageJ-Fiji poprzez wybór następującej opcji: Plugins > Tracking > TrackMate > LoG Detector > Simple Lap Tracker.
    3. Powtórz krok 4.2.2 dla różnych motorów Cin8-GFP. Przedstaw intensywność fluorescencji różnych motorów Cin8-GFP jako funkcję czasu.
      UWAGA: Strategia eksperymentalna służąca do pomiaru wielkości klastrów – tj. liczby cząsteczek Cin8 w klastrze – stanowi podstawę analizy ruchliwości związanej z klasteryzacją Cin8. W celu określenia wkładu pojedynczych cząsteczek GFP w całkowitą intensywność klastrów Cin8 stosuje się fotowybiałanie GFP przyłączonego do Cin8. Na przykład intensywności fluorescencji maleją skokowo o ok. 50 jednostek arbitralnych (a.u.), przy czym każdy pojedynczy skok prawdopodobnie reprezentuje fotowybiałanie jednej cząsteczki GFP (Rysunek 4A). Ponieważ Cin8 jest homo-tetramerycznym białkiem motorowym, zawiera cztery cząsteczki GFP. Zatem wszystkie motory Cin8 o intensywności ≤ 20 a.u. są prawdopodobnie pojedynczymi tetramerycznymi cząsteczkami Cin8. Zgodnie z tą metodą, zakresy intensywności fluorescencji motorów Cin8 przypisuje się odpowiednio jako <20, 20-40 i >40 dla pojedynczych cząsteczek Cin8, par cząsteczek Cin8 (dimer tetrameru Cin8) oraz oligomerów Cin812.
  3. Analiza rozkładu intensywności dla motorów Cin8-GFP
    1. Zmierz średnią intensywność fluorescencji wszystkich fluorescencyjnych motorów Cin8-GFP w pierwszej klatce sekwencji time-lapse, używając wtyczki TrackMate w ImageJ-Fiji, zgodnie z opisem w kroku 4.2.2.
    2. Wykreśl histogram średnich intensywności Cin8-GFP z rozmiarem koszyka (bin size) wynoszącym 20 a.u. i dopasuj główny pik histogramu do krzywej Gaussa (Rysunek 4B).
      UWAGA: Analiza rozkładu intensywności uzupełnia wyznaczanie wielkości klastrów dla motorów Cin8-GFP na podstawie eksperymentów z fotowybiałaniem. Krzywa Gaussa dopasowana do histogramu rozkładu intensywności dla populacji Cin8-GFP osiąga maksimum przy ok. 125 a.u., co jest zgodne ze średnią intensywnością pojedynczych tetramerycznych cząsteczek Cin8 zawierających jedną, dwie, trzy lub cztery fluorescencyjne (niewybiałone) cząsteczki GFP, gdzie każda fluorescencyjna cząsteczka GFP wnosi ok. 50 a.u. Zatem stosując tę metodę rozkładu intensywności, można również obliczyć wkład jednej cząsteczki GFP, co może zostać dalej wykorzystane do przypisania wielkości klastra cząsteczek Cin8-GFP.

figure-protocol-3
Rysunek 4: Profil blaknięcia i rozkład intensywności Cin8-GFP. (A) Fotoblaknięcie GFP w czterech różnych motorach Cin8-GFP. Pojedyncze stopnie fotoblaknięcia, z których każdy prawdopodobnie reprezentuje fotoblaknięcie jednej cząsteczki GFP, prowadzą do spadku intensywności fluorescencji o ~50 a.u. (B) Rozkład intensywności motorów Cin8-GFP w pierwszej klatce sekwencji time-lapse (wstawka). Szczyt Gaussa (niebieski) wyśrodkowany przy ~125 a.u reprezentuje pojedyncze cząsteczki Cin8-GFP. Szczyt ten wykazuje średnią intensywność pojedynczych tetramerów Cin8 z jedną, dwiema, trzema lub czterema fluorescencyjnymi cząsteczkami GFP, gdzie każda cząsteczka GFP wnosi ~50 a.u do całkowitej intensywności (tj. (50 + 10 + 150 + 20) / 4 = 125). Aby wyświetlić większą wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

  1. Śledzenie ruchliwości cząsteczek Cin8-GFP wzdłuż torów MT
    1. Wykadruj analizowany MT w sekwencji klatek time-lapse, zaznaczając go narzędziem Rectangle , a następnie wybierając Image > Crop.
    2. Wybierz do analizy fluorescencyjną cząsteczkę Cin8-GFP. Zapisz współrzędne cząsteczki w każdej klatce (punkcie czasowym) sekwencji time-lapse, korzystając z narzędzia Point Tool oraz opcji Measure. Przeprowadź analogiczny zapis współrzędnych dla pozostałych fluorescencyjnych cząsteczek w sekwencji time-lapse.
    3. Przypisz wielkość klastra wszystkim badanym cząsteczkom Cin8-GFP w pierwszej klatce ich pojawienia się, zgodnie z opisem w kroku 4.2.
  2. Analiza średniego przemieszczenia (MD) i średniego kwadratu przemieszczenia (MSD)
    1. Na podstawie współrzędnych ruchów Cin8-GFP wyznaczonych w kroku 4.4, oblicz przemieszczenia Cin8-GFP w każdym punkcie czasowym względem współrzędnych początkowych, korzystając z równania na obliczenie odległości między dwoma punktami o zadanych współrzędnych:
      figure-protocol-4
      gdzie dt to przemieszczenie Cin8-GFP w czasie t, a xt i yt to odpowiednio współrzędne w czasie t. x0 i y0 to odpowiednio współrzędne Cin8-GFP w t = 0.
    2. Na podstawie tych wartości oblicz przemieszczenie dla wszystkich możliwych przedziałów czasowych dla konkretnej cząsteczki Cin8-GFP. Powtórz procedurę dla wszystkich badanych cząsteczek Cin8-GFP.
    3. Wykreśl średnie przemieszczenie (MD) wszystkich badanych cząsteczek Cin8-GFP w funkcji przedziału czasowego i wykonaj dopasowanie liniowe: MD = v x t + c. Nachylenie tej prostej (v) reprezentuje średnią prędkość ruchliwych cząsteczek Cin8-GFP.
      UWAGA: W ten sposób można oddzielnie obliczyć średnią prędkość wszystkich cząsteczek Cin8-GFP należących do każdego rozmiaru klastra, co pozwala na charakterystykę ruchliwości różnych wielkości klastrów. Oprócz analizy MD można również przeprowadzić analizę średniego kwadratu przemieszczenia (MSD), podnosząc do kwadratu wartości przemieszczeń obliczone w krokach 4.5.1 i 4.5.2. Wartości MSD wykreśla się w funkcji przedziału czasowego i dopasowuje do krzywej wielomianowej MSD = v2 x t2 + 2D x t + c, co pozwala wyznaczyć dodatkowy parametr D, będący współczynnikiem dyfuzji ruchu Cin8-GFP. Analizę MD należy przeprowadzać na MT z zaznaczoną polarnością8,10, natomiast w przypadku analizy MSD znajomość polarności MT nie jest konieczna.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Celem eksperymentu jest zbadanie charakterystyki ruchliwości dwukierunkowego białka motorowego Cin8 o różnych rozmiarach skupisk na pojedynczych MTs. Reprezentatywna ruchliwość Cin8-GFP jest również widoczna na kymografach na Rysunku 5A, gdzie przedstawiono pozycję przestrzenną motoru w funkcji czasu.

W celu analizy właściwości ruchowych Cin8-GFP, najpierw przypisano rozmiar klastra (krok 4.3) do każdej cząsteczki Cin8-GFP przemieszczającej się wzdłuż MT, a następ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W pracy przedstawiono protokół oznaczania ruchliwości pojedynczej cząsteczki z dwukierunkową kinezyną-5 Cin8 oraz analizę ruchliwości. Pełnowymiarowy Cin818 , w tym natywny sygnał lokalizacji jądrowej (NLS) na C-końcu, został oczyszczony z natywnego gospodarza S. cerevisiae. Ponieważ Cin8 jest jądrowym białkiem motorycznym, mielenie komórek S. cerevisiae pod ciekłym azotem okazuje się najbardziej efektywną metodą lizy komórek. Po lizie, łącząc chromatografię powinowactwa do metal...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

To badanie było częściowo wspierane przez grant Izraelskiej Fundacji Naukowej (ISF-386/18) oraz grant Izraelskiej Fundacji Nauki Dwunarodowej (BSF-2019008), przyznany L.G.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AdeninaFORMEDIUMDOC0230
ATPSigmaA7699
Biotynylowany-BSASigmaA8549
KazeinaSigmaC7078
Katalaza (C40)SigmaC40
Kinaza kreatynowaSigmaC3755
Ditiotreitol (DTT)SigmaD0632
EDTASigmaE5134
EGTASigmaE4378
Zestaw filtrów fluorescencyjnych do GFPChroma49002: ET-EGFP (FITC/Cy2)
Zestaw filtrów fluorescencyjnych do rodaminyChroma49004: ET-CY3/TRITC
Fluorescencyjny mikroskop odwróconyZeissAxiovert 200M
GalaktozaTivan BiotechGAL02
GlukozaSigmaG8270
Oksydaza glukozowaSigmaG7141
GlicerolSigmaG5516
GlicyloglicynaMerckG0674
GMPCPPJana BioscienceNu-405L
GTBCytoszkieletBST01-010
GTPSigmaG8877
HistidineDuchefa BiochemieH0710.0100
Oprogramowanie ImageJ-FIJIhttps://imagej.net/plugins/trackmate/wersja 2.1.0/1.53c; Java 1.8.0_172 [64-bit] dla Windows 10
ImidazoleSigmaI0125
InstantBlue Coomassie Protein StainAbcamab119211
ObiektywZeiss100x/1.4 olej DIC Lizyna
FORMEDIUMDOC0161
Chlorek magnezuSigmaM8266
MetioninaDuchefa BiochemieM0715.0100
NeoAndor TechnologiesKamera
NeutraAvidinLifeA2666
Ni-NTA AgarozaInvitrogenR901-15
FosfokreatynaSigmaP1937
RurySigmaP1851
Kwas pluronowy F-127 (poloksamer)SigmaP2443
Chlorek potasuSigmaP9541
RafinozaTivan BiotechRAF01
Przyrząd do chromatografii wykluczającej rozmiarGE HealthcareAKTA Czysty
spektrofotometrThermoFisher ScientificNanoDrop
Superose-6 10/300 GLGE Healthcare17-5172-01
TrisRoshe10708976001
Triton X-100SigmaT8787
TryptofanDuchefa BiochemieT0720.0100
Cytoszkieletbiałka tubulinyT240
Tubulina, biotynylowanycytoszkieletT333P
Tubulina, TRITC Cytoszkielet rodaminyTL530M
UracilSigmaU0750-100G
Drożdżowa baza azotowaFORMEDIUMCYN0401S
&alfa;-GFP przeciwciałoSanta Cruz BiotechnologySC8036
β-merkaptoetanolSigmaM3148
sCMOS

Bibliografia

  1. Singh, S. K., Pandey, H., Al-Bassam, J., Gheber, L. Bidirectional motility of kinesin-5 motor proteins: structural determinants, cumulative functions and physiological roles. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (10), 1757-1771 (2018).
  2. Hoyt, M. A., He, L., Totis, L., Saunders, W. S. Loss of function of Saccharomyces cerevisiae kinesin-related CIN8 and KIP1 is suppressed by KAR3 motor domain mutations. Genetics. 135 (1), 35-44 (1993).
  3. Saunders, W. S., Hoyt, M. A. Kinesin-related proteins required for structural integrity of the mitotic spindle. Cell. 70 (3), 451-458 (1992).
  4. Hoyt, M. A., He, L., Loo, K. K., Saunders, W. S. Two Saccharomyces cerevisiae kinesin-related gene products required for mitotic spindle assembly. Journal of Cell Biology. 118 (1), 109-120 (1992).
  5. Gerson-Gurwitz, A., et al. Mid-anaphase arrest in S. cerevisiae cells eliminated for the function of Cin8 and dynein. Cellular and Molecular Life Sciences. 66 (2), 301-313 (2009).
  6. Fridman, V., Gerson-Gurwitz, A., Movshovich, N., Kupiec, M., Gheber, L. Midzone organization restricts interpolar microtubule plus-end dynamics during spindle elongation. EMBO Reports. 10 (4), 387-393 (2009).
  7. Movshovich, N., et al. Slk19-dependent mid-anaphase pause in kinesin-5-mutated cells. Journal of Cell Science. 121 (15), 2529-2539 (2008).
  8. Gerson-Gurwitz, A., et al. Directionality of individual kinesin-5 Cin8 motors is modulated by loop 8, ionic strength and microtubule geometry. Embo Journal. 30 (24), 4942-4954 (2011).
  9. Roostalu, J., et al. Directional switching of the kinesin Cin8 through motor coupling. Science. 332 (6025), 94-99 (2011).
  10. Shapira, O., Goldstein, A., Al-Bassam, J., Gheber, L. A potential physiological role for bi-directional motility and motor clustering of mitotic kinesin-5 Cin8 in yeast mitosis. Journal of Cell Science. 130 (4), 725-734 (2017).
  11. Goldstein-Levitin, A., Pandey, H., Allhuzaeel, K., Kass, I., Gheber, L. Intracellular functions and motile properties of bi-directional kinesin-5 Cin8 are regulated by neck linker docking. eLife. 10, 71036(2021).
  12. Pandey, H., et al. Drag-induced directionality switching of kinesin-5 Cin8 revealed by cluster-motility analysis. Science Advances. 7 (6), 1687(2021).
  13. Pandey, H., Popov, M., Goldstein-Levitin, A., Gheber, L. Mechanisms by which kinesin-5 motors perform their multiple intracellular functions. International Journal of Molecular Sciences. 22 (12), 6420(2021).
  14. Fridman, V., et al. Kinesin-5 Kip1 is a bi-directional motor that stabilizes microtubules and tracks their plus-ends in vivo. Journal of Cell Science. 126, 4147-4159 (2013).
  15. Edamatsu, M. Bidirectional motility of the fission yeast kinesin-5, Cut7. Biochemical and Biophysical Research Communications. 446 (1), 231-234 (2014).
  16. Popchock, A. R., et al. The mitotic kinesin-14 KlpA contains a context-dependent directionality switch. Nature Communications. 8, 13999(2017).
  17. Bodrug, T., et al. The kinesin-5 tail domain directly modulates the mechanochemical cycle of the motor domain for anti-parallel microtubule sliding. eLife. 9 (9), 51131(2020).
  18. Gheber, L., Kuo, S. C., Hoyt, M. A. Motile properties of the kinesin-related Cin8p spindle motor extracted from Saccharomyces cerevisiae cells. Journal of Biological Chemistry. 274 (14), 9564-9572 (1999).
  19. Pandey, H., et al. Flexible microtubule anchoring modulates the bi-directional motility of the kinesin-5 Cin8. Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (16), 6051-6068 (2021).
  20. Shapira, O., Gheber, L. Motile properties of the bi-directional kinesin-5 Cin8 are affected by phosphorylation in its motor domain. Scientific Reports. 6, 25597(2016).
  21. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  22. Britto, M., et al. Schizosaccharomyces pombe kinesin-5 switches direction using a steric blocking mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (47), 7483-7489 (2016).
  23. Kapitein, L. C., et al. Microtubule cross-linking triggers the directional motility of kinesin-5. Journal of Cell Biology. 182 (3), 421-428 (2008).
  24. Furuta, K., Edamatsu, M., Maeda, Y., Toyoshima, Y. Y. Diffusion and directed movement in vitro motile properties of fission yeast kinesin-14 Pkl1. Journal of Biological Chemistry. 283 (52), 36465-36473 (2008).
  25. Katrukha, E. A., et al. Probing cytoskeletal modulation of passive and active intracellular dynamics using nanobody-functionalized quantum dots. Nature Communications. 8, 14772(2017).
  26. Tinevez, J. Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
  27. Jakobs, M. A. H., Dimitracopoulos, A., Franze, K. KymoBulter, a deep learning software for automated kymograph analysis. eLife. 8, 42288(2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Sprostowanie


Formal Correction: Erratum: Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells
Posted by JoVE Editors on 6/09/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells. The Authors section was updated.

One of the author names was updated from:

Roy Abraham

to:

Roy Avraham

Tagi

Ruchomo kinezyny 5bia ko motorowe Cin8ruchomo pojedynczych cz steczekklastrowanie bia ek motorowychdynamika mikrotubuldwukierunkowe bia ko motorowechromatografia wykluczania cz steczekmikroskopia fluorescencyjnaSaccharomyces cerevisiaeznakowanie GFP

Powiązane artykuły